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Anticuerpos

Los anticuerpos son molculas de peso molecular


aproximado de 150 kDa, pertenecientes al grupo de las
inmunoglobulinas (Ig). Son molculas capaces de
reconocer otras molculas, los antgenos. La capacidad
de reconocimiento de un anticuerpo radica en las
secuencias ariables de sus cadenas proteicas,
generadas por recombinaci!n de una serie de "gene
cassettes# en el proceso de producci!n de los lin$ocitos %
durante el desarrollo embrionario. La combinatoria de
estas secuencias puede producir m&s de un bill!n de
secuencias di$erentes. 'sta in$ormaci!n es almacenada
en el "pool" de lin$ocitos % presentes en nuestro te(ido
lin$&tico.

La estructura b&sica de un anticuerpo se es)uemati*a en la $igura+ $ormado por
dos cadenas proteicas pesadas , dos ligeras, unidas por puentes disul$uro. Se
diiden en arias clases )ue se identi$ican seg-n el tipo de cadena pesada en+
Ig., Ig/, Ig0, IgD e Ig'.
La acci!n de en*imas proteol1ticas sobre los anticuerpos permite obtener
$ragmentos )ue presentan actiidades biol!gicas di$erenciales. Los $ragmentos
obtenidos son+
Fc. 2orresponde al extremo 23terminal de las dos cadenas pesadas. 'ste
$ragmento est& constituido por la regi!n constante de la cadena pesada ,
es caracter1stica de cada clase de inmunoglobulinas. 's en esta regi!n
donde radican las $unciones e$ectoras de la molcula como son la $i(aci!n
del complemento, la interacci!n con los receptores celulares de monocitos ,
macr!$agos, la interacci!n con la prote1na 0 de S. aureus , . de
Streptococcus sp. etc... La regi!n 4c es caracter1stica de especie.
F(ab')2. 2orresponde al extremo 53terminal de las dos cadenas pesadas ,
a las dos cadenas ligeras. Se obtiene por digesti!n con pepsina. 6iene
reconocimiento dialente del ep1tope.
F(ab). 2orresponde al extremo 53terminal de una cadena pesada , a una
cadena ligera, unidas por puentes disul$uro. Se obtiene por digesti!n con
papaina. 6iene reconocimiento monoalente del ep1tope.
De las distintas clases de inmunoglobulinas las )ue se encuentran
predominantemente en el suero de animales inmuni*ados son las Ig/ , las Ig..
Las Ig/ se sinteti*an durante la respuesta primaria , se asocian en una estructura
pentamrica. Su capacidad de reconocimiento de ep1topes es por ello de 10. Las
Ig. se sinteti*an tanto durante la respuesta primaria como secundaria, siendo en
esta -ltima donde se consiguen los ma,ores nieles de producci!n. Su acci!n
bialente les permite interactuar con m&s de una molcula de ant1geno.
Antgenos, Antigenicidad e inmunogenicidad.
7irtualmente toda molcula a(ena a un determinado organismo se comporta $rente
a ste como un ant1geno, Se pueden di$erenciar dos caracter1sticas primordiales
en un ant1geno. 8or una parte la inmunogenicidad o capacidad )ue presenta una
molcula para generar una respuesta inmune en un organismo dado , la
antigenicidad o particularidad del ant1geno )ue 9ace )ue ste sea reconocido por
un determinado anticuerpo. 0mbas propiedades pueden o no estar presentes en
un determinado ant1geno. /olculas de pe)ue:o tama:o (9aptenos o pptidos)
son poco inmunognicas , por ello se asocian a prote1nas transportadoras de alto
peso molecular o "carriers" para inducir una respuesta inmune adecuada.
/acromolculas ub1cuas (alb-minas, citocromos, etc...) o de especies
$ilogenticamente relacionadas, son poco inmunognicas. 'n estos casos, para
obtener una respuesta adecuada es aconse(able utili*ar como animal 9usped una
especie $ilogenticamente ale(ada a la del ant1geno a inocular.
;abitualmente se emplean como ant1genos puros o preiamente enri)uecidos
mediante tcnicas de concentraci!n o de separaci!n electro$ortica. <no de los
criterios de ma,or importancia en la obtenci!n de un suero monoespec1$ico es la
inmuni*aci!n con ant1genos puros.
0 la regi!n del ant1geno reconocida por un anticuerpo se le denomina eptope o
determinante antignico. <n ant1geno puede presentar un n-mero ariable de
ep1topes de estructura -nica o repetitia. La comple(idad estructural de las
prote1nas $aorece )ue stas presenten por lo general un n-mero eleado de
ep1topes distintos, mientras )ue los &cidos nucleicos , los polisac&ridos, dada su
repetitiidad estructural, poseen un n-mero escaso de ep1topes di$erentes.
Inmunizacin y preparacin del antgeno
'l proceso de inmuni*aci!n es a)uel en el )ue se in,ecta al animal el ant1geno en
condiciones adecuadas de cantidad, sustancias acompa:antes, , n-mero de
eces, )ue sean necesarias para conseguir una buena respuesta inmune. 'n
general se diide en dos $ases+ inmuni*aci!n primaria, en la cual se administra una
determinada cantidad de ant1geno en presencia de ad,uante, e inmuni*aci!n de
recuerdo ("booster"), en la )ue el ant1geno es administrado en $orma soluble o bien
con ad,uante. 'xisten numerosos protocolos de inmuni*aci!n, con una duraci!n
ariable.
2uando se inmuni*a un animal con un ant1geno , se prooca una respuesta
inmune aumenta notablemente en el suero del animal la cantidad de Ig espec1$icas
del ant1geno empleado. 'sto es la consecuencia de la selecci!n clonal de los
lim$ocitos % )ue producen anticuerpos contra el ant1geno. 2omo 9emos isto un
ant1geno puede presentar di$erentes ep1topes, , cada uno de ellos ser reconocido
por un clon de lin$ocitos % )ue producir& molculas Ig con una secuencia
caracter1stica. 8or ello en el suero de un animal inmuni*ado se acumulan un
n-mero desconocido, posiblemente eleado, de di$erentes molculas de Ig
espec1$icas en ma,or o menor medida de nuestro ant1geno. Se trata de un suero
producido por la acci!n de s1ntesis de numerosos clones de lin$ocitos % , por ello
se 9a denominado policlonal.
Interaccin primaria antgenoanticuerpo.
A!inidad y a"idez
La interacci!n entre ant1geno , anticuerpo se estabili*a mediante enlaces dbiles,
como puentes de 9idr!geno, $uer*as de 7an der =aals e interacciones
electrost&ticas e 9idro$!bicas. La suma de todos estos enlaces genera una
interacci!n estable entre el lugar de uni!n del anticuerpo (paratope) , el lugar de
uni!n del ant1geno (eptope). 'stas $uer*as son inersamente proporcionales a
una potencia de la distancia entre los grupos interactuantes, lo )ue implica )ue
ep1tope , paratope deben presentar estructuras complementarias para obtener
una energ1a de uni!n su$iciente como para resistir la disrupci!n termodin&mica. La
suma de estas $uer*as de atracci!n , de repulsi!n se conoce como a!inidad del
anticuerpo.
Los anticuerpos son molculas multialentes en su interacci!n con el ant1geno.
Las molculas de inmunoglobulina presentan un m&ximo de 10 (Ig/) , un m1nimo
de > bra*os de uni!n con el ant1geno. 'n el caso de )ue este -ltimo tambin sea
multialente, presentar& un m1nimo de dos puntos de ancla(e para el anticuerpo
correspondiente. 'sta interacci!n multialente entre ant1geno , anticuerpo permite
introducir el concepto de a"idez o a!inidad !uncional.
#speci!icidad y reaccin cruzada
La complementariedad existente entre ep1tope , paratope condiciona la relaci!n
espec1$ica entre ant1geno , anticuerpo. Dic9a complementariedad a$ecta tanto a
una relaci!n espacial entre los grupos )u1micos reaccionantes, a la relaci!n
complementaria de cargas netas como a la relaci!n estrica entre las estructuras
reaccionantes.
'n general los anticuerpos son altamente espec1$icos, siendo capaces de discernir
entre pe)ue:as ariaciones del ant1geno, tanto a niel de estructura primaria como
de con$ormaci!n estrica o con$iguraci!n !ptica del mismo.
Interaccin secundaria antgenoanticuerpo.
'n la interacci!n in itro de un ant1geno con su correspondiente anticuerpo se
distinguen dos etapas, la reacci!n primaria no isuali*able , la reacci!n
secundaria, )ue sigue a la anterior , se caracteri*a por la aparici!n de un
$en!meno isible como la aglutinaci!n, la precipitaci!n, etc.
Los comple(os iniciales )ue se $orman r&pidamente, sobre los )ue dentro de
ciertos limites las ariaciones de temperatura , concentraci!n salina tienen poca
in$luencia, se agregan luego para dar di$erentes $en!menos isibles cu,as
caracter1sticas dependen en gran parte del estado $1sico del ant1geno. 'sta etapa
se acelera con la temperatura, la agitaci!n , es electrolitodependiente.
's importante separar las etapas de la reacci!n ant1geno3anticuerpo. 8uede
ocurrir )ue se demuestre la presencia de anticuerpo por interacci!n primaria, pero
)ue este no sea detectable por interacci!n secundaria o terciaria. 'sto puede ser
consecuencia de ariaciones cuantitatias, ,a )ue para conseguir $en!menos
isibles son indispensables determinadas concentraciones de anticuerpo, ,
cualitatias in9erentes a las propiedades de la clase de inmunoglobulina
comprometida en la respuesta inmune, as1 como de las caracter1sticas del ligando.
Si bien es posible detectar un anticuerpo mediante estudios de interacci!n
primaria, ello no signi$ica )ue siempre deban ocurrir reacciones secundarias o
terciarias.
$recipitacin
2uando una anticuerpo, excepci!n 9ec9a de los blo)ueantes , no precipitantes,
es puesto en contacto con una soluci!n de macromolculas )ue lo origino, se
$orman comple(os 0c?0g )ue se insolubili*an luego en su ma,or parte dando una
reacci!n de precipitaci!n, )ue puede ser total o *onal.
's una propiedad de la ma,or parte de los anticuerpos , no una caracter1stica
particular de un determinado tipo al )ue originalmente se lo llamo anticuerpo
precipitante.
$recipitacin en medios l%uidos
'sta reacci!n se produce en dos etapas. 'n la inicial, )ue se desarrolla
r&pidamente , es in$luida mu, poco por la temperatura , los electrolitos, se $orman
los comple(os 0c?0g primarios. 0 medida )ue el tiempo transcurre, esos comple(os
iniciales se agregan, originando micelas de di$erentes tama:os, las )ue $inalmente
precipitan. 0lgunos comple(os no alcan*an a 9acerlo , )uedan en soluci!n.
La temperatura acelera esta segunda etapa, siendo adem&s
electrolitodependiente.
's muc9o m&s lenta )ue la inicial, puede durar minutos, e incluso 9oras, para )ue
se complete.
La $ormaci!n de agregados es una consecuencia de la bialencia de los
anticuerpos , la multialencia de los ant1genos. 2on 9aptenos monoalentes o
ant1genos )ue poseen un solo determinante antignico por molcula, la
precipitaci!n no se produce.
<n 9ec9o mu, particular lo constitu,en los anticuerpos monoclonales, )ue en su
ma,or parte no muestran actiidad precipitante. 'llo se debe a )ue en muc9os
casos, especialmente cuando est&n dirigidos contra macromolculas en soluci!n,
reconocen a un -nico epitope no repetido, lo )ue les impide $ormar agregados.
La $ormaci!n de estos di$erentes comple(os 9a sido explicada mediante la llamada
teor1a del enre(ado, )ue considera )ue la composici!n del precipitado $ormado es
una consecuencia del modo en )ue anticuerpo , antigeno se 9an unido. Dada la
bialencia del anticuerpo , multialencia del antigeno, las posibilidades de
combinaci!n ar1an seg-n )ue en la me*cla exista exceso de antigeno, exceso de
anticuerpos o e)uialencia de ambos.
'n la *ona de exceso de antigeno, los comple(os son solubles.
Si bien la precipitaci!n en medios l1)uidos es mu, -til para la identi$icaci!n de
ant1genos , anticuerpos, teniendo en cuenta lo anteriormente expuesto en lo
relatio a la $ormaci!n de los precipitados, la misma puede usarse con $ines
cuantitatios , constitu,e un buen mtodo para la medida de la concentraci!n de
los anticuerpos presentes en un suero. 8uede usarse tambin para medir nieles
de ant1geno.
$recipitacin en medios geli!icados
Las macromolculas pueden di$undir libremente a tras de geles@ dic9a di$usi!n
esta limitada por la concentraci!n del gel. 'mpleando soportes adecuados, en
especial a)uellos )ue como base tienen agar disuelto en electrolitos, es posible
9acer migrar ant1genos , anticuerpos de modo )ue al encontrarse interaccionen.
8ueden utili*arse tambin geles con base de pectina, alginatos, pliacrilamida , aun
tiras de acetato de celulosa gelatini*ado.
Los precipitados )ue se originan se isuali*an como n1tidas bandas de
precipitaci!n, )ue permanecer&n estables mientras un ma,or a$lu(o de molculas
de los reactios no proo)uen su redisoluci!n.
Se 9an descripto numerosas tcnicas cualitatias , cuantitatias basadas en este
principio, entre las )ue pueden citarse la di$usi!n simple monodimensional,
di$usi!n doble monodimensional, di$usi!n doble bidimensional, di$usi!n radial, etc..
&i!usin simple monodimensional
Se coloca en un tubo de ensa,o pe)ue:o agar $undido, soluci!n al 1A en cloruro
de sodio 0,15 /, me*clado con un olumen igual del antisuero para anali*ar.
8roducida la solidi$icaci!n, se a:ade la soluci!n de antigeno. 8or di$usi!n a tras
del gel el antigeno a penetrando, creando un gradiente de concentraci!n. 'n la
inter$ase gel3li)uido no se $orman precipitados, dada la alta concentraci!n
antignica, , aparecen con la $orma de bandas cuando la concentraci!n del
antigeno )ue 9a di$undido es la optima.
Si en el suero 9ab1a mas de un anticuerpo , en la soluci!n a:adida mas de un
antigeno )ue se correspondan, se $ormara tantas bandas de precipitaci!n como
sistemas 9a,an interaccionado.
'sto no es exacto, pues si se tiene en cuenta )ue dic9as separaciones dependen
de las elocidades de di$usi!n de las di$erentes molculas antignicas, solo ser&
cierto si a)uellas son distintas. 'l numero de bandas de precipitaci!n nos indica la
cantidad m1nima de sistemas reaccionantes presentes. 'sto tambin es relatio,
,a )ue es indispensable )ue los reactios no estn en concentraciones in$eriores a
las necesarias para )ue la reacci!n ocurra.
&i!usin doble monodimensional
'n este caso la reacci!n se e$ect-a colocando en la parte in$erior del tubo un
olumen de agar al 1 A $undido, me*clado con partes iguales del antisuero.
8roducida la geli$icaci!n, se agrega agar al 0,5 A en soluci!n salina, en un
olumen igual a la mitad del anterior. Despus de la solidi$icaci!n se cubre todo
con un olumen de agar al 1 A $undido, me*clado con igual olumen de la
soluci!n antignica.
0nt1genos , anticuerpos migrar&n 9acia la *ona media e interaccionar&n
desencaden&ndose la precipitaci!n cuando las concentraciones sean las !ptimas.
'stando la di$usi!n en relaci!n directa con la concentraci!n de la sustancia )ue
di$unde, la banda de precipitaci!n estar& m&s pr!xima a la *ona del ant1geno
cuando 9a, exceso de anticuerpo, , ocurrir& lo inerso en caso contrario.
'ste es un buen mtodo cualitatio )ue permite demostrar arios sistemas
reactios simult&neos, cosa )ue no ocurre en la precipitaci!n en medios l1)uidos.
8ueden detectarse 9asta 10 Bg?ml de anticuerpo.
&i!usin doble bidimensional
<n interesante mtodo de doble di$usi!n en placas $ue descripto por CDc9terlon,.
2onsiste en en$rentar en pe)ue:as per$oraciones e$ectuadas en el agar, , a
distancias conenientes, las soluciones de ant1geno , de anticuerpo. 0l di$undir
ambos , ponerse en contacto, producir&n una banda de precipitaci!n cuando
estn en la relaci!n !ptima.
2on esta tcnica puede tenerse una idea de las relaciones entre los pesos
moleculares de los ant1genos , anticuerpos reaccionantes. 6raba(ando con
concentraciones !ptimas de 0g , de 0c, si la banda de pecipitaci!n $ormada es
recta, indica )ue los pesos moleculares de ambos son mu, pr!ximos. Si la banda
es c!ncaa con especto al reserorio del ant1geno, se:ala )ue el peso molecular
de ste es superior al del anticuerpo, siendo menor en el caso en )ue la banda
presente conexidad.
6odo esto es una consecuencia de las le,es generales de la di$usi!n, )ue
establecen )ue la distancia a la )ue una sustancia di$unde est& en relaci!n directa
con su concentraci!n , en relaci!n inersa con su peso molecular. /ediante esta
metodolog1a, es posible identi$icar arios sistemas reaccionantes
simult&neamente, pues cada uno de ellos dar& una banda de precipitaci!n
espec1$ica ,, adem&s, inestigar reacciones cru*adas, pues en estos casos 9abr&
$usi!n de bandas. Criginariamente CDc9terlon, describi!, de acuerdo a este
9ec9o, tres tipos de reacciones. 4ueron denominadas como reacciones de
identidad, no identidad e identidad parcial.
'n el primer caso, los dos sistemas reactios se $unden en una -nica banda de
precipitaci!n. Si los sistemas no son iguales (reacciones de no identidad), cada
uno reacciona independientemente originando bandas de precipitaci!n )ue se
cru*an. 2uando uno de los ant1genos anali*ados tiene alg-n componente capa*
de dar una reacci!n cru*ada con el anticuerpo elaborado por el otro (identidad
parcial), las bandas de precipitaci!n de ambos sistemas se unen , $unden
parcialmente en una banda, apareciendo una prolongaci!n o espol!n en la
correspondiente al ant1geno )ue se emple! para la obtenci!n del antisuero. 'sto
indica )ue en este ant1geno 9a, componentes antignicos no compartidos con el
restante.
&i!usin radial ('cnica de (ancini)
2uando un ant1geno es colocado en un ori$icio circular practicado en una placa de
agar, al cual se adicion! anticuerpo monoespec1$ico, di$unde en $orma radial ,, de
acuerdo con los principios b&sicos de la di$usi!n, el di&metro del 9alo de
precipitaci!n est& en relaci!n directa con su concentraci!n. Si a esta operaci!n se
la e$ect-a colocando en arios ori$icios de la placa cantidades ariables conocidas
del ant1geno espec1$ico para el antisuero me*clado con el agar , se lo de(a a
temperatura ambiente 9asta )ue el 9alo de precipitaci!n no se modi$i)ue, con los
resultados obtenidos se puede con$eccionar una cura relacionando el di&metro
de los 9alos de precipitaci!n con las correspondientes concentraciones
antignicas. 'sta cura permite calcular la concentraci!n de ese mismo ant1geno
en cual)uier muestra desconocida.
La di$usi!n radial se utili*a en la cuanti$icaci!n de prote1nas )ue se encuentran
presentes en me*clas comple(as como lo son los componentes del suero 9umano.
's indispensable disponer para ello de antisueros monoespec1$icos destinados a
los ant1genos )ue se )uieren alorar.

%ibliogra$1a
9ttp+??EEE.ub.es?biocel?Ebc?tecnicas?anticuerpos.9tmFarriba
Inmunolog1a e Inmuno)u1mica. /argni, G. 0., 5H edici!n 'ditorial /dica
8anamericana 1IIJ.