Cmo se realiza el cultivo?

Sembrar es colocar una muestra de inculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento de los
microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un gel (Agar) al
que se han aadido las substancias que necesitan los microorganismos para crecer. A esto lo
llamamos medio de cultivo. A veces se aaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el
crecimiento de otras bacterias que podran contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros
tipos de medios de cultivo, como tubos de vidrio con gel, frascos con lquidos nutritivos para los
microorganismos.
A continuacin se procede a la "incubacin" del medio ya sembrado. En cada caso se hace en
condiciones particulares de presin de oxgeno, temperatura, agitacin, duracin, etc. Muchas de las
bacterias patgenas crecen bien a temperaturas cercanas a los 37C habituales de nuestro organismo.
Si el cultivo bacteriano tiene xito, crecern "colonias" de bacterias en el medio de cultivo. Estas
colonias tienen caractersticas de color, forma, tamao etc. propias de cada bacteria y esto nos ayuda
a identificarlas. Tambin se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas bioqumicas o de
otro tipo para lograr su identificacin. Algunas bacterias son muy difciles de cultivar, otras tardan
mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido cultivar.
Sistemas de Siembra: Antes de iniciar la siembra se deben cumplir determinadas condiciones:
Esterilizacin de los instrumentos de trabajo y de los medios de cultivo. Los medios de cultivo se
esterilizan con calor hmedo en la autoclave y los materiales de vidrio se esterilizan con calor seco en
el horno Pasteur. En el caso de objetos metlicos, como el asa de siembra, que se esterilizan en el
momento de su utilizacin, se mantienen en la llama hasta que se pongan al rojo, teniendo la
precaucin de enfriarlos antes de su uso.
Que el inculo no se contamine, modifique o destruya para lo cual se utiliza calor directo, flameando
las bocas de los tubos de ensayo, matraces, la pipeta y dems elementos antes y despus de su
utilizacin.
Esterilizacin del rea de trabajo para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de
los medios de cultivo. Se utilizan la cmara de flujo laminar. Si no se dispone de ella, se utiliza un
mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulacin del aire en sentido vertical y hacia arriba, es
capaz de crear un ambiente semisteril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma
que los riesgos de contaminacin disminuyen considerablemente.
Siembra de medio slido a medio lquido
Marque correctamente los tubos con el nmero del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha. Para
crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de el. Esterilice un asa
recta a la llama de un mechero y djela enfriar
Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo.
Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee
nuevamente la boca del tubo, tapelo y dejelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estril en
el cual va a colocar la muestra, destapelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el
asa con la muestra obtenida. Realice movimientos de rotacin con el asa para emulsionar con el caldo
las paredes del tubo.
Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero despus de usarla. Incube
los tubos a 37C por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda
transparente.
Requerimientos
Los medios de cultivo, para poder ser utilizados y garantizar que los resultados obtenidos a partir de
ellos sean confiables, deben cumplir con los siguientes requisitos:
Disponibilidad de nutrientes.
Consistencia adecuada del medio.
Presencia o ausencia de oxgeno y otros gases.
Condiciones adecuadas de humedad (mantener en frigorfico).
Luz ambiental.
pH adecuado.
Temperatura.
Esterilidad.



Metodologa
Recoger muestras.
Hacer el extendido con un palillo de madera.
Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las clulas
gram positivas se tien de color azul-prpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos o 5 segn la concentracin del reactivo (parte
crtica de la coloracin).
Enjuagar con agua.
Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1 minuto. Este tinte dejar
de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin.
Explicacin
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas
como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I
2
(yodo)
en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el
yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de
la clula bacteriana. El I
2
entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el
cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma
es soluble el complejo I
2
/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que
los Gram negativos s lo hacen.
Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la coloracin
de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen
violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de
contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram
positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de
contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este
mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta de
metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de
metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior;
despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal
tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck,
pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y
el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo.
Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen
la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los
microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores
resultados dan en la coloracin Gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de
metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al
compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la
molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es lahexametil-p-rosanilina (violeta
cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo
3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices
rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el
mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram.
La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino
que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales
superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos
de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede
variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas.
MTODO DE MONTAJE HMEDO
El procedimiento se lleva a cabo con el ansa de gancho o con una aguja montada sobre un trozo de
varilla, se procede tomando una pequea porcin de la colonia a estudiar (a veces es necesario
ayudarse con otra ansa). La muestra debe tomarse de un sitio intermedio entre el centro y la periferia
de la colonia. Este pequeo fragmento de colonia se transfiere a una gota de lactofenol azul de
algodn en un portaobjeto y se cubre con un cubreobjetos. Se presiona suavemente directamente
sobre el fragmento de la colonia para deprimir las hifas y otras estructuras y permitir un mejor examen
microscpico.
Ventajas
Eficiente para la identificacin de muchos hongos
Es rpida y fcil.
Desventajas
Dificultad para conservar la continuidad entre las esporas, los frutos e hifas debido al riguroso
tratamiento.
MTODO DE MONTAJE CON CINTA ADHESIVA
Se aconseja usar cinta adhesiva de alta transparencia. Se hace un doblez de una tira de 4 cm, con el
lado adhesivo hacia afuera, y se sostiene entre los dedos pulgar e ndice. El lado adhesivo se presiona
firmemente contra la superficie de la colonia del hongo. El micelio areo se adhiere a la superficie y
puede separarse del resto. Las tiras de cinta inoculadas se colocan en una gotita de lactofenol-azul de
algodn en un portaobjeto.
Penicillium spp.
El gnero Penicillium (excepto P. marneffei) son hongos filamentosos, que se encuentran en suelo,
vegetacin y en aire. La mayora de especies son considerados contaminantes, pero se han
encontrado como agentes causales de infeccin en pacientes inmunocomprometidos (Ver micosis
oportunistas). En infecciones superficiales se han encontrado causando otomicosis y queratitis
Contiene varias especies, dentro de las ms comunes encontramos P. chrysogenum, P. citrinum, P.
marneffei, P. purpurogenum, entre otras. Las colonias de este gnero son planas, aterciopeladas,
pulverulentas, lanosas, o algodonosas. De crecimiento rpido. Inicialmente tienen un aspecto blanco
que se torna verde azul, verde gris, verde oliva o amarillo.
_
Ttulo: Cultivode Penicillium spp.Agar Sabouraud. Desarrollo promedio 1 a 3
das.
__Descripcin:Colonias de crecimiento rpido, pulverulentas de color verde.



__Ttulo: Morfologa microscpica a partir de cultivo dePenicillium spp. Azul de
lactofenol, 40x.
__Descripcin: Conidiforos rectos, hialinos, con fialides que nacen sobre
mtulas. Conidias producidas en cadena, de forma __esfricas, hialinas, de
pared delgada.


Aspergillus spp.
Aspergillus es un hongo filamentoso cosmopolita aislado de la naturaleza comnmente aislado del
suelo, restos vegetales y el aire ambiental. El genero est compuesto por ms de 180 especies, de las
cuales 20 se han considerado patgenos oportunistas en humanos (Ver Micosis oportunistas). A.
fumigatus es la especie mayormente aislada y es reconocido como un patgeno humano. Las
especies relacionadas con micosis cutneas y onicomicosis son las especies de A. flavus, A. niger, A.
terreus, A. glaucus y A. fumigatus. Los aislamientos se pueden obtener en Sabouraud y Papa Dextrosa
Agar a 28 C. Este ltimo es til para inducir la esporulacin de este grupo de hongos. A continuacin
se describen las caractersticas macro y microscpicas de las especies ms comunes de Aspergillus.

Ttulo: Cultivo deAspergillus flavus. Agar Sabouraud.
__Descripcin: Colonias amarillas-verdosas pulverulentas o
aterciopeladas.


Ttulo: Morfologa microscpica a partir de cultivo deAspergillus
clavatus var. gigantus. Azul de lactofenol, 40x.
__Descripcin: Conidiforos hialinos de pared delgada.
Cabezuelas radiadas. Vesculas en forma de clava.
Fialides __uniseriadas. Conidias de pared delgada, verde plidas,
elipsoidales.


Mueller Hinton Agar
Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los
antimicrobianos. Adems es til con el agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de
microorganismos nutricionalmente exigentes.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Infusin de carne 300.0 Suspender 37 g del medio deshidratado en un litro de
agua destilada. Dejar embeber de 10 a 15 minutos.
Calentar con agitacin frecuente y hervir durante 1
minuto. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar a
45-50C y distribuir a cajas de Petri (o agregar los
suplementos que se desee) hasta un nivel de 4 mm
sobre una superficie horizontal (25-30 ml en placas de 9
cm de dimetro).
Peptona cida de casena 17.5
Almidn 1.5
Agar 15.0
pH final: 7.3 0.1


Susceptibilidad a antibiticos y sulfonamidas

El agar Mueller Hinton 2 es un medio para realizar pruebas de susceptibilidad antimicrobiana mediante
el mtodo de difusin en disco.
La composicin del medio Mueller Hinton 2 permite el crecimiento de las bacterias no exigentes
(enterobacterias, bacilos Gram-negativos no fermentadores, estafilococos y enterococos) encontrados
en patologa humana, mientras que garantiza mnimas interferencias entre los componentes del medio
y el resultado de la prueba de susceptibilidad antimicrobiana.
la concentracin de iones divalentes en el medio est ajustada para asegurar una determinacin ms
exacta de la sensibilidad de Pseudomonas frente a los aminoglicsidos y a las tetracilinas.
La baja concentracin de timina - timidina (inhibidores de sulfonamidas) restringe el crecimiento
alrededor de los discos, permitiendo una medida ms exacta de las zonas de inhibicin.
El uso del medio Mueller Hinton 2 est conforme con estndares NCCLS y CA-SFM.
Sabouraud Glucosado Agar
Medio utilizado para el aislamiento, identificacin y conservacin de hongos patgenos y saprfitos.
Tambin es til para el cultivo de levaduras.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones
Pluripeptona 10.0 Suspender 65 g del polvo por litro de agua destilada.
Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar
agitando frecuentemente y hervir 1 minuto hasta disolver.
Distribuir y esterilizar 15 minutos a 118-121C. Mantener en
lugar fresco, pues la exposicin al calor hidroliza los
componentes. Distribuir en placas o en tubos con cierre
hermtico
Glucosa 40.0
Cloranfenicol 0.05
Agar 15.0
pH final: 5.6 0.2
Contiene normalmente:
6

40 g/L glucosa
10 g/L pluripeptona
15 g/L agar
0,05 g/L [cloranfenicol]
pH 5.6