Tesis 955

3
Capt ul o 1.- La papana y su pur i f i caci n

1.1 Gener al i dades

La papana es una proteasa sulfhdrica (thiol proteasa) que tiene la
capacidad de hidrolizar los enlaces peptdicos donde los residuos de
aminocidos aromticos del grupo carbonil son arginina, lisina o
glutamina. Es anloga en funciones a la pepsina (enzima que se
encuentra en el estmago humano y descompone las protenas).
Balls (et al., 1937) desarroll un proceso para la purificacin y
aislamiento en estado cristalino de la papana. Este mtodo fue
modificado despus por Kimmel & Smith (1954) usando ltex seco
comercial. Con algunas modificaciones contribuyeron Arnon (1970),
Baines & Brocklehurst (1979). De acuerdo a Brocklehurst los extractos
acuosos del ltex de Carica papaya contienen algunas cisten-
proteasas, una de ellas la quimopapana (PM= 27KD), que pueden ser
separadas por cromatografa. Estos antecedentes fueron descritos en el
trabajo de R.Monti
13
.
Para nuestro trabajo, se tomar la referencia experimental de los
mtodos de purificacin de papana de R.Monti
13
y de G. Glibota
32
.
1.2 Pr opi edades

Es un polvo blanco o blanco-grisceo. Tiene un olor cido pungente y
algo agresivo. Es ligeramente higroscpico. Moderadamente soluble en
agua y glicerol y prcticamente insoluble en la mayora de los solventes
orgnicos. Su temperatura ptima es de 65C y su rango de pH ptimo
est entre 5-7. Tiene un punto isoelctrico de 9.6. El peso molecular es
23.4kD.
El tiempo de vida til es corto; por lo tanto, se debe mantener en
ambiente seco y fro. No congelar en suspensiones acuosas.

4

Como material de embalaje se utilizan recipientes de polietileno o
acero inoxidable pues la papana es potencialmente peligrosa; el
contacto prolongado con esta produce daos en la piel de los
trabajadores incluso reacciones alrgicas.
Los enzimas vegetales no producen fenmenos txicos cuando se
administran por va oral. La administracin por va inyectable puede
producir disminucin de la coagulacin y fenmenos de
hipersensibilidad.

1.3 El ecci n de una est r at egi a de pur i f i caci n

El manual de purificacin de protenas de Amersham Pharmacia
Biotech
1
nos da una gua para purificar un enzima; nos recomienda
la eleccin de una estrategia de purificacin y la cual se define
como las tcnicas experimentales escogidas, de acuerdo a un orden
lgico, que nos permiten cumplir los objetivos de purificacin de un
enzima.

La eleccin de una estrategia de purificacin debe estar en funcin de
un nmero mnimo de pasos y el diseo ms simple posible.

El primer paso para elegir una estrategia de purificacin es
describir el escenario bsico para la purificacin y tomar en cuenta
consideraciones generales tales como ambiente apropiado de trabajo,
disponibilidad de reactivos y mtodos experimentales adecuados.

Luego, una de las formas de organizar el trabajo experimental
deviene del planteamiento de las siguientes interrogantes: Cul es el
uso del producto? Qu clase de material de partida est disponible y
cmo debe ser manejado? Qu debe removerse completamente? Cul

5
ser la escala final de purificacin? Qu consecuencias traer la
tcnica de purificacin utilizada en una produccin de mayor escala?

Con estos elementos de juicio elaboraremos la estrategia de
purificacin, la cual responder todas las preguntas planteadas. Sin
embargo, es necesario preparar la base sobre la cual estar cimentada
la mencionada estrategia.

1.4 Gua gener al par a l a ext r acci n y pur i f i caci n

La bibliografa ya mencionada recomienda cuatro fases experimentales y
adems, una fase preparatoria. A continuacin, lo referido.

Pr epar aci n ant es de l a pur i f i caci n del enzi ma

Se establecern en esta fase de planificacin, los niveles de pureza que
persigue la purificacin en funcin de la aplicacin que se le dar al
producto final: farmacutica, alimenticia u otra aplicacin industrial. Nos
adelantamos en mencionar que tomaremos en cuenta para este trabajo
el nivel de pureza para enzimas industriales (70-90% pureza).

Toda la informacin concerniente a los contaminantes que puedan
afectar al enzima, ayudar a definir la ruta de purificacin adecuada. Es
posible que algunos compuestos puedan ser tolerados como impurezas
y no generen problemas al producto final. En referencia a la papana, la
oxidacin es un factor influyente en su calidad porque disminuye su
accin enzimtica mediante la desnaturalizacin de su sitio activo.

Dentro del trabajo preparatorio se incluye la eleccin de una
estrategia y como ayuda para este fin tenemos la siguiente tabla que
nos permitir seleccionar las tcnicas experimentales para la
purificacin de la papana; ya que de acuerdo a la propiedad del enzima
podremos establecer cul es su influencia para elegir la tcnica de

6
purificacin; as nuestro procedimiento experimental ser eficiente y
evitaremos la prdida de calidad del enzima.

Tabla 1. Efecto de las propiedades del enzima en relacin a la estrategia de
purificacin

Propiedades del enzima Influencia en l a estrategia de
purificacin

Temperatura de Definimos la
estabilidad temperatura ptima de trabajo

Estabilidad del pH Definimos que buffer
(cido o bsico) se puede
utilizar

Fuerza inica Seleccin de una sal para
precipitar el enzima

Sensibilidad a iones Necesidad de utilizar
metlicos agentes quelantes
(EDTA)

Recol ecci n de l a mat er i a pr i ma

Es el primer paso experimental en el proceso de purificacin y es
imperativo, durante la extraccin de la materia prima, que el manipuleo
sea mnimo y se evite un contacto prolongado con el medio ambiente.

Previo a la recoleccin del ltex debe considerarse que en la
seleccin de la papaya, segn el Centro de Desarrollo de Agronegocios
de Uganda, su edad debe estar comprendida entre nueve y catorce
meses de plantacin y su color tiene que ser verde claro. Para la
incisin de la fruta debe utilizarse una navaja de acero inoxidable y la

7
recoleccin debe realizarse por la maana (entre cinco y nueve de la
maana), de dos a tres incisiones. El ltex exudado debe recogerse en
receptculos de plstico. Es evidente, de acuerdo a la naturaleza cida
del ltex, la necesidad de utilizar guantes en este proceso.

Est r at egi a de pur i f i caci n

La bibliografa nos recomienda seguir las siguientes fases
experimentales en el proceso de purificacin de enzimas:

Extraccin.- Los objetivos son aislar, concentrar y estabilizar al enzima.
Adems, necesitamos remover los contaminantes crticos. Luego, debe
transferirse el extracto purificado a un ambiente apropiado para
conservar su calidad. En esta fase, G.Glibota
32
utiliza buffer cido
ctrico-fosfato cido de sodio para concentrar la papana en el buffer y
eliminar los polisacridos en forma de precipitado. Este buffer y la
papana, debido a la afinidad cido-cido, lograrn una interaccin fsica
que permitir separar el enzima del ltex.

La velocidad de trabajo es un factor crtico en este paso por cuanto los
contaminantes pueden ocasionar problemas en el producto.

Purificacin intermedia.- El objetivo es precipitar la mayor cantidad de
enzima y remover, adems, en la fase soluble la mayor parte de las
impurezas tales como otras protenas, cidos nucleicos y vitaminas. En
los procedimientos de Biologa Molecular, en la extraccin de protenas
de las clulas se utiliza etanol o acetona. Estos solventes, de alta
resolucin, miscibles con el agua, disminuyen la solubilidad de los
enzimas que se encuentran en la solucin extrada de la fase de
extraccin y logran su precipitacin de acuerdo a la disminucin del
grado de ionizacin de los residuos del enzima. En este precipitado se
encontrar dos enzimas proteolticos: papana y quimopapana.

8
La velocidad de trabajo es menos crtica por cuanto se han eliminado la
mayor parte los elementos que producen molestias al producto final.

Purificacin final (Refinado).- El objetivo es lograr una alta pureza
mediante la remocin de las trazas de impurezas an presentes. Se
necesita un ajuste de pH, sal o aditivos para el almacenamiento del
producto final. Se arriesga una prdida de muestra para lograr una alta
resolucin.

Los estudios de purificacin de enzimas recomiendan que se
resuspenda el extracto purificado de la fase anterior en un buffer y luego
que la precipitacin se lleve a cabo hasta que se alcance el punto
isoelctrico. El sulfato de amonio es la sal ms comn en este tipo de
trabajos ya que es soluble en soluciones tampn fras. Otros sustitutos
son el sulfato de sodio, polietilnglicol y acetona.

El nmero de pasos requeridos en la purificacin del enzima estar en
funcin del nivel de pureza deseado.

1.5 Medi ci n de su act i vi dad pr ot eol t i ca

El parmetro de control de calidad de la papana es la medicin de su
actividad proteoltica; se expresa como el incremento en la velocidad de
reaccin de la conversin de un sustrato en producto por intervencin
del enzima. Esta accin cataltica se la puede medir tambin en
referencia a la digestin de un pptido o protena y la extensin de tal
digestin es medida de diferentes formas; existen tres:

Mtodos que se encargan de la medicin de los residuos de un
pptido no digerido por el enzima.
Mtodos que miden los grupos amino liberados en la catlisis.

9
Mtodos que miden la rotacin ptica de los residuos digeridos, el
tiempo de coagulacin de una muestra de leche, el color producido
por un reactivo en los residuos digeridos y el aumento de los
slidos solubles en el medio de reaccin.

Dentro de este contexto, se detallarn los resultados de un estudio
realizado por G.Glibota
32
en el cual trabaja con algunos sustratos y
concluye lo siguiente:

Mtodo colorimtrico.- Consiste en la hidrlisis del sustrato sinttico
BAPA (benzoil arginina p-nitroanilina) hasta obtener el producto p-
nitroanilina que tiene coloracin amarilla. El cambio de color y su
intensidad estn en funcin de la actividad proteoltica del enzima. Los
digeridos se miden en un espectrofotmetro a 410nm. El tiempo de
reaccin es de 6 horas a 25C. Este mtodo dio resultados muy bajos y
se recomienda esta tcnica para un ensayo con tripsina -enzima
proteoltica- pues con ste enzima los resultados son ms confiables.

Mtodo titulomtrico.- Esta tcnica utiliza otro sustrato sinttico: BAEE
(N--benzoil-L-arginina etil ester). Se titula con NaOH 0.015N, al
producto de reaccin a pH constante de 6.2 y temperatura de 25C. Este
mtodo permiti obtener resultados proporcionales a la concentracin
de enzima as como un ajuste regresional en la grfica de calibracin de
la actividad. Es exacto. Sin embargo, su costo es elevado.

Mtodo de hidrl isis con casena.- Se lleva a cabo una reaccin con
casena y al final de la misma se hace precipitar con cido
tricloroactico (TCA) 30%. Luego se realizan las lecturas del
sobrenadante formado en el espectrofotmetro a 280nm. Este mtodo
no permiti obtener una curva aceptable salvo a bajas concentraciones.
Por otra parte, Enzyme Development Corporation public un
reporte acerca de un mtodo de digestin de gelatina por accin
proteoltica de la bromelana; enzima obtenido de la corteza de pia y
semejante a la papana. Este mtodo se basa en la titulacin con NaOH

10
0.1N del nitrgeno amino de la solucin de gelatina digerida con
bromelana a 45C durante 20min.

Otro mtodo, el cual es una alternativa del mtodo que utiliza
como sustrato a la casena, es el de la coagulacin de la leche
descremada; las protenas precipitan en un tiempo determinado de
acuerdo a la concentracin de enzima aadida. El tiempo de
coagulacin es la variable sujeta de control. Es de naturaleza
cualitativa.

11
Capt ul o 2.- El qui t osano como sopor t e par a l a
i nmovi l i zaci n de papana

2.1 Gener al i dades

El quitosano es un heteropolisacrido compuesto de unidades de los
monmeros: D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina; ambos estn
unidos por un enlace glucosdico -1,4. La parte que corresponde a la
D-glucosamina le confiere cierta solubilidad en soluciones acuosas.

Se obtiene a partir de la quitina (N-acetil-D-glucosamina) mediante
una deacetilacin parcial con un lcali fuerte. En nuestro trabajo, la
materia prima para la obtencin del quitosano ser el exoesqueleto de
cangrejo, del cual se desconoce su composicin de quitina.

Es un material utilizado en aplicaciones farmacuticas debido a su
biodegradabilidad, biocompatibilidad y baja toxicidad. Su versatilidad se
debe a la alta reactividad de los grupos amino que tiene en su molcula.
Adems, se caracteriza por una buena adhesin, alta fuerza mecnica y
habilidad para formar pelculas, geles, lechos porosos y hojuelas.

Su amplio espectro de adsorcin le ha permitido su utilizacin
como soporte de inmovilizacin en enzimas tales como: lipasa, tripsina,
fosfatasa alcalina, pepsina A, malato deshidrogenasa, amiloglucosidasa,
-glicosidasa, -L-arabinofuranosidasa y -D-galactosidasa.

La bibliografa menciona que una molcula de quitosano debera
estar compuesta por ms de un 75% de unidades monomricas de D-
glucosamina y por menos de un 25% de unidades monomricas de N-
acetil-D-glucosamina. Uno de los mtodos para la determinacin de este
grado de deacetilacin se basa en la titulacin potenciomtrica (Kim et
al., 2000) de los grupos amino de una muestra de quitosano con una
solucin de NaOH 0.08N.

12

F1(a). Molcul a de quitina

F1(b). Molcul a de quitosano
(Fuente: Niederhofer, A.
16
)

Para la produccin de quitosano a partir de desechos de cangrejo,
A. Niederhofer
16
en su trabajo hace referencia del procedimiento
experimental:
Desproteinizacin -eliminacin de la fraccin proteica de la muestra- de los
restos de desechos secos de cangrejo con una solucin de NaOH 2%
bajo calentamiento. Para la Desmineralizacin -eliminacin de carbonatos
de la muestra- se agrega HCl 2%; se lava la muestra para neutralizar el
pH. Por ltimo, se procede a la deacetilacin -remocin de los grupos
acetilo de las molculas de quitina- con NaOH 50% bajo calentamiento.
Esta muestra posteriormente se lava y se seca.

13
2.2 Cont r i buci n de su conf or maci n par a l a i nmovi l i zaci n

La superficie de la partcula de quitosano ofrece dos contribuciones que
juegan un rol muy importante en su eficiencia como soporte. La primera,
y ms importante, es la estabilidad que presenta bajo las diversas
condiciones de aplicacin como el pH, solvente o temperatura del
medio.

La segunda se refiere a la reactividad que sus grupos amino
favorecen la formacin de enlaces no covalentes entre el soporte y el
enzima. Tal contribucin ha permitido que el quitosano haya sido
utilizado para inmovilizar enzimas de distinta naturaleza.

2.3 Ef ect o de l as condi ci ones mi cr oambi ent al es

Ciertas circunstancias microambientales que involucran al sustrato, al
enzima y al soporte producen efectos inhibitorios en la inmovilizacin.
Un efecto se refiere al cambio de la carga neta del enzima debido a la
influencia que provoca la carga del soporte. En estas circunstancias se
produce una interaccin carga-carga a tiempos impredecibles entre el
soporte y la superficie del enzima. Esto puede provocar una inhibicin
de la propiedad cataltica del enzima. El segundo efecto se refiere a las
interacciones entre la solucin de sustrato y el soporte. Un ejemplo de
lo mencionado se evidencia en un estudio realizado con papana
inmovilizada en un soporte de titanio; en ste se trabaj con casena
como sustrato. La naturaleza cida del soporte produjo que la casena
coagulara y la funcin que cumpli la papana inmovilizada en titanio se
bloque debido a los cogulos de casena que taponaron los poros del
soporte.

R. Messing en su trabajo Carriers for immobilized biologically
active systems menciona que ciertos iones metlicos presentes en el

14
medio de reaccin pueden adherirse a la superficie del soporte e inhibir
la funcin del enzima. Estas reacciones se pueden presentar debido a la
alta reactividad del quitosano y disminuir su capacidad de adsorcin.

2.4 Est abi l i dad

Es importante esta condicin en la seleccin de un soporte para la
inmovilizacin de enzimas. Aunque el soporte no sea durable bajo todos
los rangos de pH, fuerza inica y condiciones de solvente, sin embargo,
es suficiente su estabilidad bajo las condiciones de aplicacin.

Para evaluar la durabilidad de los soportes, D. Eaton en su estudio
titulado Immobilized biochemicals and affinity chromotography ha
sugerido ciertos procedimientos de evaluacin bajo una variedad de
condiciones. Se trabaja con algunos solventes, buffers, sustratos y
productos, los cuales pueden afectar la estabilidad de la superficie del
soporte. Otras condiciones que se aplican son las altas temperaturas
por tiempos prolongados. Esta evaluacin nos permite conocer cules
son los lmites permisibles para las condiciones de trabajo del soporte.

2.5 Pr eacondi ci onami ent o

Uno de los errores ms comunes que se comete en la inmovilizacin es
exponer el enzima directamente con el soporte, sin previo
acondicionamiento del pH del soporte con respecto a la solucin del
enzima. Dado que la mayor parte de los soportes son materiales muy
reactivos, entonces pueden provocarse reacciones secundarias con
otros componentes. Por ejemplo, en un estudio con un soporte de vidrio
se detect una pelcula de impurezas que produjo un efecto inhibitorio
para la inmovilizacin.

15
Por lo tanto, el proceso de limpieza o acondicionamiento
depender de las caractersticas de durabilidad del soporte. Si el
soporte es muy estable en ambientes cidos, entonces debera ser
preacondicionado con una solucin cida.

2.6 Regener aci n

Cuando el enzima inmovilizado pierde actividad y su nivel til ha
pasado, entonces, debe removerse el enzima inactivo y preparar la
superficie del soporte para una nueva inmovilizacin. La desorcin del
enzima, para regenerar el soporte, puede lograrse con un cambio de pH
o tambin con la ayuda de agentes qumicos tales como perxido de
hidrgeno u otros agentes oxidantes.

16
Capt ul o 3.- Pr oceso de i nmovi l i zaci n de l a papana en
qui t osano

3.1 Inmovi l i zaci n por Adsor ci n.
Este mtodo es el ms simple y de ms bajo costo entre los que se
refieren a la inmovilizacin de enzimas; se basa en la adsorcin fsica
de las molculas de enzima en la superficie del soporte debido a
enlaces no covalentes. Variables como pH, cantidad de enzima,
cantidad de soporte, tiempo y temperatura, necesitan un estricto control
porque las fuerzas de adsorcin que participan son dbiles y dependen
de la naturaleza del soporte.
Puesto que este mtodo no implica la adicin de reactivos, se produce
solo un ligero e incluso nulo cambio conformacional del enzima durante
la inmovilizacin, segn Wiseman
10
.

Eventualmente el enzima se distribuye con uniformidad por todo
el soporte despus de un tiempo suficiente para que se alcance el
equilibrio y la distribucin de los centros de inmovilizacin dentro del
soporte es uniforme siempre que haya suficiente cantidad de enzima -
puede demostrarse coloreando el enzima (Carleysmith et al.,1980)-.
Cuando el enzima no est distribuido uniformemente sino concentrado
cerca de la superficie, tiende a ser ms activo que las preparaciones
equivalentes en las que el enzima est uniformemente distribuido,
debido a que las restricciones difusionales son menos importantes a
causa del menor trayecto de difusin. Sin embargo, estas preparaciones
tienden a desactivarse ms rpido debido a que estn ms expuestas a
agentes desnaturalizantes.

Generalmente para optimizar la inmovilizacin por adsorcin se
utilizan tcnicas complementarias que coadyuvan al fortalecimiento de
las interacciones fsicas entre el enzima y el soporte. A. Kilin
14
ha

17
utilizado glutaraldehido para dicho propsito; este compuesto se utiliza
en la tincin de compuestos biolgicos para fijarlos en membranas.
Adems, en su investigacin T.Hayashi
12
trabaj con espaciadores -
grupos carboxil que fijan el enzima al soporte- con la ayuda de N-
hidroxisuccinimida. Por otro lado, E.B.Pereira
18
hizo reaccionar hexano
con el quitosano para lograr su mayor reactividad como soporte.

3.2 Mecani smo de l i gadur a del si st ema papana-qui t osano

En su trabajo, A. Kilin
14
da a conocer un mecanismo que explica el
fenmeno de la inmovilizacin molecular de la papana en quitosano.
Este hace mencin a los restos de aminocidos que favorecen la
interaccin fsica con el soporte. Los restos Lis, Asp, Glu, Tir, Ser, Trio,
Cis y el quitosano forman enlaces de hidrgeno pues estos restos son
los ms reactivos y vidos para formar este tipo de interacciones.
Tambin las fuerzas de van der Waals tambin colaboran con la
formacin del nuevo sistema papana-quitosano.

Como ya se mencion, el quitosano es un biopolmero cuya
reactividad favorece la adsorcin de enzimas; sin embargo, la
naturaleza frgil de los enlaces formados con la papana limita las
condiciones de operacin. Por lo tanto recomiendan trabajar bajo rangos
de temperatura aproximados a los 35C y pH entre 3.0 y 7.0.

En la siguiente figura mostramos una seccin de la molcula de
papana en la cual sus restos de aminocidos interactan, mediante
enlaces no covalentes, con el quitosano.

18

F2. Secuencia de restos de aminocidos adsorbidos por el quitosano

En otro mbito, el sitio activo de la papana tiene entre sus
residuos de aminocidos a los grupos Cis e His; ellos tambin pueden
formar enlaces con el quitosano y esta unin del sitio activo con el
soporte impide el acceso del sustrato dejando sin efecto su accin
catalizadora. Sin embargo, este hecho tiene una probabilidad de
ocurrencia y en consecuencia habr molculas de papana en las que
sus sitios activos estn bloqueados y otras molculas que no lo
estarn; de esta forma se ver disminuida su actividad. Un ejemplo de
lo mencionado ocurre con la tripsina en la que su residuo histidil del
sitio activo puede reaccionar con un soporte de vidrio poroso y as se
impide la respectiva catlisis.

Actualmente se han desarrollado avances para prevenir el
impedimento que pudiere existir entre el enzima y el soporte. Estos se
refieren a la adicin de molculas que actan como puentes entre el
Soporte de quitosano
+
NH
2

+
NH
2

+
NH
2

+
NH
2

Molcula de
Papana
Asp
-
Thr
Ser
His

-
Gl u
-
Ser
Thr
Pr o
Gl u
Gl n
Pr o
Cis
-
Asp
Sitio activo

19
soporte y el enzima lo cual disminuye la probabilidad de taponamientos
en los sitios activos de los enzimas. Son los llamados brazos
espaciadores. Este es el aporte cientfico del trabajo de T.Hayashi:
Disminuir la entropa entre el sistema papana-quitosano.

3.3 Fact or es que af ect an su adsor ci n

Klaus Mosbach en su trabajo Immobilized Enzymes considera que uno
de los factores que producen la desorcin de un enzima del soporte se
refiere a desnaturalizantes como el calor y metales pesados; por lo cual
se recomienda un tratamiento acorde a la naturaleza del producto.

Un factor que afecta la adsorcin de la papana en quitosano se
refiere a la concentracin de enzima expuesta a la unidad de superficie
durante la inmovilizacin. Bernath & Vieth desarrollaron isotermas de
sorcin para lactasa y lisozima; con membranas de colgeno su
actividad incrementa con el incremento de su concentracin,
aproximndose asintticamente a un valor de saturacin a altas
concentraciones de enzima. Los autores proclaman que la asntota que
se aproxima a un valor lmite demuestra que hay un nmero finito de
sitios de enlace en el colgeno y que los diferentes enzimas estn
enlazados a una matriz por un mecanismo general. En tales
circunstancias, uno de los estudios en este trabajo consistir en hallar la
concentracin ptima de papana en el soporte de quitosano.
Altas temperaturas son contraindicadas debido a la desnaturalizacin de
la protena, aunque se puede alcanzar una temperatura ptima para un
enzima por un periodo extenso de tiempo.

Los factores contribuyentes en la inmovilizacin por adsorcin son
los siguientes:
(1) Concentracin y cantidad de enzima versus la unidad de superficie
de rea o peso del soporte.
(2) Fuerza inica.

20
(3) pH inicial de la operacin de absorcin y subsiguiente pH de
aplicacin.
(4) Temperatura de la operacin de absorcin.
(5) Punto isoelctrico del enzima y de los sitios de absorcin del
soporte.

3.4 Opt i mi zaci n del qui t osano par a l a adsor ci n de papana

Debido a su solubilidad en cido actico, el quitosano es conveniente
para prepararlo como membranas, geles, lechos porosos y hojuelas;
pues debido a la presencia del par de electrones libres del grupo amino,
se asume que es el origen de los enlaces dativos cuando se solubiliza a
pH menor a 6. En su trabajo A. Kilin
14
disolvi al quitosano en cido
actico 2% y luego lo hizo precipitar con NaOH 4M; finalmente fue
lavado con buffer citrato / fosfato 30mM (pH=6) y as pudo obtener
quitosano poroso; en estas condiciones el quitosano ofrece una mayor
superficie para la adsorcin de enzimas.

Un estudio de Ming-Hua
22
luego de solubilizarlo en cido actico,
lo somete a congelacin para lograr una nucleacin y crecimiento de sus
cristales. Luego aade NaOH para que el polmero adquiera rigidez bajo
la forma que se requiera. Otros estudios mencionan que si se lo coloca
solubilizado sobre una lmina de acero, adquirir dicha forma despus
de aadir el lcali pues ste se encarga de darle la rigidez requerida.

Hay un punto muy importante a ser considerado en la optimizacin
del quitosano para la adsorcin de la papana: su preacondicionamiento
con respecto al pH, pues como as recomienda A. Kilin
14
, despus del
cambio conformacional del quitosano, es imperativo el ajuste de su pH;
generalmente se utiliza el mismo buffer utilizado para extraer el enzima.

21
3.5 Ensayo de l a papana i nmovi l i zada: Pr ueba espect r of ot omt r i ca

En su estudio T.Hayashi manifiesta que cuando se ensaya con papana
inmovilizada en las pruebas de actividad existe una dificultad para llevar
a cabo este procedimiento; la casena, que tiene un elevado peso
molecular (22KDa), provoca un impedimento estrico en el sitio activo de
la papana. Razn por la cual, en su trabajo se utilizaron dos sustratos:
uno de bajo peso molecular, BAEE (N--benzoil-L-arginina etil ester) y la
mencionada casena.

En sustitucin del BAEE, que es un reactivo caro, la bibliografa
recomienda a la gelatina como sustrato de bajo peso molecular. Esta es
utilizada por los bioqumicos para realizar ensayos cualitativos rpidos y
as determinar la accin proteoltica de la papana o de la bromelana -
enzima extrado de la corteza de pia-.

Debido al alto costo de la papana y de los sustratos que se utilizan
para la determinacin de su calidad, proponemos una adaptacin de los
procedimientos experimentales -tambin llamados protocolos- que
determinan la actividad proteoltica de la papana. La misma consistira
en tomar como referencia la absorbancia de una muestra de gelatina sin
digerir -muestra testigo- que representar la concentracin inicial de
protenas en la solucin de sustrato. Luego que la papana acte sobre
la muestra de gelatina y la digiera hasta obtener restos del pptido no
detectables por el espectrofotmetro- entonces disminuir la
concentracin de protenas. Al final de la catlisis, esta disminucin de
la cantidad de protenas es detectada por el espectrofotmetro como
una absorbancia menor que la absorbancia de la muestra inicial de
protenas. Por lo tanto, podemos realizar una comparacin entre estas
lecturas y as conocer el grado de digestin que produce la papana
sobre la gelatina.

22
A continuacin presentamos el mecanismo de la accin
proteoltica de la papana sobre el sustrato. En l se evidencia la ruptura
del enlace peptdico y la formacin de los restos de pptido.

F3. (a) Mecanismo de la accin cataltica de la papana sobre el sustrato
gelatina: ruptura del enlace peptdico

F3. (b) Mecanismo de la accin cataltica de la papana sobre el sustrato
gelatina: formacin de los residuos de pptido

Sitio activo de la papana
O
-
R R

H

His159
Ruptura del enlace
peptdico

Sustrato

H
Cis25
CH
2
S
C N
Sitio activo de la papana
S

Cis25
CH
2
O
-
R
C
His159
Formacin del nuevo
enlace

Formacin de residuos de
pptido

R

H

H
N

23
3.6 Usos de l a papana i nmovi l i zada y su mer cado

Un antecedente a recalcar es que el crecimiento del negocio relacionado
con la papana ha sido tal en los ltimos aos que el mercado mundial
se calcula en unos cien millones de dlares anuales, de los cuales el
70% pertenece a las industrias relacionadas con la alimentacin. Esta
informacin ha sido proporcionada por Tecnologic Farm S.A. (Chile).

En la industria cervecera se utiliza la papana inmovilizada para
evitar que la cerveza se enturbie durante el almacenamiento o
congelacin, mediante la fragmentacin de las protenas presentes en el
proceso de obtencin de este producto. El consumo mundial como
clarificador de cerveza es de 480 ton. anuales.

Los electrodos enzimticos corresponde a otra aplicacin de la
cual puede hacerse uso con la papana inmovilizada; son dispositivos
analticos que se usan en bioprocesos para monitorear alguna variable,
por ejemplo: Medicin de la concentracin de protenas en un reactor.

Dentro de las aplicaciones en las industrias de punta tenemos la
sntesis de aminocidos y restos de pptidos; estos productos
satisfacen el mercado alimenticio como complementos dietticos, por su
capacidad de favorecer los procesos digestivos. Tambin se utiliza en la
produccin de anticuerpos que son usados en anlisis
inmunohistoqumicos. La demanda para estas aplicaciones es de
aproximadamente 90 ton. anuales.

Una potencial aplicacin de la papana inmovilizada en la industria
textil se refiere al mejoramiento de la calidad de las tinturas y tambin
para evitar el encogimiento de las lanas.

24
Capt ul o 4.- Pl aneaci n del t r abaj o exper i ment al

Int r oducci n

El punto de congruencia entre la parte terica y la experimental, que
ayuda a definir las variables sujetas a estudio, lo constituye la
planeacin del trabajo experimental; en sta se definir la estrategia
que ayudar a conseguir los objetivos planteados en este anteproyecto.
Es importante recalcar, adems, que dicha estrategia ser elaborada de
acuerdo a la disponibilidad de equipos y materiales; adems, se
pretende evitar cualquier eventualidad que se presente a lo largo de la
experimentacin.

4.1 Cmo se pl anear el t r abaj o

Dado que el trabajo experimental consiste de lo siguiente:

Obtencin del quitosano a partir del exoesqueleto del cangrejo y la
medicin de la calidad mediante su grado de deacetilacin y
adems, su preacondicionamiento como soporte para la
inmovilizacin de la papana.

Estudio de las cantidades ptimas de reactivos necesarias para la
extraccin y purificacin de la papana a partir del ltex de papaya
y la medicin del grado de digestin que produce sobre el sustrato
leche.

Estudios acerca del efecto de la concentracin de papana en el
quitosano, tiempo de la operacin de inmovilizacin de papana en
quitosano y nmero de reutilizaciones del enzima inmovilizado con
respecto a la digestin del sustrato gelatina.

25
Entonces, para facilitar su desenvolvimiento y asegurar la
confiabilidad de sus procedimientos y resultados, se propone que la
estrategia consista en dividir el trabajo en tres etapas:

Etapa de preparacin
Etapa de ejecucin
Etapa de examen de resultados

Este ser el plan de trabajo que permitir alcanzar los objetivos
propuestos aqu. A continuacin se detallarn cada uno de los
componentes de lo mencionado.

4.2 En qu consi st e l a et apa de pr epar aci n

Consistir en organizar todo lo necesario para el trabajo experimental
(lista de materiales, equipos y reactivos) y ensayar pruebas de habilidad
tanto con los protocolos experimentales como con los equipos (pruebas
operacionales). Tambin se realizarn ensayos acerca de la adaptacin
de ciertos mtodos experimentales de acuerdo a nuestras posibilidades
tcnicas y econmicas. Finalmente se ensayarn las pruebas
exploratorias de los rangos ptimos de concentraciones, tiempos y
temperaturas de operacin.

En la etapa de preparacin, antes de ensayar los mtodos de anlisis,
se fijarn los factores que determinen la calidad de las materias primas
y de los productos obtenidos; pues es imperativo primero determinar
qu parmetros evaluaremos y en funcin de esto, se establecern los
respectivos mtodos para el control de calidad.

26
4.3 En qu consi st e l a et apa de ej ecuci n

En referencia a la etapa anterior, donde se ensayaron pruebas
exploratorias y preparatorias, en esta etapa se llevarn a cabo las
pruebas finales y de reproducibilidad. En la redaccin de este captulo
solamente se detallaran los procedimientos finales y sus resultados;
nada ms.

4.4 En qu consi st e l a et apa de examen de r esul t ados

De acuerdo a la informacin obtenida en el captulo anterior, aqu
corresponder analizar todos los resultados obtenidos y sus eficiencias.
De acuerdo al informe de resultados, se discutir la hiptesis planteada.
Lo que se deduzca de este captulo de anlisis, ser la conclusin de
este anteproyecto.

27
Capt ul o 5.- Et apa pr epar at or i a
De acuerdo a lo que se mencion en el captulo anterior, aqu nos
corresponder primero la fijacin de los factores -o parmetros- de
calidad de las materias primas y productos como paso previo a la
seleccin y ensayo de los mtodos de anlisis de calidad.

5.1 Fi j aci n de l os f act or es de cal i dad

El fundamento que regir la seleccin de los mtodos de anlisis para el
control de calidad de las materias primas y de los productos, se refiere a
los factores que conjuntamente establecen su calidad.

Los siguientes son los factores que definen la calidad de la
papaya apta para la recoleccin de su ltex:

-Estado de madurez: entre 9-14 meses de plantacin
-Tamao adecuado: papaya tamao mediano (tipo hawaiana)

La bibliografa recomienda que las condiciones ambientales para
la recoleccin del ltex sean:

-Hora de recoleccin: entre 5-9 am
-Condiciones de trabajo: evitar contacto prolongado con el ambiente
-Almacenamiento del ltex recolectado: envases de plstico

Los factores que definen la calidad del ltex son:

-Color blanco.- un cambio a pardo claro-oscuro indica la
desnaturalizacin del enzima. Esta caracterstica sensorial es una forma
rpida y eficaz acerca de la calidad del ltex despus de un periodo de
almacenamiento.

28
Para nuestro estudio, se almacen ltex bajo congelamiento
durante tres meses y el color se mantuvo sin cambio alguno y tambin
su actividad. Por otro lado, una muestra de ltex que fue almacenada a
temperatura ambiente evidenci un cambio de color a pardo oscuro y su
actividad proteoltica disminuy considerablemente.

-Olor cido.- La oxidacin adems de producir un cambio de color en el
ltex tambin produce un olor a sulfuro de hidrgeno; esta es otra
alternativa para evaluar la calidad del ltex.

Acerca del exosquel eto de cangrejo no hay mayor detalle en los
factores de calidad que determinen su seleccin. Solamente nos dan
recomendaciones sobre la recoleccin de los restos de exoesqueleto de
cangrejo:
-Evitar la recoleccin de carne.
-Lavar lo recolectado previo al secado y trituracin.

El factor que regir la calidad de la papana purificada ser su
grado de digestin con respecto al sustrato leche.

Con respecto al quitosano su calidad se determinar en base a la
cuantificacin de los grupos acetilo de su molcula mediante la
medicin de su grado de deacetilacin.

La calidad de la papana inmovilizada se establecer con respecto
al grado de digestin del sustrato gelatina.

29
5.2 Sel ecci n de l os mt odos de anl i si s par a el cont r ol de
cal i dad

El mtodo para evaluar la calidad de la papaya y del ltex se basa en un
examen sensorial; el mismo determinar, de acuerdo a los factores de
calidad, la idoneidad de la materia prima.

Con respecto al exoesqueleto de cangrejo, como ya se mencion,
no existen mayores detalles que definan su calidad. No obstante, un
anlisis sensorial del estado de la materia prima en referencia a lo que
el proceso demanda s ser determinante.

De los mtodos expuestos en el captulo 2, para el control de
calidad de la papana purificada, tomaremos en cuenta el de
coagulacin de la leche, debido a su bajo costo. La medicin del grado
de digestin la llevaremos a cabo por espectrofotometra.

El mtodo ms prctico y econmico para la determinacin del
grado de deacetilacin de una muestra de quitosano es el
potenciomtrico y consiste en la titulacin con lcali de una muestra de
quitosano.

El mtodo para medir el grado de digestin del sustrato por accin
de la papana inmovilizada ser tambin el espectrofotomtrico. En este
caso el sustrato ser la gelatina, de acuerdo a las justificaciones ya
expuestas en la parte terica.

30
5.3 Pr uebas pr el i mi nar es

Como ya se mencion en el captulo 4, la estructura de trabajo
propuesta debiera de llevarse a cabo en el siguiente orden cronolgico:
pruebas exploratorias y preparatorias de los mtodos de anlisis de
calidad y estudios de purificacin e inmovilizacin de la papana; esta
secuencia nos permitira disponer de las herramientas necesarias para
controlar la calidad de los productos durante la realizacin de los
estudios pertinentes.
En este trabajo un contrapunto para seguir este orden ha sido la
indisponibilidad de papana de naturaleza comercial; ella servira como
referencia pero debido a su indisponibilidad tuvo que obtenerse del ltex
de papaya y posteriormente se realiz el anlisis de su calidad. Cabe
mencionar que cuando se pudo conseguir el quitosano de naturaleza
comercial este s permiti compararlo con el quitosano producido en
nuestro proceso. En el caso de la papana, tuvieron que realizarse unas
adaptaciones al mtodo de anlisis de su calidad propuesto en la
bibliografa y ms adelante las mismas sern sometidas a pruebas de
exploracin, preparacin y de reproducibilidad que avalizarn su
confiabilidad.

La cronologa del trabajo experimental que se tratar a continuacin, sin
embargo, responde a las circunstancias de disponibilidad de materiales
pero esto no obsta el cumplimiento de los objetivos planteados en este
anteproyecto.

31
5.3.1 Obt enci n del qui t osano a par t i r del exoesquel et o del
cangr ej o

En el siguiente protocolo se ensayar el procedimiento en base a lo
propuesto por A.Garca
29
; sin embargo, experimentaremos con
diferentes cantidades de cido clorhdrico para evaluar su efecto en la
cantidad de dixido de carbono que se formare, en beneficio de hallar
una cantidad mnima de cido para la desmineralizacin. Dado que
desconocemos cul es la composicin exacta de quitina en el cangrejo,
trabajaremos con excesos de volmenes de hidrxido de sodio con
respecto a lo recomendado por la bibliografa; pues la referencia trabaj
con muestras de langosta y nuestro trabajo propone la utilizacin de
exoesqueleto de cangrejo, como fuente alternativa de quitina.

Pr ot ocol o N 1

1.- Preparacin de la muestra de exoesqueleto.-
Realizar un lavado con agua y luego secar. Posteriormente someter a
trituracin y tamizado.

Las muestras fueron lavadas hasta eliminar los residuos de carne.
El secado se realiz a 40C durante aproximadamente 2 horas.
La premolienda se llev a cabo en un molino de martillos.
La molienda de refinado se la realiz en un molino domstico.
El tamizado dio como resultados un tamao de partcula entre
(100-400)m.

2.- Desmineral izacin.-
Agregar x mL de HCl 1.5N a 3.0 gr. de la muestra preparada durante
40min y mantener en contacto mientras se libera el dixido de carbono.

32
Tabla N 5.3.1
Efecto de la cantidad de HCl aadido sobre la
cantidad de CO2 liberado de una muestra de exoesqueleto de cangrejo*
Prueba
#
HCl aadidos
(mL)
Grado** de
liberacin de CO
2

1 25 2
2 30 4
3 40 4
4 50 4

*Muestra: 3000mg exoesqueleto de cangrejo seco
**Determinacin por anlisis sensorial
Calificacin
Muy alto = 5 Alto = 4 Mediano = 3 Bajo = 2 Muy bajo = 1

3.- Lavar la muestra con agua desmineralizada hasta lograr un pH
neutro y eliminar el sobrenadante.

4.- Desproteinizacin.-
En un baln aadir 30 mL de NaOH 5% a la muestra y calentar a 100C
durante 30min.
5.- Lavar la muestra con agua desmineralizada y eliminar el
sobrenadante. No es necesario alcanzar el pH neutro.

6.- Deacetilacin.-
A la muestra remanente, aadir 50 mL de NaOH 50% y calentar a 100C
durante 1.5 horas.
7.- Lavar la muestra con agua desmineralizada hasta lograr un pH
neutro. Eliminar el sobrenadante, filtrar y secar. Finalmente pesar la
muestra.

Cantidad de quitosano producido = 448mg

33
Pr ot ocol o par a l a obt enci n del qui t osano a par t i r del exoesquel et o
de cangr ej o

Filtracin
100C
1. 5 Hr s.
Lavado
Desmineralizacin
Y2 mL NaOH
50%
Lavar con agua
y el i mi nar el
sobr enadant e
100C
30 mi n.
Y mL NaOH
5%
Desproteinizacin
Deacetilacin
Secado
Muest r a seca
y t r i t ur ada
exoesquel et o
de cangr ej o
Mant ener en
cont act o
dur ant e 40
X mL HCl
1. 5N
CO2
Agua
desmi n.
Filtracin Lavado
Recuper ar
el
pr eci pi t ado

34
5.3.2 Medi ci n del gr ado de deacet i l aci n del qui t osano

Este ensayo exploratorio nos permitir establecer el rango bajo el cual
ocurren los dos puntos de inflexin buscados durante la titulacin de la
muestra de quitosano con el lcali.
Pr ot ocol o N1

1.- Preparar en un vaso de precipitados 100mL de solucin de quitosano
comercial al 1% con HCl 0.3N. Agregar 50mL de esta solucin en una
fiola.

2.- Preparar la solucin de NaOH 0.08N y colocarla en una bureta de
50mL.

3.- Desde la bureta aadimos el lcali hasta que se perciba la
di sol uci n del quitosano, inicialmente insoluble. Esta lectura
corresponde a la variable x de la frmula 1.1. Durante la adicin del
lcali se procede a medir el pH de la solucin.

4.- Continuamos con la titulacin hasta que la disolucin gel at i ni ce.
Esta lectura corresponde a la variable y de la frmula 1.1

5.- Aplicar la frmula 1.1 para obtener el grado de deacetilacin.

(1.1) Grado de deacetilacin = 16.1 (y - x) (N / m)

x = primer punto de inflexin: Solubilizacin del quitosano.
y = segundo punto de inflexin: Gelatinizacin del quitosano.
N = normalidad de la solucin de NaOH
m = peso de la muestra de quitosano

35
Tabla N 5.3.2
Efecto de la adicin de NaOH sobre el pH de una solucin de quitosano*
comercial
mL NaOH pH solucin
0 0,5
10 1,0
30 2,5
40 5,0
50 6,0
60 6,5

*Muestra: 500mg quitosano comercial
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 30 40 50 60
mL NaOH 0,08N aadi dos
p
H

s
o
l
u
c
i
n

Grado de deacetilacin = 16.1 (60-30)(0.08/0.5)
= 77.28%

36
Pr ot ocol o N2

1.- Agregar en una fiola 25mL de solucin al 1% de quitosano disuelto
en HCl 0.3N.

2.- Preparar la solucin de NaOH 0.08N y colocarla en una bureta de
50mL.

3.- Desde la bureta aadimos el lcali hasta que se perciba la disolucin
del quitosano, inicialmente insoluble. Esta lectura corresponde a la
variable x de la frmula 1.1. Durante la adicin del lcali se procede a
medir el pH de la solucin.

4.- Continuamos con la titulacin hasta que la disolucin gelatinice. Esta
lectura corresponde a la variable y de la frmula 1.1

5.- Aplicar la frmula 1.1.

37
Tabla N 5.3.3
Efecto de la adicin de NaOH sobre el pH de una solucin de
quitosano* producido en nuestro proceso
mL NaOH pH
solucin

5,0 2,0
7,5 2,5
15,0 3,5
19,0 6,0
20,0 6,5
21,0 7,0

*Muestra: 250mg quitosano producido en nuestro proceso
0
1
2
3
4
5
6
7
8
5 7, 5 15 19 20 21
p
H

s
o
l
u
c
i
n

Grado de deacetilacin = 16.1 (y - x) (N / m)
= 16.1 (20-7.5)(0.08/0.250)
= 64.4%

38
5.3.3 Ext r acci n de l a papana a par t i r del l t ex de papaya

De acuerdo a lo recomendado en la parte terica se detallar la
estrategia para la purificacin de la papana.

Debemos previamente definir que:

El nivel de pureza deseado estar dentro del rango entre 70-90%,
como ya se lo mencion en la teora.
Aunque el aire no se lo considera un contaminante sino mas bien
una condicin ambiental a evitar, entonces no existen
contaminantes peligrosos que mermen la calidad de la papana.
Las impurezas que sern objeto de eliminacin primaria sern los
polisacridos presentes en el ltex de Carica papaya.
La quimopapana, el enzima que tambin se encuentra en el ltex,
puede tolerarse como compuesto no contaminante y como
impureza pues este es un compaero cooperativo de la papana.
La escala de purificacin ser a nivel de laboratorio y las
cantidades que se utilicen sern en microlitros (L) y en
miligramos (mg).
Dada la naturaleza proteica del ltex, se almacenar a una
temperatura de 4C en envases de plstico.

La siguiente tabla, como ya se mencion anteriormente, ayudar a
establecer los pasos requeridos para purificar la papana.

39
Tabla N 5.3.4
Efecto de las propiedades de la papana en relacin a la estrategia
de purificacin
Propiedades
de la papana
Efectos en la estrategia de
purificacin
Temperatura de estabilidad = 65C
Temperatura ptima de trabajo =
temperatura ambiente
Estabilidad del pH = 5-7
Buffer de extraccin = Naturaleza
cida
Fuerza inica = alta
Utilizacin de un solvente para la
precipitacin
Sensibilidad a iones metlicos = S Utilizacin de un agente quelante

Est r at egi a de pur i f i caci n

Extraccin.- De acuerdo a la tabla N 5.3.4, establecemos que la
extraccin de papana se realizar con un buffer cido -el ms
recomendado es el cido ctrico / fosfato cido de sodio- a una
temperatura de trabajo ambiente y adems, se evitar prolongados
contactos con el ambiente durante este paso. Se utilizar como agente
quelante al EDTA (ethylen-diamin-tetra-acid) en el buffer, pues es as
mismo el ms recomendado por otros autores.

Purificacin intermedia.- En este paso se lograr la precipitacin del
enzima mediante la adicin de etanol. Sin embargo, esta precipitacin
incluye las dos proteasas presentes en el ltex: papana y
quimopapana.

40
Purificacin final (Refinado).- Dado que el nivel de pureza requerido
para nuestros propsitos es por debajo del 90%, prescindiremos de esta
fase.

De lo ya planteado, se expondrn a continuacin los ensayos realizados
acerca de la extraccin de la papana:

En el siguiente protocolo se experimentarn diferentes cantidades
de buffer cido ctrico-fosfato cido de sodio-EDTA a una concentracin
0.1N y pH 6.5 para la extraccin de la papana a partir del ltex de
papaya, con el fin de hallar la cantidad ptima requerida para tal
objetivo. Luego purificaremos estos extractos en base a una cantidad
constante de etanol 98 y se realizarn algunos ensayos con diferentes
cantidades del solvente. Los resultados de los distintos pesos obtenidos
determinarn la mejor de las extracciones y tambin el rango bajo el
cual tenemos que experimentar la cantidad ptima de etanol requerido
para la purificacin.

Pr ot ocol o N1
1.- Disponer de 12 muestras de 500mg de ltex cada una.

2.- Agregar x L de buffer cido ctrico / fosfato cido de sodio / EDTA
0.1N, pH 6.5 a cada muestra. Agitar durante 5min.

3.- Centrifugar a 3000g durante 5min.

4.- Filtrar la muestra y separar el sobrenadante.

5.- Aadir al sobrenadante 5000L de etanol 98 y agitar.

6.- Centrifugar a 3000g durante 5min.

7.- Desechar el sobrenadante y secar el precipitado.

41
8.- Pesar el precipitado y resuspenderlo en 1000 L de buffer de
extraccin.

Tabla N 5.3.4
Efecto de la adicin de Buffer con respecto a la obtencin de papana* a
partir del ltex** de papaya
Prueba
#
Buffer
aadido(L)
Papana
obtenida (mg)
1 1000 9
2 1500 11
3 2000 15
4 2500 18
5 3000 25
6 3500 30
7 4000 26
8 4500 27
9 5000 8
10 5500 9
11 6000 7
12 6500 6

**Muestra: 500mg de ltex de papaya
*Solvente aadido para precipitarla: 5000 L de etanol

42
Pr ot ocol o N 2

0.1N pH 6.5 a cada muestra. Agitar durante 10min.

3.- Centrifugar a 4000g (6000rpm) durante 5min.

4.- Separar el sobrenadante y eliminar el precipitado.


6.- Centrifugar a 4000g (6000rpm) durante 5min.


extraccin 0.1N.
Tabla N 5.3.5
Prueba
#
Buffer
aadido (L)
Papana
obtenida (mg)
1 1000 12
2 1500 15
3 2000 18
4 2500 23
5 3000 32
6 3500 33
7 4000 28

43
Prueba
#
Buffer
(L) aadidos
Papana
(mg) obtenidos
8 4500 28
9 5000 9
10 5500 9
11 6000 8
12 6500 7


Pr ot ocol o N3


0.1N pH 6.5 a cada muestra. Agitar durante 10min.

3.- Centrifugar a 4000g a una temperatura de 10C durante 5min.



6.- Centrifugar a 4000g (6000rpm) a una temperatura de 10C durante
5min.

Tiempo de secado = 18 horas a 35.5C

44
extraccin 0.1N.

Tabla N 5.3.6
Prueba
#
Buffer
aadido (L)
Papaina
obtenida (mg)
1 2500 25
2 3500 34
3 4500 30


45

Protocolo del estudio de la extraccin de papana a partir del ltex de papaya
X1 = 2000L Buf f er
X2 = 2500L
X3 = 3000L
X4 = 3500L
X5 = 4000L
X L Buf f er / muest r a
( ci do c t r i co
f osf at o ci do de sodi o
EDTA)
0. 1N pH=6. 5
Agi t ar
dur ant e 10mi n 500mg Lt ex de
papaya/ muest r a
( Tot al : 5muest r as)

Recuper ar el
Sobr enadant e
Cent r i f ugar
4000g ( 6000r pm)
10C
dur ant e 5mi n
Desechar el
pr eci pi t ado
Agi t ar
dur ant e
5mi n
Et anol 98
6500L
Cent r i f ugar
4000g ( 6000r pm)
10C
dur ant e 5mi n
Secar
Resuspender en
Buf f er
Recuper ar el
pr eci pi t ado
Desechar el
sobr enadant e

46
5.3.4 Pur i f i caci n de l a papana a par t i r del l t ex de papaya

De acuerdo al estudio anterior, se determin un rango apropiado de la
cantidad de etanol necesaria para la purificacin. En tales
circunstancias, realizaremos los ensayos para la bsqueda de la
cantidad ptima del solvente, en base a la ptima cantidad de buffer
necesaria para la extraccin.

Pr ot ocol o N1


2.- Agregar 3500 L de buffer cido ctrico - fosfato cido de sodio -
EDTA 0.1N pH 6.5 a cada muestra. Agitar durante 10min.

5min.


5.- Aadir al sobrenadante y L de etanol 98 y agitar.

5min.

Tiempo de secado = 18 horas a 35.5C

extraccin 0.1N.

47
Tabla N 5.3.7
Efecto de la adicin de diferentes cantidades de etanol sobre la cantidad
de papana obtenida
Prueba
#
Etanol 98
aadido (L)
Papana
obtenida (mg)
1 2000 4
2 2500 7
3 3000 10
4 3500 14
5 4500 19
6 5000 28
7 5500 30
8 6000 32

Muestra: Extracto de papana disuelto en buffer

48

Pr ot ocol o del est udi o de l a pur i f i caci n de papana a par t i r del l t ex
de papaya
3500L Buf f er / muest r a
( ci do c t r i co-
f osf at o ci do de sodi o-
EDTA) 0. 1N pH=6. 5
Agi t ar
dur ant e 10mi n 500mg Lt ex de
papaya/ muest r a
( Tot al : 5muest r as)

Recuper ar el
Sobr enadant e
Cent r i f ugar
4000g ( 6000r pm)
10C
dur ant e 5mi n
Desechar el
pr eci pi t ado
Agi t ar
dur ant e
5mi n
Et anol 98
yL/ muest r a
y1= 2000L
y2= 2500L
y3= 3000L
y4= 3500L
y5= 4000L
Cent r i f ugar
4000g ( 6000r pm)
10C
dur ant e 5mi n
Secar
Resuspender en
Buf f er
Recuper ar el
pr eci pi t ado
Desechar el
sobr enadant e

49
5.3.5 Medi ci n del gr ado de di gest i n de l a papana pur i f i cada
por espect r of ot omet r a

El siguiente ensayo es de tipo exploratorio, pues necesitamos conocer
cuales son los rangos bajo los cuales el enzima puede actuar sobre una
concentracin dada de sustrato. Los posteriores ensayos son la
consecuencia de esta exploracin.

Pr ot ocol o N1

1.-Preparacin de las soluciones de enzima:
-Tomar x L de la solucin de enzima (tubo madre) y completar en otro
tubo de ensayo un volumen de 300 L (T#1). Tomar del T#1 un volumen
de 150 L y completar con buffer hasta 300 L (T#2). As mismo, agregar
del T#2 150 L y completar 300 L (T#3). Por ltimo, tomar 180 L del
T#3 y completar hasta 300 L con buffer.

Rotulaciones de los tubos de ensayo con solucin de papana:
Concentraciones de papana:
T#0 = 5.0 mg/mL T#1 = 2.0 mg/mL
T#2 = 1.0 mg/mL T#3 = 0.5 mg/mL
T#4 = 0.3 mg/mL

2.- Preparar la solucin de sustrato:
-Aadir 0.1gr de leche descremada en 10mL de agua; calentar hasta
40C.
-Disponer 800L en 6 tubos de ensayo. Uno de los tubos corresponde
a una muestra testigo, sin adicin de papana.

3.-Aadir 150L de solucin enzimtica a los tubos de reaccin donde
se encuentran la solucin de leche.

50
4.-Someter a incubacin durante 20min. a 35.5C.

5.-Luego de la incubacin, tomamos 60L del sobrenadante formado y lo
diluimos en 2000L de agua desmineralizada.

6.-Tomar 60L de cada una de las diluciones y depositar en las cubetas
para la lectura en el espectrofotmetro; las mismas debern ser
rotuladas de acuerdo a los tubos de reaccin.

7.-Llevar las cubetas al espectrofotmetro: ajustar la funcin para la
lectura de absorbancia de protenas. Colocar una cubeta con agua
destilada y ajustar la funcin blank (el espectrofotmetro ajusta a
absorbancia cero). Luego depositamos las dems cubetas y ajustamos
la funcin sample. Reportar los resultados obtenidos en la siguiente
tabla.
Tabla N 5.3.8
Efecto de la adicin de diferentes concentraciones de soluciones de
papana purificada con respecto a la absorbancia de la leche* digerida
Prueba
#
Soluc. Papana
aadida
[mg/mL]
Absorbancia
A
leche
(nm)
Blanco 0 1.789
1 5.0 0.189
2 2.0 0.252
3 1.0 0.883
4 0.5 -
5 0.3 -

*Adicin: 150L solucin papana / 800L solucin de leche al 1%
Pr ot ocol o N2
1.- A partir de una solucin madre preparamos n muestras de papana;
las cuales sern diluidas en buffer de extraccin.

51
2.- Preparar la solucin de sustrato y calentarla hasta 40C.
-Disponer 800L en n tubos de ensayo. Uno de los tubos corresponde
a una muestra testigo (sin adicin de papana).

3.-Aadir 200L de solucin enzimtica a los tubos de reaccin donde
se encuentran la solucin de leche.

4.-Someter a incubacin durante 20min. a 35.5C.

5.-Luego de la incubacin, tomamos 60L del sobrenadante formado y lo
diluimos en 2000L de agua.

6.-Tomar 60L de cada una de las diluciones y depositar en las cubetas
para lectura en el espectrofotmetro; las mismas debern ser rotuladas
de acuerdo a los tubos de reaccin.

7.-Llevar las cubetas al espectrofotmetro: ajustar la funcin para la
lectura de absorbancia de protenas. Colocar una cubeta con agua
destilada y ajustar la funcin blank (el espectrofotmetro ajusta a
absorbancia cero). Luego depositamos las dems cubetas y ajustamos
la funcin sample. Reportar los resultados obtenidos en la respectiva
tabla.

F4.- Coagulacin de la leche por accin de la papana

52
Tabla N 5.3.9
Prueba
#
Papana
[mg/mL]
Absorbancia
A
leche
(nm)
1 0,0 1,789
2 1,0 0,883
3 1,5 0,723
4 2,0 0,598
5 2,5 0,494
6 3,0 0,373
7 3,5 0,228
8 4,0 0,265
9 4,5 0,223
10 5,0 0,189

*adicin: 200L soluc. Papana / 800L soluc. Leche 1%
0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
1, 6
1, 8
2
0 1 1, 5 2 2, 5 3 3, 5 4 4, 5 5
mg/mL papana aadi da
A

l
e
c
h
e

(
n
m
)

53
Det er mi naci n de l a absor banci a de di st i nt as concent r aci ones de
papana

Este ensayo nos servir posteriormente para evaluar, mediante
espectrofotometra, la presencia del enzima en los lavados que se
realice al soporte de quitosano preacondicionado con la papana
inmovilizada.

Pr ot ocol o ni co
1.- Preparar soluciones de papana en buffer de extraccin 0.1N.
2.- Llenar las cubetas de lectura con las soluciones de papana y leer
en el espectrofotmetro.

54
Tabla N 5.2.10
Lectura de la absorbancia de distintas concentraciones de papana
Papana
(mg/mL)
Absorbancia
A
P apa na
(nm)
Papana
(mg/mL)
Absorbancia
A
P apa na
(nm)
0,0 0,000 0,6 0,864
0,1 0,274 0,7 0,982
0,2 0,378 0,8 1,100
0,3 0,510 0,9 1,218
0,4 0,628 1,0 1,336
0,5 0,746 1,1 1,418

0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
1, 6
0, 20 0, 30 0, 40 0, 50 0, 60 0, 70 0, 80 0, 90 1, 00
mg/mL papana
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

(
n
m
)

55
5.3.6 Pr eacondi ci onami ent o del qui t osano como sopor t e de
i nmovi l i zaci n

En estas pruebas se evaluar el grado de rigidez del quitosano
modificado. Esta evaluacin del grado de rigidez ser por medio de un
anlisis sensorial.
Pr ot ocol o ni co
1.- Disponer de n muestras de 150mg de quitosano.
2.- Agregar a cada muestra x mL de cido actico 2% y agitar
vigorosamente.
3.- Agregar a cada muestra y mL de hidrxido de sodio 5% y agitar.
4.- Congelar las muestras a 4C durante 24horas.
5.- Desechar el remanente de lcali y lavar con suficiente agua
desmineralizada hasta alcanzar un pH neutro.
6.- Secar las muestras: Tiempo de secado: 3.5 horas @ 35.5C

Tabla N 5.3.11(a)*
Efecto de la adicin de cido actico** sobre el grado de rigidez de
diferentes muestras de quitosano
Prueba
#
c.Actic
(mL)
NaOH 5%
(mL)
Grado***
de rigidez
Observaciones
1 2.0
2.0
4
capacidad de formar
hojuelas
2 3.0 4
capacidad de formar
hojuelas
3 4.0 2
capacidad de formar
pelculas
4 5.0 1
capacidad de formar
geles
*Pruebas con una cantidad fija de NaOH
**Muestra: 150mg quitosano comercial
*** Determinacin por anlisis sensorial

56
Calificacin
Muy alta = 5 Alta = 4 Mediana = 3 Baja = 2 Muy baja = 1

Tabla N 5.3.11 (b)*
Efecto de la adicin de cido actico sobre el grado de rigidez de
diferentes muestras de quitosano**
Prueba
#
c.Actic
(mL)
NaOH 5%
(mL)
Grado***
de rigidez
Observaciones
5 2.0
4.0
5
capacidad de
formar hojuelas
6 3.0 4
capacidad de
formar hojuelas
7 4.0 3
capacidad de
formar pelculas
8 5.0 3
capacidad de
formar geles
*Pruebas con otra cantidad fija de NaOH
**Muestra: 150mg quitosano comercial
*** Determinacin por anlisis sensorial
Calificacin
Muy alta = 5 Alta = 4 Mediana = 3 Baja = 2 Muy baja = 1

5.3.7 Inmovi l i zaci n de papana en qui t osano

El protocolo que se presenta a continuacin es el resultado de algunas
pruebas realizadas previamente. De las cuales se pudo determinar la
cantidad de solucin de papana que puede absorber una cantidad dada
de quitosano preacondicionado y adems, se pudo determinar
cualitativamente cul de las muestras de quitosano preacondicionadas
(hojuelas o geles de quitosano) es la apropiada para inmovilizar la
papana. En referencia al tiempo de inmovilizacin se tomar como
referencia las 24horas que recomienda la bibliografa. Y los estudios en
base a esta variable se harn en funcin de establecer un tiempo

57
mnimo de operacin. Cabe mencionar que la temperatura de
inmovilizacin no ser sujeta a estudio alguno pues todas las
referencias coinciden en que la operacin de inmovilizacin debe
llevarse a cabo a temperaturas entre 10 y 4C.

Las mencionadas pruebas exploratorias determinaron que 300mg
de quitosano preacondicionado pueden absorber 1000L de solucin de
papana y que las hojuelas de quitosano, de acuerdo a su alta rigidez,
son ms apropiadas para el trabajo de inmovilizacin porque al cabo de
algunas reutilizaciones se mantiene su consistencia; los geles de
quitosano s pierden su forma, en detrimento de posibles reutilizaciones.

Ya establecidas estas condiciones de trabajo, se realizaron
ensayos con respecto a la reutilizacin de la papana inmovilizada. En
algunas pruebas cualitativas, se estableci que una muestra de papana
inmovilizada s puede reutilizarse; por lo tanto, el estudio se referir a la
determinacin del nmero posible de reutilizaciones de la papana
inmovilizada, de acuerdo a los mtodos de anlisis de la calidad ya
escogidos.

A continuacin se presenta el procedimiento para la inmovilizacin de
diferentes concentraciones de papana en el soporte de quitosano
preacondicionado.
Pr ot ocol o N1

1.- Preparar n muestras de 1000L cada una de papana a diferentes
concentraciones -diluidas en buffer de extraccin- y disponer de n
muestras de quitosano preacondicionado de 300mg cada una.

3.- Agregar las soluciones de papana a las muestras de quitosano y
mantener bajo agitacin continua durante 24 horas a 8C
aproximadamente.

58
4.- Lavar el soporte con buffer de extraccin hasta que los lavados no
presenten actividad proteoltica. Ayudarnos de la tabla Tabla N 5.2.10.

5.- Secar las muestras.

6.- Realizar las pruebas de calidad del producto. Ver ms adelante.

Tabla N 5.3.12
Adicin de diferentes cantidades de papana sobre una cantidad fija de
quitosano preacondicionado
Prueba
#
Papana aadida
(mg)
Quitosano
preacondicionado
(mg)
1 5.0
300

2 15.0
3 20.0
4 25.0
5 30.0
6 35.0
7 40.0
8 45.0

Pr ot ocol o N2
1.- Preparar n muestras de 1000L de papana con una concentracin
de 50 mg/mL -diluidas en buffer de extraccin- y disponer de n
muestras de 300mg de quitosano preacondicionado.

3.- Agregar las soluciones de papana a las muestras de quitosano y
mantener bajo agitacin continua durante n horas a 8C
aproximadamente.

59
presenten actividad proteoltica se puede leer la absorbancia del
lavado y as establecer la concentracin de papana desorbida-.

5.- Secar las muestras y almacenarlas a temperatura ambiente en
envases de vidrio.

6.- Realizar las pruebas de calidad del producto.

Tabla N 5.3.13
Diferentes tiempos de contacto de inmovilizacin de una concentracin
de papana en quitosano
Prueba
#
Tiempo de contacto
(hrs)
1 2
2 5
3 8
4 11
5 14
6 17
7 20
9 24

Pr ot ocol o N3
1.- Preparar una muestra de papana de 1000L con una concentracin
de 50 mg/mL y disponer de una muestra de quitosano preacondicionado
de 300mg.

3.- Agregar la solucin de papana a la muestra de quitosano y
mantener bajo agitacin continua durante 24 horas a 8C
aproximadamente.

60
presenten actividad proteoltica.

6.- Realizar n pruebas de calidad con la misma muestra de papana
inmovilizada.

5.3.8 Medi ci n del gr ado de di gest i n de l a papana i nmovi l i zada
por espect r of ot omet r a

El siguiente protocolo se aplic a todas las pruebas preliminares de
los estudios de inmovilizacin de papana. Adems, este protocolo
es el resultado de algunas pruebas exploratorias acerca de la
concentracin ms apropiada de sustrato y de su dilucin para la
lectura en el espectrofotmetro.
Pr ot ocol o N1
1.- Disponer de n muestras de papana inmovilizada -procedentes del
estudio de la concentracin de papana en quitosano- y colocarlas
en un sistema papel filtro y vaso erlenmeyer; dispuestas de tal
manera que podamos agregar la solucin de sustrato a travs del
lecho y recoger la solucin digerida en el vaso.

2.- Preparar y mL de solucin de gelatina al 2% y calentarla a 45C.

3.- Aadir lentamente 6000L de sustrato -a razn de 1mL/min- en cada
muestra de lecho de papana inmovilizada y con la ayuda de un
agitador, agitar lentamente. Luego con una pipeta volumtrica
recircular el sustrato; repetir esta accin durante 20min.

4.- Al cabo de los 20min. recoger 60L de la solucin digerida y diluir
en 800L de agua desmineralizada. Luego depositamos en las
cubetas y leemos en el espectrofotmetro.

61
Tabla N 5.3.15
Efecto en la absorbancia del sustrato gelatina* debido a su digestin
con diferentes cantidades de papana inmovilizada

Prueba
#
(mg) papana
inmovilizada**
Absorbancia
A
gelatina
(nm)
1 0 1,302
2 5 1,210
3 15 0,920
4 20 0,886
5 25 0,820
6 30 0,766
7 35 0,725
8 40 0,635
9 45 0,285
*Adicin: 6000L gelatina 2%
**Soporte: 300mg quitosano preacondicionado
0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
0 5 15 20 25 30 35 40 45
mg papana i nmovi l i zada
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

g
e
l
a
t
i
n
a

(
n
m
)

62
Pr ot ocol o N2

1.- Disponer de n muestras de papana inmovilizada procedentes del
estudio del tiempo de inmovilizacin de papana en quitosano- y
colocarlas en un sistema papel filtro y vaso erlenmeyer; dispuestas
de tal manera que podamos agregar la solucin de sustrato a travs
del lecho y recoger la solucin digerida en el vaso.

2.- Preparar y mL de solucin de gelatina al 2% y calentarla a 45C.

3.- Aadir lentamente 6000L de sustrato -a razn de 1mL/min- en cada
muestra de lecho de papana inmovilizada y con la ayuda de un
agitador, agitar lentamente. Luego con una pipeta volumtrica
recircular el sustrato; repetir esta accin durante 20min.

4.- Al cabo de los 20min, recoger 60L de la solucin digerida y diluir
en 800L de agua desmi neral i zada. Luego deposi tamos en l as
cubetas para lectura en el espectrofotmetro y leemos en el equipo.

5.- Reportar las lecturas de absorbancia.

63

F5 (a).- Mtodo de digestin de la gelatina: (1) Se aade la solucin de gelatina al
soporte de quitosano con papana inmovilizada

F5 (b).- Mtodo de digestin de la gelatina: (2) Recoger el sustrato digerido listo
para la lectura en el espectrofotmetro

64
Tabla N 5.3.16
Efecto del tiempo de contacto en la inmovilizacin de la papana en el
quitosano respecto a la absorbancia del sustrato* digerido por el enzima
Prueba
#
Tiempo de contacto
(hrs)
Absorbancia
A
gelatina
(nm)
1 0 1,302
2 5 1,115
3 8 1,110
4 11 0,989
5 14 0,750
6 17 0,485
7 20 0,348
8 24 0,280

0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
0 5 8 11 14 17 20 24
Ti empo de contacto (Hrs.)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

g
e
l
a
t
i
n
a

(
n
m
)

Concentracin del soporte: [50mg papana / 300mg quitosano]
*Adicin: 6000L gelatina 2%

65
Pr ot ocol o N3

1.- Disponer de una muestra de papana inmovilizada -procedente del
estudio del nmero de reutilizaciones de papana inmovilizada en
quitosano- y colocarla en un sistema papel filtro y vaso erlenmeyer;
dispuesta de tal manera que podamos agregar la solucin de
sustrato a travs del lecho y recoger la solucin digerida en el vaso.

2.- Preparar y mL de solucin de gelatina al 2%.

3.- Aadir lentamente 6000L de sustrato en la muestra de lecho de
papana inmovilizada y con la ayuda de un agitador, agitar
lentamente. Luego con una pipeta volumtrica recircular el sustrato;
repetir esta accin durante 20min.

4.- Al cabo de los 20min, recoger 60L de la solucin digerida y diluir
en 800L de agua desmineralizada. Luego depositamos en las
cubetas para lectura en el espectrofotmetro y leemos en el equipo.

5.- Lavar el soporte con z mL de buffer de extraccin y repetir n veces
los pasos 3 y 4.

6.- Reportar las lecturas de absorbancia.

66
Tabla N 5.3.17
Efecto del nmero de reutilizaciones de la papana
inmovilizada sobre la absorbancia del sustrato gelatina digerido
por el enzima

Prueba
#

N
reutilizaciones
Absorbancia
A
gelatina
(nm)
1 *0 1,302
2 **1 0,289
3 ***2 0,700
4 3 0,977
5 4 1,029

*Muestra testigo sin digerir **Primera utilizacin del soporte
***Primera reutilizacin (segunda utilizacin del soporte)
0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
0 1 2 3 4
N Reuti li zaciones
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

g
e
l
a
t
i
n
a

(
n
m
)

Concentracin del soporte: [50mg papana / 300mg quitosano]
Tiempo de digestin por cada reutilizacin: 20min.

67
5.4 Pr uebas oper aci onal es

Con respecto a la extraccin y purificacin de la papana necesitamos
trabajar con una centrfuga; se realizaron algunas pruebas para
establecer las revoluciones por minuto necesarias para obtener los
precipitados y se determin que a 6000rpm (4000g) se obtuvo en 5min y
10C un precipitado con buena consistencia y un sobrenadante fcil se
separar; de esta forma no fue necesaria una filtracin.

Por otra parte, dado que el espectrofotmetro utilizado (Eppendorf
Biophotometer, disposable cuvette for UV-light measurements) admite slo
cierto rango de concentraciones para su lectura, entonces se ensayaron
pruebas para establecer las ptimas concentraciones de sustrato a leer
en el equipo. En tales circunstancias, se estableci que el sustrato leche
necesita trabajarse al 1.0% para que sea legible su absorbancia y la
gelatina, as mismo, en un 2.0%.

68
Capt ul o 6.- Et apa de ej ecuci n: Pr uebas f i nal es

6.1 Obt enci n del qui t osano a par t i r del exoesquel et o de
cangr ej o

Se detallar a continuacin cuales fueron las condiciones finales del
trabajo experimental. No obstante, cabe recalcar que un estudio ms
profundo acerca de la obtencin del quitosano podr buscarse en el
trabajo de O.J ara y J .Guamn
30
.

Pr epar aci n de l a mat er i a pr i ma.- Las muestras de exoesqueleto de
cangrejo fueron lavadas para eliminar los residuos de carne. Luego se
procedi a su secado a 40C durante aproximadamente 2horas. En un
molino de martillos se realiz una premolienda y la molienda final de
refinado se la realiz en un molino domstico. El tamizado nos indic
que el tamao de partcula fue entre (100-400)m.

Desmi ner al i zaci n.- Para eliminar el carbonato de calcio presente en el
exoesqueleto se aadi 30mL de HCl 1.5N a una muestra de 300mg.
Durante 45 min. se permiti que actuase el cido y la liberacin de
dixido de carbono nos indic la eliminacin del carbonato.
Posteriormente se lav la muestra con agua desmineralizada hasta
lograr la neutralizacin del pH.

Despr ot ei ni zaci n.- Para la eliminacin de la fraccin proteica se
aadi 30mL de NaOH 5% y se someti a calentamiento a 100C
durante 0.5horas. Despus se desech el sobrenadante y se realiz un
lavado. No fue necesaria la neutralizacin del pH.

Deacet i l aci n.- Se aadi 50mL de NaOH 50% y se someti a
calentamiento a 100C durante 2horas. Posteriormente se lav el
precipitado hasta lograr la neutralizacin del pH. Luego se filtr y sec a

69
35C durante aproximadamente 3horas. El peso del producto obtenido
fue de 450mg.

F6.- Proceso de deacetilacin

6.2 Det er mi naci n del gr ado de deacet i l aci n del qui t osano

El procedimiento experimental para la medicin del grado de
deacetilacin de una muestra de quitosano queda establecido como
sigue:
Preparar una solucin de quitosano al 1% en HCl 0.3N y titular con
NaOH 0.08N hasta que se perciba la disolucin del quitosano,
inicialmente insoluble. Esta lectura corresponde a la variable x de la
frmula 1.1. Durante la adicin del lcali, en paralelo, se mide el pH de
la solucin. Luego, continuamos con la titulacin hasta que la disolucin
gelatinice. Esta lectura corresponde a la variable y de la frmula 1.1.
Finalmente construimos la grfica del pH de la solucin en funcin de la
cantidad de lcali aadido.
Los resultados que se presentan a continuacin se refieren a dos
muestras de quitosano ensayadas: La una de naturaleza comercial y la
otra es la que se obtuvo en este trabajo.

70
Tabla N 6.2.1
quitosano comercial*
mL NaOH pH
solucin

15 1,0
20 1,5
25 2,0
30 2,5
35 4,0
40 5,0
45 5,5
50 5,5
55 6,0
60 6,5
65 7,0

*Muestra: 500mg quitosano comercial
0
1
2
3
4
5
6
7
8
15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
p
H

s
o
l
u
c
i
n

71
Tabla N 6.2.2
quitosano* producido
mL NaOH pH
solucin

5,0 2,0
7,5 2,5
15,0 3,5
19,0 6,0
20,0 6,5
21,0 7,0

*Muestra: 215mg quitosano producido
0
1
2
3
4
5
6
7
8
5 7, 5 15 19 20 21
p
H

s
o
l
u
c
i
n

72
6.3 Ext r acci n y pur i f i caci n de l a papana a par t i r del l t ex de
papaya

Los rangos bajo los cuales tenemos que experimentar la extraccin final
ya fueron revisados en la etapa preparatoria. Por lo tanto, en estas
pruebas concierne hallar la ptima cantidad de buffer para la extraccin
de la mayor cantidad de papana a partir de 500mg de ltex de papaya.
En la tabla 6.1 presentamos los resultados obtenidos en las pruebas
finales. El protocolo ya se detall en el captulo 5.

Adems, presentamos los resultados del estudio sobre la purificacin de
papana con etanol.

La eficiencia de la operacin y mayores detalles de anlisis se revisarn
en el captulo siguiente.

73
Tabla N 6.3.1
Prueba
#
Buffer
aadido (L)
Papana
obtenida (mg)
1 0 0
2 2300 28
3 2700 31
4 3000 33
5 3500 34
6 4500 21
7 5000 10

*Solvente aadido para su precipitacin: 6500L etanol 98
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2300 2700 3000 3500 4500 5000
L Buffer aadi do
P
a
p
a
n
a

o
b
t
e
n
i
d
a

(
m
g
)

74
Tabla N 6.3.2
Efecto de la adicin de diferentes cantidades de etanol sobre la cantidad
de papana obtenida
Prueba
#
Etanol98
aadido (L)
Papana
obtenida(mg)
1 0 0
3 5500 25
4 6000 33
5 6500 34
6 7000 35

Buffer aadido: 3500L
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 5500 6000 6500 7000
L Etanol 98 aadi dos
P
a
p
a
n
a

o
b
t
e
n
i
d
a

(
m
g
)

75

F7.- Extraccin de papana a partir del ltex de papaya
(Formacin de dos fases)

F7.- Precipitacin de papana con la adicin de etanol 98

F7.- Papana centrifugada

76
6.4 Det er mi naci n del gr ado de di gest i n de l a papana pur i f i cada

El protocolo queda definido a continuacin:

Preparar n muestras de papana a diferentes concentraciones diluidas
en buffer de extraccin. Luego preparar n muestras de sustrato leche al
1% y calentar hasta 40C. Aadir la solucin de papana a las muestras
de leche en relacin 1:4. Enseguida, someter a incubacin durante
20min a 35.5C. Posteriormente, tomamos 1 parte del sobrenadante que
se formare y la diluimos en 33 partes de agua desmineralizada.
Depositar las diluciones en las cubetas para lectura en el
espectrofotmetro. Finalmente, reportar las lecturas en la tabla
siguiente.

Tabla N 6.4

Prueba
#
Papana aadida
(mg/mL)
Absorbancia
A
leche
(nm)
Blanco 0,0 1,789
1 1,0 0,879
2 1,5 0,729
3 2,0 0,598
4 2,5 0,494
5 3,0 0,370
6 3,5 0,280
7 4,0 0,265
8 4,5 0,230

77
Prueba
#
Papana aadida
(mg/mL)
Absorbancia
A
leche
(nm)
9 5,0 0,189
10 5,5 0,178
11 6,0 0,175
12 6,5 0,152
13 7,0 0,149
14 7,5 0,135
15 8,0 0,079

*Adicin: 200L soluc. papana / 800L soluc. leche 1%
0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
1, 6
1, 8
2
0 1 1, 5 2 2, 5 3 3, 5 4 4, 5 5 5, 5 6 6, 5 7 7, 5 8
Sol uci n papana (mg/mL)
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

l
e
c
h
e

d
i
g
e
r
i
d
a

(
n
m
)

78
6.5 Ef ect o de l a cant i dad de papana i nmovi l i zada en el qui t osano
con r espect o a l a capaci dad de di gest i n

El protocolo queda definido a continuacin:

Preparar n muestras de papana de 1000L a diferentes
concentraciones y disponer de n muestras de 300mg de quitosano
preacondicionado.
Agregar las soluciones de papana a las muestras de quitosano y
mantener bajo agitacin constante durante 24 horas a 8C
aproximadamente. Luego, lavar el soporte con buffer de extraccin
hasta que los lavados no presenten actividad proteoltica y despus
secar las muestras.
Para las pruebas de calidad, disponer de las n muestras de papana
inmovilizada y colocarlas en un sistema papel filtro-vaso erlenmeyer;
dispuestas de tal manera que podamos agregar la solucin de sustrato a
travs del lecho y recoger la solucin digerida en el vaso. Por otra parte,
preparar y mL de solucin de gelatina al 2% y calentar a 45C.
Inmediatamente, aadir lentamente el sustrato -a razn de 1mL/min-
en cada muestra de soporte. Luego con una pipeta volumtrica
recircular el sustrato; repetir esta ltima accin durante 20min. Al
finalizar este tiempo, recoger las soluciones digeridas y diluirlas en agua
desmineralizada en una relacin 3:4. Depositarlas en las cubetas para la
lectura en el espectrofotmetro. Finalmente, reportar las lecturas en la
tabla 6.5.

79
Tabla N 6.5
Efecto de la cantidad de papana inmovilizada en el quitosano sobre la
absorbancia de la gelatina* digerida por el enzima
Prueba
#
[mg] papana
inmovilizada **
Absorbancia
A
gelatina
(nm)
1 0 1,302
2 5 1,215
3 10 0,942
4 20 0,886
5 30 0,765
6 40 0,633
7 50 0,289

*6000L gelatina 2%
**Soporte: 300mg quitosano preacond.
0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
0 5 10 20 30 40 50
mg papana i nmovi l i zada
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

g
e
l
a
t
i
n
a

(
n
m
)

80
6.6 Ef ect o del t i empo de cont act o en l a i nmovi l i zaci n de l a
papana en el qui t osano con r espect o a l a capaci dad de
di gest i n

Preparar n muestras de 1000Lde papana con las mismas
concentraciones (50mg/mL) y disponer de n muestras de 300mg de
quitosano preacondicionado.
Agregar las soluciones de papana a las muestras de quitosano y
mantener bajo agitacin constante durante x horas a 8C
aproximadamente. Luego, lavar el soporte con buffer de extraccin
hasta que los lavados no presenten actividad proteoltica y despus
secar las muestras.
Para las pruebas de calidad, disponer de las n muestras de papana
inmovilizada y colocarlas en un sistema papel filtro-vaso erlenmeyer;
dispuestas de tal manera que podamos agregar la solucin de sustrato a
en cada muestra de soporte. Luego con una pipeta volumtrica
recircular el sustrato; repetir esta ltima accin durante 20min. Al
finalizar este tiempo, recoger las soluciones digeridas y diluirlas en agua
desmineralizada en una relacin 3:4. Depositarlas en las cubetas para la
lectura en el espectrofotmetro. Finalmente, reportar las lecturas en
tabla 6.6.

81
Tabla N 6.6
quitosano respecto a la absorbancia del sustrato digerido por el enzima
Prueba
#
Tiempo de contacto
(hrs.)
Absorbancia
A
gelatina
(nm)
1 0 1,302
2 5 1,102
3 8 1,004
4 11 0,921
5 14 0,726
6 17 0,456
7 20 0,356
8 24 0,289

0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
0 5 8 11 14 17 20 24
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

g
e
l
a
t
i
n
a

(
n
m
)

Soporte: [50mg papana / 300mg quitosano preacond.]

82
6.7 Ef ect o del nmer o de r eut i l i zaci ones de l a papana
i nmovi l i zada con r espect o a l a capaci dad de di gest i n

Preparar una muestra de 1000Lpapana (50mg/mL) y aadirla a 300mg
de quitosano preacondicionado. Mantener este conjunto bajo agitacin
continua leve durante 24horas a 8C aproximadamente.
Al cabo de este tiempo, lavar el soporte con buffer de extraccin hasta
que los lavados no presenten actividad y luego secar las muestras.
Para la prueba de calidad, disponer del soporte con papana
inmovilizada y colocarlo en un sistema papel filtro-vaso erlenmeyer;
dispuesto de tal manera que podamos agregar la solucin de sustrato a
en el soporte. Luego con una pipeta volumtrica recircular el sustrato;
repetir esta ltima accin durante 20min. Al finalizar este tiempo,
recoger la solucin digerida y diluirla en agua desmineralizada en una
relacin 3:4. Depositarla en una cubeta para la lectura en el
espectrofotmetro y reportar la lectura en la respectiva tabla. Finalizada
esta prueba, lavar el soporte con buffer para eliminar los restos de
sustrato que hubiere y repetir con el mismo soporte la prueba de
digestin n veces.

F8.- Papana inmovilizada en las hojuelas de quitosano

83
Tabla N 6.7
inmovilizada sobre la absorbancia del sustrato gelatina digerido por el
enzima

Prueba
#

N
reutilizaciones
Absorbancia
A
gelatina
(nm)
1 *0 1,302
2 **1 0,289
3 ***2 0,700
4 3 0,977
5 4 1,029
6 5 1,038
7 6 1,032

Tiempo de contacto entre la gelatina y la papana inmovilizada por cada
reutilizacin: 20min.
0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
0 1 2 3 4 5 6
N Reuti l i zaci ones
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

g
e
l
a
t
i
n
a

(
n
m
)

84
Capt ul o 7.- Resul t ados y sus anl i si s

7.1 De l as pr uebas pr el i mi nar es

Obt enci n del qui t osano
Para liberar el mayor volumen de dixido de carbono -como
resultado de la desmineralizacin de una muestra de exoesqueleto
de cangrejo- se requiri aadir entre 10-16.6 volmenes de HCl
1.5N por cada gramo de muestra seca y triturada.
Se obtuvieron en promedio 0.149gr de quitosano por cada gramo
de exoesqueleto de cangrejo seco y triturado.
El rendimiento de este proceso es aproximadamente 14.9%.

El mtodo propuesto por A.Garca
29
utiliza para la desmineralizacin
del exoesqueleto-cefalotrax de langosta un volumen de 10mL HCl
2N por cada gramo de muestra; adems, se menciona que este
proceso se realiz en dos horas. El rendimiento de obtencin fue 6%
en comparacin con el nuestro que fue 14,93%.
En nuestro trabajo se ensayaron algunos volmenes de cido pero a
una concentracin 1.5N y un tiempo de 40 minutos; esta adaptacin,
de acuerdo a los resultados, fue suficiente para la eliminacin de
altas cantidades de dixido de carbono. En las pruebas finales se
buscar cul es el volumen mnimo necesario para lograr un alto
nivel de desmineralizacin.
Para realizar algn cambio en el proceso que se describe en las
pruebas preliminares, deber conocerse los resultados del anlisis de
calidad del producto.

Gr ado de deacet i l aci n del qui t osano
Para lograr la disolucin de 500mg de quitosano comercial se
requirieron 30mL de NaOH 0.08N y para su gelatinizacin 60mL
del lcali; para 250mg de quitosano producido en nuestro proceso,
7.5mL y 20.0mL de NaOH respectivamente. Estas son las lecturas

85
que necesitamos para calcular el grado de deacetilacin por medio
de la frmula 1.1.
El grado de deacetilacin para el quitosano comercial es 77.28% y
64.4% para el quitosano producido en nuestro proceso.

De acuerdo a los resultados obtenidos en estas pruebas se deduce que
la quitina presente en la muestra de exoesqueleto de cangrejo no ha
sido deacetilada en el grado que recomienda la bibliografa. Por lo tanto,
en las pruebas finales debe mejorarse la deacetilacin de dicha
muestra; existen dos formas de llevar a cabo lo mencionado:
Incrementar el tiempo de calentamiento en el proceso de deacetilacin o
aadir un volumen ms concentrado de lcali al proceso para remover
los grupos acetilo de las molculas de quitina.

Ext r acci n de l a papana
En el protocolo N 1 del captulo 5 se aadi entre 6-9 volmenes
de buffer por cada mg de ltex para solubilizar el extracto
enzimtico; a continuacin se aadi 10 volmenes de etanol, en
funcin de la cantidad referida de ltex, para precipitar el extracto.
La masa de estos precipitados nos permiti determinar la
eficiencia de la extraccin. Cabe destacar, para este protocolo,
que cuando la relacin de adicin etanol-buffer fue 1.4:1 se obtuvo
la mejor extraccin y cuando se aument el volumen de adicin de
buffer, se obtuvieron bajas cantidades de extracto enzimtico en
comparacin con la extraccin que se mencion.
En un segundo protocolo se aument la adicin de etanol a 12
volmenes y as mismo las mayores cantidades de enzima se
obtuvieron cuando se agreg buffer en los rangos ya
mencionados.
Finalmente al ensayar con una proporcin etanol-buffer 1.8:1 se
obtuvo la mejor de las extracciones.

86
Por lo anteriormente mencionado entonces se deduce que para
extraer el enzima del ltex se requiere de un volumen ptimo de
buffer. Por lo tanto, en las pruebas finales se investigar acerca de
este punto de inflexin en la curva que relaciona la adicin de buffer y
la cantidad de extracto enzimtico obtenido.

Las adiciones de diferentes volmenes de etanol tuvieron dos
incidencias en esta fase de extraccin:
* Evaluacin de la eficiencia de la extraccin mediante la precipitacin
del extracto enzimtico disuelto en el buffer. Despus del respectivo
secado, ser la comparacin de las masas del ltex y del extracto
enzimtico obtenido la que nos permita conocer cun eficiente fue la
extraccin.
*Estudio preliminar del rango de adiciones del solvente para la fase
de purificacin intermedia del extracto enzimtico.

Pur i f i caci n de l a papana
La mayor obtencin de extracto enzimtico se logr con una
adicin de etanol entre 1.5-1.7 volmenes por cada volumen de
extracto disuelto en buffer.
En proporciones de adicin etanol-buffer menores a 1.4:1 se
obtienen bajas cantidades de enzima.

Las cantidades de extracto enzimtico obtenidas estn directamente
relacionadas con la adicin de etanol en forma proporcional; esta
informacin ya la conocamos de antemano en la fase de extraccin;
sin embargo, confirmamos el comportamiento que se evidenci en las
pruebas de extraccin y ahora sabemos con mayor certeza que para
la mayor precipitacin del enzima se requiere una relacin de adicin
mayor a 1.4 volmenes de etanol por cada volumen de buffer
aadido; no obstante, ser necesario, para efectos de conocer ms

87
acerca del efecto de la adicin de etanol en la precipitacin de la
papana, realizar pruebas con otros volmenes de etanol.

Otro comportamiento importante es que cuando la relacin de adicin
etanol-buffer es mayor a 1.4:1 las cantidades de enzima obtenidas no
representan diferencias significativas. Por lo tanto, en las pruebas
finales ms bien se investigar el volumen mnimo necesario para
obtener la mayor cantidad de papana.

Gr ado de di gest i n de l a papana pur i f i cada

El rango de concentracin de la solucin de papana purificada
para digerir la mayor cantidad de las protenas de la leche
(solucin al 1%) se encuentra entre 2.5 y 5.0mg/mL; la relacin de
adicin de la solucin de papana en la leche es 1:4. En referencia
al alto grado de digestin ste se refiere al menor valor de
absorbancia (ledo en el espectrofotmetro) de las muestras de
leche digeridas por el enzima.

Las pruebas finales para este estudio debern encaminarse a
investigar aquella concentracin de papana que permita obtener altos
grados de digestin del enzima purificado.

Pr eacondi ci onami ent o del qui t osano como sopor t e de
i nmovi l i zaci n
Para obtener hojuelas de quitosano, las cuales favorecen la
adsorcin de la papana, se establece que necesitamos aadir
13.3 volmenes de cido actico para solubilizar el polmero y
26.6 volmenes de NaOH 5% por cada gramo de quitosano
comercial; estos volmenes son los necesarios para dar rigidez a
esta nueva forma que adquiere el quitosano.

88
El alto valor de rigidez que adquiere una hojuela de quitosano, como
resultado de esta prueba, est acorde a la adicin de los reactivos ya
mencionados. Esta rigidez es la requerida para los propsitos de
inmovilizacin.

Inmovi l i zaci n de papana en qui t osano y medi ci n de su gr ado de
di gest i n

Para el estudio de inmovilizacin de papana, se utilizaron
diferentes cantidades de enzima y stas se pusieron en contacto
con sendas muestras de quitosano preacondicionado. El resultado
de tales pruebas se lo evalu mediante el efecto que produjeron
estas cantidades sobre la absorbancia de las soluciones de
gelatina digeridas. Es as que la mejor digestin -aunque no es la
recomendada- se logr con 0.15mg de papana inmovilizada por
cada mg de soporte.

Es oportuno, entonces, en las pruebas finales, buscar la mnima
cantidad de enzima inmovilizada que pueda digerir un alto porcentaje
de protenas de la gelatina. De este estudio se podr conocer qu
concentracin se puede ensayar para el estudio del tiempo de
contacto en la inmovilizacin de papana.

Las pruebas con diferentes tiempos de contacto en la
inmovilizacin de 0.16mg papana por cada mg de quitosano
dieron como resultado una digestin aproximadamente del 70%
del sustrato. La muestra que tuvo un contacto de 24horas fue la
que produjo esta digestin.

Para este estudio se utiliz un soporte de 0.16mg de papana / mg
quitosano; esta decisin fue tomada en referencia al estudio anterior y
en respuesta a la tendencia que ste evidenci, pues un porcentaje

89
ms all del 70% se podr lograr con la concentracin ya
mencionada.

Este estudio preliminar coincide con la bibliografa segn la cual
24horas son necesarias para obtener altos grados de eficiencia. No
obstante, al cabo de 20 horas ya evidencia el enzima inmovilizado un
grado de digestin mayor al 70%. En referencia a este estudio, en las
pruebas finales se pretender la reproducibilidad de estos resultados.

Finalmente se ensay cuntas veces puede utilizarse el soporte
con papana inmovilizada (0.16mg papana/mg quitosano); la
menor de las absorbancias ledas indica que hasta cuatro veces
puede digerir el enzima inmovilizado a la gelatina. Un nmero
mayor de utilizaciones produce pequeos efectos de digestin.
Cada utilizacin tuvo un tiempo de digestin de 20min.

En las pruebas finales se ensayar acerca de la mnima digestin que
puede lograrse en funcin del nmero de reutilizaciones del enzima
inmovilizado.

90
7.2 De l as pr uebas f i nal es

Obt enci n del qui t osano y su gr ado de deacet i l aci n

Para liberar el mayor volumen de dixido de carbono -como
resultado de la desmineralizacin de cada gramo de exoesqueleto
de cangrejo- se requiere que 10 volmenes de HCl 1.5N se
mantengan en contacto con la muestra durante 40min.
De acuerdo al procedimiento experimental, se obtuvieron 0.149gr
de quitosano por cada gramo de exoesqueleto de cangrejo seco.
El rendimiento de este proceso es 14.9%.
El grado de deacetilacin para el quitosano producido en nuestro
proceso es 74.88% y del quitosano comercial es 77.28%.

La referencia bibliogrfica menciona que de la langosta se puede
obtener hasta un 6% de quitosano (A.Garca
29
) y a partir del camarn
un 33%. Segn los resultados de nuestro estudio, el porcentaje de
obtencin del quitosano se encuentra en un rango aproximado a lo
que se esperara encontrar en una muestra de exoesqueleto de
cangrejo. Es decir, un porcentaje por debajo del obtenido en el
camarn; pues en ste se encuentra un alto porcentaje de quitina.
Por otra parte, S.Madrigal
28
en su investigacin obtuvo una muestra
de quitosano a partir de langostino (Pleuroncodes planipes) con un
77.85% de grado de deacetilacin. Las pruebas preliminares nos
indicaron que un bajo grado de deacetilacin requera correcciones
en el proceso; en base a lo referido, se tom la decisin de aumentar
el tiempo de calentamiento para remover los grupos acetilo de la
muestra de quitina. En consecuencia, aument el grado de
deacetilacin hasta un nivel aceptable de acuerdo a la bibliografa.

91
Ext r acci n y pur i f i caci n de l a papana

Se obtuvo 0.068mg de papana por cada mg de ltex de papaya lo
cual se logr mediante la extraccin con 7 volmenes de buffer
por cada mg de ltex. La proporcin de adicin etanol-buffer fue
1.8:1. La cantidad de papana obtenida en esta fase representa un
6.8% de obtencin, de acuerdo a la tabla N 7.2.
Para la precipitacin (purificacin de nivel intermedio) de la mayor
cantidad de papana fue necesario un volumen no menos de 1.7
de etanol 98 por cada volumen de buffer aadido. Por encima de
esta proporcin de adicin, los porcentajes de obtencin se
acercan al 6.8%.

Finalmente se ensay con los volmenes de buffer recomendados en
la fase preliminar y se ratific el comportamiento acerca de una
proporcin de adicin ptima necesaria para extraer el enzima; sta
fue la que se cita en el primer inciso. Por debajo de proporciones
etanol-buffer 1.4:1, las cantidades de papana obtenida disminuyen.
Esta disminucin se refiere a la baja capacidad para lograr la
precipitacin que tiene el etanol cuando est diluido, en la proporcin
de adicin mencionada; en estas condiciones la fuerza inica no
alcanza su nivel ptimo para precipitar cantidades representativas de
extracto enzimtico.
Cuando la proporcin etanol-buffer es 1.8:1 representa un punto en la
seccin asinttica de la curva L etanol vs. mg papana obtenida (ver
pg. 93); sta se acerca al lmite mnimo de adicin para lograr una
alta obtencin de papana, entonces para efecto de determinar
proporciones de adicin que no se encuentren en lo mnimo, debera
aadirse una proporcin etanol-buffer 2:1.
R.Monti
13
en su investigacin obtuvo un 0.243% de papana por
cristalizacin y se refiere a este nico enzima; el extracto enzimtico
de nuestra obtencin implica la presencia de papana y quimopapana.

92
Tabla N 7.2
Efecto de la adicin de buffer con respecto al porcentaje de obtencin
de la papana* a partir del ltex** de papaya
Prueba
#
Buffer
aadidos
(mL)
Papana
obtenida
(mg)
%
Obtencin de
papana
1 0 0 0,0
2 2300 28 5,6
3 2700 31 6,2
4 3000 33 6,6
5 3500 34 6,8
6 4500 21 4,2
7 5000 10 2

**Muestra: 500mg ltex de papaya
*Solvente aadido: 6500L etanol 98
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 2300 2700 3000 3500 4500 5000
L Buffer aadi dos
m
g

p
a
p
a
n
a

o
b
t
e
n
i
d
o
s
0
1
2
3
4
5
6
7
8
%

O
b
t
e
n
c
i
n

d
e

p
a
p
a
n
a

93
Tabla N 7.3
Efecto de la adicin de diferentes cantidades de etanol sobre el
porcentaje de obtencin de papana
Prueba
#
Etanol98
aadido (L)
Papana
obtenida(mg)
%
Obtencin
de papana
1 0 0 0,0
2 5500 25 5,0
3 6000 33 6,6
4 6500 34 6,8
5 7000 35 7,0

Buffer aadido: 3500L
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 5500 6000 6500 7000
L etanol aadi dos
m
g

p
a
p
a
n
a

o
b
t
e
n
i
d
o
s
0
1
2
3
4
5
6
7
8
%

O
b
t
e
n
c
i
n

d
e

p
a
p
a
n
a

94
Gr ado de di gest i n de l a papana pur i f i cada sobr e el sust r at o
l eche

Se logra un 95.6% de digestin con una proporcin de adicin
papana(8mg/mL)-leche(1%) de 0.25:1.

Se ratifica lo mencionado en el anlisis de las pruebas preliminares al
encontrar una concentracin que permita digerir un alto porcentaje de
las protenas presentes en la leche.

Tabla N 7.4
Efecto en el grado de digestin de la papana debido a
la adicin de diferentes concentraciones del enzima sobre el sustrato
leche
Prueba
#
Papana aadida
(mg/mL)
Absorbancia
A
leche
(nm)
%Digestin
Blanco 0,0 1,789 0,0
1 1,0 0,879 50,9
2 1,5 0,729 59,3
3 2,0 0,598 66,6
4 2,5 0,494 72,4
5 3,0 0,370 79,3
6 3,5 0,280 84,3
7 4,0 0,265 85,2

95
Prueba
#
Papana aadida
(mg/mL)
Absorbancia
A
leche
(nm)
%Digestin
8 4,5 0,230 87,1
9 5,0 0,189 89,4
10 5,5 0,178 90,1
11 6,0 0,175 90,2
12 6,5 0,152 91,5
13 7,0 0,149 91,7
14 7,5 0,135 92,5
15 8,0 0,079 95,6

*200L soluc. papana / 800L soluc. leche 1%
0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
1, 6
1, 8
2
0 1 1, 5 2 2, 5 3 3, 5 4 4, 5 5 5, 5 6 6, 5 7 7, 5 8
mg/mL sol uc. papana aadida
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

l
e
c
h
e

(
n
m
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%

D
i
g
e
s
t
i
n

96
Ef ect o de l a cant i dad de papana i nmovi l i zada en el qui t osano sobr e
l a ef ect i vi dad en l a di gest i n

Un 77.8% de digestin es el efecto que produce 0.16mg de
papana inmovilizada por cada mg de quitosano con respecto a
una solucin de gelatina del 2%.
Cantidades menores que 0.13mg de papana inmovilizada por
cada mg de soporte da como resultado porcentajes de digestin
por debajo del 51,4%.

Debido a que el poder cataltico disminuye representativamente por
debajo de 0.13mg de papana inmovilizada / mg quitosano, se deduce
que 0.16mg de papana inmovilizada / mg quitosano preacondicionado
es la proporcin mnima para lograr niveles considerables de digestin
en el sustrato gelatina.
La investigacin de A.Kilin inmoviliz 0.5mg de papana por cada mg
de soporte de quitosano; esto representa un 50% de retencin del
enzima en el soporte. En cambio en nuestro trabajo la cantidad que se
inmoviliz representa un 16.6% de retencin del enzima; sin embargo,
aun siendo menor este porcentaje de retencin del enzima en el
quitosano, se pudo lograr una importante digestin de la concentracin
de protenas del sustrato estudiado.

97
Tabla N 7.5
Efecto de la cantidad de papana inmovilizada sobre su porcentaje de
digestin en el sustrato gelatina
Prueba
#
[mg] papana
inmovilizada / mg
quitosano
preacond.
Absorbancia
A
gelatina
(nm)
%Digestin
1 0 1,302 0,0
2 0.016 1,215 6,7
3 0.033 0,942 27,6
4 0.066 0,886 32,0
5 0.10 0,765 41,2
6 0.13 0,633 51,4
7 0.16 0,289 77,8

*6000L gelatina 2%
0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
0 0, 016 0, 033 0, 066 0, 1 0, 13 0, 16
[mg] papana i nmovi l i zada
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

g
e
l
a
t
i
n
a

(
n
m
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
%

D
i
g
e
s
t
i
n

98
Ef ect o del t i empo de cont act o en l a i nmovi l i zaci n de l a papana en
el qui t osano con r espect o a l a capaci dad de di gest i n

24 horas de tiempo de contacto en la inmovilizacin del conjugado
enzima-soporte produce as mismo un 77,8% de digestin.

Adems, se logra un 72,7% de digestin inmovilizando durante 20
horas la papana en el quitosano. En tiempos menores ya se
evidencia grados de digestin por debajo del 70%.

Estas pruebas finales ratifican lo analizado en las preliminares. Por lo
tanto, tiempos mayores a 20 horas permitirn un efecto de aceptables
niveles de digestin del enzima inmovilizado.

99
Tabla N 7.6
quitosano sobre el porcentaje de digestin en el sustrato digerido por el
enzima
Prueba
#
Tiempo de
contacto (hrs.)
Absorbancia
A
gelatina
(nm)
% Digestin
1 0 1,302 0,0
2 5 1,102 15,4
3 8 1,004 22,9
4 11 0,921 29,3
5 14 0,726 44,2
6 17 0,456 65,0
7 20 0,356 72,7
8 24 0,289 77,8

0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
0 5 8 11 14 17 20 24
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

g
e
l
a
t
i
n
a

(
n
m
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%

D
i
g
e
s
t
i
n

Soporte: [0.16mg papana / mg quitosano preacond.]

100
Ef ect o del nmer o de r eut i l i zaci ones de l a papana i nmovi l i zada con
r espect o a l a capaci dad de di gest i n

La primera utilizacin de la papana permite obtener un 77,8% de
digestin.
A partir de la segunda utilizacin ya se evidencia un descenso de
la digestin por debajo del 70%.
Apenas un 20,7% de digestin se logra en la sexta utilizacin.

De acuerdo a lo que ya se predijo en las pruebas preliminares, el nivel
de digestin disminuye a partir de la segunda utilizacin hasta llegar a
la sexta; en sta se evidencia todava un grado de digestin del 20,7%
sobre el sustrato gelatina.

101
Tabla N 7.7
inmovilizada sobre el porcentaje de digestin del sustrato gelatina

Prueba
#

N
reutilizaciones
Absorbancia
A
gelatina
(nm)
% Digestin
1 *0 1,302 0,0
2 **1 0,289 77,8
3 ***2 0,700 46,2
4 3 0,977 25,0
5 4 1,029 21,0
6 5 1,038 20,3
7 6 1,032 20,7
Tiempo de contacto entre la gelatina y la papana inmovilizada por cada
reutilizacin: 20min.

0
0, 2
0, 4
0, 6
0, 8
1
1, 2
1, 4
0 1 2 3 4 5 6
N Reuti l i zaci ones
A
b
s
o
r
b
a
n
c
e

g
e
l
a
t
i
n
e

(
n
m
)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%

D
i
g
e
s
t
i
n

102
Capt ul o 8.- Concl usi ones y r ecomendaci ones

De l a obt enci n del qui t osano a par t i r del exoesquel et o de cangr ej o

De lo expuesto en el captulo anterior acerca de este proceso,
cuyo rendimiento fue 14.93%, se concluye que ste permiti
obtener un polmero deacetilado de quitina en un 74.88%; el
parmetro de calidad reportado nos indica que el producto bien
puede identificarse como quitosano.
Para posteriores trabajos se recomienda un estudio acerca de la
composicin qumica del exoesqueleto del cangrejo y su incidencia
en la obtencin del quitosano; esta informacin es necesaria para
el aprovechamiento de esta fuente natural para la produccin del
polmero ya mencionado.

De l a ext r acci n y pur i f i caci n de l a papana a par t i r del l t ex de
papaya

Acerca de la estrategia empleada para la purificacin de la
papana, se concluye que el nivel de purificacin, el cual fue de
nivel intermedio, permiti obtener un producto final
correspondiente a un extracto compuesto de papana y
quimopapana, su compaero cooperativo. Una concentracin de
papana de 8,0mg/mL alcanza un grado de digestin de hasta
95,6% sobre el sustrato leche; esto nos indica que el extracto
enzimtico obtenido tiene una calidad acorde a lo que a nivel
industrial pudiera exigirse de este producto.
Para un estudio ms profundo acerca de la obtencin de altos
niveles de papana, se recomienda la utilizacin de tcnicas de
purificacin ms avanzada.

103
Adems, se recomienda que en la operacin de secado se utilice
un liofilizador; este tipo de secado permitir mantener la calidad
del enzima purificado.

De l a i nmovi l i zaci n de papana en sopor t e de qui t osano y de l a
capaci dad de di gest i n del enzi ma

Se concluye que las variables experimentadas nos permitieron
inmovilizar una cantidad de papana cruda en un soporte de
quitosano preacondicionado (en un tiempo ptimo tambin
experimentado) para lograr un 77.8% de digestin de una muestra
de gelatina; este rendimiento se logr con una sola utilizacin;
seis utilizaciones solamente permiten digerir hasta un 20,7%.
Para prximos estudios se recomienda ensayar qu cantidades de
enzima fresco deben agregarse al soporte para regenerarlo y
mantener niveles altos de digestin; se espera que esta cantidad
sea menor que la aadida inicialmente.
Dentro de las aplicaciones que pueda tener este producto, se
recomienda la experimentacin con otros sustratos que estn
acorde a la naturaleza de la papana.
La utilizacin de agentes qumicos que ayuden a formar enlaces
ms fuertes es necesaria para alcanzar niveles altos de retencin
del enzima en el quitosano. Por lo tanto, se recomienda estudios
con tales compuestos y adems, que se estudien otros mtodos
de inmovilizacin.

De lo expresado, se concluye que: Un anlisis econmico de este
anteproyecto, el cual est enmarcado dentro de los requerimientos de
alguna aplicacin industrial a gran escala, ser determinante para
evaluar los alcances cientficos que este trabajo ha logrado.

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Capt ul o 1.- La papana y su pur i f i caci n

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