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Departamento de Microbiologia

Insttuto de Cincias Biolgicas


Universidade Federal de Minas Gerais
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Colorao de Gram
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Introduo
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A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarqus Hans Christan
Gram. Ela um dos processos de colorao mais teis, pois classifca as bactrias em dois grandes
grupos: gram-positvas (que coram em roxo) e gram-negatvas (coram em rosa). Tal reao colora-
o de Gram se deve s diferenas na estrutura da parede celular de clulas gram-positvas e gram-
negatvas, que permitem que o lcool descore as clulas gram-negatvas, mas no as gram-positvas.
Os diferentes tpos de bactrias reagem de modo diferente colorao de Gram, provavelmente
porque diferenas estruturais em suas paredes celulares (Figura 1) afetam a reteno ou libera-
o de uma combinao de violeta de genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I).
Entre outras diferenas, as bactrias gram-positvas tm uma parede celular mais espessa de pep-
tdeoglicano que as bactrias gram-negatvas. Alm disso, as bactrias gram-negatvas contm uma
camada de lipopolissacardeo como parte de sua parede celular. Quando aplicada s clulas gram-
positvas e gram-negatvas, a violeta de genciana e o iodo penetram facilmente nas clulas. Dentro
das mesmas, a violeta de genciana e o iodo se combinam para formar o CV-I. Este complexo maior
que a molcula de violeta de genciana que penetrou na clula e, devido a seu tamanho, no pode
ser removido da camada intacta de peptdeoglicano das clulas gram-positvas pelo lcool. Con-
seqentemente, as clulas gram-positvas retm a cor do corante violeta de genciana. Nas clulas
gram-negatvas, contudo, a lavagem com lcool rompe a camada externa de lipopolissacardeo, e
os complexos CV-I so removidos atravs da camada delgada de peptdeoglicana. Como resultado,
as clulas gram-negatvas permanecem incolores at serem contracoradas com safranina, quando
adquirem a cor rosa.
Fig. 1: Paredes celulares de bactrias gram-negatva e gram-positva.
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Procedimento
Neste procedimento, um esfregao fxado pelo calor recoberto com um corante bsico prpura,
usualmente a violeta de genciana. Uma vez que a colorao prpura impregna todas as clulas,
denomina colorao primria. Aps um curto perodo, o corante prpura lavado e o esfregao
recoberto com iodo. Quando o iodo lavado, ambas as bactrias gram-positvas e gram-negatvas
aparecem em cor violeta escuro ou prpura. A seguir, a lmina lavada com lcool ou uma soluo
de lcool-acetona. Esta soluo um agente descolorante, que remove o prpura das clulas de
algumas espcies, mas no de outras. O lcool lavado e a lmina ento corada com safranina (ou
fucsina), um corante bsico vermelho. O esfregao lavado novamente, seco com papel e exami-
nado microscopicamente.
O corante prpura e o iodo se combinam com cada bactria e a coram de violeta escuro ou prpura.
As bactrias que retm esta cor aps o lcool so classifcadas como gram-positvas; as bactrias
que perdem a cor violeta escuro ou prpura aps a descolorao so classifcadas como gram-
-negatvas. Como as bactrias gram-negatvas so incolores aps a lavagem com lcool, no so
mais visveis. por isso que o corante bsico safranina (ou fucsina) aplicado; ele cora as bactrias
gram-negatvas de rosa. Os corantes como a safranina, que possuem uma cor contrastante com a
colorao primria, so denominados contracorantes. Como as bactrias gram-positvas retm a
cor prpura original, no so afetadas pelo contracorante safranina.
Etapas
1. Confeccionar o esfregao na lamina;
2. Corar com violeta de cristal por 60 segundos;
3. Lavar com de gua destlada;
4. Cobrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos;
5. Lavar com de gua destlada;
6. Descorar com lcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;
7. Lavar com de gua destlada;
8. Corar com safranina por 20 segundos;
9. Lavar com gua destlada, secar e observar ao microscpio.
1- Cristal violeta
2- Soluo de iodo (lugol) - I
3- lcool
4- Safranina
Solues em Gram- positvas Gram- negatvas
ordem de aplicao
Clulas coradas em violeta
Formao do complexo CV-I no
interior das clulas, que per-
manecem violetas
Desidratao das paredes ce-
-lulares, diminuio da porosi-
-dade e da permeabilidade: o
complexo CV-I no pode sair
das clulas que permanecem
violetas.
As clulas no so afetadas, per-
manecendo violetas.
Clulas coradas em violeta
Formao do complexo CV-I no
interior das clulas, que per-
manecem violetas
Extrao dos lipdios da parede
celular, aumentando a porosi-
dade: O complexo CV-I remo-
vido das clulas
As clulas tomam o corante, tor-
nando-se vermelhas.
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O mtodo de Gram uma das mais importantes tcnicas de colorao em microbiologia mdica.
Porm, os resultados da colorao de Gram no so universalmente aplicveis, pois algumas clulas
bacterianas coram-se fracamente ou no adquirem cor. A reao de Gram mais consistente quan-
do usada em bactrias jovens, em crescimento.
A reao de Gram de uma bactria pode fornecer informao valiosa para o tratamento da doena.
As bactrias gram-positvas tendem a ser mortas facilmente por penicilinas e cefalosporinas. As
bactrias gram-negatvas, geralmente, so mais resistentes, pois os antbitcos no podem pene-
trar na camada de lipopolissacardeo. Alguma resistncia a estes antbitcos entre ambas as bact-
rias gram-positvas e gram-negatvas devida inatvao bacteriana dos antbitcos.
Morfologia das Clulas Bacterianas
Tamanho
- Variam de 0,3 por 0,8 m at 10 por
25 m.
- As espcies de maior interesse mdi-
co medem entre 0,5 a 1,0 m por 2 a 5 m.
Forma e arranjo
- Formas de cocos (esfricas): grupo
mais homogneo em relao a tamanho sendo
clulas menores (0,8-1,0 m). Os cocos rece-
bem denominaes diferentes de acordo com
o seu arranjo (Figura 2):
- Diplococos: cocos agrupados aos pa-
res. Ex: Neisseria meningitdes (meningococo);
- Ttrades: agrupamentos de quatro co-
cos. Ex: espcies do gnero Sarcina;
- Estreptococos: cocos agrupados em
cadeias. Ex: Streptococcus salivarius, Strepto-
coccus pneumoniae (pneumococo), Strepto-
coccus mutans;
- Estaflococos: cocos em grupos irregu-
lares, lembrando cachos de uva. Ex: Staphylo-
coccus aureus;
- Micrococos: cocos que se separam
completamente aps a diviso celular.
Forma de bastonete
So clulas cilndricas, em forma de bastonetes
que apresentam grande variao na forma
Figura 2: Arranjo em forma de coco.
Figura 3: Arranjo de bastonete
e tamanho entre gneros e espcies (Figura 3). Dentro da mesma espcie os bastonetes so relat-
vamente constantes sob condies normais de crescimento, podendo variar em tamanho e espes-
sura (longos e delgados, pequenos e grossos, extremidade reta, convexa ou arredondada). Quanto
ao arranjo podem variar em:
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- Diplobacilo: bastonetes agrupados aos pa-
res;
- Estreptobacilos: bastonetes agrupados em
cadeias;
- Paliada: bastonetes alinhados lado a lado
como palitos de fsforo. Ex: bacilo da diferia;
- Tricomas: similares a cadeias de bastone-
tes, mas com uma rea de contato muito maior en-
tre as clulas adjacentes. Ex: espcies dos gneros
Beggiatoa e Saprospira
Figura 4: Arranjo helicoidal ou espiralado
Formas helicoidais ou espiraladas
consttuem o terceiro grupo morfolgico, sendo caracterizado por clulas de forma espiral (Figura
4) que se dividem em:
- Espirilos: possuem corpo rgido e se movem custa de fagelos externos, dando uma ou
mais voltas espirais em torno do prprio eixo. Ex: Aquaspirillium;
Alm desses trs tpos morfolgicos, existem algumas formas de transio. Quando os bacilos so
muito curtos, podem se assemelhar aos cocos, sendo ento chamados de cocobacilos (Ex: Brucella
melitensis). Quando as formas espiraladas so muito curtas, assumindo a forma de vrgula, eles so
chamados de vibrio (Ex: V. cholerae).
- Espiroquetas: So fexveis e locomovem-se provavelmente s custas de contraes do ci-
toplasma, podendo dar vrias voltas completas em torno do prprio eixo. Ex: Treponema pallidum,
Treponema dentcola.
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Leitura Sugerida
Ministrio da Sade, Programa Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e AIDS. Tcni-
ca de Colorao de Gram. Braslia, 1997. Disponvel via URL em: htp://bvsms.saude.gov.br/bvs/
publicacoes/115_03gram.pdf
FREITAS, V. R.; PICOLI, S. U. A Colorao de Gram e as Variaes na sua Execuo. Newslab, 2007.
Disponvel via URL em: htp://www.newslab.com.br/ed_anteriores/82/art02/art02.pdf