Analisis Bilirubin: Sebuah Tinjauan Singkat

Reaksi bilirubin dengan larutan asam sulfanilat diazotisasi untuk membentuk produk berwarna
pertama kali dijelaskan oleh Ehrlich pada tahun 1883 dengan menggunakan sampel urin. Sejak saat
itu, ini jenis reaksi (bilirubin dengan larutan asam sulfanilat diazotisasi) telah disebut sebagai reaksi
diazo klasik, reaksi di mana semua metode yang umum digunakan saat ini didasarkan. Pada tahun
1913, van den Bergh menemukan bahwa reaksi diazo dapat diterapkan untuk sampel serum tetapi
hanya di hadapan akselerator (pelarut). Namun, metodologi ini memiliki kesalahan yang terkait
dengan itu. Ia tidak sampai 1937 bahwa Malloy dan Evelyn dikembangkan pertama metodologi yang
berguna secara klinis untuk kuantisasi bilirubin dalam sampel serum menggunakan reaksi diazo
klasik dengan larutan metanol 50% sebagai akselerator. Pada tahun 1938, Jendrassik dan Grof
dijelaskan metode menggunakan reaksi diazo dengan kafein benzoat-asetat sebagai akselerator. Hari
ini, semua metode yang umum digunakan untuk mengukur bilirubin dan fraksinya merupakan
modifikasi dari teknik yang dijelaskan oleh Malloy dan Evelyn. Bilirubin total dan bilirubin
terkonjugasi diukur dan bilirubin tak terkonjugasi ditentukan dengan mengurangi bilirubin
terkonjugasi dari total bilirubin.
Bilirubin juga telah diukur dengan menggunakan bilirubinometry pada populasi neonatal.
Metodologi ini hanya berguna pada populasi neonatal karena kehadiran senyawa carotinoid dalam
serum dewasa yang menyebabkan gangguan positif yang kuat pada populasi orang dewasa.
Bilirubinometry melibatkan pengukuran cahaya yang dipantulkan dari kulit menggunakan dua
panjang gelombang yang memberikan indeks numerik berdasarkan spektral reflektansi.
Bilirubinometers generasi baru menggunakan microspectrophotometers yang menentukan
kepadatan optik dari bilirubin, hemoglobin, dan melanin di lapisan subkutan kulit bayi. Isolasi
Matematika hemoglobin dan melanin memungkinkan pengukuran kepadatan optik yang diciptakan
oleh bilirubin.
Bila menggunakan beberapa metode yang dijelaskan sebelumnya , dua dari tiga fraksi bilirubin
diidentifikasi : terkonjugasi ( direct ) dan tak terkonjugasi ( tidak langsung ) bilirubin . Tak
terkonjugasi ( tidak langsung ) bilirubin adalah zat nonpolar dan air - larut yang ditemukan dalam
plasma terikat dengan albumin . Karena karakteristik ini , bilirubin tak terkonjugasi hanya akan
bereaksi dengan larutan asam sulfanilat diazotisasi ( diazo reagen ) di hadapan sebuah akselerator (
pelarut ) . Terkonjugasi ( direct ) bilirubin adalah senyawa polar dan larut dalam air yang ditemukan
dalam plasma dalam keadaan bebas ( tidak terikat pada protein ada) . Ini jenis bilirubin akan
bereaksi dengan larutan asam sulfanilat diazotisasi secara langsung ( tanpa akselerator ) . Dengan
demikian , fraksi bilirubin terkonjugasi dan tak terkonjugasi secara historis telah dibedakan oleh
kelarutan fraksi . Konjugasi bilirubin bereaksi dengan tidak adanya akselerator , sedangkan bilirubin
tak terkonjugasi membutuhkan akselerator . Sementara selama bertahun-tahun hasil bilirubin
dilaporkan sebagai langsung dan tidak langsung , terminologi ini sekarang usang . Hasil bilirubin
langsung dan tidak langsung harus dilaporkan sebagai terkonjugasi dan tak terkonjugasi , masing-
masing.
Fraksi ketiga bilirubin ini disebut sebagai "delta" bilirubin. Delta bilirubin adalah bilirubin
terkonjugasi yang kovalen terikat pada albumin. Ini sebagian kecil dari bilirubin dilihat hanya bila ada
obstruksi hepatik signifikan. Karena molekul melekat pada albumin, itu terlalu besar untuk disaring
oleh glomerulus dan diekskresikan dalam urin. Ini sebagian kecil dari bilirubin, jika ada, akan
bereaksi di sebagian besar metode laboratorium sebagai conjugated bilirubin. Dengan demikian,
total bilirubin terdiri dari tiga fraksi: terkonjugasi, tak terkonjugasi, dan delta bilirubin. Ketiga fraksi
bersama-sama dikenal sebagai bilirubin total.
Spesimen dan Storage
Metode total bilirubin menggunakan larutan asam sulfanilat diazotisasi dapat dilakukan di kedua
serum atau plasma. Serum, bagaimanapun, lebih disukai untuk prosedur Malloy-Evelyn karena
penambahan alkohol dalam analisis dapat memicu protein dan menyebabkan gangguan pada
metode ini. Contoh puasa lebih disukai karena adanya lipemia akan meningkatkan konsentrasi
bilirubin diukur. Sampel Hemolyzed harus dihindari karena dapat mengurangi reaksi bilirubin dengan
reagen diazo. Bilirubin sangat sensitif terhadap dan dihancurkan oleh cahaya, sehingga spesimen
harus dilindungi dari cahaya. Jika terlindungi dari cahaya, nilai bilirubin dapat mengurangi sebesar
30% -50% per jam. Jika serum atau plasma dipisahkan dari sel dan disimpan dalam gelap, sangat
stabil untuk 2 hari pada suhu kamar, 1 minggu pada suhu 4 C, dan tanpa batas waktu pada? 20 C.
Metode
Tidak ada metode referensi pilihan atau standardisasi analisis bilirubin, namun AmericanAssociation
untuk Kimia Klinik dan Badan Standar Nasional telah menerbitkan metode referensi calon bilirubin
total, dimodifikasi prosedur Jendrassik-Grof menggunakan kafein benzoat sebagai pelarut a.
Karena mereka berdua memiliki presisi yang dapat diterima dan disesuaikan dengan instrumen
otomatis banyak, prosedur Jendrassik-Grof atau Malloy-Evelyn adalah yang paling sering
Metode yang digunakan untuk mengukur bilirubin. Metode Jendrassik-Grof sedikit lebih kompleks,
tetapi memiliki beberapa keuntungan atas metode Malloy-Evelyn:
Tidak dipengaruhi oleh perubahan pH
sensitif untuk variasi 50 kali lipat konsentrasi protein sampel
Menjaga sensitivitas optik bahkan pada konsentrasi bilirubin rendah
Memiliki kekeruhan minimal dan serum relatif konstan kosong
Apakah tidak terpengaruh oleh hemoglobin hingga 750 mg / dL
Karena bab ini tidak memungkinkan untuk penjelasan rinci tentang semua metodologi tes bilirubin
disebutkan sebelumnya, hanya prinsip-prinsip yang paling banyak digunakan untuk
mengukur bilirubin dalam dewasa dan populasi anak ditutupi.