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Prof. Valmir F.

Juliano
INTRODUO AOS MTODOS
ESPECTROANALTICOS - II
QUI624
Trs tipos de mtodos pticos relacionados entre
si so conhecidos coletivamente como mtodos de
luminescncia molecular: Fluorescncia molecular;
fosforescncia e quimiluminescncia.
A fluorescncia e a fosforescncia so
similares, no tocante ao processo de excitao,
que feita por absoro de ftons. Por esse
motivo so frequentemente mencionados pelo
termo mais genrico fotoluminescncia.
A quimiluminescncia est baseada no espectro
de emisso de uma espcie excitada que
formada no decorrer de uma reao qumica.
Luminescncia Molecular
A medida da intensidade de fotoluminescncia ou
quimiluminescncia permite a determinao
quantitativa de uma variedade de espcies orgnicas
e inorgnicas importantes em concentraes muito
baixas (traos).
Atualmente, o nmero de mtodos fluorimtricos
significativamente maior que o nmero de
aplicaes de procedimento de fosforescncia e
quimiluminescncia.
Um dos aspectos mais atraentes dos mtodos de
luminescncia a sua sensibilidade intrnseca, com
limites de deteco frequentemente de uma a trs
ordens de grandeza menores de a absoro (ppb).
Luminescncia Molecular
Outra vantagem dos mtodos fotoluminescentes
a sua extensa faixa de concentrao linear, que, com
frequencia, significativamente maior que as
encontradas em mtodos de absoro.
Devido sua alta sensibilidade , os mtodos de
luminescncia quantitativos esto sujeitos a efeitos
de interferncia srios das matrizes das amostras.
Por essa razo, normalmente, as medies de
luminescncia esto associadas com tcnicas de
separao da cromatografia e da eletroforese.
Geralmente os mtodos de luminescncia
apresentam uma aplicao menos ampla. Muito mais
espcies absorvem radiao UV/Vis do que emitem.
Luminescncia Molecular
Teoria da fluorescncia e fosforescncia
Ocorrem em sistemas qumicos gasosos, lquidos e slidos
simples, bem como em sistemas complexos.
Fluorescncia de ressonncia: l
emis
= l
abs
. Observada mais
para espcies atmicas que moleculares.
Fluorescncia com deslocamento Stokes: l
emis
> l
abs
. O
fsico Irlands George Gabriel Stokes, verificou que o fton
absorvido perdia energia por inmeras vibraes microscpicas.
A absoro de ftons ocorre instantaneamente (10
-14
a 10
-15
s).
A emisso de fluorescncia ocorre em um tempo
significativamente maior (10
-9
a 10
-7
s, quando e tem valores 10
3
a
10
5
, e 10
-6
a 10
-5
s para e bem menores).
A emisso de fosforescncia, por sua vez, ocorre em
tempos muito maiores (10
-4
a 10 s ou mais) em virtude da
transio de spin singlete-triplete diferente da transio
singlete-singlete da fluorescncia.
Luminescncia Molecular
Teoria da fluorescncia e fosforescncia





O estado eletrnico molecular chamado de singlete
quando os eltrons esto emparelhados e nenhuma separao
de nveis de energia observada sob efeito de um campo
magntico. A molcula diamagntica.
No estado dublete, o que acontece com um radical livre, o
eltron pode ter duas orientaes sob campo magntico,
conferindo energias diferentes ao sistema (paramagnetismo).
O estado triplete pode ser alcanado se o eltron tornar-se
desemparelhado ao ser excitado para um nvel de maior
energia. Neste caso tambm ocorre o paramagnetismo.
Luminescncia Molecular
a) Estado fundamental singlete
b) Estado excitado singlete
c) Estado excitado triplete
Teoria da fluorescncia e fosforescncia
A molcula pode voltar ao seu estado fundamental por uma
combinao de vrias etapas mecansticas, denominados de
processos de desativao:
Processos radiativos
Fluorescncia.
Fosforescncia.
Processo no-radiativos
Relaxao vibracional (10
-12
s)
Colises entre as molculas excitadas e as molculas do solvente
eliminam excesso de energia, atingindo o menor nvel vibracional.
Converso interna
Processos intermoleculares pelos quais a molcula passa para um
estado eletrnico de menor energia sem emisso de radiao.
Converso externa (extino por coliso)
A desativao de um estado eletrnico excitado envolve a
transferncia de energia entre a molcula excitada e o solvente
ou outros solutos. Condies que reduzem o nmero de colises
(baixa temperatura e alta viscosidade) aumentam a emisso.
Luminescncia Molecular
Sempre ocorrem do menor nvel energtico vibracional
Teoria da fluorescncia e fosforescncia
Luminescncia Molecular
Processo
no-radiativo
que ser
favorecido
se houver
superposio
dos nveis de
energia
Estado triplete
Estados singlete
Processo no-radiativo
que ocorre quando h
superposio de nveis
de energia
Luminescncia Molecular
Efeito da converso interna:
Quinina
Tanto a absoro em 250 nm
quanto em 350 nm resultam
na emisso em 450 nm.
Emisso da luz
negra
Teoria da fluorescncia e fosforescncia
A estrutura molecular, assim como o ambiente qumico, influenciam a
ocorrncia ou no da luminescncia de uma molcula. Estes fatores
tambm determinam a intensidade de emisso, quando esta ocorre.
Rendimento quntico ou eficincia quntica F:
simplesmente a razo do nmero de molculas que luminescem pelo
nmero de molculas excitadas. A fluorescena possui uma eficincia
quntica prxima da unidade.
Tipos de transio
Dificilmente a fluorescncia resulta de absoro de radiao com l
menor que 250 nm, porque tal radiao suficientemente energtica
para promover a desativao dos estados excitados por pr-
dissociao ou dissociao. A emisso fica restrita a transies p* p
(maior eficincia quntica) e p* n.
Estrutura
Ainda que alguns compostos carbonlicos e alguns com estruturas de
duplas ligaes altamente conjugadas fluoresam, a fluorescncia
mais intensa e mais til encontrada em compostos com grupos
aromticos com transies p p* de baixa energia.
Luminescncia Molecular
Luminescncia Molecular
No apresentam
fluorescncia
Apresentam
fluorescncia
Fluorescena
Luminescncia Molecular
Luminescncia Molecular
Apresenta fraca
fluorescncia
F = 0,2
Apresenta forte
fluorescncia
F = 1
Empiricamente observou-se que a rigidez da estrutura
favorece a fluorescncia
Luminescncia Molecular
A rigidez do complexo
formado explica porque o
complexo de zinco com a
8-hidroxiquinolina
apresenta uma
fluorescncia muito maior
que a 8-hidroxiquinolina.
Empiricamente observou-se que a rigidez da estrutura
favorece a fluorescncia
Luminescncia Molecular
Efeito do solvente e temperatura
A eficincia quntica diminui com o aumento da
temperatura por causa do aumento da frequncia das
colises ocasionando converses externas.
Um decrscimo na viscosidade causa igual efeito.
A fluorescncia diminuda por solventes contendo
tomos pesados ou por solutos contendo tais tomos em
suas estruturas. Exemplo: CBr
4
e CH
3
CH
2
I
Efeitos de pH podem desfavorecer a fluorescncia
Apresenta
fluorescncia
No apresenta
fluorescncia
Luminescncia Molecular
Efeito da concentrao na intensidade de fluorescncia
A potncia de emisso de fluorescncia F proporcional
potncia radiante do feixe de excitao que absorvido.
F = K(P
o
P)
Escrevendo a lei de Beer, P / P
o
= 10
-ebc
, onde e
absortividade molar das molculas fluorescentes
F = K(P
o
- P
o
10
-ebc
) = KP
o
(1 - 10
-ebc
)
O termo exponencial pode ser expandido e posteriormente
simplificado. Considerando A < 0,05, o resultado passa a ser
F = 2,303KebcP
o
.
Como eb constante e possvel manter P
o
tambm
constante, o resultado final passa a ser: F = Kc
Luminescncia Molecular
Desvios da linearidade
Quando a concentrao da espcie emissora grande o
suficiente para que a absorbncia seja maior que 0,05, a
simplificao do termo exponencial se torna invlida e a
linearidade perdida. (absoro primria)
Dois outros fatores tambm causam desvios negativos da
linearidade:
Auto-supresso
Colises entre molculas excitadas provocam a transferncia de
energia no-radiativa de um modo semelhante transferncia para
molculas do solvente na converso externa.
Absoro secundria (inclui a auto-absoro)
Ocorre quando l
emisso
coincide com algum l
absoro
. O resultado
a reabsoro da radiao por quaisquer molculas na soluo.
Luminescncia Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescncia
Supresso dinmica
Tambm chamada de supresso colisional, necessita do
contato entre as espcies excitadas e o agente
supressor. O mecanismo no muito bem compreendido.
A concentrao do agente supressor deve ser suficientemente
alta para que haja uma alta probabilidade de coliso entre as
espcies excitada e supressor durante o tempo de vida do estado
excitado.
A presena de O
2
dissolvido, que paramagntico, geralmente
reduz a intensidade da fluorescncia por promover o cruzamento
intersistema. Entretanto, tambm pode promover a supresso do
estado triplete, reduzindo tambm a fosforescncia.
A fluorescncia do sulfato de quinino suprimida por altas
concentraes de ons cloreto.
Luminescncia Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescncia
Supresso esttica
Neste caso, o supressor forma com o analito fluorforo
um complexo chamado de complexo escuro.
M + L ML

Supresso de longo alcance
Neste tipo de supresso a transferncia de energia
ocorre com colises entre as molculas. O acoplamento
dipolo-dipolo entre o fluorforo excitado e o supressor
responsvel pela transferncia.
Molcula
fluorescente
Complexo no-
fluorescente
supressor
Luminescncia Molecular
Fatores que reduzem a intensidade de fluorescncia
Uma vez que a emisso de fluorescncia F diretamente
proporcional eficincia quntica F
f
, se a supresso
depender de um nico supressor, aps alguma manipulao
nas equaes do sistema, obtm-se:
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060
F
[Cl
-
]
y = 209.9462x + 1.0092
R = 0.9999
0.0000
2.0000
4.0000
6.0000
8.0000
10.0000
12.0000
14.0000
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060
F
o
/
F

[Cl
-
]
[Sup] K 1
F
F
q
0

onde F e F
o
so os sinais de fluorescncia na presena e
ausncia do supressor e K
q
a constante de supresso
Supresso da fluorescncia do sulfato de quinino por Cl
-
.
Instrumentos para medir fluorescncia e fosforescncia
Os componentes dos instrumentos para medir a
fotoluminescncia so similares queles encontrados nos
fotmetros e espectrofotmetros UV/Vis.
A fonte de radiao necessita ser mais intensa que
aquelas utilizadas na absoro molecular.
A maioria dos equipamentos emprega a tica de duplo
feixe para compensar flutuaes na potncia da fonte.
A fluorescncia emitida pela amostra se propaga em
todas as direes, mas o ngulo reto em relao ao
feixe incidente mais conveniente para evitar perdas por
espalhamento na soluo e, principalmente, nas paredes
da cubeta.
F = Kc
Luminescncia Molecular
Luminescncia Molecular
Para refletir e responder:
Seria possvel realizar uma medida de fluorescncia em um
espectrofotmetro convencional aps alguma pequena
modificao?
Luminescncia Molecular
Luminescncia Molecular
Aplicaes
Os mtodos de fluorescncia e fosforescncia so
intrinsecamente aplicveis a faixas de concentraes mais
baixas que as medidas espectrofotomtricas baseadas em
absorbncias e esto entre as tcnicas analticas mais
sensveis facilmente disponveis.
Essa sensibilidade elevada vem do fato que F aumenta se a
potncia da fonte P
o
aumentar, ou ento, pelo fato do sinal
poder ser amplificado posteriormente. A absorbncia, por
estar relacionada com P
o
/P, no se altera com o aumento de
P
o
, pois o aumento deste causa um aumento proporcional em
P.
Em contraste a alta sensibilidade, os mtodos fotoluminescentes
so menos precisos e exatos que os mtodos espectrofotomtricos
por um fator de 2 a 5.
Luminescncia Molecular
Aplicaes
Muitos ons de metais de transio so paramagnticos, o
que favorece o cruzamento intersistema ao estado triplete,
desfavorecendo a fluorescncia, embora a fosforescncia
possa ser observada.
Os complexos dos metais de transio possuem muitos
nveis de energia pouco espaados, favorecendo a
desativao por converso interna e no por fluorescncia.
Complexos de metais que no so de transio, geralmente
incolores e que formam complexos tambm incolores, so
menos suscetveis a esses processos de desativao. Estes
no poderiam ser determinados por absoro molecular no
visvel. Assim a fluorimetria complementar absoro
molecular.
Luminescncia Molecular
Aplicaes
Reagentes fluorimtricos
Luminescncia Molecular
Aplicaes
Luminescncia Molecular
Quimiluminescncia
A aplicao da quimiluminescncia qumica analtica
relativamente recente. O nmero de reaes qumicas que
produz quimiluminescncia pequeno, limitando assim o
mtodo.
A quimiluminescncia produzida quando uma reao
qumica fornece uma espcie excitada eletronicamente
que emite luz quando retorna ao estado fundamental.
A bioluminescncia a quimiluminescncia que ocorre
em sistemas biolgicos. Os exemplos mais conhecido
so os vaga-lumes e as guas-vivas.
A instrumentao para medidas de quimiluminescncia
notavelmente simples. necessrio um sistema
fechado com apenas um tubo fotomultiplicador.
Luminescncia Molecular
Quimiluminescncia
A utilizao do luminol para deteco de sangue em uma
cena de crime baseia-se a reao do luminol com H
2
O
2
em
meio alcalino catalisada pelo ferro presente hemoglobina.
Dentro de certos limites, a intensidade de quimilumines-
cncia do luminol diretamente proporcional concentrao
do oxidante, do catalisador ou do luminol.
Os mtodos de quimiluminescncia em geral so altamente
sensveis porque nveis baixos de luz podem ser detectados
na ausncia de rudo. No h atenuao da radiao em
monocromadores ou filtros. Com isso limites de deteco na
faixa de partes por bilho (ppb) ou partes por trilho (ppt)
podem ser alcanados.
Luminescncia Molecular
Quimiluminescncia
luminol
on 3-aminoftalato
Vantagens (em comparao absoro molecular)

Muito mais sensvel. Alcana facilmente limites de deteco
de ppb. A quimiluminescncia pode fornecer limites de
deteco da ordem de ppt.
Mais seletiva. O fato de absorver um determinado l e
emitir em outro, diminui em muito a probabilidade de existir
na mesma soluo outra espcie que faa o mesmo.
Serve para a determinao de metais que no so de
transio que, em geral, so incolores e tendem a formar
quelatos tambm incolores e que no poderiam ser
determinados por absoro molecular na regio do visvel.
Luminescncia Molecular
Desvantagens (em comparao absoro molecular)

Limitada a um nmero muito menor de sistemas que
incorporam caractersticas estruturais e ambientais que
provocam uma desacelerao dos processos de relaxao ou
desativao no-radiativos. Apesar disso, existem mais de
200 substncias que podem ser analisadas por esta tcnica.
Espcies orgnicas e bioqumicas produtos
alimentcios, frmacos, produtos naturais e amostras
clnicas:
Enzimas e coenzimas, esterides, vitaminas, etc.
Pior exatido e preciso por um fator de 2 a 5.
Custo maior do equipamento.
Ao contrrio da absoro molecular, no se aplica a
determinao de complexos de metais de transio.
Luminescncia Molecular
Para refletir e responder:
Seria possvel analisar um analito orgnico aromtico com
anis condensados em uma mistura de compostos orgnicos
atravs da espectrometria de luminescncia molecular? Em
caso positivo, quais seriam as limitaes da anlise?
Luminescncia Molecular
Exerccio:
Os volumes de uma soluo padro contendo 1,10 ppm de Zn
2+
, mostrados
na tabela, foram pipetados para frascos separados, cada um contendo
5,00 mL de uma soluo de concentrao desconhecida de zinco. Cada
uma foi extrada com 3 alquotas de 5mL de CCl4 contendo excesso de 8-
hidroxiquinolina. Os extratos foram ento diludos a 25,00 mL e a fluo-
rescncia foi medida com um fluormetro.
a) Construa a curva de trabalho.
b) Determine a equao linear.
c) Calcule o desvio padro da inclinao, do intercepto e da regresso.
d) Determine a concentrao de zinco na amostra com o respectivo
desvio padro
Luminescncia Molecular
Volume da
soluo
padro de
Zn
2+
, mL
Leitura do
fluormetro
0,00 6,12
4,00 11,16
8,00 15,68
12,00 20,64

2
) (
) ( ) (
x x
y y x x
m
i
i
x m y b


2 2
2
) (
) ( 1
x x m
y y
N m
s
s
i
r
x
2
) ( ) (
2 2 2


N
x x m y y
s
r

2
2
2
) (
) (
x x
s
x x
s
s
r r
m

2
2
2

i i
i
r b
x x N
x
s s
Exerccio - resposta:
a) Curva de trabalho em volume de padro adicionado.
b) Equao linear.









c) Desvios-padro
Regresso: s
r
= 0,154402
Inclinao: s
m
= 0,01726
Intercepto: s
b
= 0,12918
d) Desvio padro da leitura: s
x
= 0,17251
s
c
= 0,17251 x 1,10 / 5 = 0,038 ppm
[Zn
2+
] = (6,188/1,202) x 1,10 / 5 = 1,13 ppm
Luminescncia Molecular
Volume da
soluo
padro de
Zn
2+
, mL
Leitura do
fluormetro
0,00 6,12
4,00 11,16
8,00 15,68
12,00 20,64
y = 1.202x + 6.188
R = 0.9996
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12 14
L
e
i
t
u
r
a

d
o

f
l
u
o
r

m
e
t
r
o

Volume de soluo padro de Zn
2+
, mL
Exerccio - resposta:
a) Curva de trabalho em concentrao de padro adicionado.
b) Equao linear.









c) Desvios-padro
Regresso: s
r
= 0,154402
Inclinao: s
m
= 0,39233
Intercepto: s
b
= 0,12918
d) Desvio padro da leitura: s
x
= 0,00759
s
c
= 0,00759 x 25 / 5 = 0,038 ppm
[Zn
2+
] = (6,188/27,31) x 25 / 5 = 1,13 ppm
Luminescncia Molecular
[Zn
2+
], ppm Leitura do
fluormetro
0,00 6,12
0,176 11,16
0,352 15,68
0,528 20,64
y = 27.318x + 6.188
R = 0.9996
0
5
10
15
20
25
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
L
e
i
t
u
r
a

d
o

f
l
u
o
r

m
e
t
r
o

[Zn
2+
], ppm
Exerccio:
Compare a luminescncia molecular com a absoro molecular
no UV/Vis. Porque o aumento da potncia da fonte luminosa
no aumenta a sensibilidade de deteco na absoro
molecular, mas aumenta a emisso?



A = log (P
0
/P)


F = K (P
0
P)
F = K(P
o
- P
o
10
-ebc
)
F = KP
o
(1 - 10
-ebc
) 2,303KebcP
0
Luminescncia Molecular
Fim da Luminescncia
Molecular. O que ser que
vem a seguir?