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APROVEITAMENTO DO BAGAO DE CANA-DE-ACAR PARA A

PRODUO ENZIMTICA DE XILITOL


UTILIZATION OF SUGAR CANE BAGASSE FOR ENZYMATIC
PRODUCTION OF XYLITOL
SENE L., VITOLO M., *FELIPE M. G. A, PESSOA Jr. A
Depto. De Tecnologia Bioqumico-Farmacutica FCF USP
*Depto. de Biotecnologia FAENQUIL Cx Postal 116
CEP 12600-000 Lorena SP
E-mail: lsene@hotmail.com
Resumo
Os nveis enzimticos de xilose redutase bem como a bioconverso de
xilose em xilitol foram avaliadas no cultivo da levedura Candida guilliermondii
em hidrolisado de bagao em pH inicial de 3,5, 5,0 e 7,0 a 30
0
C. A maior
atividade especfica da xilose redutase (327,35 UI.mg
-1
) foi obtida em
hidrolisado de pH 7,0 aps 24h, o que poderia explicar a alta produtividade
encontrada (0,42 g.L
-1
.h
-1
) para este mesmo valor de pH, o que representa um
aumento de 60% em relao ao valor encontrado para o cultivo em pH inicial
5,0.
Abstract
Both the xylose reductase levels and the bioconversion of xylose to
xylitol were investigated using Candida guilliermondii yeast grown in bagasse
hydrolysate at initial pH values of 3.5, 5.0 and 7.0 at 30
0
C. The highest xylose
reductase specific activity (327.35 UI.mg
-1
) was attained in medium at pH 7.0
after 24h, which could explain the high volumetric productivity (0.42 g.L
-1
.h
-1
)
found for the same pH value. This activity level was 60% higher than that found
for pH 5.0.
Palavras-chave: xilose redutase, xilitol, Candida guilliermondii
INTRODUO
Embora o bagao de cana-de-acar venha sendo utilizado na gerao
de energia em usinas, um maior aproveitamento deste resduo de grande
importncia na reduo do impacto ambiental por ele causado, principalmente
no Brasil, onde so liberados anualmente cerca de 10 toneladas de bagao.
Este resduo pode ser empregado para obteno de xilitol, um substituto
de acares convencionais para diabticos (MANZ et al., 1973) e deficientes da
enzima glicose 6-fosfato desidrogenase (EMODI, 1978). Alm disso, o xilitol
apresenta propriedades anticariognicas (MAKINEN, 1976).
A produo industrial de xilitol se d por via qumica atravs da
hidrogenao cataltica da xilose, empregando-se nquel como catalisador
(HYVNEN et al., 1982). Entretanto, leveduras como C. guilliermondii so
capazes de utilizar a xilose obtida por hidrlise cida da frao hemicelulsica
do bagao de cana-de-acar para a produo de xilitol (FELIPE et al., 1997),
processo que apresenta vantagens econmicas em relao ao processo
convencional (ROSEIRO et al., 1991). Esta bioconverso enzimtica
dependente da enzima xilose redutase (EC 1.1.1.21), a qual induzida na
presena de xilose e responsvel pela converso direta de xilose em xilitol, em
um primeiro passo do metabolismo da xilose (JEFFRIES, 1983; ROSEIRO et
al., 1991; WEBB LEE, 1990).
MATERIAIS E MTODOS
Preparo do hidrolisado hemicelulsico de bagao de cana-de-acar:
O bagao foi hidrolisado em reator de 250L a 121
0
C, 10 min,
empregando 100 mg H
2
SO
4
por grama de matria seca. Aps filtrao, parte
do hidrolisado foi concentrado a vcuo a 70
0
C. O tratamento para remoo
parcial de compostos txicos consistiu da elevao do pH at 7,0 com CaO,
seguido da acidificao at pH 5,5 com H
3
PO
4
, tendo sido o precipitado
formado separado por filtrao. Em seguida, adicionou-se carvo ativo na
proporo de 2,4%, sob agitao de 200 min
-1
, a 30
0
C, por 1 h com nova
filtrao para a remoo do carvo.
Microrganismo:
Empregou-se a levedura C. guilliermondii FTI 20037, a qual foi mantida
em gar extrato de malte a 4
0
C. Para o cultivo do inculo, foi empregado o
hidrolisado em sua forma original contendo 18,8 g/L de xilose, 1,7 g/L de
glicose e 3,2 g/L de cido actico, com pH inicial de 5,5, o qual foi
suplementado com 2,0 g/L de (NH
4
)
2
SO
4
, 0,1 g/L de CaCl
2
. 2H
2
O e 20 g/L de
extrato de farelo de arroz in natura.
Fermentaes:
Os ensaios de fermentao foram conduzidos em meio constitudo pelo
hidrolisado concentrado contendo 52,0 g/L de xilose, 4,2 g/L de glicose e 5,0
g/L de cido actico. Aps acerto do pH para 3,5, 5,0 e 7,0 com H
2
SO
4
ou
NaOH conforme o caso, os hidrolisados foram suplementados com os mesmos
nutrientes empregados na obteno do inculo. Os testes foram realizados em
frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL de meio os quais foram
incubados em agitador rotatrio a 200 min
-1
, 30
0
C. Em intervalos regulares
foram retiradas amostras as quais foram centrifugadas a 800g por 15 min,
tendo sido o sobrenadante reservado para a determinao de acares e xilitol.
As clulas foram lavadas e ressupensas em tampo fosfato 0,1 M pH 7,2 e
congeladas em freezer para posterior determinao das atividades
enzimticas.
Mtodos analticos:
As concentraes de glicose, xilose e xilitol foram determinadas em
Cromatgrafo Lquido de Alta Eficincia (WATERS 786), empregando-se
coluna BIO RAD Aminex HPX-87H, detector de ndice de refrao IR Waters
410 e como solvente, H
2
SO
4
0,01N sob fluxo de 0,6 mL/min.
Rompimento celular:
Empregou-se o processador ultrasnico Vibra Cell 100W -Sonics &
Materials acoplado a uma sonda de 13 mm, com vibraes em pulso durante
35 min. O volume de suspenso celular empregado foi 3 mL, tendo sido
mantido, durante o rompimento, em banho refrigerado a 15
0
C.
Ensaios enzimticos:
As atividades da xilose redutase foram determinadas conforme
ALEXANDER (1985). Uma unidade de atividade enzimtica foi definida como
sendo a quantidade de enzima que catalisa a oxidao de 1 mol de cofator
por minuto temperatura ambiente. Os resultados foram expressos em UI.mg
protena
-1
. A concentrao de protena nos extratos livres de clulas foram
determinados conforme BRADFORD (1976).
.
RESULTADOS E DISCUSSO
A Figura 1 mostra o consumo de glicose, xilose e produo de xilitol nas
fermentaes do hidrolisado hemicelulsico de bagao por C. guilliermondii sob
diferentes condies de pH inicial. Verificou-se que quando foi empregado o
hidrolisado de pH inicial 3,5, ocorreu um lento consumo de glicose seguido de
um lento consumo de xilose o qual coincidiu com o esgotamento da glicose do
meio, ou seja, em torno de 36h. Nesse momento, foi verificada a presena de
xilitol no meio, porm em baixas concentraes. A baixa atividade fermentativa
em pH 3,5 provavelmente deve-se presena de cido actico na forma no
dissociada, o que est relacionada acidez do meio (FERRARI et al., 1992). J
nas fermentaes em que se empregou pH inicial de 5,0 e 7,0, observou-se um
0 12 24 36 48
0
10
20
30
40
50
Figura 1 - Variao da concentrao de glicose
( ) pH 3,5, ( ) pH 5,0, ( ) 7,0, xilose
( ) pH 3,5, ( ) pH 5,0, ( ) pH 7,0, e
produo de xilitol ( ) pH 3,5, ( ) pH 5,0,
( ) pH 7,0 em fermentao do hidrolisado
hemicelulsico de bagao de cana-de-acar por
C. guilliermondii em funodo pH inicial.

C
o
n
c
.

d
e

g
l
i
c
o
s
e
,

x
i
l
o
s
e

e

x
i
l
i
t
o
l

(
g
/
L
)
tempo (h)
rpido consumo de glicose, no sendo este acar detectado no meio aps
12 h de cultivo. O rpido consumo de glicose foi tambm constatado na
fermentao dos hidrolisados hemicelulsicos de eucalipto e de bagao de
cana-de-acar por C. guilliermondii em pH 5,5 (FELIPE et al., 1996, 1997).
Com relao xilose, verificou-se um consumo de 58% e 83% aps 48h para
os pHs 5,0 e 7,0, respectivamente. Da mesma forma, observou-se tambm na
Figura 1, um favorecimento na produo de xilitol decorrente da elevao do
pH do meio, encontrando-se as concentraes finais de 18,84 g/L e 26,88 g/L
de xilitol para os valores de pH 5,0 e 7,0, respectivamente. Com relao aos
parmetros fermentativos (Tabela 1), verificou-se que a bioconverso de xilose
em xilitol foi favorecida com a elevao do pH de 3,5 para 5,0 e 7,0. Maior
valor de rendimento aps 48h foi verificado em pH inicial 5,0 (0,71 g/g). No
entanto, com relao produtividade, verificou-se um aumento desta com a
elevao do pH do meio (Tabela 1).
Tabela 1 Parmetros fermentativos da bioconverso de xilose em xilitol
por C. guilliermondii em funo do pH inicial do hidrolisado
hemicelulsico de bagao de cana-de-acar.
PH inicial
Tempo (h) 3,5 5,0 7,0
12 - 0,81 0,41
Rendimento (g/g) 24 - 0,50 0,54
36 0,46 0,65 0,66
48 0,46 0,71 0,69
12 - 0,04 0,09
Produtividade(g/L.h) 24 - 0,17 0,42
36 0,04 0,26 0,57
48 0,08 0,42 0,56
No que se refere s atividades especficas da xilose redutase (Tabela 2)
observou-se um decrscimo destes valores para todos os pH estudados aps
12h de cultivo quando comparadas ao tempo zero (513,03 UI.mg prot
-1
). Este
comportamento provavelmente deve-se represso catablica da xilose
redutase pela glicose presente no meio (4,2 g/L), uma vez que foi verificado
o consumo de glicose preferencial xilose (Figura 1). A represso da induo
da xilose redutase foi anteriormente constatada em diversas espcies de
leveduras (du PREEZ et al., 1986; SKOOG, HAHN-HGERDAL, 1988; KERN
et al., 1997).
Conforme pode ser tambm observado na Tabela 2, as atividades
enzimticas aumentaram no decorrer das fermentaes iniciadas em pH 3,5 e
5,0. No entanto, para pH 7,0 observou-se que a atividade especfica da xilose
redutase foi mxima no tempo correspondente a 24 h (327,35 UI.mg prot
-1
),
decrescendo em seguida. KERN et al., 1997, verificaram que as atividades
especficas da xilose redutase e xilitol desidrogenase de Candida tenuis
cultivada em meio sinttico e pH inicial 5,5, aumentaram durante a fase
exponencial de crescimento, decrescendo em seguida devido ao esgotamento
do substrato responsvel pela induo destas enzimas, a xilose. Isto
provavelmente explica o comportamento verificado no presente trabalho
quando se empregou pH inicial 7,0, uma vez que neste valor de pH o consumo
de xilose foi favorecido (Figura 1).
Tabela 2 Atividades especficas da xilose redutase (UI.mg prot
-1
) em
C. guilliermondii variando-se o pH inicial do hidrolisado hemicelulsico
de bagao de cana-de-acar.
pH inicial
Tempo (h) 3,5 5,0 7,0
12 43,78 72,89 99,66
24 72,99 71,99 327,35
36 93,59 146,49 255,45
48 119,67 212,72 175,25
T0 = 513,03 UI.mg prot
-1
Por fim, observou-se que as condies de cultivo para a obteno de
xilitol so diferentes daquelas onde foram encontrados maiores valores de
atividade enzimtica. Sendo assim, esse fato de grande importncia tendo-se
em vista a produo de xilitol a partir da xilose em reator contendo a xilose
redutase imobilizada, processo este que representa uma nova possibilidade em
relao ao processo fermentativo convencional.
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