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DISCIPLINA: ANLISE BACTERIOLGICA DA GUA

PROFESSORA MARIA DAS DORES COSTA DUARTE










TCNICAS UTILIZADAS NA DETERMINAO DE
BACTRIAS DO GRUPO COLIFORME:
TUBOS MLTIPLOS;
MEMBRANA FILTRANTE;
SUBSTRATO DEFINIDO.








Drio Macedo Lima e Jos Eduardo da Silva Castro
Curso Tcnico Integrado em Controle Ambiental 3ano








Joo Pessoa
Janeiro de 2012







Autores: Drio Macedo Lima e Jos Eduardo da Silva Castro



TCNICAS UTILIZADAS NA DETERMINAO DE
BACTRIAS DO GRUPO COLIFORME:
TUBOS MLTIPLOS;
MEMBRANA FILTRANTE;
SUBSTRATO DEFINIDO.





Relatrio de aula destinado
disciplina de Anlise Bacteriolgica
da gua, ministrada pela Professora
Maria Deise das Dores Costa
Duarte.








Joo Pessoa
Janeiro de 2012



1. INTRODUO

A gua indiscutivelmente o elemento de maior importncia para a
sobrevivncia de todos os seres vivos do planeta. Contudo, milhares de anos aps o
surgimento das primeiras civilizaes, ainda no fomos capazes de adotar um modelo
de desenvolvimento que utilize a gua com o mnimo de sabedoria (ANA, 2011).
Quase um bilho de pessoas em todo o mundo no tem acesso gua potvel.
Segundo a Organizao das Naes Unidas (ONU), cerca de quatro mil crianas
menores de 5 anos morrem todos os dias de doenas passiveis de preveno
relacionadas a gua, como diarria, febre tifide, clera e disenteria.
A contaminao dos ecossistemas de gua est intimamente ligada a esses
dados alarmantes. No Brasil, cerca de 80% do esgoto no tem tratamento adequado, de
acordo com o levantamento de 2008 do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica
(IBGE).
Entre os contaminantes da qualidade da gua mais difundidos especialmente
em reas onde o acesso a gua limpa e segura limitado esto os organismos
patognicos: bactrias, protozorios e vrus. Estes organismos representam uma das
principais ameaas sade humana no planeta (ANA, 2011). Os maiores riscos de
contaminao microbiana vm do consumo de gua contaminada com agentes
patognicos provenientes de fezes humanas ou animais (Carr e Neary, 2008).
A gua potvel no deve conter microorganismos patognicos e deve estar
livre de bactrias indicadoras de contaminao fecal. Os indicadores de contaminao
fecal, tradicionalmente aceitos, pertencem a um grupo de bactrias denominadas
coliformes. O principal representante desse grupo de bactrias chama-se Escherichia
coli (FUNASA, 2006).
O grupo dos coliformes est dividido em coliformes totais e coliformes
termotolerantes.
As bactrias que pertencem ao grupo dos coliformes totais so caracterizadas
por apresentar bacilos gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no
formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na presena de sais
biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produo de cido, gs e
aldedo a 35,0 0,5C em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima -
galactosidase. A maioria das bactrias do grupo coliforme pertence aos gneros
Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora vrios outros gneros e
espcies pertenam ao grupo (MS, 2005).
O grupo dos coliformes termotolerantes, comumente chamados de coliformes
fecais, um subgrupo dos coliformes totais, restrito aos membros capazes de fermentar
a lactose em 24 horas a 44,5-45,5C, com produo de gs. Essa definio objetivou,
em princpio, selecionar apenas as enterobactrias originrias do trato gastrintestinal (E.
coli), porm, atualmente sabe-se que o grupo inclui membros de origem no fecal
(vrias cepas Klebsiella pneumoniae, Pantoea agglomerans, Enterobacter aerogenes,
Enterobacter cloacae e Citrobacter freundii). Em funo disso, o termo coliformes
fecais tem sido, gradativamente, substitudo por coliformes termotolerantes (SILVA et
al, 2010).
A Escherichia coli, considerada o mais especfico indicador de contaminao
fecal e de eventual presena de organismos patognicos, est includa tanto no grupo
dos coliformes totais quanto no dos coliformes termotolerantes. Seu habitat natural o
trato instestinal de animais de sangue quente (SILVA et al, 2010). A E.coli,
reconhecida como um micro-organismo modelo, pois foi exaustivamente estudada
geneticamente e bioquimicamente nos ltimos anos.
A razo da escolha da E. coli como indicadora de contaminao da gua deve-
se aos seguintes fatores: est presente nas fezes de animais de sangue quente, inclusive
os seres humanos; sua presena na gua possui uma relao direta com o grau de
contaminao fecal; facilmente detectvel e quantificvel por tcnicas simples e
economicamente viveis, em qualquer tipo de gua; possui maior tempo de vida na gua
que as bactrias patognicas intestinais, por ser menos exigente em termos nutricionais,
alm de ser incapaz de se multiplicar no ambiente aqutico; mais resistente ao dos
agentes desinfetantes do que os germes patognicos (FUNASA, 2006).
A portaria 518 de 2004 do Ministrio da Sade determina que a gua para
consumo humano no deve apresentar E. coli ou coliformes termotolerantes.
Para identificar e quantificar a presena de bactrias do grupo coliforme na
gua foram desenvolvidas diversas metodologias de anlise, dentre elas, destacam-se:
fermentao em tubos mltiplos; tcnica da membrana filtrante; tcnica do substrato
definido ou substrato Cromognico / Fluorognico.
A tcnica dos tubos mltiplos ou mtodo do NMP (nmero mais provvel)
um mtodo clssico na contagem de coliformes totais, termotolerantes e E. coli em
gua. A tcnica de contagem em meio lquido menos exata que as que usam meio
slido, apresentando a vantagem de que permitem detectar o gs produzido no
metabolismo bacteriano (CEBALLOS, 1996).
O mtodo consiste em inocular alquotas da amostra de gua ou diluies dela
em uma srie de tubos com meio de cultura apropriado e observar o crescimento
bacteriano. Este que se manifesta como cmbio na cor do meio lquido e turbidez ou, s
turbidez ou turbidez e gs. O gs se observa retido em tubos de Durham que foram
colocados previamente dentro do tubo com meio de cultura. (CEBALLOS, 1996). O
nmero de tubos positivos nos quais ocorreu crescimento de gs em cada diluio
utilizado para determinar o Nmero Mais Provvel (NMP) desse microrganismo na
amostra de gua analisada, consultando uma tabela estatstica (tabela de McGrady)
(ABELHO, 2011).
O Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater
recomenda tambm, ao lado do mtodo do NMP, a tcnica da membrana filtrante. A
recomendao afirma que a tcnica pode ser adotada para determinar a potabilidade de
qualquer gua, desde que, aps uma srie de exames paralelos, obtenham-se com as
duas tcnicas, resultados compatveis.
Em linhas gerais a tcnica da MF consiste em passar volumes ou diluies da
amostra atravs de uma membrana com poros microscpicos que retm as bactrias.
Estas membranas filtrantes so ento colocadas sobre meios seletivos com gar,
contidos em placas de Petri. A determinao de coliformes procedida contando-se as
colnias tpicas que crescem na superfcie da membrana, aps 24 horas.
O mtodo da membrana filtrante possui algumas vantagens e desvantagens em
relao ao mtodo dos tubos mltiplos.
Vantagens: tem boa reprodutibilidade; os resultados so relativamente rpidos;
permite o processamento de grandes volumes de amostra de forma a aumentar a
sensibilidade do teste; um mtodo mais econmico que o NMP (ABELHO, 2011);
pode ser processado com o mnimo de espao e equipamentos; resultado tem maior grau
de preciso em relao tcnica dos tubos mltiplos.
Desvantagens: as amostras com gua muito turva impedem a filtrao de
grandes volumes e se esta turbidez for devido presena de algas ou substncias em
suspenso, estas podem formar uma pelcula na superfcie da membrana e interferir no
desenvolvimento de colnias caractersticas de coliformes; quando existem grandes
populaes de bactrias no coliformes, porm capazes de se desenvolver sobre o meio
de cultura, os coliformes podero ser impedidos de se desenvolver ou seno a densidade
de coliformes pode ser menor do que a obtida pela tcnica do NMP; se existirem metais
e fenis presentes na amostra podem adsorver aos filtros e inibir o crescimento
bacteriano (ABELHO, 2011).
O mtodo do substrato Definido permite a determinao simultnea de
Coliformes Totais e E. coli. um mtodo extremamente simples e prtico baseado na
utilizao de substratos anlogos lactose (glicopiranosdeos) processados somente por
Coliformes Totais e E. coli. Esses substratos so hidrolisveis e detectam
simultaneamente enzimas presentes nessas bactrias.
O teste vem sendo cada vez mais usado em todo o mundo, apresenta muitas
vantagens, principalmente com relao rapidez de sua realizao, pois ele apresenta
um tempo de manuseio inferior a um minuto, detecta coliformes totais e E. coli,
simultaneamente, em 24 horas ou menos, no h necessidade de nenhuma confirmao
ou de limpeza de utenslios de vidro nem de contagem de colnia. O mtodo tambm
possui uma fcil execuo, eliminando a necessidade de preparao de meios, uma vez
que o substrato j vem em uma embalagem de dose unitria. O procedimento
realizado em 15 minutos. O mtodo do substrato Cromognico / Fluorognico tambm
se destaca por ser muito preciso.
Neste relatrio descreveremos as trs tcnicas de identificao e quantificao
de bactrias do grupo coliformes aqui introduzidas: tcnica dos tubos mltiplos, tcnica
da membrana filtrante e a tcnica do Substrato Definido (DST) ou Substrato
Cromognico / Fluorognico.




























2. OBJETIVOS

Ressaltar e fortalecer a importncia da realizao da anlise bacteriolgica da
gua para a sade das pessoas, dos animais e do meio ambiente;
Destacar as bactrias do grupo coliforme, com enfoque na E. coli, como
microorganismos indicadores fundamentais na averiguao da qualidade da gua;
Descrever, analisar e comparar as tcnicas de determinao de Coliformes Totais
e E. Coli.


3. METODOLOGIA

3.1. Preparao da amostra e diluies

A preparao e inoculao de diluies requerida nos ensaios quantitativos,
para reduzir o nmero de microorganismos por unidade de volume. A amostra pode ser
inoculada bruta ou diluda, a necessidade de diluies ou o nmero de diluies seriadas
vai depender do nvel de contaminao esperado e deve ser tal que permita a obteno
de tubos positivos nas menores diluies e negativos nas maiores no caso do mtodo do
N.M.P. No mtodo de filtrao em membrana geralmente no so feitas diluies da
amostra, pois o mtodo uma tcnica de concentrao dos microorganismos em
amostras com baixas contagens. O procedimento usual a filtrao de 100ml, que
podem ser fracionados em duas pores de 50ml, 4 pores de 25ml ou 3 pores de 70,
25 e 5ml, respectivamente. A seleo do volume a ser filtrado, entretanto, depende da
contaminao estimada na amostra, de forma a resultar em placas com contagens na
faixa de 20 a 200 colnias (SILVA et al, 2010).
A amostra diluda na gua de diluio que resultado da mistura de duas
solues. A sua preparao est descrita na sequncia.
Soluo 1:
Pesar 34 gramas de Fosfato de Potssio Monobsico (KH2PO4) e dissolver em
500 ml de gua destilada, ajustar o pH para 7,2 com Hidrxido de Sdio, soluo
normal (NaOH 1N) e diluir a 1 litro com gua destilada. Normalmente so necessrios
175 ml de NaOH 1N para elevar o pH.
Soluo 2:
Pesar 81,1 gramas de Cloreto de Magnsio hexahidratado (MgCl2.6H2O) e
dissolver em 1 litro de gua destilada.
Soluo 3 = Soluo 1 + Soluo 2:
Adicionar 1,25 ml da soluo 1 e 5 ml da soluo 2 a 1 litro de gua destilada.
Distribuir em tubos de ensaio em quantidade que, aps autoclavao, assegurem um
volume de 9 0,2 ml. Esterilizar em autoclave a 121 C (1Kg/cm2 de presso) durante
15 minutos.
A diluio inicial recomendada de 1:10 (10
-1
). Ela obtida acrescentando
assepticamente 1 ml da amostra com uma pipeta estril 9 0,2 ml de gua de diluio
esterilizada. Em seguida, deve-se misturar bem.
Para obter uma segunda diluio 10
-2
preciso transferir assepticamente 1 ml
da primeira diluio 10
-1
para 9 0,2 ml do mesmo diluente. Para mais diluies
subseqentes proceder de maneira similar.
Nota: assepticamente = bancada sanitizada; utilizao de luvas, mscara e
toca; chama do bico de Bunsen prxima de onde est se realizando a
tcnica.





3.2. Tcnica dos tubos mltiplos

Essa tcnica dividida em trs etapas: presuntiva, confirmativa e completa.
Esta ltima, porm opcional e muitos laboratrios terminam a anlise na fase
confirmativa (SILVA et al, 2010).

3.2.1. Preparao do meio de cultura

O meio de cultura usado na etapa presuntiva o Caldo Lactosado em
concentrao dupla e simples. O Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) tambm pode ser
utilizado nessa primeira fase.
Na fase confirmativa do teste so os usados o Caldo Verde Brilhante Bile 2%
(VB) e o Caldo E. coli (EC).
Na preparao dos meios a seguir voc pode preparar apenas a quantidade
necessria para o uso. Esse valor adquirido aplicando uma regra de trs simples.

3.2.1.1. Caldo Lactosado em concentrao dupla

Pesar 26 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.000 ml de gua destilada. Em
seguida distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos (10 ml em cada
tubo), tampar os tubos. Esterilizar a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante
15 minutos. Aps frio ele pode ser armazenado no refrigerador e vlido por uma
semana.

3.2.1.2. Caldo Lactosado em concentrao simples

Pesar 13 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.000 ml de gua destilada. Em
seguida distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos (10 ml em cada
tubo), tampar os tubos. Esterilizar a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante
15 minutos. Aps frio ele pode ser armazenado no refrigerador e vlido por uma
semana.

3.2.1.3. Caldo VB

Pesar 40 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.000 ml de gua destilada. Em
seguida distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos (10 ml em cada
tubo), tampar os tubos. Esterilizar a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante
15 minutos. Aps frio ele pode ser armazenado no refrigerador e vlido por uma
semana.

3.2.1.4. Caldo EC

Pesar 37 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.000 ml de gua destilada. Em
seguida distribuir em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos (10 ml em cada
tubo), tampar os tubos. Esterilizar a 121 C (1 Kg/cm2 de presso) em autoclave durante
15 minutos. Aps frio ele pode ser armazenado no refrigerador e vlido por 96 horas.

3.2.2. Fase Presuntiva

3.2.2.1. Material

Tubos de ensaio com caldo lactosado de concentrao dupla
Tubos de ensaio com caldo lactosado de concentrao simples.
Estante para tubo de ensaio.
Pipeta graduada de 10 mL.
Pipeta graduada de 1 mL.
Bico de Bunsen ou lamparina a lcool.
Estufa bacteriolgica.

3.2.2.2. Procedimento

Tomar uma bateria contendo 15 tubos de ensaio distribudos de 5 em 5; nos
primeiros 5 tubos, (os que contm caldo lactosado de concentrao dupla) inocular
assepticamente com pipeta esterilizada, 10 ml da amostra de gua a ser examinada, em
cada tubo (Diluio 1:1); nos 10 tubos restantes (os que contm caldo lactosado de
concentrao simples), inocular assepticamente nos 5 primeiros, 1 ml da amostra
(Diluio 1:10) e nos 5 ltimos tubos, inocular 0,1 ml da amostra, em cada tubo
(Diluio 1:100).
Incubar a 35 0,5 C durante 24/48 horas.
Se no final de 24/48 horas, houver a formao de gs dentro do tubo de
Durhan, significa que o teste Presuntivo foi positivo, ou seja, considerada suspeita
(presuntiva) a presena de coliformes. Neste caso, fazer o teste confirmativo. Se no
houver a formao de gs durante o perodo de incubao, o exame termina nesta fase e
o resultado do teste considerado negativo.

3.2.3. Fase confirmativa

3.2.3.1. Material

Tubos de ensaio com VB.
Tubos de ensaio com EC.
Estante para tubo de ensaio.
Ala de platina com cabo de Kolle.
Bico de Bunsen ou lamparina a lcool.
Estufa bacteriolgica.

3.2.3.2. Procedimento

Tomar o nmero de tubos do Teste Presuntivo que deram Positivos (Formao
de gs) nas 3 diluies 1:1; 1:10 e 1:100. Depois tomar igual nmero de tubos contendo
o meio de Cultura Verde Brilhante Bile a 2% e o meio de cultura E. coli. Com a ala de
platina, previamente flambada e fria, retirar assepticamente de cada tubo positivo uma
poro de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio Verde Brilhante.
Repetir o mesmo procedimento com os tubos que contem o meio EC. Esta tcnica
chama-se repicagem.
Incubar durante 24/48 horas a 35 0,5C os tubos que contm o caldo VB. Se
no final desse perodo houver a formao de gs dentro do tubo de Durham o teste
considerado positivo para coliformes totais. Se no houver formao, o teste
considerado negativo.
Os tubos que contm o caldo EC devem ser incubados durante 24 2 horas a
44,5 0,2 C. Se no final de 24 horas ou menos houver a formao de gs, est indicado
a presena de coliformes de origem fecal.

3.2.4. Expresso dos resultados

Os resultados so expressos em N.M.P (Nmero Mais Provvel) /100 ml de
amostra. Para se determinar o N.M.P, verifica-se a combinao formada pelo nmero de
tubos positivos que apresentaram as diluies 1:1; 1:10 e 1:100 no Teste Confirmativo.
Exemplo:
nos 5 tubos da diluio 1:1, obtiveram-se 3 tubos positivos;
nos 5 tubos da diluio 1:10, obtiveram-se 2 tubos positivos;
nos 5 tubos da diluio 1:100, obteve-se 1 tubo positivo;
Formou-se, portanto, a combinao 3-2-1 e determina-se o N.M.P consultando
a tabela 1 (ver em Anexos) de acordo com essa combinao.
Se no quiser trabalhar com 15 tubos para determinar o NMP fazer apenas 5
tubos na diluio 1:1 (10 ml do meio de cultura + 10 ml da amostra) e calcular o NMP
consultando a tabela 2 (ver em Anexos).
Essas tabelas podem ser usadas para os resultados de coliformes totais (VB) e
coliformes termotolerantes (EC).
Se a amostra estiver sido diluda o resultado da tabela precisa ser corrigido.
Voltando ao exemplo anterior, ao olhar a tabela veramos que a combinao 3-2-1
indica 17 bactrias/100 ml, mas se a amostra estiver sido diluda a 10
-1
, antes de ser
inoculada, esse resultado precisa ser multiplicado por 10 e, portanto a amostra analisada
contm 170 bactrias/100 ml.




3.3. Tcnica da membrana filtrante

3.3.1. Preparao do meio de cultura

O Caldo m-FC com adio de cido Roslico o meio de cultura usado para a
determinao de coliformes termotolerantes. Em substituio ao Caldo m-FC pode ser
usado o gar m-FC.
O M ENDO MF usado em coliformes totais. O gar M-Endo LES pode
substitu-lo.
Na preparao dos meios a seguir voc pode preparar apenas a quantidade
necessria para o uso. Esse valor adquirido aplicando uma regra de trs simples.


3.3.1.1. Caldo m-FC

3.3.1.1.1. Material

Meio de cultura desidratado (Caldo M FC);
gua destilada;
cido roslico a 1% em NaOH 0,2 N.
Frasco Erlenmeyer de 125 ml.
Vidro de relgio
Bico de Bunsen ou lamparina a lcool.

3.3.1.1.2. Procedimento

Pesar 3,7 gramas do meio desidratado;
Transferir para o Erlenmeyer;
Dissolver o meio pesado, em 100 ml de gua destilada;
Adicionar 1 ml da soluo de cido roslico a 1%;
Aquecer at a ebulio;
Deixar esfriar;
Para preparar o cido roslico a 1% dissolver 1 grama do cido em 100 ml de
NaOH 0,2 N;
Para preparar o NaOH 0,2 N diluir 20 ml da soluo 1N para 100 ml de gua
destilada.

3.3.1.2. Caldo M ENDO MF

3.3.1.2.1. Material

Meio de cultura desidratado (M ENDO MF);
gua destilada;
lcool etlico a 95%;
Frasco Erlenmeyer de 125 ml;
Vidro de relgio;
Bico de Bunsen ou lamparina a lcool.

3.3.1.2.2. Procedimento

Pesar 4,8 gramas do meio desidratado;
Transferir para o Erlenmeyer;
Adicionar aos poucos 100 ml de gua destilada contendo 2 ml de lcool etlico a
95%;
Aquecer em banho-maria ou no bico de Bunsen at o incio da fervura (no
deixar ferver);
Deixar esfriar;


3.3.2. Material do ensaio

Conjunto de filtrao esterilizado (holder).
Meios de cultura: Caldo m-FC com adio de cido Roslico (para coliformes
fecais) e M ENDO MF para coliformes totais.
Bquer esterilizado.
Placas de Petri esterilizadas.
Membranas de 47 mm de dimetro, porosidade de 0,45, brancas e
quadriculadas.
Proveta de 100 ml estril.
Pina.
Bomba de vcuo.
Estufa bacteriolgica a 45 0,5C e 35 0,5C.
Contador de colnias.

3.3.3. Procedimento do ensaio

Com a pina, colocar cuidadosamente na placa de Petri um carto absorvente.
Com pipeta esterilizada colocar 2 ml de Caldo m-FC (coliformes termotolerantes) ou
1,8 ml de Caldo M ENDO MF (coliformes totais) no carto absorvente e tampar a placa.
Colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a pina previamente
flambada e fria.
Agitar o frasco contendo a amostra, pelo menos 25 vezes, destampar e flambar
a boca do frasco.
Medir 100ml num proveta estril e verter cuidadosamente no copo do conjunto
de filtrao, evitando respingos.
Ligar a bomba de vcuo (seringa) e fazer a suco. Desligar a bomba de vcuo
antes que a membrana seque excessivamente. As bactrias ficam retidas na membrana.
Aps filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes do funil com gua de diluio
estril com pores de 20 ml aplicando vcuo. Aps a lavagem e filtrao, aliviar o
vcuo e remover o funil do suporte.
Com a pina flambada e fria, remover o filtro do suporte e coloc-lo na placa
de Petri, antes preparada, com o lado quadriculado para cima. Tampar a placa de Petri e
incub-la invertida a 35 C durante 24 2 horas (placas com meio M ENDO MF, para
coliformes totais) e a 44,5 0,2 C durante 24 2 horas (placas com meio m-FC, para
coliformes termotolerantes).
Todos os procedimentos de transferncia, filtrao e inoculao, devem ser
realizados de acordo com as medidas asspticas j citadas em nota no item 3.1.

3.3.4. Contagem das colnias

Aps o perodo de incubao retirar as placas de Petri da estufa, coloc-las
sobre uma bancada limpa e proceder contagem das colnias com o auxlio de um
contador de colnias
Contar apenas as colnias tpicas, ou seja, as colnias de bactrias de
coliformes (ver tabela 3).

Meio de cultura Grupo Caracterstica das colnias
M ENDO MF Coliformes totais Cor rosa ou vermelha com
brilho metlico
caracterstico
m-FC Coliformes termotolerantes Cor Azul
Tabela 3 Caracterstica tpica das colnias

As colnias indicativas de Coliformes termotolerantes aparecem de cor azul.
As no coliformes, aparecem em colorao clara ou rsea.
As colnias indicativas de Coliformes Totais tpicas tm uma cor rosa a
vermelho escuro, com brilho metlico. O brilho pode aparecer no centro ou na periferia
da colnia. As no coliformes aparecem com colorao vermelho-clara ou escura sem o
brilho metlico caracterstico.
s vezes, quando o disco est muito mido e a fonte de luz muito intensa, as
colnias de no Coliformes podem aparecer com um brilho falso, causando erros. Isto
poder ser contornado usando-se fonte de luz mais difusa ou secando-se o filtro antes de
ser examinado.

3.3.5. Clculo dos resultados

Nas sistuaes normais, em que so filtrados 100 ml da amostra, o nmero de
unidades formadoras de colnias (UFC) / 100 ml da amostra dado diretamente pelo
nmero de colnias presentes.
Exemplo 1: Foram contadas 40 colnias de coliformes fecais em uma
membrana, cujo volume de gua filtrado foi 100 ml, ento o resultado se d: 40
UFC/100 ml.
Se for filtrado um volume diferente de 100 ml, considerar o volume no clculo
do resultado. Nesse caso, o nmero de UFC/100 ml dado pela seguinte frmula:
UFC/100 ml = __N de colnias tpicas x 100___
Volume da amostra que foi filtrado
Exemplo 2: Foram contadas 30 colnias de coliformes fecais em uma
membrana, cujo volume de gua filtrado foi 15 ml, ento o resultado se d:
30 x 10 = 200 UFC/100 ml
15

3.4. Tcnica do Substrato Definido

Essa tcnica pode ser executada de trs maneiras: atravs dos tubos mltiplos e
da contagem Quanty-Tray onde se pode identificar e quantificar a presena dos
Coliformes por meio da tabela do N.M.P. ou a partir do procedimento P/A onde se pode
apenas identificar a presena ou no de bactrias do grupo Coliforme.

3.4.1. Substrato

um meio de cultura base da combinao de substratos que foi desenvolvido
pela Colilert and Colilert MW, Idexx Laboratries, Inc. Westbrook, Maine.
So usados dois substratos:
Substrato cromognico: ONPG (Orto-nitrofenol -D-galactopiranosdeo);
Substrato fluorescente: MUG ( D-glucoronido-4-metil-umbeliferona).
Quando se inocula o meio em uma amostra de gua que contem Coliformes
totais e E. coli ocorrem as seguintes reaes:
O grupo dos Coliformes Totais definido como todas as bactrias possuidoras
da enzima -galactosidase, que quebra o substrato cromognico ONPG (orto-nitrofenil-
-galactopiranosdeo) resultando na liberao do cromgeno de cor amarela,
denominado ortonitrofenol.
A bactria Escherichia coli d uma resposta positiva igual para os coliformes
totais e ainda possui a enzima -glucoronidase, a qual cliva o substrato fluorgeno
MUG ( D-glucoronido-4-metil-umbeliferona), resultando na liberao do fluorgeno
4-metilumbeliferona que emite cor fluorescente sob a luz ultravioleta.

3.4.2. Procedimento

3.4.2.1. P/A

Indica a presena/ ausncia em 100 ml adicionando o substrato enzimtico a
100 ml da amostra de gua numa garrafa ou frasco de vidro no fluorescente. O meio
desidratado estril comercializado em ampolas, na quantidade necessria para 100 ml
da amostra.
Agitar levemente a soluo, no precisa dissolver totalmente, essa dissoluo
ocorrer normalmente.
Incubar a 35C durante 24 horas.

3.4.2.2. Tubos mltiplos

Indica o nmero mais provvel (NMP) em 100 ml, fracionando-se e
adicionando assepticamente os 100 ml em 10 alquotas de 10 ml.
Incubar a 35C durante 24 horas.
3.4.2.3. Contagem Quanty-Tray

Assepticamente adicionar o substrato 100 ml da amostra de gua e transferir
para cartelas de quantificao Quanty-Tray 200 ou Quanty-Tray 2000.
Selar a cartela em seladora prpria e levar a cartela para incubao 35C por
18 ou 24 horas.

3.4.3. Resultados

Aps o perodo de incubao fazer a contagem das cubetas (Quanty-Tray) ou
tubos (tubos mltiplos) amarelos (= colifiormes totais) e fluorescentes (= E. coli). Para
quantificao utilizar a tabela do NMP (em Anexos). Os frascos do procedimento P/A
seguem o mesmo padro: quando amarelos indicam a presena de coliformes totais e
quando fluorescentes a presena da bactria E. coli. Dependendo do resultado, ele deve
ser relatado como presente ou ausente em 100 ml da amostra.
A anlise de fluorescncia deve ser realizada usando uma lmpada ultravioleta
de longo comprimento de onda (366nm).

4. Consideraes Finais

Como j foi falado, as bactrias do grupo coliforme tm um papel principal
como indicador da qualidade da gua, por essa razo, a gua, para ser considerada
prpria para o consumo humano, precisa passar por peridicos e sistemticos processos
de anlises para avaliao e quantificao da presena desses microrganismos.
Esse fator faz com que as anlises de coliformes se destaquem como as mais
executadas na maioria dos laboratrios de gua. Por esse motivo esses laboratrios
tendem a buscar metodologias que demandem menos tempo, sejam eficientes e precisas,
facilitem, e barateiem os custos.
Dentre as metodologias aqui descritas, no se pode deixar de dar destaque a
tcnica do substrato definido, que atende os itens almejados pelos laboratrios de
maneira muito satisfatria: rpida, eficiente, precisa, de fcil execuo e relativamente
barata se comparada a outras anlises. Nela as duas reaes especficas para coliformes
e coliformes fecais, so visualizadas simultaneamente, enquanto que nas metodologias
empregadas pelo mtodo tradicional, cada reao ocorre separadamente, levando o
dobro do tempo para a verificao do resultado. Alm disso, a tcnica do substrato
definido apresenta mais clareza e preciso nos resultados.
J o mtodo dos tubos mltiplos mais trabalhoso para ser executado, pois
requer a preparao e esterilizao dos caldos de cultura. Necessita, portanto, de um
laboratrio equipado com autoclave, vidrarias e outros equipamentos, alm de tcnicos
bem treinados (BETTEGA, J. M. P. R. et al et al,2006).
A tcnica da membrana filtrante, por sua vez, ganha em alguns aspectos do
mtodo dos tubos mltiplos, aspectos que j foram citados na introduo. Ela, porm se
demonstra to trabalhosa quanto, exigindo tambm uma boa preparao do laboratorista
para ser executada.
Apesar das discrepncias, as trs tcnicas so comprovadamente eficientes
quanto ao resultado final. Alm disso, o sucesso de uma metodologia depende da
adequao do laboratrio a ela.

5. Referncias

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Qualidade microbiolgica da gua. Disponvel em
<http://www.esac.pt/Abelho/MicroAmbiental/Protocolos%20MA%5B3%5D_2010_201
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melhorar a qualidade dos recursos hdricos / Agncia Nacional de guas; Programa das
Naes Unidas para o Meio Ambiente Braslia: ANA, 2011.

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SILVA, N. da; AMSTALDEN, V.C. Manual de Mtodos de Anlise
Microbiolgica de Alimentos e gua. So Paulo: Livraria Varela Editora, 2010.

6. Anexos



Tabela 1 do NMP com limite de confiana de 95% para
vrias combinaes de resultados positivos quando 5 tubos
so usados para cada diluio (10 ml, 1,0 ml e 0,1 ml)

Tabela 2 do NMP com limite de confiana de 95% para
os resultados positivos quando 5 pores de 10 ml so
examinadas