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LABORATORIO DE
SALUD AMBIENTAL


PROCEDIMIENTO DE ANALISIS PARA
LA NUMERACIN DE Escherichia coli Y COLIFORMES

LSA P5.4-ML05


INDICE

1. OBJETIVO.......................................................................................................... 2

2. ALCANCE ...................................................................................................... 2

3. DOCUMENTOS RELACIONADOS ... ... 2

4. RESUMEN . 2

5. DESARROLLO..... 2

6. FORMULARIOS Y REGISTROS... 4

7. REFERENCIAS.... 4

8. ANEXOS ... 4



FECHA DE APROBACION: 25 de agosto de 2008
FECHA DE REVISION: 25 de agosto de 2008

REVISION: 02














NOMBRE CARGO FIRMA
APROBO

Blga. Soledad Osorio Alva.
Directora del Laboratorio de Salud
Ambiental - DIGESA

REVISO

Blga. Edith Villanueva Huamn
Aseguramiento de calidad. Laboratorio
de Salud Ambiental DIGESA.

Blga. Aydee Valenzuela
Warthon.
Jefe del rea de Microbiologa de
Alimentos. Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.

ELABORO Blga. Patricia Nez Ramos.
Analista del rea de Microbiologa de
Alimentos. Laboratorio de Salud
Ambiental DIGESA.


LABORATORIO DE
SALUD AMBIENTAL
PROCEDIMIENTO DE ANALISIS PARA LA
NUMERACIN DE Escherichia coli y Coliformes

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I OBJETIVO

Describir la metodologa para realizar el ensayo de numeracin de Escherichia coli y Coliformes
de acuerdo con el mtodo oficial AOAC 991.14 mtodo de la lamina rehidratable.

II ALCANCE

Este procedimiento se aplica para realizar el ensayo de numeracin de Escherichia coli y
Coliformes en alimentos y bebidas a travs del mtodo de recuento directo en lmina
rehidratable.

III DOCUMENTOS RELACIONADOS

Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico.
Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de cultivo.
Procedimiento de aseguramiento de la calidad de los resultados.

IV RESUMEN

El mtodo de numeracin de Escherichia coli y Coliformes se basa en la inoculacin de 1 mL de
las diluciones decimales de la muestra o de la suspensin inicial en dos laminas rehidratables
(petrifilm). La incubacin aerbica de las placas se realiza a 35C + 1C durante 24 h + 2 horas
para el recuento de coliformes y de Escherichia coli a 35C + 1C durante 24 h + 2 horas a 48
horas. El clculo del nmero de Escherichia coli y/o de coliformes por mililitro o por gramo, de
muestra proviene de la media obtenida de las placas en la dilucin escogida.

V DESARROLLO

5.1 Medios de cultivo
Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de
alimentos para anlisis microbiolgico.

5.1.1 Placas Petrifilm para recuento de Escherichia coli y Coliformes

5.2 Equipos y Materiales.
Adicionalmente a lo requerido en el Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de
alimentos para anlisis microbiolgico e Instructivo de preparacin y esterilizacin de medios de
cultivo:

5.2.1 Incubadora, para mantenimiento de los medios inoculados, placas y tubos dentro de un rango de
temperatura de 35C 1 C o 37C 1 C.

5.2.2 Pipetas graduadas, serolgicas de vaciado total, capacidad nominal de 1 mL, 2 mL 10 mL,
graduada en divisiones de 0,1 mL, 0,1 mL y 0,5 mL, respectivamente.

5 5. .3 3 Preparacin de la muestra, suspensin inicial y diluciones.
5.3.1 Ver Instructivo de preparacin y dilucin de muestras de alimentos para anlisis microbiolgico.

5.4 Inoculacin e Incubacin
5.4.1 Inoculacin
5.4.1.1 Colocar las placas Petrifilm para el recuento de EC sobre una superficie plana y lisa.
5.4.1.2 Levantar la lmina superior y transferir, por medio de una pipeta estril, 1 mL de la muestra a
analizar si el producto es lquido, 1 mL de la suspensin inicial (dilucin 10
-1
) el caso de otros
productos a cada una de las dos placas de petrifilm, en el centro de la lmina. Repetir el
procedimiento para las siguientes diluciones si fuera el caso.

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5.4.1.3 Dejar caer la lmina hacia abajo sobre la muestra, evite la formacin de aire.
5.4.1.4 Colocar el aplicador o esparcidor plstico con el lado plano hacia abajo sobre el centro de la
lmina. Presione cuidadosamente sobre el centro y distribuya cuidadosamente la muestra.
Distribuya el inoculo en la Placa Petrifilm sobre el rea de crecimiento antes de que se forme el
gel. No deslice el aplicador a travs de la lmina.
5.4.1.5 Remover el aplicador o esparcidor de la placa y esperar que se gelatinice la placa.

5.4.2 Incubacin
- Incubar las placas en una posicin horizontal, con el rea limpia hacia arriba y no ms de 20
placas una sobre otra.
- Para el recuento Coliformes incubar por 24 h 2 hs a 35C 1C.
- Para obtener los resultados de las placas petrifilm para recuento de E. coli incubar
adicionalmente 24 h 2 h (48 h + 4 h total) a 35C 1C.

5.5 Seleccin de placas e interpretacin
5.5.1 El recuento de las placas Petrifilm EC pueden utilizarse para el conteo un contador estndar de
colonias u otra fuente de luz amplificada. No contar las colonias desarrolladas sobre la zona
blanca ya que no estn bajo la influencia selectiva del medio. No contar las burbujas que puedan
estar presentes.
5.5.2 Aproximadamente el 95% de los E. coli producen gas. Numerar las colonias de color azul a rojo-
azulado asociados con formacin de burbujas de gas sin tomar en cuenta la intensidad del color
y el tamao de la colonia, estas colonias corresponden a E. coli. Colonias azules sin gas no
sern enumeradas como E. coli.
5.5.3 Otras colonias de coliformes son de color rojo asociadas (dentro de un dimetro de la colonia)
con burbujas de gas. Colonias no asociadas con gas (con una distancia ms grande que un
dimetro entre colonias y burbujas de gas) no sern enumeradas como Coliformes. El recuento
total de Coliformes consiste en enumerar las colonias rojas y azules asociadas con gas en 24
horas.
5.5.4 Para contar las colonias, elegir, siempre que sea posible, nicamente aquellas placas que
presenten menos de 150 colonias caractersticas.

5.6 Clculos:

5.6.1 Para calcular el nmero de organismos de Coliformes o de Escherichia coli, por gramo o mL de
muestra, se multiplica la media aritmtica hallada de los dos valores del nmero de colonias por
la dilucin correspondiente.

5.7 Reporte

5.7.1 Los resultados obtenidos, se expresaran unidades formadores de colonias (UFC) de Coliformes
o Escherichia coli / gramo o mililitro.

5.7.2 Los resultados para cada muestra se transcriben al Registro interno de resultados que luego se
archiva.

5.8 Control de calidad
5.8.1 Para verificar la capacidad del laboratorio para la numeracin de coliformes, con el mtodo y
medio descrito en este procedimiento, sembrar la placa con una cepa de Escherichia coli, y
proceder a travs de todo el protocolo analtico usado para la muestra prueba. Un medio de

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control positivo asegura que ninguna sustancia en el medio de cultivo es inhibidor para la
Escherichia coli.

5.8.2 Se incluyen un control negativo, colocando 1 mL del diluyente en la lmina rehidratable.

VI FORMULARIOS Y REGISTROS

6.1 Registro de numeracin de Escherichia coli y Coliformes


VII REFERENCIAS

7.1 AOAC 991.14: 2005. Mtodo de Lmina rehidratable para recuento de Coliformes y Escherichia
coli en Alimentos.



VIII ANEXOS


N ANEXO TITULO
1 Diagrama de flujo del procedimiento
2 Composicin y preparacin de los medios de cultivos y reactivos





























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ANEXO 1: Diagrama de flujo del procedimiento (muestra slida)






Colonias de color azul a rojo- Colonias de color rojo asocia-
azulado asociadas con burbu- das con burbujas de gas.
jas de gas. +
Colonias de color azul a rojo-
azulado asociadas con burbu-
jas de gas.


Escherichia coli Coliformes totales




90 mL
APS

9 mL
APS
10
-1

10
-2
10
-3


1 mL
1 mL 1 mL
Levantar la lmina superior y con la pipeta perpendicular dispensar
1 mL de la muestra en el centro del botn de la lmina.
Dejar caer la lmina hacia abajo sobre la muestra, evitar la
formacin de burbujas de aire.
....
1 mL 1 mL
Placas Petrifilm para recuento
de E. coli y Coliformes
Incubar las placas horizontalmente a 35C + 1C
por 24 h + 2h. (a 48 h + 4h)
Lectura y reporte
10 g de muestra
Colocar el esparcidor plstico con el lado plano hacia abajo sobre el centro de la lmina.
Presionar cuidadosamente sobre el centro. Esperar que se solidifique.


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ANEXO 2: Composicin y preparacin de los medios de cultivos y reactivos.

2.1 Placas Petrifilm

Las placas Petrifilm para recuento de E. coli y coliformes (EC) es un medio de cultivo listo cuyo sistema
contiene nutrientes, Rojo bilis violeta (VRB), un agente gelificante soluble en agua fra, un indicador de la
actividad glucoronidasa, 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-b-D-glucuronido (BCIG) y el indicador de tetrazolium
que facilita la enumeracin de colonias.