Cromatografia su strato sottile Tecnica operativa della TLC By Chimicando

CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE

La cromatografia su strato sottile (TLC Thin Layer Chromatography), come tecnica microanalitica
preferibile alla cromatografia su colonna e alla cromatografia su carta per le sue pi alte
caratteristiche di efficienza, risoluzione e riproducibilit. La fase stazionaria immobilizzata sotto
forma di strato sottile, su una superficie, generalmente piana, lungo la quale viene fatta correre la
fase mobile (per capillarit, per gravit oppure esercitando una certa pressione). Pi precisamente la
fase stazionaria costituita da un materiale granulare omogeneo fatto aderire a un supporto piano o
pi raramente (cilindrico); linsieme della fase stazionaria e del supporto detto lastrina.
Se la fase stazionaria un materiale polare (come il gel di silice), la separazione di miscele dovuta
principalmente a meccanismi di adsorbimento e perci la fase mobile deve essere non polare; in
questo caso si parla di cromatografia in fase diretta. Se invece lo stato modificato (o imbevuto)
con sostanze non polari, la separazione dovuta principalmente a meccanismi di ripartizione e
quindi la fase mobile deve essere relativamente polare; in questo caso si parla di cromatografia in
fase inversa.
Oggi si possono preparare strati di vario tipo, che consentono di sfruttare, per la separazione , anche
fenomeni di scambio ionico e di esclusione.
La TLC consente di ottenere efficaci separazioni in tempi che variano da poche decine di minuti a
1-2 ore, ma nelle versioni pi moderne questi tempi sono molto pi brevi.
La miscela da separare seminata sul lato pi corto dello strato, sotto forma di piccole macchie
dopodich si immerge parzialmente la lastrina nelleluente, scelto in modo opportuno, il quale
migra e trascina, con velocit diverse i singoli componenti. Questo processo, in cui la miscela si
suddivide nei diversi componenti, detto sviluppo.
Le applicazioni della TLC, come in genere per tutte le tecniche cromatografiche, interessano
praticamente tutti i campi di lavoro e di ricerca, spaziando dalle sostanze organiche, naturali o
sintetiche, fino agli ioni inorganici.

TECNICA OPERATIVA DELLA TLC

1. PREPARAZIONE DELLA LASTRA
La fase stazionaria applicata alla lastra (le dimensioni possono variare a seconda del
modello) con un adatto stratificatore, sotto forma di pasta fluida molto omogenea, ottenuta
aggiungendo alladsorbente una giusta quantit di acqua e un po di gesso, che funge da
legante.
Lo spessore delladsorbente deve essere omogeneo (0,2-0,4 mm). Dopo essiccazione
allaria, le lastre devono essere attivate in stufa per 30-60 min, a 110-200C, e raffreddate
poi in essiccatore. Lattivit di un adsorbente dipende dalla quantit di acqua presente
nelladsorbente stesso, la qual ne blocca i centri attivi, per questo importante la fase di
essiccazione.
Fortunatamente esistono in commercio lastre pronte alluso delle pi svariate dimensioni
create industrialmente, a prezzi relativamente contenuti.
In genere i campioni vengono deposti luno di fianco allaltro, a 1-1,5 cm di distanza e a 2
cm dal bordo inferiore della lastrina.

2. DEPOSIZIONE DEL CAMPIONE
Questa una fase particolarmente delicata dellanalisi; il campione deve essere deposto alla
base della lastrina, come macchia (deposizione a goccia) o come striscia (deposizione
lineare), nel modo pi compatto possibile.
Bibliografia:
Laboratorio di Chimica Organica e Bio-Organica, A. Danieli, Hoepli, ISBN 88-203-2249-8
Analisi Chimica Strumentale, R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Zanichelli, ISBN 88-08-23714-1
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La linea di partenza delle macchie o delle strisce viene tracciata con una matita morbida di
grafite a 1,5-2 cm dal bordo inferiore della lastrina (in ogni caso sopra il livello raggiunto
dalleluente).

Deposizione a goccia. Si usano siringhe micrometriche (capacit da 0,2 2 L) o
microcapillari, che consentono di depositare singole macchie di diametro costante 2-
3 mm al massimo. Il capillare pu essere preparato anche in laboratorio attraverso
lallungamento di piccoli tubi di vetro cavi. Loperazione viene fatta alla temperatura
di rammollimento del vetro attraverso un becco bunsen a fiamma blu.
Il campione deve essere deposto senza abradere lo strato ci provocherebbe una
migrazione eccessiva delle macchie). Si possono depositare da 10 a 100 g di
sostanza; se il campione molto diluito, occorre depositare il campione pi volte e
perci utile asciugare la macchia con un phon in modo da evitare un allargamento
eccessivo.
Deposizione lineare. Pu essere effettuata manualmente con microsiringhe, ma in
commercio sono disponibili dispositivi di semina lineare della lunghezza desiderata
della lunghezza desiderata e con diverse capacit che consentono di depositare
omogenee e compatte.

3. CAMERA DI ELUIZIONE
Si tratta, in genere, di recipienti di vetro di forma e volume opportuni dotati di un coperchio
a tenuta(vedi figura). Se si lavora con solventi acquosi e poco aggressivi, si possono usare
anche recipienti in plastica.

Inserisci figura 13.9 pagina 58

Leluente deve essere collocato sul fondo del recipiente, in modo da raggiungere il livello di
0,5-1 cm; poi si chiude ermeticamente il coperchio e si lascia a condizionare. Il grado di
saturazione (condizionamento) della camera di sviluppo molto importante per la buona
riuscita della separazione cromatografia.
Per ottenere una saturazione ottimale si pone nella camera, appoggiato alla parete, un foglio
di carta da filtro imbevuto di eluente.

4. ELUIZIONE
In questo paragrafo tratteremo solo il caso dello sviluppo ascendente tralasciando i metodi a
sviluppo discendente e orizzontale entrambi meno utilizzati.

Sviluppo ascendente. E la tecnica pi diffusa. La lastrina viene appoggiata sul
fondo della camera, assicurandosi che il solvente non lambisca le macchie.
In genere leluente viene fatto correre fino a 0,5 1 cm dal bordo superiore della
lastra; i tempi necessari per leluizione variano da 20 minuti a un paio dore.

5. RIVELAZIONE DELLE SOSTANZE SEPARATE
Quando lo sviluppo completato, si estrae la lastra dalla camera di eluizione, si segna con
una matita morbida il livello raggiunto dal fronte del solvente e si asciuga strato allaria o
con laiuto di un phon. Se le sostanze eluite non sono tremolabili, si pu porre la lastra in
stufa per qualche minuto a 100-105 C
Se le macchie risultano colorate, quindi visibili ad occhio nudo, non ci sono problemi
altrimenti bisogna ricorrere ad alcuni metodi:

Bibliografia:
Laboratorio di Chimica Organica e Bio-Organica, A. Danieli, Hoepli, ISBN 88-203-2249-8
Analisi Chimica Strumentale, R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Zanichelli, ISBN 88-08-23714-1
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Rivelazione con luce UV. Se le sostanze da rivelare possiedono cromofori derivanti
da particolari gruppi funzionali quali doppi legami coniugati, carbonili, carbossili,
ecc sufficiente illuminare la lastrina con una lampada UV che emetta a 254 e
366 nm; si osservano cos delle macchie luminose sul fondo scuro.
Se invece le sostanze da rivelare non possiedono cromofori, si pu usare una lastra la
cui fase stazionaria, prima o dopo leluizione, viene impreganat di una sostanza
fluorescente ai raggi UV. Illuminando la lastra con le apposite lampade, si osservano
delle macchie scure su sfondo fluorescente.
Gli indicatori di fluorescenza pi usati sono:
- un silicato di zinco e magnesio attivato, che presenta un massimo di assorbimento a
254 nm e da una fluorescenza verde;
- un pigmento inorganico che ha un massimo di assorbimento a 366 nm e da una
fluorescenza blu.
In alcuni casi, dopo eluizione si spruzza la lastrina con indicatori che reagiscono con
le sostanze da rivelare formando composti fluorescenti. Gli indicatori pi usati sono:
- rodamina B (soluzione allo 0,025-0,05% in etanolo), adatta per usi generali
- rodamina 6G (soluzione all1% in acetone), adatta per rivelare i lipidi;
- diclorofluoresceina (soluzione allo 0,01-0,2% in etanolo), adatta per usi generali.

Rivelazione con reagenti chimici. Questi reagenti, vaporizzati sulle sostanze eluite,
formano con esse composti colorati.
Per la vaporizzazione si usa un nebulizzatore a polpetta o, ancora meglio, una
bomboletta spray di gas inerte. A volte in mancanza di questi apparecchi si immerge
la lastrina nel contenitore con il reattivo dopodich si lascia scaldare il tutto su una
piastra riscaldante fino alla comparsa delle macchie che indicano la fine dello
sviluppo.
Attenzione a lavorare sotto cappa e con protezioni in quanto il pi delle volte si tratta
di sostanze altamente tossiche e nocive.
Nella tabella seguente riportato un elenco dei rivelatori chimici di pi largo
impiego.

Soluzione di coloranti di uso generale in TLC e PC (paper Chromatography)

REAGENTE PREPARAZIONE UTILIZZO
Soluzione di iodio Soluzione allo 0,5% in EtOH o cloroformio Adatta per composti azotati
Nitrato di argento
ammoniacale
Mix 1+5 di una sol. 0,1 N di AgNO
3
con una sol. 5
N di NH
3
. La soluzione va preparata al momento
perch altrimenti possono verificarsi esplosioni.
Dopo, il trattamento, scaldare per 5-10 min. la
lastrina a 105 C finch non si notano macchie
scure
Adatta per sostanze riducenti e
zuccheri
Alizarina Soluzione satura di etanolo. Dopo aver nebulizzato
porre la lastrina umida in una camera contenente
NH
3
al 25%. Si formano macchie di diversi colori a
seconda dei cationi eluiti
Adatta per cationi
Solfuro di idrogeno Esporre la lastrina al gas, fatto sviluppare (per
esempio riscaldando la tioacetammide) in una
camera di sviluppo chiusa, fino alla comparsa di
macchie scure.
Adatto per cationi e metalli
pesanti
Molibdato di ammonio Spruzzare una soluzione all1% di molibdato
dammonio. Essiccare la lastrina e spruzzare ancora
con una soluzione all1% di SnCl
2
. Riscaldare a
105 C per 3-4 min.
Adatto per fosfati
Bibliografia:
Laboratorio di Chimica Organica e Bio-Organica, A. Danieli, Hoepli, ISBN 88-203-2249-8
Analisi Chimica Strumentale, R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Zanichelli, ISBN 88-08-23714-1
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Anisaldeide Aggiungere 1 mL di H
2
SO
4
conc. A 0,5 mL di
anisaldeide sciolta in 50 mL di CH
3
COOH glaciale.
Nebulizzare sulla lastrina e riscaldare a 105 C.
Adatta per steroidi e terpeni
Vapori di iodio Riscaldare debolmente lo iodio in un piccolo becher
e porlo in una camera di sviluppo chiusa contenente
la lastrina da rivelare. Le macchie appaiono pi o
meno scure sul fondo della lastrina
in genere un reagente di uso
generale, adatto per composti
contenenti doppi legami
H
2
SO
4
concentrato in miscela
cromica
Nebulizzare sulla lastrina e porla in stufa. I
composti oraganici si carbonizzano formando
macchie scure, e a volte colorazioni specifiche.
Sono reagenti di uso generale
utilizzabili per la carta.
KMnO
4
neutro allo 0,05 % in
H
2
O
Di uso generale, ossida le specie chimiche
riducenti; le macchie scure che si formano sulla
lastrina sono dovute al MnO2.
Per composti facilmente
ossidabili.
KMnO
4
In H
2
SO
4
Miscelare 0,5 g di permanganato con 15 mL di
H2SO4 concentrato
Per usi generali
Ninidrina Aggiungere 3 mL di acido acetico glaciale a 100 ml
di una soluzione allo 0,3% di ninidrina in n-
butanolo. Nebulizzare e scaldare la lastrina a
100C, finch si forma il colore.
Adatto per amminoacidi,
ammine e amminozuccheri.
Cloruro di antimonio (III) Sciogliere 25 g di SbCl3 in 75 mL di cloroformio.
Nebulizzare e porre la lastrina per 10 minuti in
stufa a 100C; infine, esporre, esporre ai raggi UV.
Adatto per glucosidi, steroidi,
carotenoidi, flavonoidi, derivati
terpenici, vitamine A e D.
Verde di bromocresolo Soluzione allo 0,04% in etanolo Per acidi e basi organiche
2,7-diclorofluoresceina Soluzione allo 0,2% in etanolo Per lipidi saturi e insaturi
Reattivo di Dragendorff Soluzione di KI 0,11 M e 0,6 mM di subnitrato di
bismuto in CH3COOH 3,5 M
Adatto per alcaloidi e composti
di azoto quaternario
Cloruro di ferro(III) Soluzione al 2,7% in HCl 2M Per fenoli e acidi fenolici
Fluorescamina Soluzione allo 0,05% in acetone Per amminoacidi primari,
ammine, peptici e proteine
Iodoplatinato di potassio Soluzione allo 0,15% di iodoplatinato di potassio e
al 3% di KI in HCl diluito.
Per alcaloidi, ammine e
composti azotati organici.
Isatina Soluzione allo 0,2% in metanolo Per peptidi, prolina,
idrossiprolina e altri
amminoacidi.
Acido molibdico Soluzione di MoO
3
allo 0,9% in H
2
SO
4
4,2 M Per fosfolipidi e derivati
Orcinolo e Cloruro di ferro
(III)
Soluzione allo 0,9% di FeCl3 e allo 0,55% di
orcinolo in etanolo acidificato con HCl
Per zuccheri, glicosidi, e
solfolipidi
Acido fosfomolibdico Soluzione al 10% in etanolo. Per lipidi, steroli, lattoni,
composti fenolici, chetoacidi,
idrossiacidi, acidi grassi
insaturi.
Rodamina B Soluzione allo 0,25% in etanolo Per lipidi

6. ANALISI QUALITATIVA
La TLC usata soprattutto per analisi di tipo qualitativo. In genere, per identificare una
sostanza, non sufficiente la sola misura del valore di RF perch una grandezza poco
riproducibile, condizionata da molti fattori difficili da controllare. Per questo motivo le
analisi qualitative vengono effettuate seminando, di fianco alla miscela in esame, i
componenti puri; il riconoscimento delle sostanze viene dunque effettuato per confronto.
Oltre al confronto con componenti puri si possono mettere altri standard soprattutto per
seguire il decorso di reazioni chimiche.
In tal senso si possono depositare le miscele allinizio della reazione, quelle dopo un
determinato tempo e quelle a reazione ultimata; magari affiancando gli standard dei
sottoprodotti (ipotizzati o noti) e quello del prodotto finale.
Per essere ragionevolmente sicuri dellidentit di una sostanza sconosciuta, si effettuano
diverse prove con eluenti e fasi stazionarie diverse. Inoltre i reagenti usati per rivelare le
Bibliografia:
Laboratorio di Chimica Organica e Bio-Organica, A. Danieli, Hoepli, ISBN 88-203-2249-8
Analisi Chimica Strumentale, R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Zanichelli, ISBN 88-08-23714-1
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macchie colorano le diverse sostanze in modo caratteristico. Eventualmente si pu estrarre la
macchia dallo strato, asportando con una spatola la porzione di materia su cui si diffusa la
macchia e dissolvendo questultima in un sovente opportuno. Sulla soluzione filtrata si
possono condurre analisi chimico-fisiche (analisi elementare, UV, IR, NMR, Massa, ecc...)
Le determinazioni quantitative risultano difficili in quanto la procedura deve essere
rigidamente standardizzata e altamente riproducibile.

MATERIALI E STRUMENTAZIONE

1. MATERIALI
Materiali di sostegno
I materiali che costituiscono la fase stazionaria solida sono delle polveri e perci
devono essere depositati su una superficie rigida e chimicamente inerte che funge da
sostegno. I materiali pi usati sono i seguenti.

Vetro: le lastrine hanno uno spessore di 1-2 mm, sono facili da maneggiare e rigide,
ma sono anche fragili e pesanti. Le dimensioni tipiche sono 20x20, 10x20 e 5x20
cm. Spesso, le macchie eluite appaiono meglio definite se osservate dal retro della
lastrina, che trasparente.

Alluminio: Sono disponibili in commercio dei fogli dello spessore di 0,2 mm, gi
rivestiti della fase stazionaria. Questi fogli sono facili da maneggiare e consentono di
ritagliare lastrine delle dimensioni desiderate; le lastrine, per, si deformano con
facilit. Inoltre, queste lastrine non possono essere usate in ambienti molto alcalini o
in presenza di acidi minerali.

Plastica: Sono disponibili in commercio sia lastre di 0,2 mm di spessore e
dimensioni standard, sia fogli o rotoli gi rivestiti della fase stazionaria. Alcuni
solventi organici possono intaccare questo tipo di lastra.

Fase stazionaria solida
La fase stazionaria pu essere sia un solido sia un liquido impregnato su un supporto
opportuno.
In questa sede ci limiteremo a trattare le fasi stazionarie solide elencandone le
caratteristiche per tipologia.
Fase stazionarie solide Sono costituite di materiale granulare che viene fatto aderire
saldamente al sostegno. Linterazione (adsorbimento) di questi materiali con la fase
mobile dipende dalla geometria delle particelle che le costituiscono.
Lattivit il parametro che da una misura dellefficienza dei diversi materiali
adsorbenti nella separazione di miscele; in alcuni casi usata per esprimere la
capacit di adsorbire le sostanze in termini quantitativi, ma pi spesso riferita
semplicemente allentit delladsorbimento.
Precisamente:
- il gel di silice e lallumina di attivit I sono considerati adsorbenti forti, cio
molto attivi;
- il Kieselguhr adsorbente medio;
- la cellulosa adsorbente debole.

Bibliografia:
Laboratorio di Chimica Organica e Bio-Organica, A. Danieli, Hoepli, ISBN 88-203-2249-8
Analisi Chimica Strumentale, R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Zanichelli, ISBN 88-08-23714-1
Cromatografia su strato sottile Tecnica operativa della TLC By Chimicando
Gel di silice. il materiale pi usato. costituito da acido silicico (H
4
SiO
4
) amorfo
e altamente poroso ottenuto, sotto forma di particelle dure e leggermente opache,
trattando il vetro solubile (silicato di sodio) con acido fosforico:

2Na
2
O*SiO
2
+ 2H
2
SO
4
H
4
SiO
4
+ 2Na
2
SO
4

Lacido silicico polimerizza eliminando molecole di acqua e si formano cos granuli
porosi sulla cui superficie sono presenti siti attivi Si-OH:

immagine pagina 49

Le caratteristiche del gel dipendono dalle condizioni in cui viene effettuata la
reazione preparativa con lacido solforico. Il volume dei pori , di 0,7-0,8 mL/g e il
diametro medio di 6 nm. Il gel di silice un materiale molto adsorbente, la sua
attivit dipende dalla quantit di acqua presente nello strato che blocca i siti attivi.
Perci bisogna essiccare il gel, ma comunque non oltre 200C, per evitare
trasformazioni o sinterizzazioni del materiale. Lacqua che evapora quella
trattenuta tra i pori e in parte quella adsorbita dai gruppi attivi.

Allumina (ossidi di alluminio). Viene preparata a partire da idrossidi di alluminio
(come lidroargillite). Mediante trattamenti opportuni e una disidratazione energica
(a 400-500C) si pu ottenere in tre forme diverse: acida, basica e neutra.

Immagine pagina 50

Lattivit di questo materiale, come nel caso del gel di silice, dipende dalla quantit
di acqua in esso presente, che blocca i siti attivi in superficie. Nella cromatografia su
strato sottile, in genere, si usa allumina di tipo basico (pH della sospensione acquosa
al 10% circa 9,5).

Cellulosa in polvere. La cromatografia su strato di cellulosa rappresenta una
evoluzione della cromatografia su carta rispetto alla quale consente tempi di
esecuzione pi brevi, la preparazione di strati pi omogenei e minore diffusione delle
macchie. Con la cellulosa, in TLC, si effettua una cromatografia di ripartizione,
perch le sostanze da separare si ripartiscono appunto fra la fase mobile e lacqua
presente nella cellulosa.
Per la preparazione degli strati, si usa una cellulosa di alta qualit, ottenuta mediante
i normali processi e successivamente macinata e trattata in modo da ottenere fibre di
lunghezza ottimale. Si ottiene cos una cellulosa con grado di polimerizzazione
dellordine di 400-500, con fibre lunghe 2-20 m. A partire da queste fibre, per
idrolisi con HCl 2,5 N (allebollizione, per 15 minuti), viene preparata la cellulosa
microcristallina, che fornisce migliori prestazioni; il grado di polimerizzazione si
riduce a 40-200.
Sono disponibili in commercio lastre di cellulosa naturale e di cellulosa
microcristallina a elevata purezza, oltre alle cellulose modificate.

Altri materiali adsorbenti. Per separazioni particolari, si usano i seguenti materiali
adsorbenti:
- Kieselguhr. Si tratta di acido salicilico amorfo di origine fossile, noto anche come
terra di diatomee (tipo gel di silice)
Bibliografia:
Laboratorio di Chimica Organica e Bio-Organica, A. Danieli, Hoepli, ISBN 88-203-2249-8
Analisi Chimica Strumentale, R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Zanichelli, ISBN 88-08-23714-1
Cromatografia su strato sottile Tecnica operativa della TLC By Chimicando
- Poliammidi. Resine con gruppi funzionali amminici, carbossilici e ammidici che
possono interagire con fenoli, chinoni, acidi carbossilici, nitrocomposti.
- Silicati di magnesio (Florisil) oppure talco indicati per la separazione di zuccheri e
loro derivati, di derivati poliossidrilici, di terpeni e di acidi grassi.
- Fosfati di calcio.(apatite). Per proteine e monogliceridi.
- Fosfati di magnesio. Per carotenoidi.
- Solfato di calcio. Per carboidrati e test biologici.
- Polvere di vetro. Per idrocarburi a elevata massa molare.
- Carbonato e ferrocianato di zinco. Per aldeidi, chetoni e altri composti carbonilici.
- Carbone attivo.
- Amido. Per cationi.
- Saccarosio e mannitolo. Per pigmenti vegetali.

Fase mobile
La polarit fondamentale per la scelta delleluente in TLC. Dalla polarit, infatti,
dipende lentit del trascinamento delle sostanze lungo la lastrina in una TLC
normale. possibile ordinare i solventi puri e anche le miscele di solventi in una
serie eluotropa, secondo la polarit crescente (vedi tabella seguente). Comunque, in
generale, pi una molecola polare, maggiore la sua capacit di fluire altre
molecole.

Serie eluotropa di miscele di solventi adatti per TLC

Bibliografia:
Laboratorio di Chimica Organica e Bio-Organica, A. Danieli, Hoepli, ISBN 88-203-2249-8
Analisi Chimica Strumentale, R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Zanichelli, ISBN 88-08-23714-1
Miscele o solventi puri composizione
Benzene
Benzene/cloroformio 1+1
Cloroformio
Cicloesano/acetato detile 8+2
Cloroformio/acetone 95+5
Benzene/acetone 9+1
Benzene/acetato detile 8+2
Cloroformio/dietiletere 9+1
Benzene/metanolo 95+5
Benzene/dietiletere 6+4
Cicloesano/acetato di etile 1+1
Cloroformio/dietiletere 8+2
Benzene/acetone 8+2
Cloroformio/metanolo 99+1
Benzene/metanolo 9+1
Cloroformio/acetone 85+15
Benzene/dietiletere 4+6
Benzene/acetato di etile 1+1
Cloroformio/dietiletere 6+4
Cicloesano/acetato detile 2+8
Acetato di butile
Cloroformio/metanolo 95+5
Cloroformio/acetone 7+3
Benzene/acetato di etile 3+7
Acetato di butile/metanolo 99+1
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Benzene/dietiletere 1+9
Dietiletere/metanolo 99+1
Dietiletere
Dietiletere/DMF 99+1
Acetato di etile
Acetato di etile/metanolo 99+1
Benzene/acetone 1+1
Cloroformio/metanolo 9+1
Diossano/metanolo 9+1
Diossano
Acetone
Metanolo
Diossano/acqua 9+1


Bibliografia:
Laboratorio di Chimica Organica e Bio-Organica, A. Danieli, Hoepli, ISBN 88-203-2249-8
Analisi Chimica Strumentale, R. Cozzi, P. Protti, T. Ruaro, Zanichelli, ISBN 88-08-23714-1