Rev.

MVZ Crdoba 14C2):1667-1676, 2009

ORIGINAL
INMUNOGENICIDAD DE LA PROTENA
RECOMBINANTE ASPIR DE Ancylostoma caninutn
EN UN MODELO MURINO
IMMUNOGENICITY OF THE PROTEIN RECOMBINANT ASPlr
OF >) can/num I N A MURINE MODEL
Maria Giraldo G, M.Sc, Jhon C Castao 0, Ph.D.
Universidad del Quindio, Facultad Ciencias de la Salud, Grupo de Inmunologa Molecular,
Armenia, Quindio, Colombia. Correspondencia: gymoi@uniquindio.edu.co
Recibido: Mayo 15 de 2009; Aceptado: Agosto 19 de 2009
RESUMEN
Objetivo. Construir un plsmido recombinante que exprese la protena ASPlr de Ancylostoma
caninum y evaluar su capacidad inmunognica en un modelo murino. Materiales y mtodos.
Se realiz extraccin de ARN de parsitos adultos de Ancylostoma caninum, se amplific por
RT -PCR el gen de la protena ASPl. Este gen fue insertado en el vector pcDNA3. El inserto
fue digerido con Bamhl y EcoRl y clonado direccionalmente. Posteriormente, se llev a
cabo transformacin y seleccin de las clulas de E. coi! DH5a competentes con el producto
de la ligacin. Se realiz un tamizaje por PCR confirmando la presencia del gen ASPl. El
vector pcDNA3-ASPl fue administrado va intraglandular en ta partida e intramuscular en
ratones Balb/c. En estos animales se les realiz determinacin de anticuerpos en suero y
saliva mediante las tcnicas de ELISA e inmunohistoqumica. Resultados. Se determin que
el plsmido pcDNA3-ASPl fue incorporado y expresado clulas E. coli DH5a. Este plsmido
recombinante indujo la produccin de anticuerpos Anti-ASPl especficos en ratones Balb/c.
Conclusiones. Se logr demostrar que la utilizacin de pcDNA3-ASPl no produjo reacciones
desfavorables en ratones Balb/c, adems indujo respuesta humoral contra la protena pcDIMA3-
ASPl de excrecin/secrecin de Ancylostoma caninum en ratones.
Palabras clave: Ancylostoma caninum, protena ASPl, inmunohistoqumica, vacunas, ADN,
clonacin.
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ABSTRACT
REVISTA MVZ CORDOBA Volumen 14(2), Mayo - Agosto 2009
Objective. To construct a recombinant plasmid expressing the ASPlr protein of ^. caninum
and evaluate its immunogenic capacity in a murine model. Materials and methods. RNA of
adults of Ancylostoma caninum was amplified by reverse transcription polymerase chain
reaction. The ASPl protein gene was inserted into the pcDNA3 vector. Plasmid was digested
with Bamhl and EcoRl and cloning was performed directionally. Latera transformation and
selection of E. coli DH5a cell competent with the product for the ligation was made. Then,
a screening by PCR was carried out to confirm the presence of ASPl gene. PcDNA3-ASPl
was inoculated by intraglandular parotide and intramuscular route in Balb/c mice. Antibodies
in these animals was measured in serum and saliva by ELISA and immunochemistry. Results.
PcDNA3-ASPl was incorporated and expressed in E. coliDH5a cell. This recombinant psmid
was able to produce antibodies anti-ASPl specific in Balb/c mice. Discussion. It was
possible to demonstrate that using of pcDNA3-ASPl did not display reactogenicity and it did
not produce unfavorable reactions, futhermore, it induced a humoral response against the
excrecin/secretion protein of Ancylostoma caninum in mice.
Key words: Ancylostoma caninum, ASPl protein, Immunohistochemistry, Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay, DNA vaccines, Cloning Molecular.
INTRODUCCIN
Ancylostoma spp, es un helminto redondo
que se localiza en el intestino delgado de
perros, y otros carnvoros silvestres. Dentro
de esta familia se distinguen tres especies de
importancia: A. braziliense, A. caninum y A.
tubaeforme, los cuales se caracterizan por su
hematfagia. A caninum macho miden de 11 a
13 mm y la hembra de 14 a 20 mm (1).
Presentan un ciclo de vida directo, teniendo
dos vas de entrada al hospedero: la ms
frecuente es la ingestin de la larva (L3)
encapsulada; la segunda en orden de
importancia, es por penetracin a travs de
la piel, tambin se transmiten por ingestin
de L3 presentes en la leche materna. Despus
de ingresar, la L3 se transporta rpidamente
al intestino, por va sangunea, ingresa a los
pulmones y luego contina hacia la trquea.
El principal signo de ia infeccin por los
ancilostmidos es la anemia (1). En el humano
y en el perro en la forma crnica se presenta
emaci aci n, prdida del apet i t o y
debilitamiento. Tambin, se presenta diarrea
ligera y heces oscuras, algunas veces teidas
con sangre. En infecciones masivas produce
edema en las partes bajas del cuerpo y la
piel de estas reas puede ulcerarse. En las
ltimas etapas puede presentarse epistaxis
y el ndice de coagulacin sangunea baja.
La reaccin intensa que manifiestan los
animales a la superinfeccin consiste en
hemorragias del intestino delgado, reaccin
vesicular grave y, a veces, desprendimiento
de tejido necrtico.
Las larvas infectivas L3 de A. caninum cuando
se cultivan in vitro en condiciones favorables
liberan dos protenas secretorias ricas en
cisteina (CRISPs), las cuales son conocidas
como protenas de secrecin/excrecin ASP-
1 y ASP-2 (2,3). Por otro lado, estas larvas
cuando son incubadas bajo condiciones de
un probable hospedero en cultivos de tejido
liberan continuamente ASPl y ASP2 en
cantidades pequeas, pero cuando este
medio es suplementado con fracciones de
suero del hospedero y anl ogos de
gl utati n, la larva L3 experimenta un
cambio fenotpico caracterizado por la
adaptacin al medio (2-6).
Este fenmeno coincide con la liberacin de
ASPl Y ASP2, las cuales son molculas
predominantemente producidas por L3 in
vitro (2,7). La larva L3 de A. caninum
t ambi n l i bera menor canti dad de
macromolculas adicionales bajo esas
condiciones incluyendo una metaloproteasa
de zinc las cuales podran ser utilizadas como
posibles blancos teraputicos (8,9).
Giraldo - Inmunugenicidad de la proteina recombinante ASPIR
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La funcin de la ASPs de las larvas no estn
bien definidas aunque, han sido descritas
en otros nemtodos, incluyendo parsitos
de animales y plantas (4,10-11). Las ASPs
exhiben propiedades angiognicas que son
importantes durante la transi ci n del
estadio larval de forma libre en el suelo
lo que facilita su ingreso al hospedero
mamfero (2, 12) y posee homologa con
regiones de aminocidos de alrgenos del
veneno del reptil vestid (2-3), sugiriendo
que estas ASP pueden tener un papel
i mpor t ant e en la pat ognesi s de
infecciones causadas por nemtodos en
animates y humanos (13). Sin embargo,
esto puede ser dispuesto por la presencia
de al menos 17 genes di f er ent es
relacionados a ASPs encontrados en el
nematodo de vida libre Caenorhabditis
elegans (3), proponiendo que la familia de
prot e nas ASP cumpl en un papel
i mportante en la biologa y no en el
parasitismo.
Las ASPs son de inters teraputico por
que tienen potencialidad como candidato
vacunal contra infecciones por nemtodos
en humanos y animales (13,14). Adems
han demostrado ser inmunodominantes y
por to tanto son fcilmente reconocidos
por el sistema inmune de los rumiantes
vacunados con ASPs y retados con larvas
L3 (15,16). Las ASPs recombinantes de
Larvas L3 y producidas naturalmente son
ant genos ef ect i vos para vacunas
establecidos en modelos animales de
laboratorio probados con L3 de A. caninum
(17-19), Haemonchus contortus (20),
Brugia Malawi (21) y Onchocerca volvulus
(22). Similarmente, las ASPs aisladas de
H. contortus adultos han demostrado ser
altamente efectivos en la proteccin de
ovejas contra infecciones (23-26).
Hasta el momento no hay reportes en la
literatura de la utilizacin de vacunas
de cidos nucleicos desnudos con los
genes de las prot e nas ASPl de A.
caninum, por ello, el objetivo del presente
trabajo fue construir un sistema de expresin
plasmdico recombinante con pcDNA3 para
expresar la protena ASPl de A. caninum,
evaluando su capacidad inmunognica en
un modelo murino
MATERIALES Y MTODOS
Ani mal es. Se utilizaron ratones Balb/c
endocriados del bioterio de la Universidad
Nacional de Colombia (Bogot) libres de
infecciones por helmintos verificada por
examen coprolgico. Los ratones se
mantuvieron en la unidad de experimentacin
animal del CIBM-UQ, siguiendo las normas
de utilizacin de animales de la convencin
de Helsinki. En el estudio se utiliz un total
de 16 ratones hembras de 20 gramos
distribuidos en 3 grupos para los estudios
de inmunizacin.
El proyecto y los procedimientos del mismo
fueron aprobados por el comit de biotica
de la facultad de ciencias de la salud de la
Universidad del Quindo.
Parsitos: Obtencin de larvas L3 y
adultos de A. caninum y preparaci n de
productos de excrecin / secreci n. Las
larvas L3 y adultos fueron obtenidos de
intestinos delgado de perros sacrificados en
el centro de zoonosis de la ciudad de Armenia
dentro del programa de control de animales
callejeros y/o terminales, siguiendo las normas
estipuladas para estos procedimientos por
la sociedad protectora de animales.
Los intestinos se transportaron al laboratorio
en solucin salina estril en una nevera a
40c, una vez en el laboratorio se disecaron
y se tomaron las larvas de aquellos que
estaban parasitados, despus se lavaron con
PBS varias veces y fueron cultivadas en 1000
mi de RPMI 1640( Gibco, USA), suplementado
con 25 mM HEPES, 100 U/ml de penicilina y
100 mg/ml de estreptomicina y se incubaron
a 37Cpor 15 horas. Posteriormente se filtr
la suspensin en un filtro de policarbonato
de 0.2 |jm. (Nudeopore.Inc, Cambridge, USA),
finalmente la suspensin se concentr por
medio de evaporacin y se guard igual que
los ancylostomas a -70C hasta su uso.
Extraccin de ARN. La extraccin de ARN
se realiz a partir de una suspensin de larvas
L3 y adultos de A. caninum las cuales se
maceraron; la extraccin total del ARN de
las L3 se realiz con el kit comercial de
extraccin SV isolation Promega(H).
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RT- PCR. A parti r de ARN obteni do de larvas
L 3 , se real i z el pr ocedi mi ent o de
retrotranscripcion y PCR en un slo paso,
mediante ei kit comerciai de Promega Cg).
Las secuencias de iniciadores fueron las
siguientes; ASPl:
Oligo 1 5 ' - GGGG
Oligo 2 3'-GGGG
TITTCTCCTG TAG TCG T -3 '
G ACTG AnAAG G AG CG C-5 '
Ollgo 1 5 ' - GGGG ^ ^ ' " " J G AI ACTG TG CAATG G AACAG CAG 3 '
Oligo 2 3 ' G G G G ECOt^AATTC AG TAG CACCAG G CG AACACT -5 '
Los Primers se disearon utilizando el
programa Primer-3 y genruner, usando la
secuenci a para ASPl de A. caninum
reportada en el G en Bank (AF13 2291).
Se utiiiz ia si gui ente mezcla para un
volumen fi nal de 5 0pl : Tampon 10 X,
dNTPs 100 pM, 2.5 mM cl or ur o de
magnesi o, cebadores 0.2 pM, l Taq
polimerasa (Invitrogen,Carlsbad,Ca,USA).
Con el siguiente ciclo trmi co: Un ciclo de
37OC/50 min para Rt, predenaturacin 95 C
X 5 min y 3 5 ciclos de denaturacin 940C
X 45 seg, tempiado 490C x 1 min, extensin
72C X 1:3 0 min, y una extensin final a
72OCX 10 mi n.
Los productos de amplificacin se verificaron
por electroforsis en gel de agarosa al 1% (p/v)
teido con l pl de bromuro de etidio ai 0.0004%
(v/v) y visuaiizado en transiluminacin con luz
ultravioleta. Se consider como amplificacin
positivas para A. caninum la visualizacin de
una nica banda de 1079 pb para ASPl.
Clonaje de los fragmentos amplificados
usando el Plsmido pcDNA3. El clonaje del
producto de RT-PCR de ASPl se hizo
di rectamente en el pismido pcDNA3
(Invitrogen,Carisbad,Ca,USA) con la enzima T4
ADN llgasa (Promega, Madison, WI, USA),
realizando la reaccin con el plsmido y ei Inserto
previamente digeridos con ias enzimas de
restriccin BamHl (Promega, Madison, WI, USA)
y ECORl (Promega, Madison, WI , USA),
obteniendo un cionaje direccional con los dos
fragmentos adhrentes.
Transformacin de cluias de E . coli DH5a
con plsmido-inserto. El crecimiento
bacteriano de la cepa DH5 a de E . coi! se reaiiz
en medio LB (Oxoid,ljenexa,Ks,USA) sin ampicilina
y posteri ormente se trat con CaCI2
(Sigma,St.ljOuis,MO,USA) para obtener clulas
competentes (27). Se realiz la transformacin
y se incub a 3 70c con agitacin por 1.5 horas,
luego se sembraron lOOpl de esta solucin con
clulas en LB-agar (1.5 % )- ampiciiina a una
concentracin de 5 0ug/mi (Invi trogen,
Carlsbad,Ca,USA) y se incub toda la noche a
370c.
Seieccin de las colonias de E . cot DHSa
recombinantes y purificacin del plsmido
recombinante. El primer tamizaje delascotonias
se hizo mediante la presin de seleccin de la
ampicilina presente en los platos de cultivo, se
cultivaron en medio lquido LB-ampiciiina a 37C
y se realiz la purificacin de los plsmidos por
iisis osmtica con H^Od y choque trmico a
OO^C por 2 mi n, iuego se procedi a
centrifugar a 14.000 g por 1 min para
recuperar el sobrenadante. A partir de esta
purificacin se realiz un tamizaje secundario
por PCR usando ios cebadores con que se
realiz ia amplificacin primaria, buscando
ia presencia del gen de ASPl. Las colonias
seieccionadas como positivas por PCR se
repicaron a 15 mi de medio L B/ampicilina
5 0Mg/ml y se incubaron a 37OC toda la
noche, posteriormente se cosech y se
purific el plsmido PcDNA3 con el inserto
ASPl mediante el mtodo de Iisis alcalina y
limpieza con PEG 8000 (27).
La determinacin de la concentracin y pureza
del ADN plsmidico se hizo medi ante
espect rof ot omet ri a a 260 y 280 nm.
Posteriormente se procedi a eliminar las
endotoxinas con el Kit removal endotoxin
(Sigma, USA) siguiendo las especificaciones
del fabricante.
Inmunizacin intramuscular e
intragiandular de ratones (Baib/c
endocriados) con pcDNA3-ASPl. 3 grupos
de ratones de 20 gramos se inocularon en la
glanduia partida y va intramuscular con 2 dosis
a intervaios de 15 das con 50 |jl de suspensin
de pcDNA3 -ASPl(5 0pg/ml) en solucin saiina
libre de pirgenos. Se formaron ios grupos 1
inoculado intramuscular con pcDNA3 -ASPl,
grupo 2 intragianduiar con pcDNA3 -ASPl y
ei grupo control con pcDNA3 resuspendido
en soiucin salina libre de pirgenos.
Giraldo - Inmunugenicidad de ia proteina recombinante ASPIR
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Obtencin de muestras de saliva y sangre
de los ratones inmunizados. Previa a cada
inoculacin se tomaron muestras de sangre as:
das 1, 15, 30; se indujo la salivacin con
pllocarpina 5% 40 pi por ratn. Despus de 5
mln de inyectar intraperitoneaimente la
piiocarpina, se procedi a la obtencin de
muestras de saiva con ei objetivo de determinar
la presencia de anticuerpos contra el antgeno
de A. ninum mediante ELISA.
Determinacin de anticuerpos en sangre y
saliva mediante ELISA de los animales
inmunizados. Para determinar la presencia de
anticuerpos murinos sricos y en saliva contra
la protena ASPl de A. ninum se dise la
siguiente ELJSA. Los pozos de placas maxisorp
se recubrienan con 100 fjl de solucin a 5 MQ/ml
del antgeno en buffer de recubrimiento pH 9.6
(Na^COj: 0.159 g/100 mi, NaHCO3:0.293 g/
lOOml) se incubaron a 37OC por 2 horas al cabo
de las cuales se realizaron 3 lavados con PBS-
Tween 20 (0.05% v/v), posteriormente se
adicionaron 300 |jl de solucin de bloqueo con
albmina srica bovina(Sigma,St.LQUis,MO,USA)
ai 1% (p/v), al cabo de dos horas se lav varias
veces, luego se adicionaron 100 pt las muestras
a una dilucin de 1:20 para la saliva y 1:50 para
los sueros en PBS-tween 20 (0.05% v/v).
Se incub la placa en cmara hmeda a
por 2 horas, luego se realizaron 3 lavados con
PBS-Tween20(0.05% v/v). Posteriormente
se aadi eron 100 [JI de sol uci n de
conjugado anti-IgG de ratn- fosfatasa
alcaiina (Sigma,St.Louis,MO,USA) para
suero y anti- IgA ratn-fostatasa aicaiina
(Sigma,St.Louis,MO,USA) a una diiucin
1:30.000 en PBS- tween 20. Se incub a
370c por una hora, luego se reaiizaron 3
lavados con PBS-tween 20 y se adicion
200pl por pozo de la solucin sustrato p-
Ni t r ophenyl phosphat e (pNPP-
Sigma,St.Louis,MO,USA). La reaccin se
detuvo a los 30 min con 25 \j\ de NaOH
3N. Se ley la reaccin a una longitud de
onda de 410 nm con un lector de ELISA
Dynatech 5000.
Inmunohistoqumica. Con el n de determinar
la especificidad de los anticuerpos desarrollados
por los animaies inmunizados con el plsmido
recombinante, se realiz una prueba de
inmunolocalizacin de ios parsitos, para ello
los Ancylostomas que fueron recuperados se
fijaron con formaldehdo al 10%, se incluyeron
en bloques de parafina a partir de los cuales
se r eal i zar on cort es hi st ol gi cos
iongitudinaies con el micrtomo. Primero se
fijaron tres iminas con acetona, se realizanDn
lavados suaves, luego se sensibiiizaron las
lminas, dos con el anticuerpo primario (suero
de ratones inmunizados con los plsmidos
recombinantes) a una dilucin 1:10 en PBS-
Tween20 y una con PBS-Tween20 (control
negativo) y se incub por 24 horas en cmara
hmeda, despus se retir ei anticuerpo
primario lavando 3 veces suavemente con PBS
Tween20, posteriormente se aplic como
anticuerpo secundario conjugado anti-IgG de
ratn-peroxidasa en una dilucin 1:30.000.
Se incub por 24 horas en cmara hmeda, se
iav 3 veces suavemente con PBS Tween20, la
inmunoreaccin fue reveiada con nitroblue
tetrazoi i um (NBT) como substrato; se
interrumpi la reaccin con agua corriente, por
ltimo se deshidrat la lmina con alcohol al
70% y se aclar con Xiioi. Rnaimente se procedi
a observar en el microscopio ptico.
RESULTADOS
Clonacin del gen de la protena ASPl
de 4. caninum en el plsmido PCDNA3.
Se recuperaron plsmidos recombinantes
que contenan ei inserto dei gen de ia
protena ASPl a partir de ias bacterias
E.coli DH5a competentes y transformadas
con el plsmido, adquirieron ia capacidad
de ser resistentes a ia ampicilina, io que es
per mi t i crecer en medi o LB agar
suplementado con 50[jg/mi de ampicilina.
Esto fue evidenciado mediante electroforsis
en gel de agarosa al 1% coioreado con
bromuro de et i di o de los product os
ampiificados mediante PCR del ADN molde
obtenido iuego de ia lisis osmtica de ias
colonias de E. coli DH5a transformadas
obt eni das dei LB-agar ampicilina y
observado mediante transiluminador con luz
ultravioleta (Figura 1,,A).
Ai purificar ios pismidos por medra de lisis alcaiina
y ilmpieza con PEG 8000, se verific por medio
del gel de agarosa 1% (Figura I B). La
concentracin final dei ADN plasmdico obtenida
fue de 700 pg/mi cuantificado por
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espectrofotometra a 260nm/280nm. A partir de
esta concentracin de ADN plasmdico, y
despus de remover las endotoxinas, las
concentraciones finales de ADN plasmdico
se midieron nuevamente, se ajust la solucin
a una concentracin de 50 pg/ml y se
inocularon los ratones.
Reactogenicidad de los animales
inmunizados. Los ani mates que se
inmunizaron con los diferentes esquemas
utilizados hasta el da 30 de observacin
presentaron en buen estado de salud
aparente. No se present ninguna muerte
luego de la inmunizacin, ni se observaron
efectos adversos durante el seguimiento.
Resultados de anticuerpos anti A.
caninum en ratones Balb/c. Los valores
de anticuerpos determinados mediante la
tcnica ELISA, mostraron valores de
absorbancia para IgG anti- A. caninum en
los animales preinmunizados que oscilaron
ent re 0.059 y 0. 077; mi ent ras la
cuantificacin en los sueros de los mismos
animales despus de la inmunizacin muestra
claramente un incremento muy marcado de
los ratones que se inmunizaron con pcDNA3-
ASPlr utilizando cualquiera de las dos vas
A
de i nmuni zaci n i nt ramuscul ar o
intragiandular comparados con los sueros de
ratones sanos (Figuras 2A), tambin se
encontr una diferencia estadsticamente
significativa entre ios das de inoculacin
con una p = 0.0018, indicando que los
refuerzos son importantes para obtener un
fuerte respuesta i nmune, pero no se
presentaron diferencias estadsticamente
significativas entre las vas de inoculacin
(Figura 2B, Cy 3).
No fue posible detectar anticuerpos tipo IgA
secretorios en saliva Anti- A. caninum en
los animales preinmunizados debido a la
escasa cantidad de saliva que se obtuvo.
Inmunohistoqumica. La interpretacin
de la inmunoreaccin de mareaje tisular,
fue considerada positiva cuando se
present un color marrn en el tejido,
indicativa de ia expresin de ia protena
ASPl , en este estudio correspondi
hasta el 100% y en el control negativo
se obtuvo un color rosa lo que
corresponde a una ausencia de
expresin. La inmunoreactividad fue
claramente identificada al microscopio
ptico (Figura 3).
B
Pb 1
Figura 1. A. Eiectroforsis en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio de los productos de
amplificacin iuego de ia PCR para ASPl (A) En ei pozo 1 marcador de peso molecular
(PUC 18 digerido Hli^), en el pozo 2 controi positivo, en el pozo 3, 4, 6, 8 las colonias
de E. coli DH5 positivas para el plsmido pcDNA3-ASPl. B. Purificacin de ios plsmidos
por medio de lisis alcalina, se verific por medio dei gel de agarosa 1%. En el pozo 1
purificacin de ios pismidos, pozo 2 marcador de peso molecular.
Giraldo - Inmunugenicidad de la proteina recombinante ASPIR
1673
B
APLCACDN
-*- litan iicir
\1>
aps

-
-

31
on
0,18
0.1Q
3 0,14
n 0.12
0.08
0,08
-
-
-
_

*
Intramuscular intraglandular
APLICACIN
Figura 2. Valores anticuerpos sricos tipo IgG anti A. caninum medidos a una DO de 410 nm. (A) Niveles
de absorbancias segn los das post inoculacin de ratones Balb/c, inmunizados por via IG y
via IM con pcDNA3-ASPl. (B) Variacin de niveles de absorbancias segn los das post inoculacin
para ambas vas de inoculacin. (C) Niveles de absorbancias segn las vas de inoculacin
B C
Figura 3. Inmunohistoquimica en corte longitudinal de tejido de Ancylostoma caninum (A) Positivo para
IgG marcado con fosfatasa alcalina, la flecha seala el tracto gastrointestinal teido de marrn,
(B) Positivo para IgG la flecha seala ei tracto gastrointestinal teido de man-n. (C) Control
negativo la flecha seala el tracto gastrointestinal teido de rosa.
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DISCUSIN
A. caninum es un parsito que tiene una amplia
distribucin mundial, tiene un ciclo de vida
directo y no tiene hospedero intermediario,
posee una protena llamada ASPl que es
liberada durante la infeccin del hospedero.
Esta molcula juega un papel importante en
el establecimiento de la invasin, se expone
directamente al sistema inmune del hospedero
y puede inducir inmunidad protectora.
La proteina de excrecin/ secrecin ASPl es
predominante, bajo la activacin in vitro en
condiciones similares a las que existen en el
hospedero, la cual presenta un peso molecular
de 42kDa, esta desempea un papel importante
en la patognesis de infecciones causadas por
helmintos en animales y humanos (8).
En trabajos reaiizados con protenas
recombinantes de A. caninum y su utizacin
como vacuna en ratones, han demostrado,
dificuitades debido a ios probiemas en probar
este candidato en modeios murinos ya que ei
estado infectivo deyA. caninum no se desarroila
en este hospedero y por lo tanto no se puede
realizar un reto con larvas infectivas L3 (28).
Por esta razn muchos investigadores consideran
que este modeio para A. caninum no es
fisiolgico, en cambio ia prueba precinica del
candidato requiere ia vacunacin de perros antes
de hacer un reto (29).
Estudios reaiizados en ratones BALB/c al ser
inmunizados con Ac-asp-1 recombinante
precipitada con saideaiuminio obtuvieron una
proteccin de 58% y 72%, pero no midieron ios
niveies de anticuerpos de ios animales
inmunizados que pudieran ser comparados con
io obtenido en el presente estudio (30).
Otros trabajos se han realizado utiiizando
protenas de excrecin / secrecin de
Ancylostoma sp como posible candidato
vacunal, se han medido ios efectos de ia
combi naci n de antgenos ASP2 y ia
metaloproteasa 1 en hamsters infectados
y enfermos con Ancylostoma ceylanicum,
estas fueron clonadas y expresadas en
Pichia pastoris y cuando se inmunizaron
animales con esta protena se encontraron
altos ttulos de IgG para ASP-2 (1:62,850)
y ant i MTPl ( 1: 151, 356) los cuaies
di smi nuyeron a travs del ti empo. La
combinacin de estos dos antgenos no
presentaron efectos significativos, pero si
presentaron proteccin en ia reduccin de
ia carga parasi tari a y mej oraron
perceptibiemente ios parmetros cinico-
patol gi cos asociados a enfermedad
aumentandovaioresdeia hemoglobina y pesos
corporaies en hamsters infectados (31).
En este estudio se encontr que ia concentracin
de anticuerpos de tipo IgG aument desde ia
primera inmunizacin, gracias a que el pismido
persisti en ei tiempo. Esto se pudo confirmar
por medio de ensayos ELISA anti-ASP-1
reaiizados en ios das O, 10 y 20
postinmunizacin. Por otro iado, se utiliz la
tcnica de inmunohistoqumica para confirmar
que ASP-1 se encuentra iocaiizada en ei intestino
dei aduito de A caninum. Un trabajo simiiar
fue reaiizado por Zhan et al (9) utilizando
como blanco una glutation S-tranferasa (Ac-
GST-1), y por medio de inmunolocalizacin y
ELISA confirmaron que Ac-GST-1 se iocaiiza
en ia hipodermis, tejido muscuiar e intestino
de aduitos de A. caninum (32). Lo anterior
permite conciuir que por medio de la utilizacin
de la inmunohistoqumica, que tiene el mismo
principio de ia inmunoiocazacin, para
determinar ia ubicacin de ia ASP~1 en el
nematodo reconocida por ios anticuerpos
desarroilados durante ia inmunizacin con
ei pismido recombinante io que muestra ia
especificidad de la respuesta suscitada por
ia protena expresada por ei pismido
i nocul ado por va i nt r amuscul ar e
intragianduiarenei modelo murino.
En este trabajo se obtuvo un pismido pcDNA3-
ASPl que no present reacciones desfavorables
en ratones BALB/c ai ser administrado por va
intraglanduiar e intramuscuiar, adems se indujo
una respuesta de tipo humoral contra ia protena
de excrecin/secrecin ASPl de A. caninum.
Ei plsmido persisti en ei tiempo y ia respuesta
dei sistema inmune mejor con ei refuerzo de la
inmunizacin, loque permiti la iocaiizacindel
antgeno y su fuerte reconocimiento por ios
anticuerpos producidos mediante ia inmunizacin
con ei plsmido.
En conciusin, se demostr que ia utizacin de
pcDNA3-ASPl no produjo reacciones
Giraldo - Inmunugenicidad de la proteina recombinante ASPIR
1675
desfavorables en ratones BALB/C y
concomitantemente indujo respuesta humorai
contra la protena pcDNA3-ASPl de excrecin/
secrecin de ancyiostoma caninum en ratones.
Con ia obtencin de estos resultados se
pretender probar el plsmido recombinante
en un modelo canino y de igual manera saber
si se genera una respuesta inmune que permita
obtener un nuevo candidato a vacuna.
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