DEFENSAS ANTIMICROBIANAS

DEFENSAS ANTIMICROBIANAS
DE PLANTAS SUPERIORES:
DE PLANTAS SUPERIORES:

Un caso de aplicaci
Un caso de aplicaci

n
n

Julio Armando Pedrozo Prez

Profesor Asociado
Departamento de Qumica
Pontificia Universidad Javeriana
Bogot Colombia
2003
GIFUJ
CULTIVO DE PAPA
CULTIVO DE PAPA
(Guasca Cundi.)
El cultivo de plantas ornamentales se ha convertido en Colombia,
en una de las industrias de mayor crecimiento, debido a la gran
demanda internacional de flores de excelente calidad y sanidad.
Constituye uno de los rubros de mayor importancia de la econo-
ma nacional, generando divisas comparables a las producidas
en aos precedentes por el petrleo o el caf.
FLORICULTURA
FLORICULTURA
FLORICULTURA EN COLOMBIA
FLORICULTURA EN COLOMBIA
Colombia posee una combinacin nica de condiciones topogrficas
y de temperatura, que permiten la produccin intensiva de ms de 30
tipos de flores cultivadas en invernadero, desde rosas, pompones,
crisantemos, astromelias, girasoles y claveles, hasta las ms
exticas, como heliconias y el ave del paraso .
Hongos Fitopat
Hongos Fitopat

genos
genos
Alternaria
Aspergillus
Rhizoctonia
Colletotrichum
Sphaerotheca
Fusarium
Botrytis
Bacterias Fitopat
Bacterias Fitopat

genas
genas
Pseudomonas
FITOPAT
FITOPAT

GENOS
GENOS
CONTROL QU
CONTROL QU

MICO
MICO
AGRICULTURA ORG
AGRICULTURA ORG

NICA
NICA
SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS
SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS
1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS
INHIBIDORES
POSINHIBIDORES
2. FITOALEXINAS
ECOSISTEMA PAR
ECOSISTEMA PAR

MO
MO
Pramo de Guasca (Guasca Cundi.)
VEGETACI
VEGETACI

N DEL SUBP
N DEL SUBP

RAMO
RAMO
PROYECTO
PROYECTO
ESTUDIO QU
ESTUDIO QU

MICO Y EVALUACI
MICO Y EVALUACI

N DE LA
N DE LA
ACTIVIDAD ANTIF
ACTIVIDAD ANTIF

NGICA Y ANTIBACTERIANA
NGICA Y ANTIBACTERIANA
DE PLANTAS AUT
DE PLANTAS AUT

CTONAS DE P
CTONAS DE P

RAMOS
RAMOS
COLOMBIANOS
COLOMBIANOS
Investigadores:
Rubn Daro Torrenegra Guerrero
Julio Armando Pedrozo Prez
COLCIENCIAS/U. JAVERIANA, cdigo 1203-05-394-95, CT-128-97
Cromatogramas
Medio de cultivo +
Microorganismo
Medio de cultico +
Cromatograma invertido
Refrigeracin / 18 horas
Retirar CCD
Incubacin
Comparacin de resultados
con duplicado de CCD
Medicin de Rf y zonas de
inhibicin
Zonas de inhibicin
TEST BIOAUTOGRFICO
Dipolostephium phylicoides - -
Diplostephyum revolutum - -
Senecio formosus b,c b,c
Senecio pampae b.c b,c
Pentacalia corymbosa - b,c
Pentacalia ledifolia - b,c
Pentacalia pulchella - b,c
Bejaria aestuans - -
Gaultheria anastomosans b -
Pernettya prostrata - -
Vaccinium floribundum - -
Cavendishia cordifolia - -
Lupinus paniculatus - -
Calamagrostis effusa - -
Baccharis tricuneata - -
Espeletia grandiflora a,b -
Espeletia argentea a,b -
Espeletiopsis corymbosa a,b -
Ageratina vacciniaefolia a,b b
Ageratina fastigiata a,b b
Ageratina tinifolia a,b b
Especies vegetales A.AB A.AF
Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr.
(Guasg
(Guasg

n
n
-
-
Huasg
Huasg

n)
n)
Pentacalia ledifolia (H.B.K)Cuatr.
(Guasg
(Guasg

n
n
-
-
Huasg
Huasg

n)
n)
EXTRACCI
EXTRACCI

N DEL VEGETAL
N DEL VEGETAL
Extracto:
Extracto:
Sustancias de la superficie foliar
Sustancias de la superficie foliar
200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CHCl
3
(5 ml/g); el solvente fue removido por filtracin y
concentrado al vaco; el residuo obtenido se trat con
Me
2
CO y enfri a 4 C durante 12 h. El flculo fue
removido por filtracin y, el filtrado resultante, fue
concentrado y secado al ambiente.
El extracto se guard en nevera a 4C para
evaluarle luego su accin antifngica
EXTRACCI
EXTRACCI

N CON PETR
N CON PETR

LEO
LEO
El material vegetal, previamente lavado con CHCl
3
,
fue secado al ambiente y luego pulverizado.
A 600 g, se le extrajo con ter de petrleo durante
72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y
concentrado al vaco.
El extracto se trat con Me
2
CO y, despus de 12
h de reposo se filtr a mnimo volumen y se sec
al ambiente.
El extracto se guard en nevera a 4 C, para evaluar
luego su accin antifngica.
EXTRACCI
EXTRACCI

N CON ETANOL
N CON ETANOL
El material desengrasado se extrajo por
percolacin en fro con EtOH 96% v-v.
El extracto resultante se trat con agua, se
filtr y al filtrado obtenido se le fraccion L/L
con CHCl
3
y luego con AcOEt.
Las fracciones se concentraron, se secaron al
ambiente y se guardaron a 4 C para evaluarles,
posteriormente, su accin antifngica.
M
M

TODO DE CRECIMIENTO
TODO DE CRECIMIENTO
RADIAL EN PDA
RADIAL EN PDA
Extracto vegetal
Medio de cultivo
Inculo
Incubacin / 6 das
Medicin de los dimetros
de las colonias
CIM EN
CIM EN
mg
mg
/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES
/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES
DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS
DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS
Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride
1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,4
2h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,6
2f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6
2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6
3h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,5
3f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,5
3r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,5
1h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,3
2h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,6
2f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6
2r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6
3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,5
3f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,5
3r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5
EXTRACTO DE MAYOR
EXTRACTO DE MAYOR
ACCION ANTIF
ACCION ANTIF

NGICA
NGICA
Procedimiento:
Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceracin en fro con
CHCl
3
, durante 8 das; el material se extrajo una segunda vez
durante 2 das ms. Los extractos se mezclaron, se concentraron
y se trataron con Me
2
CO. Los filtrados se concentraron, se redi-
solvieron en mezclas hidroalcohlicas y se extrajeron L/L con
CHCl
3
.
Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en nevera
a 4 C.
Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride
FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2
FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3
CIM EN
CIM EN
mg
mg
/ml DE LA FCA DE ESPECIES
/ml DE LA FCA DE ESPECIES
DE PENTACALIA, ANTE
DE PENTACALIA, ANTE
HONGOS FITOPATOGENOS
HONGOS FITOPATOGENOS
RECONOCIMIENTO DE PROBLEMAS
RECONOCIMIENTO DE PROBLEMAS
FITOPAT
FITOPAT

GENOS
GENOS
Sphaerotheca pannosa var. rosae (Ascomicetes)
Parsito obligado
Causante del mildeo polvoso en el fruto del du-
rasno, fresa y mora; es la enfermedad de mayor
severidad y diseminacin en cultivos de rosa en
invernadero y en campo abierto.
La forma ms corriente es la asexual, designada
como Oidium leucoconium.
La forma sexual presenta cleiostecios globosos con unos peque-
os apndices miceloides de color caf; contienen 8 ascosporas.
Las esporas asexuales (conidias) son producidas en gran nmero y
son prcticamente responsables de la propagacin y diseminacin
de la especie.
Mildeo polvoso del rosal
Mildeo polvoso del rosal
Los sntomas tempranos son un leve levan-
tamiento, como una ampolla, a menudo, en
reas rojas en la superficie de la hoja.
El micelio (con conidiforos) aparece como
manchas discretas en la superficie de las
hojas jvenes, las cuales se vuelven curva-
das, deformes y, comnmente, se recubren
de un polvo blanco llamado.
Ataca las espinas en su base; a los tallos en las partes ms tiernas;
a las hojas jvenes en toda su superficie; a las flores en los pedn-
culos, en spalos y receptculos, especialmente cuando la flor an
no est abierta.
El dao reduce el crecimiento de la hoja, el valor esttico de la
planta, la eficiencia en la fotosntesis y, por consiguiente, el desa-
rrollo.
BIENSAYO
BIENSAYO
in vivo
in vivo
PARA HONGOS
PARA HONGOS
PAR
PAR

SITOS OBLIGADOS
SITOS OBLIGADOS
Invernadero: dividido en naves de aproximadamente 1.000 m
2
y, confor-
mada cada una por 15 a 20 camas. Slo se utilizaron 6 de estas camas,
cada una conteniendo 280 plantas en periodo de floracin. stas camas
fueron distribuidas segn un diseo de bloques al azar con aleatoriza-
cin restringida
Evaluacin: la evaluacin del dao del hongo sobre las plantas se rea-
liz de acuerdo a una escala de calificacin, correspondiente a porcen-
tajes de ataque entre 0 y 50%.
Aspersin: se utiliz una bomba de presin constante, previamente de-
sinfectada y calibrada. Se utiliz el mtodo de aplicacin en escuadra.
Muestras experimentales: se utilizaron soluciones acuosas de extrac-
tos de especies de Pentacalia, adicionando un adherente especial
(Pegal 0,5%).
Anlisis: se realiz la prueba de ty el anlisis de varianza (ANOVA)
que permite comparar ms de dos medias poblacionales.
APLICACI
APLICACI

N DE LA
N DE LA
FRACCI
FRACCI

N ACTIVA
N ACTIVA
M
M

TODOS DE SEPARACI
TODOS DE SEPARACI

N E
N E
IDENTIFICACI
IDENTIFICACI

N
N
M
M

TODOS DE SEPARACI
TODOS DE SEPARACI

N
N
|Cromatografa en capa delgada preparativa
Fraccionamiento sobre lecho de slica
Cromatografa en columna flash
Cromatografa en columna de slica
Cromatografa en columna de sephadex
M
M

TODOS DE IDENTIFICACI
TODOS DE IDENTIFICACI

N
N
Espectrofotometra ultravioleta
Espectrometra de masas
Resonancia Magntica Nuclear
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
Hongos Fitopat
Hongos Fitopat

genos
genos
Alternaria
Aspergillus
Rhizoctonia
Colletotrichum
Sphaerotheca
Fusarium
Botrytis
Bacterias Fitopat
Bacterias Fitopat

genas
genas
Pseudomonas
FITOPAT
FITOPAT

GENOS
GENOS
SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS
SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS
1. SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS CONSTITUTIVAS
INHIBIDORES
POSINHIBIDORES
2. FITOALEXINAS
ECOSISTEMA PAR
ECOSISTEMA PAR

MO
MO
Pramo de Guasca (Guasca Cundi.)
VEGETACI
VEGETACI

N DEL SUBP
N DEL SUBP

RAMO
RAMO
Dipolostephium phylicoides - -
Diplostephyum revolutum - -
Senecio formosus b,c b,c
Senecio pampae b.c b,c
Pentacalia corymbosa - b,c
Pentacalia ledifolia - b,c
Pentacalia pulchella - b,c
Bejaria aestuans - -
Gaultheria anastomosans b -
Pernettya prostrata - -
Vaccinium floribundum - -
Cavendishia cordifolia - -
Lupinus paniculatus - -
Calamagrostis effusa - -
Baccharis tricuneata - -
Espeletia grandiflora a,b -
Espeletia argentea a,b -
Espeletiopsis corymbosa a,b -
Ageratina vacciniaefolia a,b b
Ageratina fastigiata a,b b
Ageratina tinifolia a,b b
Especies vegetales A.AB A.AF
Pentacalia corymbosa (Benth.)Cuatr.
(Guasg
(Guasg

n
n
-
-
Huasg
Huasg

n)
n)
EXTRACCI
EXTRACCI

N DEL VEGETAL
N DEL VEGETAL
Extracto:
Extracto:
Sustancias de la superficie foliar
Sustancias de la superficie foliar
200 g de hojas frescas se lavaron por 3 min en CHCl
3
(5 ml/g); el solvente fue removido por filtracin y
concentrado al vaco; el residuo obtenido se trat con
Me
2
CO y enfri a 4 C durante 12 h. El flculo fue
removido por filtracin y, el filtrado resultante, fue
concentrado y secado al ambiente.
El extracto se guard en nevera a 4C para
evaluarle luego su accin antifngica
EXTRACCI
EXTRACCI

N CON PETR
N CON PETR

LEO
LEO
El material vegetal, previamente lavado con CHCl
3
,
fue secado al ambiente y luego pulverizado.
A 600 g, se le extrajo con ter de petrleo durante
72 h, al cabo de las cuales fue filtrado y
concentrado al vaco.
El extracto se trat con Me
2
CO y, despus de 12
h de reposo se filtr a mnimo volumen y se sec
al ambiente.
El extracto se guard en nevera a 4 C, para evaluar
luego su accin antifngica.
EXTRACCI
EXTRACCI

N CON ETANOL
N CON ETANOL
El material desengrasado se extrajo por
percolacin en fro con EtOH 96% v-v.
El extracto resultante se trat con agua, se
filtr y al filtrado obtenido se le fraccion L/L
con CHCl
3
y luego con AcOEt.
Las fracciones se concentraron, se secaron al
ambiente y se guardaron a 4 C para evaluarles,
posteriormente, su accin antifngica.
CIM EN
CIM EN
mg
mg
/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES
/ml DE EXTRACTOS DE ESPECIES
DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS
DE PENTACALIA, ANTE HONGOS FILAMENTOSOS
Extractos F. solani A. solani R. solani C. gloeosp. T. viride
1h-Pc 1,9 2,0 2,0 2,0 2,4
2h-Pc 2,0 2,2 2,5 2,4 2,6
2f-Pc 2,1 2,4 2,4 2,4 2,6
2r-Pc 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6
3h-Pc 1,9 2,2 2,1 2,1 2,5
3f-Pc 2,1 2,4 2,3 2,1 2,5
3r-Pc 2,2 2,4 2,3 2,3 2,5
1h-Pl 1,9 2,0 2,0 2,0 2,3
2h-Pl 2,0 2,2 2,3 2,4 2,6
2f-Pl 2,2 2,4 2,4 2,4 2,6
2r-Pl 2,4 2,4 2,4 2,4 2,6
3h-Pl 2,0 2,2 2,1 2,1 2,5
3f-Pl 2,1 2,4 2,4 2,1 2,5
3r-Pl 2,4 2,4 2,3 2,3 2,5
EXTRACTO DE MAYOR
EXTRACTO DE MAYOR
ACCION ANTIF
ACCION ANTIF

NGICA
NGICA
Procedimiento:
Se extrajeron 800 g de hojas frescas por maceracin en fro con
CHCl
3
, durante 8 das; el material se extrajo una segunda vez
durante 2 das ms. Los extractos se mezclaron, se concentraron
y se trataron con Me
2
CO. Los filtrados se concentraron, se redi-
solvieron en mezclas hidroalcohlicas y se extrajeron L/L con
CHCl
3
.
Estos extractos se rotularon como FCA y se guardaron en nevera
a 4 C.
Extractos F. solani A.solani R. solani C. gloeosp. T.viride
FCA-Pc 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2
FCA-Pl 1,2 1,2 1,2 1,2 1,3
CIM EN
CIM EN
mg
mg
/ml DE LA FCA DE ESPECIES
/ml DE LA FCA DE ESPECIES
DE PENTACALIA, ANTE
DE PENTACALIA, ANTE
HONGOS FITOPATOGENOS
HONGOS FITOPATOGENOS
M
M

TODOS DE SEPARACI
TODOS DE SEPARACI

N E
N E
IDENTIFICACI
IDENTIFICACI

N
N
M
M

TODOS DE SEPARACI
TODOS DE SEPARACI

N
N
|Cromatografa en capa delgada preparativa
Fraccionamiento sobre lecho de slica
Cromatografa en columna flash
Cromatografa en columna de slica
Cromatografa en columna de sephadex
M
M

TODOS DE IDENTIFICACI
TODOS DE IDENTIFICACI

N
N
Espectrofotometra ultravioleta
Espectrometra de masas
Resonancia Magntica Nuclear
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
O
CH
3
O
HO
O
O
CH
3
O
O
O
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
CUMARINAS DE LA SUPERFICIE FOLIAR
Escopoletina
7-O-geranilescopoletina
FITOQUINOLES DE LA SUPERFICIE FOLIAR FITOQUINOLES DE LA SUPERFICIE FOLIAR
QUINOLES DE PENTACALIA
QUINOLES DE PENTACALIA
(1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato ...
Jacaranona
1
2
3
4
5
6
7
8
O
HO O
CH
3
O
1
2
3
4
5
6
7
8
O
HO O
CH
2
.CH
3
O
Etiljacaranona
JACARANONA
JACARANONA
M
M

TODO DE CRECIMIENTO RADIAL

TODO DE CRECIMIENTO RADIAL
Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum
SUSTANCIAS ANTIFUNGICAS
SUSTANCIAS ANTIFUNGICAS
Escopoletina 120 120
7-geraniloxilescopoletina 90 90
Jacaranona 660 650
Metiljacaranona 650 650
Sustancias CIM en g/ml
F.oxysporum B.cinerea
INDUCCI
INDUCCI

N DE ESCOPOLETINA
N DE ESCOPOLETINA
PATGENO
Virus del mosaico
Virus
Virus
Ceratostomella
fimbriata
Helicobasidium
mompa
Phytophthora
infectans
Pseudomonas
solanacearum
PLANTA
Tabaco
Tabaco
Papa
Papa
Papa
Papa
Tomate
BIBLIOGRAFA
Best, 1944
Andreae, 1948
Uritani, 1953
Hoshiya, 1958
Fang, 1988
Hofer, 1984
Paxton, 1944
Tambin se ha encontrado ser inducidas por
nemtodos e insectos
JACARANONA
JACARANONA
Marcada accin citotxica y antitumoral
* Activo a 2 mg/kg sobre el sistema leucemia linfoctica P338
* Solamente accin citotxica marginal (ED
50
) a niveles de
2,1 g/ml)
Accin inhibidora del crecimiento de
Spodoptera litura (Lepidoptera)
Concentraciones inferiores a 1000 ppm
Mecanismos: como reactivos electroflicos estn implicados
con intermediarios de la fosforilacin oxidativa y en reac-
ciones de eliminacin. Pueden sufrir ataques nucleoflicos
posiblemente por constituyentes celulares con grupo-S de
una enzima clave.
1
2
3
4
5
6
1'
2'
3'
4'
5'
6'
1''
2''
3''
4''
5''
6''
7
8
9
10
11
1'''
2'''
O
O
CH
3
O
O
O
H
OH
H
H
H
HO
HO
O
H
H
H
C
O
O
H
H
OH
PENTACALIOSIDOS
PENTACALIOSIDOS
O O
CH
3
O
H H
H
H 6,37
7,68
7,05
7,59
3,73
5,73
4,40
5,14
4,74
4,14
4,38
4,34
O
O
H
OH
H
H
H
HO
HO
O
H
H
H
C
O
O
H
H
OH
H
H
H
H
6,32
7,52
3,10
3,23
ASIGNACIONES DE LAS SE
ASIGNACIONES DE LAS SE

ALES DEL
ALES DEL
ESPECTRO
ESPECTRO
1 1
HNMR DE PENTACALI
HNMR DE PENTACALI

SIDO A
SIDO A
(1-hidroxi-4-oxo-2,5-ciclohexandienil) acetato de 6-escopolinilo
O O
CH
3
O
H H
H
H 6,37
7,68
7,05
7,59
3,73
5,73
4,40
5,14
4,74
4,14
4,38
4,34
O
O
H
OH
H
H
H
HO
HO
O
H
H
H
2,35; 2,95
2,14; 2,31
3,10
3,23
C
O
O
H
H
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
ASIGNACIONES DE LAS SE
ASIGNACIONES DE LAS SE

ALES DEL
ALES DEL
ESPECTRO
ESPECTRO
1 1
HNMR DE PENTACALI
HNMR DE PENTACALI

SIDO B
SIDO B
(1-hidroxi-4-oxo-ciclohexanil) acetato de 6-escopolinilo
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
1. Sobre la superficie foliar de Pentacalia corymbosa
existen sustancias protectoras contra hongos e
insectos.
2. Estas sustancias mostraron estructuras de tipo
cumarnico y quinlico.
3. Las cumarinas aisladas fueron la escopoletina y
la 7-O-geranilescopoletina.
4. Los quinoles aislados fueron la jacaranona y la
etiljacaranona.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
COLCIENCIAS
UNIVERSIDAD DE STRATHCLYDE
(Glasgow Escocia)
INSTITUTO DE INMUNOLOGIA
(Bogot Colombia)
AGRADECIMIENTOS
AGRADECIMIENTOS