La hemofilia B Leyden y mutaciones cis - reguladores antiguamente misteriosas

La hemofilia B es un clsico, la coagulacin de la sangre es una enfermedad

monognica causada por mutaciones en el factor de coagulacin
IX ( F9 ) locus . Aunque la interpretacin de mutaciones dentro del
gen en s mismo ha sido relativamente sencillo , atribuyendo
mecanismos moleculares a la suite completa de mutaciones, dentro de la regin
del promotor ha demostrado ser un tanto difcil y se ha logrado recientemente.
Estas mutaciones, que estn agrupadas en el factor de transcripcin discreto a
sitios de unin, dinmicamente cambian la expresin del desarrollo de F9 de
diferentes formas. Ellos ilustran cmo mutaciones de un solo nucletido en las
regiones cis-regulador puede tener ramificaciones drsticas para el control de la
expresin del gen y en algunos casos ser causante de la enfermedad
Aqu presentamos el promotor F9 humano como ejemplo de modelo para que la
cartografa mutacin saturacin ha puesto de manifiesto los mecanismos de su
regulacin. Por otra parte ,sugerimos que el creciente nmero de genomewide
estudios de la actividad del factor de transcripcin se acelerar tanto el
descubrimiento y la comprensin de regulador polimorfismos y mutaciones .

Polimorfismos de un solo nucletido (SNPs) en regulador
regiones son una fuerza impulsora en la evolucin

Los avances tecnolgicos que facilitan la recopilacin de datos puede
tener efectos profundos . La secuenciacin del genoma revel por primera vez
que , al contrario de algunas expectativas , el genoma humano
no contiene mucho ms genes que otros organismos
[ 1,2 ] . Ms recientemente, como las tecnologas de secuenciacin a gran escala
han progresado , los estudios de asociacin de genoma completo ( GWAS )
han revelado que una gran proporcin de potencialmente funcional
SNPs no residen en regiones codificantes , pero se encuentran aguas arriba
o aguas abajo de los genes en lo que puede ser regulador
regiones . En la actualidad se piensa generalmente que las diferencias fenotpicas
,
no slo entre especies , sino tambin entre los individuos ,
son en gran parte debido a la diferencia de los perfiles de expresin de genes
que surgen de cis-regulador mutaciones [3-5] . De hecho , en
factor de ocupacin de los seres humanos , la expresin de genes y transcripcin
diferir considerablemente entre los individuos , debido en parte
de SNPs y las variaciones genticas en las regiones reguladoras
[ 6,7 ] . La comprensin de cmo regulador SNPs y mutaciones funcionan y
afectan a la expresin de sus genes diana tiene
por lo tanto convertido en una prioridad en la biologa.
Sorprendentemente, sin embargo, aunque muchos SNPs
se han identificado en las regiones reguladoras putativas , que tiene
menudo result difcil determinar su mecanismo de
accin o incluso para estar seguro de que son funcionalmente impor -
tantes cambios , en lugar de simplemente marcadores que estn vinculados
a an por descubrir mutaciones funcionales [ 8,9 ] . muchos
investigadores pueden sentirse decepcionados por la aparente lentitud
tasa de progreso . En esta revisin se cubre 20 aos de
anlisis de variantes de un solo nucletido en la coagulacin
promotor del factor IX ( F9 ) proximal para proporcionar una sorprendente
ejemplo de lo difcil que se ha de definir el meca-
nismo por el cual tales mutaciones operan . Lo ms importante ,
sugerimos que los actuales avances en nuestra comprensin de
factores de transcripcin y sus sitios de reconocimiento , en particular
derivados de la secuenciacin de inmunoprecipitacin de la cromatina
( Chip- Seq ) los estudios , pueden acelerar rpidamente
progreso.


La hemofilia B Leyden : una enfermedad gentica inusual que
resuelve despus de la pubertad

La hemofilia B se vincula X -an, hered trastorno hemorrgico
que resulta de mutaciones en el gen F9 y fue primero
reconocido como una condicin distinta de la hemofilia A
( otra enfermedad ligada al cromosoma X ) en la dcada de 1950 [ 10 ] . En 1970,
un
forma particularmente inusual de la hemofilia B se describe
en los Pases Bajos [ 11 ] . Este subtipo de la enfermedad , denominada
hemofilia B Leyden, fue notable en el de los afectados
machos exhiben sntomas en la niez , pero poco a poco
mejorado, y, a menudo recuperado clnicamente , despus de la pubertad
[ 12 ] . A lo largo de los aos 1980 y 1990 fami - independiente
mentiras de muchos pases tambin fueron identificados con hemo -
filia B , que se resolvi despus de la pubertad [ 13-26 ] . Hoy ms
de 100 casos de hemofilia B Leyden se han reportado
[ 27,28 ] .
La secuenciacin de la regin de codificacin F9 , los sitios de empalme , y
regiones de regulacin aguas arriba de familias con Leydenlike
sntomas identificaron mutaciones puntuales en el proximal
promotor [ 15,16,18,20,21,23,25,26,29,30 ] . Ms de 20 diferentes
mutaciones puntuales se han identificado , en la agrupacin
tres regiones : uno alrededor de 20 pb aguas arriba de los principales
sitio de inicio de transcripcin (TSS , 1 ); uno a -5 ; y la tercera
inmediatamente aguas abajo de la SAT , en torno a 10
( Figura 1 ) . Estos sitios fueron reconocidos inmediatamente como
elementos reguladores potenciales . Se plante la hiptesis de que
cada grupo de mutaciones interrumpe el sitio de unin para un
protena activadora de la transcripcin y de ese modo la alteracin
la expresin del gen F9 , al menos hasta la pubertad .
Estas mutaciones son de particular inters en que
demostraron cmo las mutaciones puntuales individuales podran
asociarse con profundas alteraciones en el desarrollo
tiempo mental de la expresin gnica . Cada uno de estos un solo
mutaciones de nucletidos es suficiente para cambiar de un gen
que se expresa a lo largo de la vida slo despus de la pubertad
( Figura 2 ) .

Mapeando el promotor F9 en vivo a travs de forma natural
ocurren , mutaciones de un solo nucletido

La bsqueda de los factores de transcripcin que se unen a los tres
elementos funcionales reguladores cis en el promotor F9
comenz a finales de 1980 en el momento en que el primero de los mamferos
se estn identificando factores de transcripcin . F9 es
expresado principalmente en los hepatocitos , y porque el hgado
es grande y relativamente homognea que era un modelo adecuado
rgano para los estudios iniciales en la purificacin del factor de transcripcin .
Varios grupos tuvieron xito en la identificacin , purificacin ,
y en ltima instancia, la clonacin de los ADNc de hgado especficos
Protenas de unin al ADN [ 31,32 ] . Fue posible definir
aproximar , aunque , secuencias de consenso imperfectas para
estos factores de transcripcin y , en consecuencia , algunos DNAbinding
protenas se identificaron como candidatos que podran
regular el gen F9 . La primera candidata ensayada fue la
CCAAT protena cremallera de leucina / potenciador de unin protena al
(C / EBPA ), que se sabe que se une la TTGNNCAA sitio,
una secuencia que es similar a la regin 10 de la F9
promotor ( Figura 1 ) .
Se encontr que el C / EBPA enlazado a la regin 10 y
que las mutaciones asociadas con la expresin del gen F9 reducida
antes de la pubertad interrumpido de unin [ 17 ] . estudios posteriores
en ratones knockout C / EBPA , cuando estuvieran disponibles ,
confirm que C / EBPA se requiere funcionalmente para
los niveles normales de expresin F9 [ 33 ] .
El siguiente factor de transcripcin fue investigado hepatocitos
el factor nuclear 4 ( HNF4 ) . El gen se clon en Hnf4
la dcada de 1990 [ 32 ] y la protena purificada se muestran a
unirse a la regin -20 del promotor F9 y para activar
el promotor de reportero ensayos [34,35] . Una vez ms , la conocida
mutaciones interrumpidos transactivacin de unin e inhibido
por HNF4 , lo que confirma que se requiere funcionalmente para
la expresin gnica .

Polimorfismos de un solo nucletido (SNPs) en regulador
regiones son una fuerza impulsora en la evolucin

Los avances tecnolgicos que facilitan la recopilacin de datos puede
tener efectos profundos. La secuenciacin del genoma revel por primera vez
que, al contrario de algunas expectativas, el genoma humano
no contiene mucho ms genes que otros organismos
[1,2]. Ms recientemente, como las tecnologas de secuenciacin a gran escala
han progresado, los estudios de asociacin de genoma completo (GWAS)
han revelado que una gran proporcin de potencialmente funcional
SNPs no residen en regiones codificantes, pero se encuentran aguas arriba
o aguas abajo de los genes en lo que puede ser regulador
regiones. En la actualidad se piensa generalmente que las diferencias fenotpicas,
no slo entre especies, sino tambin entre los individuos,
son en gran parte debido a la diferencia de los perfiles de expresin de genes
que surgen de cis-regulador mutaciones [3-5]. De hecho, en
factor de ocupacin de los seres humanos, la expresin de genes y transcripcin
diferir considerablemente entre los individuos, debido en parte
de SNPs y las variaciones genticas en las regiones reguladoras
[6,7]. La comprensin de cmo regulador SNPs y mutaciones funcionan y afectan
a la expresin de sus genes diana tiene
por lo tanto convertido en una prioridad en la biologa.
Sorprendentemente, sin embargo, aunque muchos SNPs
se han identificado en las regiones reguladoras putativas, que tiene
menudo result difcil determinar su mecanismo de
accin o incluso para estar seguro de que son funcionalmente impor-
tantes cambios, en lugar de simplemente marcadores que estn vinculados
a an por descubrir mutaciones funcionales [8,9]. Muchos
investigadores pueden sentirse decepcionados por la aparente lentitud
tasa de progreso. En esta revisin se cubre 20 aos de
anlisis de variantes de un solo nucletido en la coagulacin
promotor del factor IX (F9) proximal para proporcionar una sorprendente
ejemplo de lo difcil que se ha de definir el meca-
nismo por el cual tales mutaciones operan. Lo ms importante,
sugerimos que los actuales avances en nuestra comprensin de
factores de transcripcin y sus sitios de reconocimiento, en particular
derivados de la secuenciacin de inmunoprecipitacin de la cromatina
(chip-Seq) los estudios, pueden acelerar rpidamente
progreso.


La hemofilia B Leyden: una enfermedad gentica inusual que
resuelve despus de la pubertad

La hemofilia B se vincula X-an, hered trastorno hemorrgico
que resulta de mutaciones en el gen F9 y fue primero
reconocido como una condicin distinta de la hemofilia A
(Otra enfermedad ligada al cromosoma X) en la dcada de 1950 [10]. En 1970, un
forma particularmente inusual de la hemofilia B se describe
en los Pases Bajos [11]. Este subtipo de la enfermedad, denominada
hemofilia B Leyden, fue notable en el de los afectados
machos exhiben sntomas en la niez, pero poco a poco
mejorado, y, a menudo recuperado clnicamente, despus de la pubertad
[12]. A lo largo de los aos 1980 y 1990 fami-independiente
mentiras de muchos pases tambin fueron identificados con hemo-
filia B, que se resolvi despus de la pubertad [13-26]. Hoy ms
de 100 casos de hemofilia B Leyden se han reportado
[27,28].
La secuenciacin de la regin de codificacin F9, los sitios de empalme, y
regiones de regulacin aguas arriba de familias con Leydenlike
sntomas identificaron mutaciones puntuales en el proximal
promotor [15,16,18,20,21,23,25,26,29,30]. Ms de 20 diferentes
mutaciones puntuales se han identificado, en la agrupacin
tres regiones: uno alrededor de 20 pb aguas arriba de los principales
sitio de inicio de transcripcin (TSS, 1); uno a -5; y la tercera
inmediatamente aguas abajo de la SAT, en torno a 10
(Figura 1). Estos sitios fueron reconocidos inmediatamente como
elementos reguladores potenciales. Se plante la hiptesis de que
cada grupo de mutaciones interrumpe el sitio de unin para un
protena activadora de la transcripcin y de ese modo la alteracin
la expresin del gen F9, al menos hasta la pubertad.
Estas mutaciones son de particular inters en que
demostraron cmo las mutaciones puntuales individuales podran
asociarse con profundas alteraciones en el desarrollo
tiempo mental de la expresin gnica. Cada uno de estos un solo
mutaciones de nucletidos es suficiente para cambiar de un gen
que se expresa a lo largo de la vida slo despus de la pubertad
(Figura 2).

Mapeando el promotor F9 en vivo a travs de forma natural
ocurren, mutaciones de un solo nucletido

La bsqueda de los factores de transcripcin que se unen a los tres
elementos funcionales reguladores cis en el promotor F9
comenz a finales de 1980 en el momento en que el primero de los mamferos
se estn identificando factores de transcripcin. F9 es
expresado principalmente en los hepatocitos, y porque el hgado
es grande y relativamente homognea que era un modelo adecuado
rgano para los estudios iniciales en la purificacin del factor de transcripcin.
Varios grupos tuvieron xito en la identificacin, purificacin,
y en ltima instancia, la clonacin de los ADNc de hgado especficos
Protenas de unin al ADN [31,32]. Fue posible definir
aproximar, aunque, secuencias de consenso imperfectas para
estos factores de transcripcin y, en consecuencia, algunos DNAbinding
protenas se identificaron como candidatos que podran
regular el gen F9. La primera candidata ensayada fue la
CCAAT protena cremallera de leucina / potenciador de unin protena al
(C / EBPA), que se sabe que se une la TTGNNCAA sitio,
una secuencia que es similar a la regin 10 de la F9
promotor (Figura 1).
Se encontr que el C / EBPA enlazado a la regin 10 y
que las mutaciones asociadas con la expresin del gen F9 reducida
antes de la pubertad interrumpido de unin [17]. Estudios posteriores
en ratones knockout C / EBPA, cuando estuvieran disponibles,
confirm que C / EBPA se requiere funcionalmente para
los niveles normales de expresin F9 [33].
El siguiente factor de transcripcin fue investigado hepatocitos
el factor nuclear 4 (HNF4). El gen se clon en Hnf4
la dcada de 1990 [32] y la protena purificada se muestran a
unirse a la regin -20 del promotor F9 y para activar
el promotor de reportero ensayos [34,35]. Una vez ms, la conocida
mutaciones interrumpidos transactivacin de unin e inhibido
por HNF4, lo que confirma que se requiere funcionalmente para
la expresin gnica.

El mecanismo de recuperacin de la hemofilia B despus de
pubertad

Por la misma poca, los investigadores comenzaron a investigar la
causa del aumento de la expresin de F9 en pacientes Leyden
despus de la pubertad. El anlisis sistemtico de la hemofilia B
pacientes mediante la secuenciacin del gen F9 identificaron otro
nuevo subtipo de la enfermedad, denominada hemofilia B Branden-
burg [35]. Los individuos afectados presentaron hemorrgico
sntomas durante toda la vida y se exhiben los niveles muy bajos de
F9. Se encontr que las regiones normales de codificacin F9 y
los sitios de empalme, pero llevado a mutaciones en la posicin -26 en el
promotor proximal (Figura 1) [27,28,35-39]. Estos Muta-
ciones eran de particular inters en que, a diferencia de todos los dems
mutaciones en el promotor F9, que no se asociaron con
recuperacin espontnea en la pubertad (Figura 2).
Se observ que esta regin del promotor se asemejaba
un elemento de respuesta a andrgenos (ARE), el sitio de unin para los
el receptor de andrgenos (AR) factor de transcripcin. La AR
la protena es una transcripcin zinc dedo de la familia de receptores de esteroides
factor que se une a secuencias de ADN conformes a la
SON consenso y activa la transcripcin en presencia
de testosterona. Se demostr que la AR puede unirse a
la regin -26 y que el Brandenburg hemofilia B
mutaciones alteran la unin [35]. Por consiguiente, era
llegaron a la conclusin de que los pacientes con hemofilia B Brandenburg
hicieron
No recibir un impulso en la expresin F9 despus de la pubertad, debido a
interrupcin de la ARE a -26. Por el contrario, todos los dems
pacientes con mutaciones del promotor que la actividad deteriorados
(Es decir, en torno a -20, -5, y 10) hizo experimentar un aumento
en F9 despus de la pubertad porque sus AREs estaban intactos
y sensible a la testosterona. Por ltimo, cabe sealar
que el ARE se solapa parcialmente con el elemento de HNF4
a -20 (Figura 1). Como tales, las mutaciones Brandenburg
abolir ambos sitios y la inhibicin de la unin de
HNF4 y AR juntos se cree que causa una forma de
hemofilia que no puede ser resuelto por la testosterona [38].
Adems de las mutaciones -26 Brandenburgo, dos adicionales
Se han notificado mutaciones en -23 y -24, y
Estos tambin se predicen para interrumpir tanto la AR y HNF4
sitios (Figura 1). Estos pacientes tambin seran no espera
para recuperarse despus de la pubertad, pero hasta donde sabemos esto no
tiene
sido confirmada por anlisis longitudinal [28,40]. La importancia de una intacta SE
a -26 es tambin coherente
con la observacin de que la administracin de testosterona
y los esteroides anablicos es suficiente para elevar F9
expresin en un paciente pre-pubescente de Leyden [13]. Ms
Recientemente, un caso ha sido reportado en la cual un individuo
con hemofilia B Leyden estaba utilizando esteroides anablicos
para la mejora de atltico [41]. Cuando este individuo
descontinuado el uso de esteroides a sus niveles F9 declin.
En conjunto, estos estudios proporcionan una fuerte evidencia de que los
andrgenos
estn involucrados en el aumento de F9 observado en la hemofilia
Pacientes B Leyden despus de la pubertad.
La observacin de que los andrgenos afectar los niveles F9 en
Pacientes Leyden plantea la cuestin de si los esteroides sexuales
normalmente jugar un papel en la regulacin fisiolgica de F9
expresin. La visin alternativa es que la ARE es normalmente
en gran medida no slo se convierte en funcional y significativa
cuando el promotor F9 se ve comprometida por la mutacin en
los -20, -5, o 10 pginas. Aunque esta cuestin es difcil
para resolver observamos que la ARE no se conserva en otros
mamferos, por ejemplo en el ratn. Adems, en contraste
a los pacientes Leyden, los niveles de F9 en machos normales no lo hacen
aumentar dramticamente despus de la pubertad (Figura 2) [42] y son
similares a los encontrados en las mujeres [43]. Por lo tanto parece bastante
posible que la ARE es normalmente un elemento no funcional
que se ha convertido en importante slo en el contexto de la hemofilia
B Leyden. Si este es el caso, es una excelente
ejemplo de cmo los diferentes patrones de desarrollo y
regulacin sensible a hormonas puede evolucionar en diferentes especies,
e incluso de personas diferentes en la misma especie, a travs de
mutaciones muy sutiles que, bsicamente, desenmascaran consenso
sitios que pueden estar presentes por casualidad de unin.

La pieza final del rompecabezas

Dado que el mecanismo por el cual el -20 y 10 punto
racimos de mutacin operados, y que la contabilidad defecto
para la hemofilia B Brandenburgo se explica todo en la dcada de 1990, se podra
haber esperado que la transcripcin
factor de unin para el tercer grupo de mutaciones, los
ah -5, tambin se encontrara rpidamente. El mpetu
para encontrar esta protena fue particularmente fuerte debido a que el -5
cmulo de mutaciones representa alrededor de la mitad de los casos de hemofilia
Pacientes B Leyden [27,28]. La regin -5 contiene un
Sitios dinucletidos CpG y tales haban observado en el momento
ser hotspots mutacionales en el gen F9 y otros loci [44].
Por otra parte, las diversas mutaciones en este sitio se asocian
con diferentes niveles de gravedad de la enfermedad [18,19,21,28], y por lo tanto
la comprensin de sus mecanismos de accin era de algunos
inters. Sin embargo, a pesar de un inters significativo por
investigadores, no se hizo ningn progreso durante ms de 20 aos,
ilustra lo difcil que puede ser para determinar el mecanismo
por el cual regulador SNPs y mutaciones afectan a la
la expresin de los genes cercanos.
El -5 rompecabezas fue resuelto finalmente por dos grupos simultneamente
quien recientemente public sus resultados en conjunto [45].
El progreso en varios frentes prepar el terreno para la
avanzar. La clonacin de virtualmente todas las protenas de unin al ADN
y el advenimiento de ChIP-Seq eran fundamentales para la
avance. Hace veinte aos, no todo el ADN vinculante
protenas haban sido identificados, y que por lo tanto no era
posible probar todos los factores candidatos. Ahora, ms que
1.500 factores de transcripcin humanos putativos se conocen
[46] y anlisis sistemtico, a pesar de ser de trabajo intensivo,
es por lo menos posible [47,48]. Los datos de la Seq-chip para la
factor de transcripcin ONECUT1 (tambin conocido como hepatocitos
factor nuclear 6, HNF6) jug un papel decisivo en lo que sugiere que
como un candidato para la unin al elemento de -5 en el F9
promotor [49]. Adems, los datos Chip-a-chip siempre
evidencia de que (en el ratn por lo menos) ONECUT1 ocupada
el promotor proximal del gen F9 en hepatocitos [50].
Estudios-chip Sec. extensos han demostrado que
ONECUT1 se une especficamente a la regin -5 de la F9
promotor en hepatocitos humanos [45] (Figura 1). ONECUT1
funcionalmente activa el promotor de reportero de expe-
mentos, y los embriones de ratn knockout deficientes en
ONECUT1 han reducido los niveles de F9 [45]. Curiosamente,
el factor relacionado ONECUT2 tambin se une el sitio -5
in vitro y estudios sobre Onecut1/Onecut2 doble knockout
embriones confirmaron que cuando ambas protenas estn ausentes
el locus F9 es prcticamente silencioso [45].
Es importante destacar que las diversas mutaciones se encuentren dentro del -5
Cluster todo perturbar la unin de los factores Onecut
in vitro e inhibir la transactivacin en ensayos celulares
[45]. Curiosamente, el grado de inhibicin vara, y
existe un amplio acuerdo entre la severidad de la hemofilia
y el grado en que los interrumpe mutacin
de unin. Hay que subrayar, sin embargo, que adicional
factores, tales como otros gentica, epigentica, o ambiental
efectos, tambin pueden influir en los sntomas - y por lo tanto la clnica
gravedad de la hemofilia B no se puede predecir de forma fiable
conocimiento puramente a travs de la mutacin.

El gen F9: mapeo de saturacin de un promotor humana

El gen F9 fue uno de los primeros genes humanos aislados y
desde entonces ms de 1.000 mutaciones diferentes tienen
sido identificados en miles de pacientes en todo el mundo [27,28].
El nmero de mutaciones es tal que es posible que
el gen efectivamente ha sido sometido a mutagnesis de saturacin in vivo y la
mayora de las mutaciones funcionales tener
ahora se ha identificado [40]. El gen F9 codifica una serina
proteasa y muchas mutaciones interfieren con la actividad o
la estabilidad de esta enzima. Otras mutaciones afectan postraduccional
procesamiento, incluyendo la escisin de la pre-y
propptidos, o modificaciones tales como g-carboxilacin o
b-hidroxilacin. Tambin hay mutaciones que afectan a ARN
procesamiento en el nivel de corte y empalme, como en el caso de la "real
enfermedad "que afligi a los descendientes de la reina Victoria [51].
Las 21 mutaciones distintas en el promotor proximal muy
posiblemente identificar todos los elementos esenciales en la reglamentacin
regin. Esto no quiere decir que no hay otros factores de transcripcin
unirse y contribuir a la expresin, sino ms bien que si hay
son otros sitios en el promotor que no estn obligados a
sostener clnicamente niveles pertinentes de F9. Tambin existe la
posibilidad de que haya casos de hemofilia B para los que
ninguna mutacin se ha identificado an, tal vez lo ms probable en
regiones distales que pueden no haber sido objeto de investigacin por
secuenciacin de rutina de la regin de codificacin F9 y promotor.
Estas mutaciones, si existen, pueden un da ser encontrados a
asignar a un promotor esencial o a algn otro gen que es
requerida para la expresin o actividad F9. De hecho, una aguas arriba
regin reguladora parece ser necesario para sostenida
expresin de F9 en ratones transgnicos [52]; Sin embargo, no hay
mutaciones humanas asociadas con hemofilia han sido
reportados en esta regin.

El reto de la asignacin de funciones a los SNPs de reglamentacin
y mutaciones

Histricamente, las mutaciones que causan enfermedades eran frecuentes
descrito en las regiones codificantes de los genes en lugar de en
cis-regulador regiones [8]. Esto fue en parte debido a que el
impacto funcional podra ser mucho ms fcil asignar a
tales mutaciones, sino tambin porque la secuencia de promotor
y elementos potenciadores era raramente una parte de la rutina
pruebas de diagnstico [53]. Por otra parte, las regiones reguladoras de
el genoma eran difciles de definir y no siempre puede ser
pronosticado por la secuencia de conservacin [54-56]. Hoy en da, sin embargo,
mutaciones reguladoras representan una fraccin cada vez mayor
de todas las enfermedades que causan variantes (en la actualidad el 1,9% en el
Human Gene Mutacin base de datos, agosto de 2013 [9,57]).
GWAS y vinculacin anlisis han revelado muchos SNPs
que estn vinculados a una serie de trastornos genticos, y es
espera que muchos de estos tambin influir en la expresin de genes
mediante la interrupcin de sitios de unin de factores de transcripcin
[8]. Ser tambin tomar mucho tiempo para identificar el correspondiente
factores de transcripcin?
En algunos casos se puede. En el caso de la hemofilia B Leyden
el trastorno estaba claramente definido, las mutaciones residan
en el promotor proximal, que se encontraron
repetidamente en pacientes independientes con fenotipos similares,
y por lo general alteran los niveles de expresin F9
por lo menos un orden de magnitud, tanto in vivo como in
ensayos de transfeccin celular in vitro. Por el contrario, muchos
SNPs que estn vinculadas a otros trastornos genticos sern
ms difcil. Algunos residen en potenciadores distal o
cartuchos del silenciador que estn involucrados en las interacciones de largo
alcance
y puede no funcionar correctamente en ensayos de reportero -
y que por lo tanto ser ms difcil de estudiar. Algunos pueden ser gainof-
funcin de las mutaciones que crean nuevo factor de transcripcin
sitios que no ordinariamente ser detectados mediante la unin
Chip anlisis-Seq de tejido de tipo salvaje, como en [58,59]. Otros
tendr efectos sutiles pero clnicamente relevantes que son
difcil de evaluar en un contexto de otra gentica,
epigentica, y los factores ambientales.
Sin embargo, los recientes avances en la definicin tanto de la reglamentacin
componentes del genoma humano, as como la
ocupacin genmico de factores de transcripcin es probable que
acelerar la elucidacin de los mecanismos moleculares por los
que SNPs y mutaciones reguladoras operan. En el
estudios recientes ENCODE, DNasa-Seq se realiz para
una gran variedad de tipos de clulas, destacando las regiones del regulador
potencial [60]. Adems, los experimentos de ChIP-Sec
se llevaron a cabo durante 119 protenas de unin a ADN, ms
la definicin de los de unin al ADN in vivo matrices de preferencia en por
estos factores [48]. Otros avances tcnicos recientes incluyen
mtodos para determinar con precisin la transcripcin de todo el genoma
ocupacin del factor [61], y tcnicas de alto rendimiento
para la validacin funcional de elementos reguladores [62] y
la determinacin del factor de transcripcin de unin a consensos
[47,63].
En conjunto, estos estudios estn informando a nuestra clasificacin
de los segmentos reguladores del genoma. En el
futuro, los SNPs vinculada a condiciones genticas a travs de GWAS
experimentos cada vez ms pueden asignar directamente a las compilaciones
de ChIP-Seq y los datos-DNasa Sec para ver si alguno
residir en, in vivo conocidos sitios de unin para cualquier estudiado
factores de transcripcin en el tejido de inters, como en [64].
Un mejor conocimiento de las matrices para el factor de transcripcin
unin in vivo permitir predicciones sobre si
el SNP no influir significativamente la afinidad de
de unin al factor de transcripcin. El impacto previsto puede
fcilmente ser evaluada por ensayos in vitro de unin al ADN en o,
siempre que sea posible, los estudios-chip Sec en muestras de pacientes.
La mutacin del motivo candidato en vivo ahora pueden ms
ser fcilmente logrado con emergente ingeniera genmica
tecnologas que utilizan las nucleasas de dedos de zinc artificiales, la transcripcin
nucleasas activador de efectores (Talens), y
agrupado repeticin palindrmicas cortas intercaladas reglamentario
Nucleasas (CRISPR) asociados [65]. Verificacin funcional
de la contribucin que el factor de transcripcin hace
a la expresin gnica puede ser probado ya sea por RNAi desmontables
experimentos en ensayos celulares o por examen de
modelos animales knockout, que son cada vez ms disponibles
desde los grandes depsitos (como EUCOMM, http://
www.eucomm.org/; KOMP, https://www.komp.org/; y
MMRRC, http://www.mmrrc.org/).
As, una serie de avances tcnicos significa que es ahora
ms fcil para asignar la funcin a regulador SNPs y mutaciones
de lo que era en el pasado. Hay, sin duda, mltiple
retos que seguirn obstaculizando el progreso. Por ejemplo,
Estudios-chip Sec. han demostrado que la transcripcin
factores se unen tpicamente a miles de sitios del genoma de ancho,
y muchos eventos tal unin se cree que son funcionalmente
insignificante [66]. Por otra parte, eucromtica
regiones cis-reguladoras son frecuentemente co-ocupados por una multitud
de factores de transcripcin [66]. Como tal, exigente
protenas funcionalmente relevantes de los que se unen como un mero
consecuencia de la accesibilidad de la cromatina puede resultar difcil.
Adems, los ensayos de chip-Seq estndar normalmente definen
relativamente amplias regiones de ocupacin que pueden contener
numerosos supuestos sitios de unin para una transcripcin dada
Revise Trends in Genetics 01 2014, vol. 30, N 1
factor de. En tales casos, bona fide sitios de unin especficos podra
slo ser identificado por validacin funcional subsiguiente o por
tcnicas de alta resolucin como chip-exo [61]. Por ltimo,
aunque el nmero de conjuntos de datos ChIP-Seq disponible es
de hecho en aumento, sigue siendo una empresa elaborada para
investigar la cohorte completa de la transcripcin humana FAC-
res a travs de una amplia gama de tipos de clulas que pueden o
no recapitular tpica regulacin gnica in vivo.
Regulacin gnica seguir siendo un sutil y sofisticado
campo, y es inevitable que el mecanismo de accin, y
de hecho, la relevancia funcional, de muchos SNPs y mutaciones
seguir siendo un misterio durante muchos aos por venir.
Sin embargo, los grandes saltos hacia adelante en la tcnica
dos ltimas dcadas indican que el progreso importancia ser
hecho en la comprensin de cmo los genes de enfermedades y otros loci
estn regulados, y proceder ms rpidamente en el futuro.