UNIDAD V: MTODOS

CROMATOGRFICOS






Equipo 5:
Aguilar Popo Alfredo
Amayo Regino Franco Alberto
Reyes Vasquez Christian Daniel
Rojas Martnez Laura Edith
Vicente Andrade Ricardo
_

Anlisis
Instrumental
Contenido


UNIDAD V: MTODOS CROMATOGRFICOS ................................................................ 0
CROMATOGRAFA ........................................................................................................... 2
CROMATOGRAFA DE GASES ........................................................................................ 4
Tipos de cromatografa de Gases .................................................................................. 4
Objetivo de la cromatografa de gases ........................................................................... 4
Aplicaciones de la cromatografa de gases .................................................................... 4
CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA (HPLC) .............................................. 6
Cromatografa de fase normal ........................................................................................ 6
Cromatografa de fase reversa ....................................................................................... 6
Cromatografa de exclusin molecular ........................................................................... 7
Cromatografa de intercambio inico .............................................................................. 7
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (CCF) ....................................................................... 8
Mtodos qumicos. ......................................................................................................... 9
Mtodos fsicos. ........................................................................................................... 10
CROMATOGRAFA DE FLUIDOS SUPERCRTICOS ..................................................... 11
BIBLIOGRAFA ................................................................................................................ 12


CROMATOGRAFA
La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de
mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia. Es un
conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo
es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y
determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en
el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado una retencin
diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en
funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla.
La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen
mutuamente:
Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que
puedan ser usados posteriormente.
Medir la proporcin de los componentes de la mezcla. En este caso, las
cantidades de material empleadas son pequeas.
Las distintas tcnicas cromatogrficas se pueden dividir segn cmo est
dispuesta la fase estacionaria:
Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre
un papel. Las principales tcnicas son:
Cromatografa en papel
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna.
Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen:
Cromatografa de lquidos
Cromatografa de gases
Cromatografa de fluidos supercrticos
La cromatografa de gases incluye a numerosos compuestos orgnicos. En el
caso de compuestos no voltiles se recurre a procesos denominados de
derivacin, a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilicen en las
condiciones de anlisis.
Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography), que es la
tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente en su
modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter no polar, y
la fase mvil posee carcter polar. El nombre de reversa viene dado porque
tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de slice o almina, de
carcter polar, y por tanto la fase mvil era un disolvente orgnico poco polar.


Tabla 1. Tipos de cromatografa y su fase mvil y estacionaria comnmente
utilizadas
Tipos
Fase
mvil
Fase estacionaria
Cromatografa en
papel
Lquido Papel de celulosa.
Cromatografa en
capa fina
Lquido Gel de slice o almina.
Cromatografa de
gases
Gas
Columnas capilares de slice fundida, columnas
empacadas con tierras diatomeas hechas de tubos
de vidrio o metal.
Cromatografa
lquida
en fase reversa
Lquido
(polar)
Empaques de siloxano de octilo o siloxano de
octadecilo.
Cromatografa
lquida
en fase normal
Lquido
(menos
polar)
Empaques de slice, almina o un soporte al que se
unen qumicamente grupos polares (ciano, amino,
etc).
Cromatografa
lquida
de intercambio
inico
Lquido
(polar)
Resinas de intercambio inico.
Cromatografa
lquida
de exclusin
Lquido
Empaques de pequeas partculas de slice o
polmeros con red de poros uniforme.
Cromatografa
lquida
de adsorcin
Lquido
Partculas finamente divididas de slice o de
almina.
Cromatografa de
fluidos
supercrticos
Lquido
Columnas abiertas de slice fundida con
recubrimientos internos de varios tipos de siloxanos
enlazados y de enlaces cruzados.


CROMATOGRAFA DE GASES
La cromatografa de gases es la tcnica a elegir para la separacin de
compuestos orgnicos e inorgnicos trmicamente estables y voltiles
Tipos de cromatografa de Gases
La cromatografa gas-lquido (GLC) lleva a cabo la separacin por medio del
reparto de los componentes de una mezcla qumica, entre una fase gaseosa que
fluye (mvil) y una fase lquida estacionaria sujeta a un soporte slido. La
cromatografa gas-slido (GSC) utiliza un absorbente slido como fase
estacionaria. La disponibilidad de detectores verstiles y especficos, y la
posibilidad de acoplar el cromatgrafo de gases a un espectrmetro de masas o a
un espectrofotmetro de infrarrojo, amplan an ms la utilidad de la cromatografa
de gases.
Objetivo de la cromatografa de gases
Un cromatgrafo de gases consiste en varios mdulos bsicos ensamblados para:
Proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase mvil)
Permitir la introduccin de vapores de la muestra en la corriente de gas que
fluye
Contener la longitud apropiada de fase estacionaria
Mantener la columna a temperatura apropiada (o la secuencia del programa
de temperatura)
Detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna
Proveer una seal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada
componente
Aplicaciones de la cromatografa de gases
La cromatografa de gases tiene amplia aplicacin, en las industrias se enfoca
principalmente a evaluar la pureza de los reactantes y productos de reaccin o
bien a monitorear la secuencia de la reaccin, para los fabricantes de reactivos
qumicos su aplicacin para la determinacin de la pureza es lo ms importante.
En la investigacin es un auxiliar indispensable para diversas tcnicas de
evaluacin, entre las principales estn los estudios cinticos, anlisis de adsorcin
a temperatura programada, determinacin de reas especficas por adsorcin de
gas y determinacin de isotermas de adsorcin.
En el campo tambin pueden ser aplicados, principalmente en estudios de
contaminantes del agua: insecticidas en agua, pesticidas en aguas de lagos,
lagunas, ros; desechos industriales descargados en ros o lagunas.
En la industria del petrleo juega una funcin primordial, por medio de la
cromatografa se pueden analizar los constituyentes de las gasolinas, las mezclas
de gases de refinera, gases de combustin, etc.
Las aplicaciones de la cromatografa son mltiples y la convierten en la tcnica de
anlisis ms poderosa que existe, su utilizacin requiere principalmente de
constancia y entusiasmo.

CROMATOGRAFA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA
(HPLC)
La Cromatografa lquida de alta eficacia o High performance liquid
chromatography (HPLC) es un tipo de cromatografa en columna utilizada
frecuentemente en bioqumica y qumica analtica. Tambin se la denomina a
veces Cromatografa lquida de alta presin o Cromatografa Lquida de Alta
Resolucin (High pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta
terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica
utilizada para separar los componentes de una mezcla basndose en diferentes
tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatogrfica.

En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs
de la fase estacionaria mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin a
travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas
cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las
interacciones qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que adelantan
por la columna.

Cromatografa de fase normal
La cromatografa de fase (NP-HPLC) normal fue el primer tipo de sistema HPLC
utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los compuestos
en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase
mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El
compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de
adsorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la
interaccin entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar aumenta el tiempo
de retencin.
La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto
de inters, sino tambin en factores estericos de forma que los ismeros
estructurales a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de
disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los
compuestos mientras que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el
tiempo de retencin.
Cromatografa de fase reversa
La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y
una fase mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms
comunes de este tipo de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, donde la
R es una cadena alquil tal como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es
mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las molculas de
carcter polar eluyen ms rpidamente.
El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y
disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La cromatografa
de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna
especificacin adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio
de las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un
disolvente relativamente polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase
estacionaria apolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a la fase
estacionaria es la disminucin del rea del segmento apolar del analito expuesto al
disolvente. Este efecto hidrofbico est dominado por el aumento de la entropa, y
la consecuente disminucin de la energa libre, asociada con la minimizacin de la
interfase compuesto-disolvente polar. El efecto hidrofbico disminuye con la
adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica el coeficiente de
particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.
Cromatografa de exclusin molecular
La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa
por filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao.
Generalmente se trata de una cromatografa de baja resolucin de forma que se
suele utilizar en los pasos finales del proceso de purificacin. Tambin es muy til
para la determinacin de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las
protenas purificadas.
La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en
columna por el cual las molculas se separan en solucin segn su peso
molecular, o ms precisamente, segn su radio de Stokes.
Cromatografa de intercambio inico
En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin
electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase
estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga
opuesta son retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores inicos
son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores inicos de celulosa y
dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de tamao de poro controlado. En
general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada carga y
radio pequeo. Un incremento en la concentracin del contrain (respecto a los
grupos funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin. Un incremento en
el pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio catinico
mientras que una disminucin del pH reduce el tiempo de retencin en las
cromatografas de intercambio aninico.
CROMATOGRAFA EN CAPA FINA (CCF)
La cromatografa en capa fina (CCF) es
una tcnica cromatogrfica donde la fase
estacionaria es una capa uniforme de un
adsorbente mantenido sobre una placa, la
cual puede ser de vidrio, aluminio u otro
soporte. En cromatografa en capa fina se
utiliza una placa cromatogrfica inmersa
verticalmente en un eluyente apolar; la
placa cromatogrfica consiste en una fase
estacionaria polar (comnmente se utiliza
slica gel) adherida a una superficie slida
con algn agente cementante. El eluyente
debe ser un compuesto lquido apolar, generalmente orgnico. Para realizar la
CCF, se debe apoyar la placa cromatografica sobre algn recipiente o cmara que
contenga la fase lquida a aproximadamente 1 cm (la distancia entre el principio de
la placa y la muestra que se desea analizar).


La eleccin del eluyente depende del componente que se va a separar y del
material en que la separacin se lleva a cabo. Un mtodo que se emplea para la
seleccin del eluyente es una cromatografa en capa fina con distintos disolventes
y unas muestras patrn.

Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
ter de petrleo
ter dietlico
Ciclohexano
Acetato de etilo
Tetracloruro de carbono
Piridina
Benceno
Etanol
Cloroformo
Metanol
Diclorometano
Agua
cido actico

En la eleccin del eluyente influyen varios factores:
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes a menos que se conozcan las
proporciones de los disolventes que conformen la mezcla (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy voltiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la
polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la
misma placa para aplicar otros eluyentes ms polares, hasta dar con el ms
apropiado.
Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar varias
muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos
eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente
radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la
separacin se realiza de una manera ms eficaz.
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el
mtodo ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa
casi en vertical, por la accin de la capilaridad. La cromatografa se realiza en una
cubeta. Para conseguir la mxima saturacin posible de la atmsfera de la
cmara, las paredes se impregnan del eluyente.
Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del desarrollo,
para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo, por lo general,
no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografa cualitativa suele ser de
un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografa preparativa puede
llegar a un par de horas.
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin
de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:
Mtodos qumicos.
Consisten en realizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y los
componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos
reveladores.
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos
coloreados con los componentes orgnicos, pero las manchas desaparecen con el
tiempo con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con
los componentes orgnicos produciendo manchas negras.
Tambin es utilizado el permanganato potsico, que deja unas manchas de color
amarillo. El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de
componente separado.
Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehdos y cetonas).
Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos).
Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
Ninhidrina (para aminocidos).
Mtodos fsicos.
El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal
forma que al colocar la placa bajo una lmpara ultravioleta, y dependiendo del
indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas
en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia con lo que pueden ser
detectados directamente en una lmpara de ultravioleta.
La constante RF es simplemente una manera de expresar la posicin de un
compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un
componente. Se define como: RF= Distancia de la muestra desde el
origen/Distancia del eluyente desde el origen
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de
la mancha, los clculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF
sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones como el espesor de
la placa, fase mvil, fase estacionaria, y la cantidad de muestra. El mximo valor
de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.55 y 0.7.


CROMATOGRAFA DE FLUIDOS SUPERCRTICOS

La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una tcnica hbrida entre la
cromatografa de gases (GC) y la HPLC, que combina lo mejor de ambas tcnicas.
Esta tcnica es importante porque permite la separacin de mezclas en las que no
es adecuada la aplicacin de la GC ni de la HPLC. En concreto, se aplica a
compuestos no voltiles o trmicamente inestables que no pueden ser separados
mediante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su
deteccin en HPLC
La temperatura crtica de una sustancia es la temperatura por encima de la cual no
puede existir en la fase lquida independientemente de la presin. La presin
crtica es la presin de vapor de una sustancia a su temperatura crtica. Una
sustancia a temperaturas y presiones por encima de su temperatura y de su
presin crtica (punto crtico) se denomina fluido supercrtico.
Los fluidos supercrticos tienen densidades, viscosidades y otras propiedades que
son intermedias entre las caractersticas de esa sustancia en estado gaseoso y en
estado lquido.
Las propiedades seleccionadas son aquellas que son significativas para la
cromatografa de gases, lquidos y fluidos supercrticos, as como la extraccin de
fluidos supercrticos. Una propiedad importante de los fluidos supercrticos, que
est relacionada con sus densidades elevadas (de 0,2 a 0,5 g/cm3), es su notable
capacidad para disolver molculas grandes no voltiles. Por ejemplo, el dixido de
carbono supercrtico disuelve fcilmente n- alcanos que poseen entre 5 y 30
tomos de carbono. Una segunda propiedad notable de los fluidos supercrticos es
que los analitos disueltos en ellos pueden ser fcilmente recuperados por el
procedimiento simple de permitir que las disoluciones se equilibren con la
atmsfera a temperaturas relativamente bajas. Otra ventaja de los fluidos
supercrticos es que son baratos, inocuos y no son sustancias txicas, por lo que
se pueden dejar evaporar libremente en la atmsfera sin efectos ambientales
dainos.

La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una modalidad hbrida entre la
cromatografa de gases y de lquidos que combina algunas caractersticas de cada
una de ellas.
Esta tcnica es una de los tres tipos importantes de cromatografa en columna,
sta permite la separacin y determinacin de compuestos que no son
manipulados ni por la cromatografa de gases ni por la de lquidos: compuestos no
voltiles o trmicamente lbiles para los que la cromatografa de gases es
inaplicable y los compuestos que tienen grupos funcionales que no son
detectables por las tcnicas espectroscpicas o electroqumicas empleadas en
cromatografa de lquidos.


BIBLIOGRAFA
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
http://ocw.uv.es/ocw-formacio-permanent/2011-1-35_Manual.pdf
Skoog, Douglas A. y Leary, James J. (1994). Anlisis Instrumental. Armenia
McGraw-Hill.
McNair, Harold M. & Miller, James M. (1998). Basic Gas Chromatography.
Canada:
Willard, H. H., Merritt, L. L., Dean, J.A., Settle, F.A. Mtodos Instrumentales de
Anlisis, editorial CECSA.