BIOQUIMICA

PERFIL LIPDICO: DETERMINACIN DE

TRIACILGLICEROLES DETERMINACIN DE
COLESTEROL TOTAL Y FRACCIONADO
DETERMINACIN DE LIPOPROTENAS SRICAS

DR. SANTOS DOMINGUEZ


ESTUDIANTE:
25 AGOSTO, 2014














OBJETIVOS

Determinar en suero EL: colesterol total, HDL-Colesterol y triglicridos
Conocer el procedimiento


INTRODUCCIN

El perfil lipdico lo constituye la cuantificacin analtica de una serie de lpidos que son transportados
en la sangre por los diferentes tipos de lipoprotenas plasmticas. La determinacin de estos
parmetros es un procedimiento analtico bsico para el diagnstico y seguimiento de enfermedades
metablicas, primarias o secundarias. Entre estos parmetros analticos que se pueden determinar
estn: el colesterol total, el colesterol transportado por las LDL, el colesterol transportado por las
HDL, los triglicridos totales, ciertas apoprotenas particulares etc.
Altos niveles de colesterol se asocian a riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares, en especial
aquel unido a las LDL (colesterol malo). El colesterol de las HDL (colesterol bueno), puesto que
representa aquella fraccin de colesterol que se transporta al hgado para su metabilizacin y
excrecin por va biliar, no se asocia con riesgo de enfermedad.

1. MECANISMOS DE ACCION

1.1. Determinacin de colesterol total

Para la determinacin de colesterol total las reacciones que tienen lugar son:

. Una colesterol estearasa (CHE) hidroliza los steres de colesterol a colesterol mas cidos
grasos libre.
. A continuacin una colesterol oxidasa (CHOD) oxida todo el colesterol a colestenona y
perxido de hidrgeno.
El perxido de hidrgeno es sustrato de una peroxidasa (POD) que junto con 4-amino fenazona (4-AP)
da lugar a la formacin de una quinona roja. La quinona formada es proporcional a la concentracin
de colesterol en la muestra.

1.2. Determinacin de HDL-colesterol
Para la determinacin del colesterol presente en las principales lipoprotenas que lo contienen como
HDL (lipoprotenas de alta densidad) y LDL (lipoprotenas de baja densidad), es necesario:
Primero, la separacin selectiva de la lipoprotena correspondiente con agentes precipitantes.
Segundo, la cuantificacin del colesterol presente en dicha lipoprotena como se indic anteriormente.
Entre estos reactivos precipitantes estn el cido fosfotungstico y magnesio que precipitan a las LDL y
VLDL (lipoprotenas de muy baja densidad) mientras que las HDL permanecen en solucin.

1.3. Determinacin de triglicridos
Para la determinacin de triglicridos en suero se utilizan reactivos comerciales (Kit comercial de
LinearChemicals) que incluyen las enzimas y sustratos necesarios para la cuantificacin por
espectrofotometra visible.
Las reacciones que tienen lugar son:


1. Una lipasa hidroliza los triglicridos dando glicerol mas cidos grasos libre.
2. El glicerol formado es sustrato de una glicerol quinasa que en presencia de ATP lo fosforila a
glicerol 3P.
3. El glicerol 3P es oxidado a dihidroxiacetona por una glicerol fosfato oxidasa dando tambin
perxido de hidrgeno.
4. El perxido de hidrgeno junto con los cromgenos p-clorofenol y 4-AP son sustrato de una
peroxidasa para formar una quinona roja cuantificable a 505 nm. La quinona formada es
proporcional a la concentracin de triglicridos presente en la muestra.

2. LISTADO DE MATERIAL NECESARIO
- Tubos de ensayo
- Pipetas automticas
- Espectrofotmetro
- Suero
- Estndar de colesterol (200 mg/dl)
- Reactivo de trabajo para el colesterol
- Reactivo precipitante Estndar de triglicridos (200 mg/dl) R
- Reactivo de trabajo para triglicridos

3. PROTOCOLOS A REALIZAR

3.1. Determinacin de colesterol total
Disponer de tubos de ensayo rotulados como blanco, estandar y muestra. La muestra se refiere al
suero a valorar y se colocan tantos tubos muestras como sueros se quieran valorar.
Pipetear los componentes indicados en la Tabla I, aadiendo en ltimo lugar el reactivo de trabajo de
colesterol.
Tabla I. Protocolo para la cuantificacin de colesterol total
Blanco Estndar Muestra
Estndar de colesterol - 20 l -
Suero - - 20 l
React. de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml
Mezclar e Incubar 5 min a 37oC ( 10 min a temperatura ambiente).
Leer la absorbancia a 505 nm.
Calcula la concentracin de colesterol total de cada una de las muestras de suero del siguiente modo:


Amuestra =
Aestandard =
Conc. Estndar =
Resultado =



3.2. Determinacin de HDL-colesterol
1. Mezclar 1ml del suero con0,1ml del reactivo precipitante.
2. Incubar10mina temperatura ambiente y centrifugar durante 20 min a 4000 rpm ( 2 min a
12000 rpm).
3. La determinacin de HDL-colesterol se realiza con 40 l del sobrenadante como se indica en la
Tabla II y utilizando el reactivo indicado en la determinacin de colesterol total
4. Pipetear los componentes indicados en la Tabla II, aadiendo en ltimo lugar el reactivo de
trabajo de colesterol.
Tabla II. Protocolo para la cuantificacin de colesterol de las HDL
5. Mezclar e Incubar 5 min a 37oC ( 10 min a temperatura ambiente).
6. Leer la absorbancia a 505 nm.

Calcula la concentracin de colesterol de las HDL del siguiente modo:

Amuestra =
Aestandard =
Conc. Estndar =
Resultado =


3.2. Determinacin de triglicridos
1. Disponer de tubos de ensayo rotulados como blanco, estandar y muestra. La muestra se refiere al
suero a valorar y se colocan tantos tubos muestras como sueros se quieran valorar.
2. Pipetear los componentes indicados en la Tabla III, aadiendo en ltimo lugar el reactivo de
trabajo de triglicridos.








Blanco Estandar Muestra
Estndar - 20 l -
Sobrenadante - - 40 l
H2O 40 l 20 l -
React. de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml
Blanco Estndar

Muestra
Estndar - 20 l -
Muestra - - 20 l
React. de trabajo 2 ml 2 ml

2 ml
3. Mezclar e Incubar a 37oC 4 min ( 10 min a temperatura ambiente). Leer la absorbancia a 505
nm.
Calcula la concentracin de colesterol de las HDL del siguiente modo:

Amuestra = 0,174
Aestandard = 0,487
Conc. Estndar = 200
Resultado = 71
Este resultado va conforme al parmetro normal de triglicridos

4. RESULTADOS ESPERADOS
Los resultados esperados son aquellos que se indican a continuacin y se corresponden con los
valores de referencia encontrados en la poblacin sana y que varan segn sexo y edad
4.1. Colesterol total
Hasta 30 aos: 120-215 mg/dl 30- 39 aos: 135-240 mg/dl 40-49 aos: 140-280 mg/dl 50- 59 aos:
145-295 mg/dl
4.2. Colesterol-HDL
Hombre > 55 mg/dl Mujer > 65 mg/dl
4.3. Triglicridos
36-165 mg/dl

5. APLICACIN DE LA FRMULA DE FRIEDEWALD
La frmula de Friedewald nos permite averiguar la fraccin LDLcolesterol (LDLc) si conocemos el
colesterol total (CT), la fraccin HDLcolesterol (HDLc) y los triglicridos (TG). Su clculo se realiza del
siguiente modo:

LDLc = CT - (HDLc + TG/5) en mg/dl

LDLc = CT - (HDLc + TG/2.21) en mmol/L