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Universidade do Algarve - Licenciatura em Cincias Biomdicas

Virologia Aplicada
3 Ano, 2 Semestre Joana Canadas, N42351


1
Virologia
Fora das suas clulas hospedeiras, os vrus
sobrevivem como partculas virais, ou viries
(partcula viral = virio; virio # vrus). O virio um
sistema de entrega de genes, contm o genoma do
vrus as suas funes consistem na proteo do
genoma e em auxiliar a sua entrada numa clula
hospedeira, na qual poder ser replicado e
empacotado em viries novos.
O genoma empacotado numa estrutura
proteica conhecida como uma cpside.
Muitos vrus tm tambm uma componente
lipdica, normalmente presente na superfcie do
virio formando um envelope, que tambm
contm protenas com funes de auxiliar a
entrada nas clulas hospedeiras. Alguns vrus
formam corpos de ocluso de proteo ao redor de
protenas.
Virio ou Virion: possui genoma, cpside (natureza proteica), matriz, envelope (pode existir ou no),
antirecetores (que lhe permite estabelecer contacto com a clula hospedeira; de onde entra e sai
informao). uma partcula viral completa que est fora da clula hospedeira; constitui a forma
inativa do vrus.
No so vrus:
Virides - so os menores sistemas genticos capazes de se replicar no interior de uma clula;
so molculas de RNA que se replicam mas no tm genes. Os viroides no codificam protenas
e so denominados "Agentes Subvirais".
Pries - um agente infecioso composto por protenas com forma aberrante. Tais agentes no
possuem cidos nucleicos (DNA e/ou RNA) ao contrrio dos outros agentes infeciosos
conhecidos (vrus, bactrias, fungos e parasitas). No t genoma.
Os vrus infectam organismos vivos para se aproveitarem dele e se poderem replicar.
1. Genoma dos vrus
Cada molcula de cido nucleico de cadeia simples (ss), ou de cadeia dupla (ds), dando quatro
possveis categorias para o genoma de um vrus: dsDNA, ssDNA, e ssRNA dsRNA.
Os vrus com dsDNA codificam os seus genes no mesmo tipo de molcula que animais, plantas,
bactrias e outros organismos celulares, ao passo que os outros trs tipos de genoma so
nicos para os vrus.
O tamanho mximo de um genoma do vrus est sujeita a restries, e varia de acordo com a categoria
de genoma. medida que as restries so menos severas para dsDNA, todos os genomas grandes de
vrus passam a ser compostos por dsDNA.
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Os maiores genoma de RNA conhecidos so os de alguns coronavrus, que possuem 33 kb de
ssRNA.
Os genomas maiores de vrus, tais como o do mimivrus, so maiores do que os mais pequenos
genomas dos organismos celulares, tais como alguns micoplasmas
1
.
Tamanho dos vrus: 30-70 nm.
1.1 Modificaes das extremidades dos
genomas dos vrus
Os genomas de certos vrus de DNA e de muitos
vrus de RNA so modificados numa ou em ambas
as extremidades. Alguns genomas tm uma
protena covalentemente ligada na extremidade
5. Em pelo menos alguns vrus isto um vestgio
de um primer que foi utilizado para a iniciao da
sntese do genoma.
Alguns genomas de RNA tem uma ou ambas as
modificaes que ocorrem no RNA mensageiro
eucaritico (mRNA): um cap metilado na
extremidade 5 e uma sequncia de resduos de
adenosina, cauda poli A na extremidade 3.
Genomas de muitos vrus de RNA funcionam como
mRNAs depois de terem infetado clulas
hospedeiras. O cap e a cauda poli A de um genoma
de RNA pode indicar que a molcula est pronta
para funcionar como mRNA.
As protenas no covalentemente associadas com genomas virais
Muitos cidos nucleicos empacotados em viries tem protenas ligadas a elas de forma no
covalente.
Papillomavrus e poliomavrus, que so vrus de DNA, possuem histonas celulares ligados ao genoma do
vrus. A maioria das protenas associadas aos genomas de vrus codificada pelos vrus.
Em alguns vrus, como o vrus do mosaico do tabaco (TMV) a protena de revestimento do genoma
constitui a cpside do virio.
1.2 Genomas segmentados
A maioria dos genomas de vrus consistem numa nica molcula de cido nucleico, mas os genes de
alguns vrus so codificadas em duas ou mais molculas de cidos nucleicos.
Estes genomas segmentados so muito mais comuns entre os vrus de RNA do que vrus de DNA.
Exemplos de vrus ssRNA com genomas segmentados so os vrus da influenza, que empacota
os segmentos num virio, e vrus do mosaico de brome, que empacota os segmentos em viries
separados.

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Micoplasmas o nome que foi dado s bactrias do gnero Mycoplasma, com tamanho do que o
apresentado normalmente pelas outras bactrias.
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A maioria dos vrus de dsRNA, como os membros da famlia Reoviridae, tem genomas segmentados. A
posse de um genoma segmentado proporciona a um vrus a possibilidade de novas combinaes de
genes e, portanto, um potencial de evoluo mais rpida. Uma nova clula torna-se infetada apenas se
todos os segmentos do genoma entrarem na clula.
1.3 Sequncias Repetidas
Muitos genomas virais lineares tm sequncias repetidas nas suas extremidades, caso em que as
sequncias so conhecidas como repeties terminais.
Se as repeties estiverem na mesma orientao, so designadas de direct terminal repeats
(DTRs);
Se estiverem em orientao oposta, so conhecidos como inverted terminal repeats (ITRs).
Estritamente falando, as sequncias referidas como "ITRs" em cadeia simples de cidos nucleicos no se
repete at a segunda cadeia ser sintetizada, durante a replicao. Em molculas de cadeia simples, as
"ITRs" so, de facto, repeties de sequncias complementares.
1.4 Diversidade dos Genomas Virais
RNA de sentido positivo (+): informao pode ser
traduzida pelos ribossomas.
RNA de sentido negativo (-): primeiro necessrio
passar para a cadeia principal.
DNA de sentido positivo (+): cadeia de DNA igual do
mRNA.
DNA de sentido negativo (-): cadeia de DNA
complementar de mRNA.
Replicao do genoma de RNA:

2. Protenas Virais
medida que o tamanho do genoma aumenta, o nmero
de espcies de protenas tambm tende a aumentar;
As protenas, que so componentes de viries, so
conhecidas como protenas estruturais. Estas protenas
tm de realizar uma grande variedade de funes,
incluindo:
Proteo do genoma do vrus;
Ligao do virio a uma clula hospedeira (por
muitos vrus);
Fuso do envelope do virio membrana da
clula (para vrus com envelope).
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Protenas de vrus podem ter funes adicionais, algumas podem ser protenas estruturais, e outras
protenas no-estruturais - protenas sintetizadas pelo vrus numa clula infectada, mas que no so
componentes do virio. Estas funes adicionais incluem:
As enzimas como, por exemplo, protase e transcriptase reversa;
Fatores de transcrio;
Primers para a replicao dos cidos nucleicos;
Interferncia com a resposta imune do hospedeiro.
Num virio, o genoma do vrus colocado entre uma camada de protenas, conhecida como cpside.
3. Cpside
Genomas virais retirados de suas cpsides so mais suscetveis inativao, de modo que a funo
principal da cpside , sem dvida, a proteo do genoma.
Uma segunda funo importante de muitas cpsides a de reconhecer e de se ligar a uma clula
hospedeira em que o vrus se possa replicar. Embora a cpside deva ser suficientemente estvel para
sobreviver no ambiente extracelular, deve tambm ter a capacidade de alterar a sua conformao, de
modo a que, no momento apropriado, o vrus possa libertar o seu genoma na clula hospedeira.
Envolvendo o cido nucleico so encontradas protenas capsmeros - codificadas pelo genoma viral,
sendo o conjunto destas protenas denominado de cpside. Em geral, estes possuem forma geomtrica
bem definida: icosadrica, helicoidal, cilndrica, esfrica, entre outras. A cpside em associao com o
material gentico viral compe a nucleocpside/nucleocapsdeo.
Para a grande maioria dos vrus a simetria presente na cpside helicoidal ou icosadrica.
3.2 Cpsides com simetria helicoidal
As cpsides de muitos vrus ssRNA tm simetria helicoidal; o RNA enrolada sob a forma de uma hlice
e muitas cpias das mesmas espcies proteicas so dispostas em torno da hlice. Isto forma uma
estrutura alongada, que pode ser uma haste rgida se as ligaes presentes entre as protenas, em voltas
sucessivas em torno da hlice, forem fortes, ou uma haste flexvel, se as ligaes forem fracas.
O comprimento da cpside determinado pelo comprimento do cido nucleico.
Para muitos vrus ssRNA, tais como o vrus do sarampo e da gripe (vrus influenza), o cido nucleico
helicoidal revestido com as protenas forma um nucleocapsdeo, que est dentro de um envelope.
O nucleocapsdeo pode ser enrolado ou dobrado de modo a formar uma estrutura compacta.
Os viries de alguns vrus de DNA, tais como os fagos filamentosos, tambm tm simetria helicoidal.
3.3 Cpsides com simetria icosadrica
Um icosaedro um objeto com:
20 faces, sendo cada uma um tringulo equiltero;
12 vrtices, cada um formado onde os vrtices de cinco tringulos se juntam;
30 arestas, cada uma onde os lados de dois tringulos se encontram.
As protenas de cpsides com uma simetria icosadrica tm menos contacto com o genoma do vrus do
que as de uma cpside com simetria helicoidal.
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Para construir um icosaedro a partir de molculas proteicas idnticas, o nmero mnimo necessrio de
trs por face triangular, dando um total de 60 para todo o icosaedro.
Nas cpsulas constitudas por mais de 60 molculas proteicas, impossvel todas as molculas estarem
dispostas de forma completamente simtrica e com ligaes equivalentes a todas as suas molculas
vizinhas.
As cpsides de muitos vrus com simetria icosadrica so constitudas por mais do que uma espcie
proteica.
Para se adicionar material gentico a um vrus com simetria icosadrica subdivide-se as faces
em tringulos.

Capsmeros
As cpsides do vrus do papiloma so construdos a partir de 72
capsmeros, que so idnticos, mas as cpsides de alguns vrus
so construdas a partir de dois tipos de capsmeros: pentes,
que se encontram nos vrtices do icosaedro e hexes, que
compem o restante o capsdeo.
Um vrus ao encapsidar pode perder parte do seu genoma.


4. Membranas Virais - Envelope
Muitos vrus tm um componente de membrana de lpidos. Na maior parte destes vrus a membrana
lipdica encontra-se superfcie do virio e est associada a uma ou mais espcies de protenas do vrus.
Esta estrutura lipdica-proteca designada de envelope e envolve o nucleocapsdeo (cido nucleico +
capsdeo).
Os viries da maioria dos vrus envelopados so esfricos, ou aproximadamente esfricos, mas existem
outras formas.
Alguns vrus tm uma membrana localizado no na superfcie do virio, mas dentro da cpside.
Muitos vrus animais possuem envelope, incluindo todos aqueles com simetria helicoidal como, por
exemplo, o vrus influenza.
Algumas glicoprotenas de superfcie do vrus com envelope desempenham a funo de fuso da
membrana do virio membrana da clula durante o processo de infeco.
Estas protenas de fuso possuem uma regio hidrofbica adicional, que desempenha um papel
importante no processo de fuso.
Muitos vrus com envelope, incluindo os vrus influenza e retrovrus, possuem uma camada de protenas
entre o envelope e a nucleocpside. Esta camada frequentemente designada por matriz proteica.
4.1 Lpidos de membrana
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A maioria das membranas de viries derivada das membranas das clulas hospedeiras, que so
submetidos a modificao, antes da incorporao em viries.
Quando os viries so libertados a partir das clulas hospedeiras, a composio lipdica do envelope
pode refletir que tipo de clula foi infetada.
4.2 Outros componentes do virio - RNA do vrus em vrus de DNA
RNA do vrus est presente em alguns viries de vrus de DNA. Os hepadnavrus e os caulimovrus tm
sequncias curtas de RNA ligadas de forma covalente aos seus DNAs. Estes RNAs tm funcionado como
primers para a sntese de DNA e permanecem anexados ao genoma do virio maduro.







5. Sistema de Classificao de Baltimore
O Sistema de Classificao de Baltimore, criado por David Baltimore, um modo de classificao que
ordena os vrus em sete grupos, com base na caracterstica do genoma viral e na forma como este
transcrito a mRNA. Neste sistema, os vrus so agrupados como apresentado a seguir:
Grupo I: Vrus DNA dupla fita (dsDNA);
Grupo II: Vrus DNA fita simples (ssDNA);
Grupo III: Vrus RNA dupla fita (dsRNA);
Grupo IV: Vrus RNA fita simples senso positivo ((+)ssRNA);
Grupo V: Vrus RNA fita simples senso negativo ((-)ssRNA);
Grupo VI: Vrus RNA com transcrio reversa (ssRNA-RT);
Grupo VII: Vrus DNA com transcrio reversa (dsDNA-RT).

TMV (Vrus do mosaico do tabaco) foi importante para a descoberta dos vrus no incio do
sculo 20.
Poliovrus simetria icosadrica; causa poliomielite.
Adenovrus tm projeces proteicas.
bola simetria helicoidal, faz um n numa das pontas.
Influenza vrus da gripe, tipo A, B e C; 8 helicapsdeos.
Vaccinia partcula viral feita por muitas protenas, est na origem das vacinas; 200 nm.
Mimivrus quando observados pareciam parasitas.
T4 cabea tem simetria icosadrica, cauda e protenas de adeso s clulas.
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Uma vantagem da classificao Baltimore a diferenciao entre os vrus RNA positivo (+) que sofreram
transcrio reversa (classe VI) e que no sofreram (classe IV) e entre vrus de dsDNA que sofreram
transcrio reversa (classe VII) e no sofreram (classe I).
Atravs desta classificao descobriu-se que os retrovrus iam contra o dogma central da biologia.
6. Reconhecimento, adeso e entrada nas clulas hospedeiras
Infeo Eclipse Infeo Produtiva Partculas virais
Eclipse: fase latente em que se deixa de ver as partculas virais.
Infeo produtiva: produo de novas partculas virais.
Reconhecimento bioqumico Reconhecimento e adeso: reconhecimento de molculas da clula
hospedeira e do virio permite o reconhecimento e a entrada do virio na clula.
Tropismo: preferncia de uma partcula viral para um determinado tipo de clulas.
As clulas possuem recetores naturais, dos quais as partculas virais se aproveitam para
conseguirem entrar dentro das clulas.
6.1 Clulas permissivas
Para se replicar, um vrus deve ter acesso a uma clula permissiva, ou seja, uma clula que ir permitir a
replicao do vrus.
Uma clula considera-se suscetvel quando se deixa infetar pelo vrus.
No caso de vrus que se ligam superfcie da clula hospedeira, como primeiro passo de infeo a clula
deve ter recetores apropriados a que o vrus se possa ligar. Alm disso, todas as exigncias do vrus
devem ou estar presentes na clula ou serem induzidas pela presena do vrus. Estes requisitos incluem
protenas celulares, tais como fatores de transcrio e enzimas.
Alguns vrus esto limitados a uma gama restrita de tipos de clulas permissivas, por exemplo,
vrus da hepatite B est limitado quase exclusivamente a hepatcitos.
Um outro requisito de uma clula permissiva a ausncia de defesas contra o vrus ou, por outro lado, o
vrus deve ter a capacidade de superar as defesas da clula.
As clulas desenvolveram muitos mecanismos para se defender contra a infeo por vrus e
micrbios celulares.
As clulas de vertebrados respondem presena de dsRNA, que produzido durante a infeo por
mltiplos vrus, atravs da sntese de citocinas, incluindo interferes, interleucinas e fator de necrose de
tumor. Estas protenas podem desencadear uma srie de defesas anti-virais.
6.2 Replicao dos vrus
Em geral, o processo de replicao de vrus pode ser dividido em sete passos:
1. Ligao de um virio a uma clula hospedeira;
2. Entrada na clula;
3. Transcrio de genes virais em molculas de RNA mensageiro (RNAm);
4. Traduo de mRNAs virais em protenas do vrus;
5. Replicao do genoma;
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6. Montagem de protenas e genomas em viries;
7. Sada dos viries a partir da clula hospedeira.
6.3 Vrus de animais
6.3.1 Recetores celulares e co-recetores
A adeso do virio realizada atravs de uma ou mais das suas protenas de superfcie a molculas
especficas presentes na superfcie de uma clula hospedeira. Estas molculas celulares so conhecidos
como recetores e o reconhecimento de um recetor por um virio um processo altamente especfico.
Verificou-se que alguns vrus necessitam de se ligar a um segundo tipo de molcula de
superfcie celular, um co-recetor, para infetar uma clula hospedeira.
Recetores e co-recetores so molculas de superfcie celular, normalmente glicoprotenas, com uma
ampla gama de funes que incluem:
Atuar como receptores para quimiocinas e fatores de crescimento;
Mediar o contacto clula-clula e a adeso.
6.3.2 Locais de ligao dos vrus
Cada virio tem mltiplos locais que se podem ligar a recetores antirecetores - e cada local
constitudo por regies de uma ou mais molculas proteicas.
Os locais de ligao do vrus, para vrus no encapsulados, so sobre a superfcie da cpside, por vezes,
no interior de depresses (por exemplo, poliovrus), ou em sulcos.
Os locais de ligao de alguns vrus no encapsulados so em estruturas especializadas, tais
como as fibras e os knobs de adenovrus;
Ao passo que os locais de ligao de vrus com envelope so nas glicoprotenas de superfcie.
Ligao do vrus ao recetor: inicialmente, um virio est fracamente ligado a uma clula, visto que
apenas estabeleceu a ligao com alguns recetores. Nesta fase, a ligao reversvel e o virio pode
soltar-se da clula hospedeira. Contudo, se permanecer ligado clula vo se criando oportunidades
para estabelecer novos pontos de ligao com os recetores, tornando a ligao clula irreversvel.
6.3.3 Entrada do vrus nas clulas animais
Aps a ligao a recetores nas clulas, a partcula viral tem de atravessar a membrana plasmtica para
entrar na clula hospedeira.
Muitos vrus, tais como o adenovrus, sofrem endocitose e as suas vesculas so revestidas por
clatrina.
Alguns vrus, como o SV40, so endocitados por regies da membrana plasmtica revestida por
caveolina.
Outros vrus so capturados por mecanismos que so independentes de clatrina e caveolina.
A acidificao que se verifica dentro dos endossomas onde os viries se encontram importante para os
vrus com envelope levarem a cabo a fuso do envelope com a membrana da vescula, desencadeada
pela acidez.
Entrada de vrus sem envelope
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possvel que alguns vrus sem envelope entreguem o seu genoma nas suas clulas hospedeiras atravs
de um poro formado na membrana plasmtica, mas para a maioria dos vrus sem envelope a fixao
irreversvel do virio superfcie das clulas conduz a endocitose. A membrana plasmtica flui em
redor do virio. medida que se estabelecem mais ligaes com recetores. O virio completamente
envolvido por membrana, formando um endossoma.
Entrada de vrus com envelope
H dois processos atravs dos quais a infeo da clula pode ocorrer:
1. Fuso do envelope do virio com a membrana plasmtica;
2. Endocitose seguida pela fuso do envelope do virio com a membrana do endossoma.
Ambos os processos envolvem a fuso do envelope do virio com a membrana celular; diretamente
com a membrana plasmtica ou membrana da vescula (=membrana plasmtica).
Bicamadas lipdicas no se fundem espontaneamente e cada um dos vrus com envelope tem
uma glicoprotena especializada responsvel pela fuso das membranas.









Se a sequncia de fuso estiver exposta quando o virio entrar em
contacto com a superfcie da clula, em seguida, a infeo pode
ocorrer quer por fuso com a membrana plasmtica ou por
endocitose. Se, no entanto, a exposio a um pH baixo for
necessria para expor a sequncia de fuso, a endocitose a
nica opo. Existem, por conseguinte, duas categorias de fuso
de membrana:
pH-independente de fuso, por exemplo, herpesvrus e
HIV.
Fuso desencadeada pela acidez, por exemplo, vrus
influenza.

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6.3.4 Transporte intracelular
Aps a entrada do vrus na clula, muitos necessitam de ser entregues a determinados locais,
nomeadamente o ncleo. Para alguns vrus do destino alcanado atravs de um dos sistemas de
transporte da clula, os microtbulos.
Vrus de RNA
Imagens da T1:
Slide 23: Fuso com a membrana plasmtica Retroviridae e Herpesviridae.
Slide 24: Fuso com a membrana endossomal Vrus influenza.
Slide 25: Endocitose mediada por Clatrina Adenoviridae e Parvoviridae.
Slide 26: Lise da membrana endossomal Adenoviridae.
Slide 27: penetrao mediada por poro membranar Picornaviridae, Poliomaviridae e
Papilomaviridae.
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A maioria dos vrus de RNA de clulas eucariotas replicam-se no citoplasma; a maioria codifica
todas as enzimas necessrias para a replicao a partir do seu genoma, no sendo necessria
qualquer codificao pelo ncleo da clula para obter enzimas.
O vrus influenza, contudo, constitui uma exceo, visto que requere a maquinaria de splicing
das clulas, para que o seu genoma seja entregue ao ncleo das clulas.

Retrovrus tambm so vrus de RNA que replicam os seus genomas no ncleo. Primeiro
copiam o seu genoma de RNA para DNA de cadeia dupla no citoplasma Durante a mitose da
clula, a membrana nuclear da clula temporariamente quebrada e o DNA do vrus (com
protenas associadas) capaz de entrar no compartimento nuclear. Desta forma, estes vrus s
se conseguem replicar em clulas em replicao.
Nota: os lentivrus so um tipo de retrovrus com capacidade de se replicar em clulas ps-
mitticas, ou seja, que no esto em diviso.
Vrus de DNA
Alguns vrus de DNA, tais como iridoviruses e poxvrus, replicam-se no citoplasma das clulas
eucariticas, mas a maioria dos vrus de DNA replicam-se no ncleo. Para estes vrus (assim como, para
o vrus influenza e lentivrus) o seu genoma tem de ser transportado para a membrana nuclear e, de
seguida, tem de atravess-la. As protenas estruturais de alguns destes vrus tm sequncias que lhes
permitem anexar-se aos microtbulos.
Protenas, conhecidas como protenas motores, movem-se ao longo dos microtbulos com
determinada carga que transportam.
O trfego para o ncleo inclui protenas ribossomais e histonas, enquanto o trfego para fora
do ncleo inclui ribossomas, mRNAs e RNAs de transferncia.
Nucleocpsides pequenas/viries, como o virio parvovrus, podem passar, mas os vrus maiores tm
de libertar alguma da sua carga para formar estruturas mais pequenas e uncoating no poro nuclear.
6.3.5 Uncoating (desencapsulamento) do genoma
Uncoating pode ser definido como a remoo completa ou parcial da cpside (protenas que envolvem o
genoma) para libertar o genoma do vrus. Dependendo do vrus, o processo pode ter lugar:
Na superfcie da clula, a cpside libertada e permanece no exterior da clula;
No citoplasma da clula;
Num poro nuclear;
Dentro do ncleo.
A entrada com sucesso de um virio numa clula no sempre seguida por replicao do vrus. As
defesas do hospedeiro intracelulares, tais como enzimas lisossomais, podem inativar a capacidade
infeciosa do vrus antes ou depois do uncoating.
Em alguns casos, o genoma do vrus pode iniciar uma infeo latente, em vez de completar o
ciclo de replicao.
Pelo menos em alguns casos, no entanto, desde que o genoma do vrus uncoating permanea
intacto e na localizao correta na clula, em seguida, a sua transcrio (ou, em alguns casos
traduo) podem comear.
6.3.6 Bacterifagos (Fagos)
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Os bacterifagos um tipo de vrus que s infecta bactrias.
Assim como os vrus de animais, os fagos ligam-se especificamente a molculas de superfcie celular
(recetor-antirecetor). Para muitos fagos estas molculas esto na superfcie da parede da clula
hospedeira, mas para alguns fagos podem estar na superfcie de outras estruturas (pili, flagelos ou
cpsulas).
Tal como acontece com vrus de animais, a ligao de um fago ao seu hospedeiro inicialmente
reversvel, e torna-se irreversvel aps ligao a recetores adicionais e/ou co-recetores.
7. Replicao, transcrio e traduo

8. Eventos tardios: montagem da cpside e sada da clula
8.1 Montagem de vrus
Capsdeo helicoidal
Processo espontneo;
As subunidades agregam-se, formando discos duplos;
Pode ser produzido in vitro;
Formam-se hlices a partir dos discos duplos e o genoma puxado l para dentro.
Capsdeo icosadrico
Necessria energia para atividade enzimtica;
As molculas juntam-se volta do genoma quando este est
condensado ou formam um ncleo volta das protenas;
posteriormente enzimas e eliminam essas protenas e o genoma
introduzido dentro do icosaedro; no um processo espontneo.
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8.2 Sada da clula
Vrus sem envelope: Lise celular
Estes vrus no saem da clula medida que so produzidos, vo se acumulando dentro do citoplasma
da clula at que esta atinge o seu limite e sofre lise, libertando todas as partculas virais produzidas at
ao momento.
Vrus com envelope
Este tipo de vrus necessita de adquirir membrana celular, que ser o seu futuro envelope. Desta forma
sai da clula por exocitose/gemulao/budding.
O budding tambm pode ocorrer na membrana nuclear (Herpes vrus) e depois exportado para o
citoplasma atravs de vesculas e sai da clula por exocitose.
Nota: as clulas vegetais esto em continuidade entre elas atravs do citoplasma, desta forma, atravs
do citoplasma que as partculas virais conseguem infetar novas clulas vegetais.















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APONTAMENTOS:
Podemos encontrar dentro da clula cpsulas icosadrica sem genoma; so bastante estveis.
Os vrus com envelope no provocam lise celular porque saem da clula por endocitose;
contudo a quantidade de membrana celular vai sendo mais reduzida at que a clula morre por
apoptose.
Os retrovrus fazem integrao no genoma da clula hospedeira. Os outros vrus que o fazem,
fazem-no acidentalmente e produzem consequncias para as clulas hospedeiras.
Os vrus que no conseguem completar o seu ciclo de replicao podem integrar.
As ligaes entre as protenas da cpside so fracas para que mais tarde a cpside se possa
destruir.
Os genomas de cadeia simples de DNA e RNA tendem a formar emaranhados porque h
complementaridade de bases entre regies da mesma cadeia.
Maturao: ocorre aps o budding, onde as partculas virais com envelope adquirem as suas
membranas e protenas associadas, ou seja, completam a formao da cpside.

9. Mecanismos de defesa celular
Algumas infees virais no so produtivas.
Uma infeo pode tornar-se latente, mas o genoma do vrus persiste na clula hospedeira,
possivelmente durante todo o tempo de vida da clula, podendo, talvez, ser passado para as
clulas filhas.

Uma infeo pode ser abortada, no caso de no ocorrer uma infeo latente nem uma infeo
produtiva.
Uma infeo de longo prazo, para alguns vrus, pode levar ao desenvolvimento de cancro no hospedeiro
infetado.
A clula tem detetores de situaes anmalas, que levam apoptose. Uma delas a ativao de
caspases (proteses).
Alguns vrus bloqueiam a ativao de caspases ou desencadeiam, por exemplo, a ativao da
p53.
9.1 Mecanismos de defesa celular
Mecanismos intracelulares (autnomos): mecanismos inatos, tais como, RNA interferncia,
desaminao da citidina e apoptose; a resposta celular depende apenas da clula infetada.

Mecanismos extracelulares (No-autnomos): mecanismos inatos que so induzidos pela
exposio ao vrus e outros estmulos, atravs de fatores solveis do sistema imunolgico; a
resposta de uma clula depende da resposta de outras clulas.
9.1.1 Mecanismo extracelular: Interfero
Os interferes (IFN) so protenas sintetizadas e secretadas pelas clulas do sistema imunitrio em
resposta infeo por vrus. So citoquinas - protenas excretadas que induzem uma resposta especfica
em clulas que possuem recetor apropriado -, protenas sinalizadoras.
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Um forte indutor para a produo do interfero dsRNA, que produzido no s por vrus
dsRNA, mas tambm por vrus ssRNA, quando se replicam.
Induo menos eficiente por bactrias e alguns vrus de DNA.
Produzido em quantidades mnimas (10 moleculas/clula).
A funo dos interferes proteger as clulas adjacentes da infeo e ativar a imunidade mediada por
clulas T.
Tipos de interferes:
Interfero Tipo 1: Interferes alfa e beta ( e ), que so produzidos pela maioria dos tipos de
clulas quando se tornam infetadas com o vrus. Aps secreo, as molculas de interfero
difundem-se para as clulas vizinhas, onde podem provocar diversas atividades anti-virais por
ligao a recetores de interfero.
o Atividades anti-virais desencadeadas por -e -interferes incluem: ativao de
clulas NK e induo de apoptose.

Interfero Tipo 2: Interfero Gama (), produzido principalmente por clulas T e clulas NK, na
presena de certas molculas (por exemplo, a interleucina-2), libertadas durante as respostas
imunes.
o Este interfero tem uma srie de efeitos, incluindo a estimulao da apresentao de
antignios e a ativao dos fagcitos e as clulas NK.











Aparecimento ao fim de 1 hora. Pico entre 5 e 10h. Induo de mltiplos efeitos:
Inibio de replicao viral;
Modulao de atividade de sistema imunitrio;
Febre, regulao negativa do crescimento celular
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Diversos vrus desenvolveram mecanismos que bloqueiam
a atividade da PKR (Adenovrus, HIV, etc.).
Em resumo:
A clula infectada produz o interfero que sai desta clula
e desencadeia um mecanismo extracelular de defesa,
preparando as clulas vizinhas para uma possivel infeco
viral. Esta clula, onde o interfero activado,
posteriormente, morre, mas o mecanismo extracelular
transmite a informao s clulas vizinhas onde h
produo de PKR e 2,5-OAS.
PKR: inibe a aco dos ribossomas;
2,5 OAS: promove a ao do siRNA e a
degradao do RNA viral.





9.1.2 Mecanismo intrecalular: RNA silencing
RNAsi: sistema inado das clulas que percebe que deixa de
haver estmulo para a produo de um determinado mRNA,
impedindo a sua formao. Constitui tambm uma forma de
defesa contra vrus de RNA.
RNA silencing, tambm conhecido como o silenciamento ps-
transcricional de genes ou RNA de interferncia (RNAi), um
processo intracelular que induzido por dsRNA. O processo
resulta na destruio de mRNAs que possuem a mesma
sequncia que o dsRNA indutor, tanto mRNAs celulares como
virais podem ser destrudos.
Este processo envolve a clivagem do dsRNA em pequenos
dsRNAs de interferncia (siRNAs), com 21-25 pb. As clivagens
so realizadas por um complexo proteico contendo uma
enzima chamada Dicer, que pertence famlia RNase III.
Cada um dos siRNAs junta-se a um complexo de protenas para
formar o RISC (RNA induced silencing complex). O siRNA de
cadeia dupla desenrolado e a cadeia negativa de RNA
permanece associada com o complexo - RISC ativado. A cadeia
negativa de RNA quem selecciona o mRNA alvo
complementar, por emparelhamento de bases, para que, em
seguida, este mRNA seja degradado.
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Argonaute tem capacidade de destruir o mRNA e pertence ao RISC.
O DICER reconhece RNA de cadeia dupla. Constitui um sistema de defesa porque todos os crus
de RNA para passarem para DNA tm de passar por uma faze transitria de dsRNA.
possivel produzir um siRNA especifico para um determinado vrus de RNA.
VSR: so protenas codificadas por vrus que tm a capacidade de suprimir o sileciamento pelo siRNA. As
VSRs so protenas de defesa do vrus.
Enquanto os siRNA so altamente especificos, os supressores (VSR) dos vrus so altamente
aleatrios.
Clulas Vegetais:
Em clulas vegetais e alguns animais (ex.: Caenorhabditis elegans) o siRNA no se restringe apenas a
uma clulas, ou seja, no se trata de um mecanismo intracelular, mas sim extracelular. H transporte de
siRNA entres as clulas vegetais porque o seu citoplasma est em continuidade e, desta forma, h uma
amplificao do silenciamnto e um aumento da produo do siRNA.
Slide 8, T2: Experincia
1. A clorofila quando exposta a UV fica vermelha, enquanto a transgnica com GFP fica verde.
2. Quando excesso de expresso de mRNA de GFP verifica-se um mecanismo de silenciamento,
onde algumas regies que deveriam estar verdes passam a estar vermelhas, devido supresso
do mRNA do GFP.
3. Na presena de um supressor viral, qie inibe o mRNA, no h silenciamento do mRNA de GFP,
mantendo a cor verde.
O RNAi contribui para o mecanismo de defesa antiviral em clulas de mamferos?
Os mamferos evoluram para sistemas altamente sofisticados e eficazes de reconhecimento inata e
adaptativo. Alm disso, o dsRNA activa de forma no especfica a degradao de RNA e uma represso
generalizada da sntese de protenas, primariamente mediada pela protena cinase R (PKR) e RNase L.
Pode-se afirmar que as clulas de mamferos no precisam de uma resposta antiviral baseada
em RNAi, e que o papel principal de RNAi em mamferos a regulao da expresso de genes
endgena.
9.2.Morte celular programada
A infeco viral de uma clula pode dar incio a um processo que provoca a morte da clula, antes de
vrus descendentes serem produzidos, impedindo a propagao da infeco a outras clulas. Nas clulas
animais, este mecanismo de suicdio conhecido como apoptose.
9.3 Infeces no produtivas
Em algumas circunstncias, um vrus infecta uma clula, mas o ciclo de replicao no concludo. Se o
genoma do vrus persistir na clula infectada ento diz-se que est en estado latente, caso contrrio,
trata-se de uma infeco abortiva.
9.3.1 Infeces latentes
Quando uma infeco latente iniciada, o genoma do vrus mantido na clula infectada integrado no
genoma da clula ou como mltiplas cpias de DNA circular forma epissomal.
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Em clulas eucariticas, o DNA do vrus est associado com histonas da clula hospedeira, que
desempenham papis na manuteno da latncia.
Muitas infeces latentes podem sofrer reactivao e torneram-se em infees produtivas, num
processo designado de induo.
9.3.2 Infeces abortivas
Uma infeo abortiva uma infeo no produtiva, na qual o genoma do vrus no persiste na clula, ao
contrrio de uma infeco latente. Um vrus pode iniciar infees produtivos em alguns tipos de clulas
(clulas permissivas) e infeces abortivas em outros tipos de clulas (clulas no permissivas). Algumas
infeces abortivas podem matar a clula hospedeira.
Alguns viries podem conter genomas mutantes que podem ser capazes de iniciar o ciclo de replicao,
mas podem no ter o conjunto completo de genes funcionais necessrios para o completar. Tais viries
so ditos ser defeituosos.
H um nmero de tipos de vrus defeituosos. Um tipo conhecido como uma partcula
defeituoso interferente (DIP).

10. Replicao e expresso de vrus de DNA
Classe I - dsDNA:
Genomas pequenos <100 Kbp;
Genomas mdios 40 Kbp;
Genomas grandes >80Kbp.
Alguns vrus de DNA de classe I replicam-se no
citoplasma, contudo a maioria replica-se no
ncleo. Os vrus com replicao no citoplasma
levam as suas enzimas necessrias replicao
na particula viral.
Ao contrrio dos vrus de RNA, em que as enzimas de replicao e as enzimas de expresso so as
mesmas, nos vrus de DNA, as enzimas so fiderentesm as enzimas de replicao sao DNA polimerases
e as enzimas de expresso so RNA polimerases.
Num vrus o DNA replicado muito mais vezes do que nas clulas de humanos, o que acresce o
problema de haver uma diminuio das extremidades com o aumento das replicaes em genomas
linearizados, ou seja, o genoma vai encurtando. Para compensar isto os vrus possuem um genoma
linearizado ou o genoma linera sifre circularizao antes da replicao.
10.1 Dois modelos bsicos de replicao




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No strand displacement apenas uma cadeia funciona como molde para a produo de novas cadeias de
DNA. Este tipo de replicao no ocorre em clulas eucariotas.
10.2 Transcrio
O adenovrus, hepadna, herpes,
papiloma e polioma entram no
ncleo.




10.3 Genomas de classe I de dsDNA de tamanho pequeno
10.3.1 Simian vrus 40 SV10 (Polyomaviridae)
Modelo muito simples, utilizado em laboratrio.
Vrus sem envelope;
Genoma circular de dsDNA e com 5Kb;
Capsdeo icosadrico constitudo por protenas VP1, VP2 e VP3;
Antignio T oncoprotena;
No letal para smios.
Hospedeiro natural: macacos asiticos, especialmente o macaco rhesus
Doena: infees assintomticas persistentes em hospedeiros naturais, doena neurolgica em
imunodeprimidos; tumores em roedores experimentalmente infetados.
SV40 tem capacidade de atravessar a barreira hemato-enceflica.
Replicao: em certas clulas de rim de primata; ncleo; estimula a sntese celular de DNA; ciclo de
crescimento longo
Nota histrica: Contaminantes nas primeiras poliovacinas administradas a milhes de pessoas;
primeiros estudos de biologia molecular em carcinognese.

Genoma: associado com histonas celulares como um complexo de
cromatina. Codifica cerca de 5-9 protenas.
Expresso gnica: transcrio nuclear e tem duas fases: fase early
replicao - fase late montagem e sada do virio. As 5-9 protenas
so expressas a partir de dois pr-mRNA por splicing alternativo.
Todos os genes so transcritos por uma RNA polimerase II do
hospedeiro.
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Regio de controlo:
PE Promotor early controla toda a transcrio que ocorre
antes da replicao do genoma. Possui caixa TTA e
enhancers.
PL Promotor late controlo aps a replicao do genoma.
Codifica para protenas da cpside. No possui caixa TATA.
Origem de replicao (ori);
Local de ligao do antignio T.
Antignio T:
LT-Ag (Antignio T grande) protena chave na interao entre o vrus e a clula.

Este vrus necessita da DNA polimerase da sua clula hospedeira para se replicar. Isto constitui um
problema para a replicao do vrus se a clula no se encontrar em replicao, mais precisamente na
fase S, onde disponibilidade de DNA polimerase para a produo de novas cpias de DNA.
p53: associada induo da apoptose, quando h replicao descontrolada a p53 ativada e
h induo da apoptose.
Rb: desencadeia a entrada da clula na fase S, levando produo de DNA polimerase.
Ligao do Antignio T ao Rb e p53 (supressor de tumores) Ativao da replicao do DNA celular

Promovem a ativao da sntese de DNA e RNA celular ligando-se a produtos do gene de
controlo celular, Rb e p53. Esta ligao bloqueia estas protenas de controlo de manterem as
clulas inibidas pelo contacto. Esta funo permite clula infetada comear nova replicao
do DNA.
Bloqueia a apoptose que normalmente induzida quando o p53 inativado.
Ligao ao ori do SV40 para iniciar a replicao viral e bloquear a transcrio viral.
Desliga a transcrio viral early ligando-se a regies no e perto do promotor early.
Ativao da transcrio late.

As oncoprotenas de DNA viral (caixas pretas) atuam nos supressores de
tumores Rb e p53, levando a uma inativao da sua funo e a uma
desregulao do ciclo celular e da via de resposta apopttica.
O Antignito T bloqueia o p53 impedindo que ocorra apoptose e
bloqueia o Rb para impedir que se converta em Rb-P, para que
haja inicio do ciclo de replicao.
O antignio T auto regula-se. Quando se inicia a replicao do DNA viral,
o antignio T liga-se ao PE, promotor dos genes early, nomeadamente no
LT-Ag, bloqueando-o.
Replicao do SV40:
Teta e o sigma so duas formas de replicao do DNA do polyomaviridae. A estrutura teta consiste na
replicao atravs de dois garfos, numa replicao bidirecional a partir da ori; a estrutura sigma uma
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replicao unidirecional (interna) que poder eventualmente dar origem a uma replicao teta. (slide
16, T2.1)
1. Entrada do DNA viral no ncleo (endocitose, com perda do capsdeo), onde a RNA polimerase
transcreve os gene early para produzir o antignio T.
2. A ativao do antignio T permite a induo do ciclo celular, com entrada na fase S e produo
de DNA polimerase.
3. DNA viral replicado pela DNA polimerase, formando dsDNA.
4. Os genes late codificam para as protenas estruturais, VP1, VP2 e VP3, por meio da RNA
polimerase.
5. Montagem das partculas virais ocorre no ncleo.
Existe uma regio no DNA do SV40 com um palndroma, que onde se inicia a replicao. este local
onde se inicia a replicao porque necessria uma regio de DNA com cadeia simples, que se forma
nessa regio devido ao estabelecimento de complementaridade de bases entre o palndroma.





Expresso tardia:
mais abundante (mais DNA);
Consiste, essencialmente, na produo de protenas do capsdeo.
Infeo de clulas no permissivas
O SV40 bloqueia o p53 o que poderia, eventualmente, provocar o desenvolvimento de tumores. Isto no
se verifica porque a replicao do genoma viral leva destruio da clula hospedeira, impedindo que
esta se replique indefinidamente, podendo desenvolver cancro.
Contudo quando o vrus infecta uma clula no permissiva no ocorre diviso celular mas h transcrio
dos genes early (anteriores replicao), que incluem o antignio T. O antignio T bloquear a p53 mas,
nesta caso, como no h produo de novas partculas virais, que provocariam a destruio da clula
hospedeira, esta continua em diviso celular, podendo desenvolver um tumor.
No caso de infeo de uma clula no permissiva, o genoma viral pode permanecer na sua forma
epissomal no ncleo, acabando por desaparecer com as divises celulares e a clula volta ao seu estado
normal, ou, eventualmente, e de forma aleatria, poder integrar de forma estvel no genoma da
clula, sendo transmitido descendncia.
Ver imagem, slide 23, T2.1
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Em 72 horas consegue obter-se
entre 10 000 a 100 000
partculas virais/clula.
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10.3.2 Human papiloma vrus HPV (Papilomaviridae)
Genoma dsDNA pequeno; HPV-16 contm um genoma circula de 7Kbp.
Assim como o SV40 no possui DNA polimerase, o que significa que tambm bloqueia o p53 e o
Rb para a clula hospedeira entrar na fase S.
Contrariamente ao poliomavrus, papilomavrus codifica todas as suas protenas a partir de uma nica
cadeia de DNA. Os pormenores relativos expresso do mRNA dependem do papilomavrus em causa.
HPV-16 possui apenas um promotor conhecido, que parece controlar a expresso tante dos
transcritos early como dos late.




Os genes E6 e E7, so classificados como oncogenes
devido sua capacidade de induzir a transformao
maligna das clulas infetadas. O E6 e E7 codificam
oncoprotenas que tm como alvo as protenas Rb e p53
respetivamente, que so protenas codificadas por genes
supressores tumorais.
Rb (gene do retinoblastoma) impede a clula de prosseguir a diviso celular, ao bloquear o
factor de transcrio E2F.
p53 tem o mesmo efeito ao aumentar a expresso de p21, alm de tambm desencadear a
apoptose em casos de dano extenso do DNA.
Basicamente, os genes E6 e E7 induzem a diviso celular e evitam a apoptose, assim como o
Antignio T no paliomavrus.

O HPV infecta apenas clulas do epitlio basal estratificado, inserindo o seu DNA no ncleo de forma a
haver replicao do genoma viral medida que h diviso das clulas epiteliais. Nesta fase so
expressos os apenas os genes early.
Quando uma das clulas migra para longe da membrana basal e atinge um maior estado de
diferenciao para produzir queratina, estabelece-se o sinal para a expresso dos genes late,
codificando as protenas L1 e L2 responsveis pela sntese da cpside para criao de novos vrus.





E6 e E7 transformam protenas;
E1 e E2 reguladores da transcrio e replicao
viral;
E4 e E5 fatores late;
L1 e L2 protenas estruturais virais.

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Integrao no genoma
A integrao do DNA de HPV resulta em elevados nveis de expresso de E6 e E7.
Em pequenas leses, o genoma viral permanece no ncleo na sua forma epissomal, estando associado a
baixos nveis de expresso de E6 e E7. Contudo, quando h integrao no genoma da clula hospedeira,
que ocorre em caso de cancro, geralmente est associado com a deleo de pores do genoma viral,
com reteno preferencial da regio LCR (long control region) - E6 - E7 e elevados nveis de expresso de
E6 e E7.





EM RESUMO: SLIDE 31, T2.1








10.4 Genomas classe I de dsDNA de tamanho mdio - Adenovrus
Capsdeo icosadrico; sem envelope.
Provoca doenas respiratrias;
Necessidade de estimular e utilizar muitas funes celulares, nomeadamente promover a
diviso celular para haver DNA polimerase;
Capacidade de transformar as clulas atravs de infeo abortiva;
Interao com p53 e Rb.
Os grupos A e B de adenovrus humanos podem ser oncognicos em ratinhos; os serotipos 2 e 5 do
grupo C so utilizados como vetores virais.
A sua cpside constituda por 3 protenas principais. (Ver resumo de TGC, pgina 12)
Hexo: aglomerados de protenas; ligam-se a 6 protenas sua volta e tm uma regio mais
varivel. com base nesta regio varivel que o vrus consegue escapar ao sistema imunitrio.
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Na extremidade da fibra encontra-se o antirecetor do adenovrus, que se vai ligar a recetores
CAR na superfcie de clulas, para permitir a entrada do vrus.
Genoma
dsDNA linear com, aproximadamente, 36 Kbp;
100bp de ITR (inverted terminal repeats) em cada extremidade;
Sinal de empacotamento psi.
Ambas as cadeias de DNA codificam; uso de splicing alternativo com bastante frequncia;
o Existem muito mais ORFs e, por isso, existe uma interao muito mais completa.
Expresso do genoma




Protenas E1A e E1B so semelhantes em funo ao antignio T grande do SV40. O E1A e E1B em
conjunto vo levar a clula hospedeira a entrar em fase S do ciclo celular.
E1A bloqueia a atividade supressora de crescimento do Rb e regula a transcrio do E2, E3 e
E4.
o E2- componentes da DNA polimerase.
o E3 funes imunossupressoras; lise celular
o E4 - inibe o transporte de transcritos celulares para citoplasma; promove o transporte
de transcritos virais tardios.
o Protenas codificadas pelas regies E2 e E4 so necessrias para a transcrio de genes
tardios.
E1B - inibe a apoptose, interagindo com o p53.
L: transcritos tardios; protenas estruturais, essencialmente do capsdeo.
Regio L3: hexo;
Regio L5: fibra;
Regio L2: pento.

Entrada na clula e desencapsulamento

Este vrus s infecta
clulas com o recetor
CAR superfcie.



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Replicao do Genoma
A replicao do DNA em adenovrus realiza-se pelo modelo strand displacement
Neste tipo de replicao no se
utiliza um primer para a iniciao
da replicao, mas sim uma
protena que se liga na
extremidade do DNA, mas no
ocupa nenhum nucletido da
cadeia molde. Desta forma, a
replicao completa e no
necessrio voltar ao lugar
ocupado pelo primer para
completar a cadeia.
DBP: protenas que se ligam ao
DNA de cadeia simples.

Adenovrus induz lise celular
Adenovrus replica-se no ncleo e induz a morte celular por lise. Uma lise celular e eficiente do
adenovrus a partir da clula infetada requere uma protena designada de ADP Adenovirus Death
Protein. O gene desta protena est localizado na regio de transcrio early E3, mas o gene expresso
primeiramente apenas numa fase mais tardia da infeo.
Desta forma, uma overexpression da protena ADP (E3-11.6KDa) aumenta a lise celular e a
disperso de adenovrus.
Obtm-se 10 000 viries aps 24-36 horas da infeo.
EM RESUMO: SLIDE 10, T3
VA RNAs 160 nucletidos, altamente
estruturado, ricos em G-C.
Saturam o PKR e DICER, impedindo que
o sistema imunitrio reconhea o
genoma do adenovrus e o destrua,
atravs do DICER.
O nmero de molculas por clula
aproxima-se do dos ribossomas (10^8).
VA RNAs bloqueiam os mecanismos do
Interfero e do siRNA.

Adenovrus como Vetor Viral
Expresso transitria: dia, semana;
Clulas alvo limitadas s que possuem recetores CAR; existem ainda certas clulas que mesmo
com o recetor CAR o adenovrus no consegue infectar;
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Infetam clulas quiescentes, u seja, que no esto em replicao;
Elevados ttulos.
Subgrupo C, serotipo 5 ou 2 (no tm atividade oncolgica).
Pontos essenciais para construir o vetor:
Impedir capacidade de replicao;
Possuir espao para a insero do transgene no genoma viral.
o Tamanho do genoma total tem de ser > 75% e <105% wt.
o O genoma para encapsidar com sucesso tem de possuir >75% e <105% do seu
genoma.
Primeira Gerao de Vetores Adenovirais:
1. Deleo do E1 no h transcrio da regio correspondente a E1; o transcrito do E1 crucial
para a entrada da clula em fase S e haver produo de DNA polimerase. Desta forma, a
deleo do E1 torna o vrus no competente para replicao.

2. Deleo adicional de genes no-essenciais (E3) - permite o ganho de espao adicional no
genoma (E1 +E3 7,4 Kbp).
a. O E3 considerado no essencial, contudo importante para a evaso ao sistema
imunitrio, por isso, numa segunda gerao de produo deste vector, optou-se por
manter em parte o E3.
Clulas de E.coli so permissivas para a transfeco e recombinao homloga.
Clulas HEK-293 expresso o E1 recombinante de adenovrus, permitindo que, aps a introduo do
vetor com o gene de interesse, haja produo de novos adenovrus a partir do vetor introduzido sem o
gene E1.
Adenovrus recombinantes levam tipicamente entre 14-20 dias a formarem-se.
Problemas com a primeira gerao de vetores:
A primeira gerao de vetores de adenovrus possui duas grandes desvantagens que limitam,
significativamente, a sua utilidade.
1. Apesar da deleo do E1, continua a haver expresso de baixos nveis de genes virais nas
clulas transfetadas. A expresso destes genes provoca toxicidade direta e induz uma resposta
imunitria anti-viral. Esta resposta imunitria, frequentemente, leva ao clearance das clulas
transfetadas, resultando numa pequena durao da expresso do transgene.

2. Recombinao homloga entre vetores de primeira gerao e a linha de clulas complementar
cria um problema recorrente relativo produo de um adenovrus competente, com
capacidade de se replicar (RCA: replication-competent adenovirus).
Desta forma, tornou-se importante criar uma segunda gerao de vetores, que foi produzida
introduzindo mais delees nos genes virais, de forma a serem mais seguros.
Terceira Gerao de Vetores Adenovirais: Vetor contm apenas as sequncias de ITR e o sinal de
empacotamento; todas as outras funes so fornecidas em trans por um plasmdeo helper.
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Sistema Cre/LoxP:
LoxP site: 34 bp especficos, sendo que a
sequncia central, onde a recombinao toma
lugar, consiste em 8 bp, e flanqueada dos dois
lados por 13 bp repeties invertidas.
Cre recombinase: enzima que cataliza a
recombinao entre os dois locais de LoxP.








O resultado da recombinao Cre-lox determinado pela orientao e localizao dos flanqueadores
LoxP.
(A) Se os locais de LoxP estiverem orientados em direes opostas, a Cre recombinase promove
uma inverso do fragmento flanqueado.
(B) Se os locais de LoxP estiverem localizados em diferentes cromossomas, a Cre recombinase
promove uma translocao cromossmica.
(C) Se os locais de LoxP estiverem orientados na mesma direo, num mesmo cromossoma, a Cre
recombinase medeia uma deleo do fragmento flanqueado.
Slide 24, T3: Utilizao do sistema Cre/LoxP na produo de partculas virais sem capacidade de
replicao.
Nas clulas HEK-293 coloca-se o adenovrus com o gene de interesse (plasmdeo cis) e um outro
vetor (plasmdeo trans) com todos os genes virais necessrios replicao. Como no se quer
que o plasmdeo trans saia da fbrica viral, opta-se por flanquear o sinal de empacotamento
deste vetor pelas sequncias de LoxP que, aps a adio de Cre recombinase (ou expresso
caso a clula possua o seu gene), eliminado. Assim assegura-se que o plasmdeo trans no sai
da clula viral.
Relativamente possvel recombinao com o gene E1 presente nas clulas HEK-293, assegura-se que
no ocorre criando um vetor <105% do genoma do adenovrus, mas que se houver recombinao ir
exceder esta percentagem. Ao exceder este valor torna-se impossvel o seu empacotar, logo no h
formao de partculas virais recombinadas com capacidade de replicao.
Caso existam ainda alguns vetores que tenham sofrido recombinao e tenham conseguido empacotar,
existe ainda outro ponto de controlo que consiste na medio da densidade dos vetores. Os vetores
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recombinados possuem uma poro de genoma a mais que os vetores que possuem apenas o transgene
sendo, portanto, mas pesados/densos. Para fazer esta medio da densidade recorre-se a cloreto de
csio.
10.5 Genomas classe I de dsDNA de tamanho grande Vrus Herpes
Genoma: dsDNA linear com 120-240 nm de dimetro.
Trs estruturas: capsdeo icosadrico, tegumento e envelope.
50 250 genes, 80 Kbp 400 Kbp.
Pode assumir vrias formas pleomrfico.
O DNA est alojado no capsdeo, que rodeado pelo tegumento. O tegumento contm pelo menos 15
espcies de protena e algumas molculas de mRNA do vrus. O envelope contm um grande nmero de
glicoprotenas (pelo menos 12 espcies).
As protenas mais abundantes na cpside e no tegumento so VP5 e VP16 (-TIF),
respetivamente.
A cpside constituda por 162 capsmeros.
VP16 (-TIF): crucial para a ativao da transcrio dos genes
Os vrus herpes depois de terem infetado um hospedeiro mantm-se, frequentemente, como infees
persistentes para toda a vida do hospedeiro. Estas infees so frequentemente infees latentes que
podem ser reativadas de tempos a tempos, especialmente se o hospedeiro se tornar
imunocomprometido.
Vrus Herpes Humanos:
Neurotrpicos (infetam clulas neuronais): Herpes simplex virus 1 (HSV1), HSV2,
Varicela*/Zoster (VZV).
Linfotrpicos: Human cytomegalovirus (HCMV), Epstein-Barr virus (EBV), Kaposi sarcoma
(KSHV).
Potencialmente carcinognicos: Epstein-Barr virus (EBV), Kaposi sarcoma (KSHV).
Estratgia dos herpesviridae:
Infeo primria suave rapidamente resolvida;
Hospedeiro imune a re-infees;
O vrus no eliminado na totalidade, persistindo genomas virais no replicantes em algumas
clulas - latncia. O vrus fica na fase de latncia, geralmente, no nervo trigmio e no
detetado.
Stress imunitrio desencadeia passagem fase produtiva temporria com infeo de outras
clulas hospedeiros nova manifestao.
10.5.1 Vrus Herpes Simplex 1 e 2 (HSV-1 e 2)
Estes vrus inicialmente infetam clulas epiteliais da mucosa oral ou genital, da pele ou da crnea. O
vrus pode entrar nos terminais pr-sinpticos dos neurnios e ser transportado para o ncleo, onde se
pode estabelecer infees latentes (nervo trigmio).
HSV-1, geralmente, infeta atravs dos lbios ou do nariz, entre os 6 e 18 meses. A infeo
latente pode ser reativada em situaes de stress ou de imunodeficincia.
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HSV-2 o agente causador, habitualmente, de herpes genital, que uma doena sexualmente
transmissvel.
Geralmente as infees por HSV-1 so predominantes porque grande parte das pessoas so infetadas
em criana por HSV-1, conferindo de imediato imunidade a infees por outros herpes, como o HSV-2
que provoca herpes genital e ao qual, geralmente, estamos expostos mais tarde. Contudo o herpes
genital no to comum porque j possumos imunidade para o herpes, adquirida pela infeo com
HSV-1.
Genoma:
O genoma constitudo por duas sequncias nicas de tamanhos diferentes e flanqueadas por
sequncias de repetio.
Sequncia maior designada de U
L;

Sequncia menor designada de U
S
.
O genoma do HSV-1 codifica pelo menos 74 protenas, e alguns RNAs que no so traduzidos. Ambas as
cadeias de DNA so utilizadas para a codificao.
Possui 84 ORFS que codificam para genes essenciais, para a replicao numa clula permissiva, e genes
no essenciais/acessrios, que tm funes relacionadas com a interao do vrus com a clula
hospedeira e fase de latncia.
Entrada, Trancrio/Traduo, Replicao e Sada do HSV-1
1. Pelo menos cinco das espcies de glicoprotena do envelope esto envolvidas no processo de entrada
na clula hospedeira. A nucleocpside e as protenas do tegumento so libertadas no citoplasmada
clula hospedeira e o nucleocapsdeo transportado para o ncleo, onde a replicao do vrus tem
lugar.
O DNA do vrus libertado no ncleo, onde a molcula linear convertido numa molcula
circular, e associado com histonas.
As protenas do tegumento possuem uma variedade de funes que incluem a regulao do DNA da
clula hospedeira, RNA e sntese proteica.
Vhs protena do tegumento que degrada mRNA.
VP16 protena major do tegumento; est envolvida na ativao de genes virais;
transportada para o ncleo, onde se associa com o genoma viral.
2. Transcrio e Traduo: os genes do vrus herpes so expressos em trs fases: immediate early (IE ou
), early (E ou ) e late (L ou ).
Os genes IE so ativados pela VP16. Posteriormente, a VP16, atua como um fator de transcrio para
recrutar a RNA polimerase II do hospedeiro e os componentes de iniciao associados a cada gene IE.
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Existem cinco protenas IE e todas elas so fatores de transcrio com funo de ativar os genes E e L e
ainda down-regulate a expresso de alguns destes genes.
Algumas das protenas E
tm papis na replicao do DNA do
vrus.
A maioria das protenas L
so as protenas estruturais do vrus.







3. Replicao do genoma do vrus: realizada por protenas E.
No local ori liga-se um complexo de trs protenas, que agem como uma helicase, que desenrola a hlice
dupla para formar um garfo de replicao. Numa das cadeias o complexo das mesmas trs protenas,
que funciona agora como uma primase, sintetiza uma pequena sequncia de RNA complementar ao
DNA, que ir funcionar como primer para a DNA polimerase comear a sintetizar a cadeia principal de
DNA. Na outra cadeia de DNA (atrasada/lagging) as primases sintetizam pequenos RNAs, que so os
primers para a sntese dos vrios fragmentos de Okazaki.
Pensa-se que o DNA circular primeiramente amplificado por replicao (teta), e que depois o modo
de replicao muda para (sigma), tambm conhecido como crculo rolante/rolling circle.
A replicao por circulo rolante o modo predominante para a replicao do DNA do vrus
herpes, sendo os produtos molculas de DNA longas conhecidas como concatameros (cada um
dos quais consiste de mltiplas cpias do genoma do vrus).

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4. Encapsulamento e Sada da clula hospedeira
A pr-cpside mais arredondada do que
um capsdeo maduro e sua integridade
estrutural mantida pela incorporao de
protenas scaffolds.
Antes ou mesmo durante o encapsulamento do DNA
as protenas scaffolds so removidos por uma
protease codificada pelo vrus. Cada pr-cpside
adquire um genoma de DNA, que cortado a partir
de um concatamero (que possui vrias cpias do
genoma do vrus herpes).
Aps a construo da nucleocpside, ainda necessrio adquirir o tegumento e o envelope, para que o
vrus possa ser libertado da clula hospedeira. Pensa-se que a sequncia de eventos seja a seguinte:
1. Budding atravs da membrana interna nuclear, dando ao nucleocapsdeo um envelope
temporrio;
2. Fuso do envelope temporrio com a membrana externa nuclear, liberando o nucleocapsdeo
no citoplasma;
3. Aquisio de VP16 e outros componentes do tegumento;
4. Aquisio do envelope do virio por budding para dentro de uma vescula derivada do
complexo de Golgi;
5. Fuso da membrana da vescula com a membrana plasmtica, libertando o virio da clula.

Ciclo de Replicao do HSV-1
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Fase de Latncia:
No so necessrias nenhumas protenas virais para manter o estado de latncia em clulas que no se
dividem. Contudo, so sintetizados RNAs virais conhecidos como LATs (latency-associated transcripts).
Os LATs sofrem splicing e, pelo menos um deles, tem um papel na inibio morte celular da clula
hospedeira, assegurando a sobrevivncia do neurnio com a infeo por HSV-1 em fase de latncia.







O estado de latncia do HSV-1 estabelece-se no ncleo de neurnios. As partculas virais so
transportadas, desde o local da infeo, at ao ncleo destes neurnios, por transporte retrgado.
Pensa-se que a entrada em fase de latncia nestas clulas deve-se perda da protena do tegumento
VP16, crucial para a iniciao da transcrio dos genes immediate early.
Na fase de latncia apenas o promotor LAT funciona, mantendo a latncia do vrus. Contudo, pensa-se
que seja importante tambm para re-ativao do vrus, visto que, vrus sem este promotor no sofrem
re-ativao.
Slide 16, T5: O genoma viral pode persistir como uma molcula epissomal no estado de latncia, dentro
do neurnio.
Nota: algumas partculas virais podem continuar seu transporte at neurnios do SNC, onde podem ter
efeitos malignos como provocar encefalites.
EM RESUMO: SLIDE 14, T5
A clula hospedeira, com a acumulao
das partculas viras acaba por sofrer
lise celular, permitindo a libertao de
todos os vrus produzidos nessa clula.
Este vrus apresenta fenmenos de
integrao do genoma.
Nota: existem vrus que produzem primeiro a
pr-cpside vazia e depois o genoma
introduzido l dentro vrus de dsDNA e
outros nos quais a pr-cpside construda
diretamente em torno do genoma vrus de
ssDNA.
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Vrus herpes simples como vetor:
Infeo natural benigna de neurnios; pode ser direcionar para doenas do sistema nervoso
perifrico; vasta gama de clulas alvo;
o Clulas que no se dividem podem ser eficientemente transfetadas e expressor o
transgene.
Altamente infecioso ( = Eficincia de transfeco alta; );
Grande nmero de genes no essenciais, que podem ser eliminados, criando mais espao que
poder ser, eventualmente, ocupado por genes de interesse;
Persistncia ao longo da vida como episoma;
O comportamento latente do vrus pode ser explorado para obter expresso estvel a longo
prazo de transgenes teraputicos em neurnios.
A cascata de expresso gnica abortiva resulta de uma estado similar ao de latncia, mas o
vrus no consegue sofrer reativao. Isto permite que a expresso do gene seja crnica em
clulas neuronais e no neuronais.
Slide 20, T5: Estratgias para usar o genoma do HSV-1 como um vetor de terapia gnica no
patognico.
10.6 Genomas classe I de dsDNA de tamanho grande Baculovrus
dsDNA, circular; codifica 90 a 180 genes;
Genomas grandes: 110-170 Kbp;
Nucleocapsdeo em forma de basto;
Envelope;
Replicao nuclear;
Lepidopteran Nucleopolyhedrovirus (NPVs);
NPVs lepidpteros tm diversas aplicaes biotecnolgicas.
Ver slide 32, T5
Para alm do envelope de bicamada lipdica, estes vrus so envolvidos por uma matriz proteica,
formando um corpo de ocluso OB (occlusion body), que uma estrutura que confere estabilidade
fsica e biolgica s partculas virais.
Quando a matriz protica dos OB formada por poliedrina, estes so denominados poliedros,
quando por granulina, grnulos.
Os baculovrus podem apresentar duas diferentes morfologias:
Morfologia de um vrus que sofreu budding (BV-Budding virions) disseminao sistemtica;
Vrus que sofreram ocluso (ODV -Occlusion derived virions) e que esto envolvidos por corpos
de ocluso (OB)(OBs = PIBs polyhedrail inclusion bodies) Transmisso horizontal (entre
insetos hosedeiros).
Os Baculovrus, membros da famlia Baculoviridae, so vrus que infetam artrpodes, maioritariamente
insetos da ordem Lepidoptera, que so uma ordem de insetos muito diversificada que inclui as
borboletas e as traas.
Por causarem infeo letal nestes animais, tais vrus so aplicados como agentes de controlo
biolgico de insetos pragas da agricultura.
Por meio de tcnicas de engenharia gentica, os baculovrus tambm so utilizados como
vetores de expresso de protenas heterlogas, e em terapia gnica.
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Vantagens da utilizao do Baculovrus como Pesticida: Slide 25, T5
No txico, no causa danos aos seres humanos, aos animais e ao meio ambiente;
Mata somente a lagarta da soja, mantendo o equilbrio da lavoura;
Pode ser aplicado em fertilizantes foliares, herbicidas, inseticidas e fungicidas;
Reduz as aplicaes de inseticidas qumicos;
Proporciona economia de at 50% em relao ao controlo qumico;
No preciso aguardar para fazer a reentrada na lavoura.
Ciclo de infeo do baculovrus:
O ciclo de infeo do baculovrus envolve duas formas distintas do vrus:
ODV, responsvel pela infeo primria do hospedeiro;
BVs, que so libertados pelas clulas hospedeiras mais tarde, na infeo secundria.
Tipicamente, a infeo inicial ocorre quando um inseto hospedeiro suscetvel se alimenta de plantas que
esto contaminados com a forma do vrus ocludo (ODV). Aps a ingesto, os viries (ODVs) so
liberados, mediante a dissoluo dos corpos de ocluso nas condies alcalinas (pH>7,5) e sob ao de
protases do tubo digestivo do inseto
Quando em contato com as microvilosidades intestinais, os nucleocapsdeos invadem as clulas
epiteliais, onde se multiplicam no ncleo da clula sem produzirem corpos de ocluso, formando BV e
caracterizando a infeo primria. Os vrus extracelulares (BV), quando alcanam a hemolinfa da larva
hospedeira, podem gerar uma infeo sistmica. A partir deste momento h produo de grandes
quantidades de nucleocapsdeos e posterior formao dos corpos de ocluso no ncleo das clulas dos
tecidos suscetveis da lagarta, caracterizando a infeo secundria. Posteriormente, h morte da larva
com libertao dos Corpos de Ocluso (OBs).
Os insetos mortos so importantes fontes de inculos virais para infees seguintes.
As membranas dos OBs muito resistente, permitindo-lhes resistir s condies ambientais.
Fase early - 6 Horas;
Fase late - 12 a 20 Horas (BV);
Fase Very Late Mais de 20 Horas (OB lise celular).
AcMNPV
2
como vetor viral:
Objetivos: expresso do transgene em clulas de mamferos ou produo de uma protena eucaritica
(por exemplo, vacinas, interfero, etc.).
sf9 (Spodoptera frugiperda), ou clulas equivalentes de inseto para a expresso de protena;
BV-based; poliedrina no essencial; Transgenes para ser inseridos sob o promotor polh forte;
No se replicar em clulas de mamferos;
Diversos tipos de clulas de mamferos captam e transduzem BVs com uma eficincia variada;
GP64 essencial; recetor celular desconhecido.
Slide 34, T5

2
Baculorvrus mais estudado Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus (AcMNPV)
Comentrio [J1]: No percebo!!
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Classe II ssDNA
10.7 Genomas classe II de ssDNA - Parvoviridae
A famlia Parvoviridae infeta clulas animais. Esta famlia tambm importante porque utilizada para
o combate de antropodes.
ssDNA linear, sendo umas cadeias de sentido positivo e outras de sentido negativo;
Genomas muito pequenos de 4-6 Kb;
Capsdeo icosadrico constitudo por 60
protenas, sem envelope;
Replicao nuclear;
Grande dependncia de fatores celulares
ou de outros vrus.
Parvovrus esto entre os vrus mais pequenos conhecidos, com viries entre 18-26 nm de dimetro. A
subfamilia Parvovirinae inclui o gnero Dependovirus, cujos membros so defeituosos, normalmente
replicam-se apenas quando a clula co-infetada com um vrus auxiliar. Outros parvovrus que no
requerem vrus auxiliares so conhecidos como parvovrus autnomos.
Genoma do Parvovrus:
Em cada extremidade de uma molcula de ADN, h uma srie de curtas sequncias complementares,
que podem sofre complementaridade e formar uma estrutura secundria. Alguns genomas parvovrus
tm sequncias nas suas extremidades, conhecidos como repeties terminais invertidas (ITRs), em que
a sequncia de uma das extremidades complementar e na orientao oposta, sequncia na outra
extremidade. Outros Parvovrus tm uma sequncia nica, e, por conseguinte, uma estrutura nica,
secundria diferente para cada extremidade do ADN.
Estas regies de complementaridade so muito importantes para o incio da replicao.

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O genoma de um parvovrus codifica poucas protenas, devido sua pequena dimenso. Desta forma, o
vrus depende da sua clula hospedeira (ou outro vrus) para fornecer protenas importantes, tais como
DNA polimerase e outras protenas envolvidas na replicao do ADN, e que esto disponveis apenas
durante a fase S do ciclo celular, quando h sntese de DNA.
Isto restringe a possibilidade de replicao parvovrus para a fase S, nica fase onde a clula
hospedeira tem as protenas necessrias para a replicao do parvovrus.
Entrada no ncleo, transcrio/traduo e replicao do Parvovrus:
1. Com um dimetro de 18-26 nm, o parvovrus suficientemente pequeno
para passar atravs de um poro nuclear. No ncleo o genoma do vrus de
cadeia simples convertida para dsDNA por uma DNA polimerase da clula.
As extremidades do genoma so de cadeia dupla como resultado do
emparelhamento de bases, e na extremidade 3 o grupo -OH
funciona como um primer ao qual a enzima se liga.
2. Aps a converso para dsDNA, a RNA polimerase da clula produz o(s)
transcrito(s) primrio(s), que so submetidos a vrios eventos de splicing
para a produo de duas classes de mRNAs com tamanhos diferentes.
Os mRNAs maiores codificam as protenas no estruturais,
enquanto os mRNAs menores codificam as protenas estruturais.
As protenas no estruturais so fosforiladas e desempenham um papel no controlo da
expresso gentica e na replicao do ADN.
3. Posteriormente o DNA replicado por um mecanismo conhecido como rolling-hairpin replication.
Slide 10, T4
As pr-cpsides so construdas a partir das protenas estruturais e cada uma preenchida por uma
cpia do genoma do vrus, de DNA (+) ou um DNA (-). Uma das funes das protenas no estruturais
como a helicase desenrolar o dsDNA de modo a que apenas uma cadeia de DNA entre na pr-cpside.







Ciclo de replicao do Parvovrus
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Estrutura do genoma do AAV2:
Rep 78 e 68 integrao no genoma;
Rep 52, 40 e VP1 encapsidao;
Vp2 e Vp3 formao do capsdeo.





Replicao de um Dependovrus:
Quando uma clula co-infetada com um dependovrus e um vrus helper apropriado existe uma
infeo produtiva, com ambos os vrus.
Na natureza, mais comum um dependovrus infetar uma clula na ausncia de um vrus helper, caso
em que o genoma do vrus, depois de ter sido convertido para dsDNA, permanece em latncia espera
de um vrus helper ou da entrada da clula na fase S. Nestes casos, o vrus pode sofre integrao num
cromossoma da clula (raro) ou permanece na forma epissomal.
A integrao ocorre como resultado de recombinao entre a clula e o DNA viral, resultando
numa infeo latente. Em clulas humanas, o vrus de DNA integrado especificamente no
cromossoma 19.
10.7.1 AAV Vrus Adeno-Associado
O AAV pertence famlia Parvoviridae e um dependovrus.
ITRs: origens de replicao;
p5, p19 e p40 so os trs promotores.
Existem duas classes de mRNAs funcionais:
Classe de mRNAs maiores: quatro primeiros que
codificam para as protenas rep (replicao) Rep
78, 68, 52 e 40;
Classe de mRNAs menores: dois ultimos que
codificam para as proteinas cap (capsdeo) VP1, 2
e 3.

Estes vrus, assim como muitos outros, no codificam para protenas necessrias sua replicao, como
a DNA polimerase, por isso, utilizam as protenas da clula hospedeira. Contudo, vrus da famlia
Parvoviridae, no conseguem induzir a fase S nas clulas hospedeiras, nica fase onde existe DNA
polimerase disponvel. Desta forma, como estes vrus requerem a fase S celular mas no a conseguem
induzir, tm duas hipteses: (slide 13, T4)
Necessitam de um vrus helper que induza a fase S nas clulas por eles, e nesta caso so
designados de dependovrus; exemplo: AAV.
Ou infetam clulas que estejam em diviso celular (de indivduos jovens), designando-se,
nestes casos, de autnomos.

Infeo por Parvovrus:
Entra no ncleo: ssDNA dsDNA Transcrio Traduo:
1. Protenas estruturais Cpside
2. Protenas no estruturais Replicao do genoma
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EM RESUMO: SLIDE 11, T4









Caractersticas dos vetores de Vrus Adeno-Associados:
Vrus parental no patognico; AAVs so frequentemente encontrados em seres humanos;
integrao?
Vrus pequenos bem definidos;
No provocam processos inflamatrios;
Longa persistncia e com expresso gnica de longo prazo;
Capacidade limitada de DNA ~ 4,5 Kbp;
Incompetncia de replicao.
As clulas HEK-293 funcionam como fbrica viral e possuem o gene para E1.
Num vetor viral a partir de AAV crucial manter as extremidades ITRs.
Cada clula infetada com AAV ir produzir um grande nmero de partculas virais, o que constitui uma
vantagem quando o vrus est a ser utilizado para terapia com vetores virais.
O processo clssico para a purificao dos vetores virais a centrifugao seguida de separao por
densidade com Cloreto de Csio.
Os Baculovrus, vrus que s infetam antropodes, so muitas vezes utilizados como vrus helper,
utilizando clulas de antropodes como fbricas virais que possam ser infetadas por estes vrus.
11. Vrus de RNA e retrotranscrio
RNA world: teoria que defende que os organismos de RNA so antecedentes aos de DNA, que so
percursores da vida atual.
Os retrovrus so vrus de RNA que copiam os seus genomas para DNA durante a sua replicao. Estes
vrus contm duas cpias do genoma de RNA semelhantes e lineraes, e, desta forma,os retrovrus
podem ser descritos como diplides. As duas molculas esto presentes como um dmero, formado por
emparelhamento de bases entre sequncias complementares.
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Organizao genmica de um retrovrus simples
Para alm do genoma de RNA do vrus, este contm molcula de RNA de clulas hospedeiras, que
incluem uma molcula de RNA de transferncia (tRNA), ligado a cada cpia de RNA do vrus,numa
sequncia conhecida como primer binding site (PBS).
A protena mais abundante a protena da nucleocpside (NC), que reveste o RNA.
O gene pol codifica para vrias enzimas importantes para o ciclo viral do retrovrus:
A transcripatase reversa, enzima que produz uma
cadeia de DNA a partir de uma de RNA, uma DNA
polimerase dependente de RNA.
Esta enzima, apesar de utilizar RNA para produzir
uma cadeia de DNA, no esquseita e consegue
utilizar como molde tambm uma cadeia de DNA.
Ribozimas so molculas de RNA com capacidade enzimtica.
Estas enzimas so obtidas pelo corte da protena, resultante da traduo do gene pol, em
vrios fragmentos.
Associado com o envelope dos vrus existem duas protenas: uma protena transmembranar (TM) ligada
a uma superfcie de uma proteina altamente glicosilada (SU). Na maioria dos retrovrus as ligaes entre
as protenas TM e SU no so covalente.
Os genes que codificam as protenas virais esto organizadas em trs grandes regies do genoma:
gag (grupo antgeno especfico) protenas internas estruturais;
pol (polimerase) enzimas;
env (envelope) - protenas do envelope.

Retrotransposes e Retrovrus (slide 4, T6)
Os retrotransposes funcionam como os transposes a nica diferena que em vez de serem de DNA
so de RNA (retro); saltam entre diferentes regies do genoma da clula.
Verifica-se que existem semelhanas entre a sequncia de RNA dos retrotransposes e a dos retrovrus,
contudo a transmisso destas sequncias de RNA diferentes:
Os retrotransposes no so transmitidos de forma horizontal, so apenas na forma vertical
(para a descendncia);
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Contrariamente o RNA de retrovrus tem capacidade de transmisso horizontal porque possui
genes que lhes permitem encapsidar e transformar num vrus capacitado, com capacidade de
sair a clula e infetar outras.
11.1 Vrus que usam Trancritase Reversa - Classes VI and VII
Diverse kinds of genomes < 10 Kb:
1. Hepadnaviridae ssDNA circular 3 Kb vertebrados;
2. Caulimoviridae dsDNA circular 8 Kb plantas;
3. Pseudoviridae ssRNA linear 5-8 Kb leveduras e plantas;
4. Metaviridae ssRNA linear 4-10Kb fungos e invertebrados;
5. Retroviridae ssRNA dmero 7-10 Kb vertebrados.
Os vrus de RNA tm genomas relativamente pequenos porque a transcriptase reversa no tem
capacidade para corrigir erros.
11.1.1 Retroviridae classe VI
Os retrovrus podem ser classificados como simples ou complexos, dependendo da complexidade de
seus genomas.Existem retrovrus simples, com os 3 genes gag, pol e env convencionais, e retrovrus mais
complexos.
Retrovrus simples: Alfa-retrovrus, Beta-retrovrus e Gama-retrovrus.
o Alfa-retrovrus: 60-100 nm.
Alguns retrovrus simples possuem um gene adicional, chamado de oncogene viral, porque a
sua expresso pode resultar no desenvolvimento de um tumor na clula hospedeira.

Retrovrus complexo: Lentivrus (HIV) - 120 nm
o O capsdeo comea por se icosadrico mas, mais tarde, aps a maturao, adquire
forma de cone.
Os retrovrus complexos (slide 26, T6) resultam de varios padres de splicing possiveis que
originam uma vasta variedade de diferentes protenas produzidas. Possuem genes adicionais
que levam a produtos que tm uma variedade de funes no ciclo de replicao.
1. Ligao e entrada na clula hospedeira. O vrus liga-se a recetores celulares, atravs do local de
ligao do vrus, que est localizada na protena SU. Esta interao provoca uma mudana
conformacional na protena TM que permite que uma sequncia hidrofbica de fuso seja exposta
permitindo a fuso da membrana do vrus com a membrana celular. A estrutura que libertada para o
citoplasma perde algumas protenas e o complexo de transcrio reversa formado.
2. Transcrio reversa. Sntese de ambas as cadeis da DNA, positiva e negativa, inicia-se com um primer
de RNA a 3-OH. O primer para a sntese do DNA (-) o tRNA ligado ao genoma, ao passo que o primer
para a sntese do DNA (+) um PPT (PPT = Polipurine = A + G), no genoma do vrus. Este ltimo torna-se
acessvel, como resultado da hidrlise do genoma de RNA a partir da extremidade 3, pela RNase H, uma
enzima que digere o RNA na forma de um hibrido RNA-DNA.
O DNA que resulta da transcrio reversa provrus - maior do que o genoma do RNA. Cada uma das
regies terminais tem a sequncia U3-R-U5, conhecida como uma long repeat terminal (LTR).
3. Integrao do provrus. O provrus (de dsDNA), ainda associado com algumas protenas do virio,
transportado para o ncleo como um complexo de pr-integrao.
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A maioria dos retrovrus s consegue entrar no ncleo de clulas
em mitose, porque neste momento a membrana nuclear
encontra-se destabilizada, permitindo a entrada do complexo de
pr-integrao no ncleo. Isto significa que pode haver uma
infeo produtiva apenas em clulas em diviso.
HIV e vrus relacionados (lentivrus), no entanto, podem infetar
produtivamente clulas sem estarem em mitose, porque os
complexos de pr-integrao destes vrus so capazes de entrar
no ncleo intactos.
Uma das protenas do vrus que ainda est associado com o pr-vrus a
integrase, esta enzima corta o DNA da clula num local especifico e insere
o provrus nessa regio. Os genes do provrus integrado podem ser
expressos imediatamente, ou pode haver pouca ou nenhuma expresso
de genes virais, caso em que uma infeo latente iniciada.
Se uma clula com o retrovrus em latncia se dividir, o genoma viral integrado transmitido s
clulas filhas.
A integrao aleatria mas em simultneo apresenta alguma preferncia porque existem
determinadas regies no genoma da clula hospedeira que tm maior propenso para sofrer
integrao.
Vrus diferentes mostram tendncias diferentes para os locais onde integram. O HIV-1 tende a integrar
em regies ranscritas, mais ou menos iguais ao longo dessas regies; MuLV tende para seletivamente
inserir o seu DNA em sequncias a montante da extremidade 5 'de regies transcritas, perto dos locais
de incio da transcrio; ASLV mostrou apenas preferncia muito fraca para genes ativos e nenhuma
para regies a 5 '.












Transcrio reversa retroviral:
1. Cpia do genoma do vrus com um tRNA ligado
ao PBS.
2. A transcriptase reversa comea a sntese da
cadeia de DNA (-) na extremidade 3 do tRNA.
3. A RNase H digere o RNA na regio onde existe
dupla cadeia RNA-DNA. O DNA (-) liga-se na
extremidade 3 de ambos.
4. Alongamento do DNA (-) continua, enquanto a
RNase H degrada o RNA molde a partir da
extremidade 3ar para trs do PPT.
5. Inicio da sntese da cadeia de DNA(+).
6. O restante RNA degradado.
7. O DNA (+) solta-se da extremidade 5 do molde
de DNA (-) e liga-se extremidade 3 do mesmo
molde.
8. Sntese de ambas as cadeias de DNA
concluda.

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4. Transcrio e replicao do genoma. Fatores de transcrio ligam-se a um promotor no LTR a
montante, em seguida, a clula de RNA polimerase II inicia a transcrio na juno U3-R. A transcrio
continua at LTR a jusante: existe um sinal de poliadenilao da regio R e a transcrio termina na
juno R-U5. A transcrio assegura que as regies U5 e U3 so includas. Em cada transcrio
adicionado o cap e a cauda de poliadenilao.
Provrus: o genoma
estende-se para alm das
regies R.
Vrus: o genoma restringe-
se ao espao entre as duas
regies R.

5. Traduo e modificaes ps-traducionais.
O gene env traduzido a partir de um mRNA que sofreu splicing no RER, onde comea a glicosilao.
Posteriormente, as protenas env so transportados para o complexo de Golgi, onde so clivadas por
uma protease em protenas SU e TM.
Os dois produtos de clivagem permanecem em associao estreita, e depois da glicosilao so
transportados para a membrana plasmtica.
As protenas codificadas pelos genes gag e pol so traduzidos a partir de todo o mRNA em poliprotenas
Gag e Gag-Pol. Os retrovrus requerem quantidades muito maiores de protenas Gag do que protenas
Pol, e, por isso, desenvolveram mecanismos para sintetizar a quantidade requerida de cada um.
Estes mecanismos envolvem, aproximadamente, 95 % de ribossomas que terminam a traduo
depois da sntese da protena Gag, enquanto os restantes 5% continuam a traduo para
sintetizar Gag-Pol.
5.1 tRNA supressor
O mecanismo do tRNA supressor, utilizado pelo
vrus da leucemia no murine (MuLV), consiste na
leitura atravs de um codo STOP no final do
mRNA da protena Gag. Um tRNA supressor
incorpora um aminocido no codo STOP na
traduo e h continuao da traduo do mRNA
da protena Pol, que est no mesmo quadro de
leitura que o gag.
5.2 Frameshiftin ribossomal
A maioria dos retrovrus, contudo, assegura que
h traduo nas propores corretas por um
mecanismo de frameshifting ribossomal. Aqui o
gag e pol esto em quadros de leitura diferentes
e h uma mudana de no quadro de leitura antes
da juno gag-pol, em cerca de 5% das
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Ciclo de replicao do Retrovrus
tradues.
Este mecanismo utilizado pelo HIV-1.
6. Montagem e libertao dos vrus. A maioria dos retrovrus monta os seus componentes na superfcie
interna da membrana plasmtica. Um vrus imaturo adquire o seu envelope por budding da superfcie
celular.
Durante e/ou aps o processo de budding as poliprotenas Gag e Gag-Pol so clivadas pela
protease do vrus.
o Os produtos de clivagem do Gag formaram a matriz, a cpside e o componente
proteico da nucleocpside.
o Os produtos de clivagem do Pol so as enzimas do virio.











EM RESUMO: SLIDE 14, T6
Ver slide 15, T6


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Retrovrus so altamente variveis (slide 29, T6)
Existem duas causas principais para a variabilidade gentica existente no retrovrus:
Ausncia de capacidade de correo de erros/ de reviso da Transcriptase Reversa (10E-4
erros por nucleotdeo replicado);

Copy-choice mechanism: na replicao, como o genoma diploide, ou seja, constitudo por
duas cadeias lineares e idnticas, por vezes, a transcriptase reversa salta da cadeia que est a
transcrever para a outra cadeia, produzindo um DNA que resulta de uma transcrio em
simultneo das duas cadeias de RNA.
11.1.2 Efeitos de infees retrovirais
1. Infees persistentes sem efeitos citopticos (mais provveis);
2. Tumorignese;
3. Efeito citoptico (alguns: por exemplo HIV-1).
1. Retrovrus endgenos Infees persistentes/crnicas sem efeitos citopticos
Os genomas de vertebrados contm sequncias retrovirais. Os genomas da maioria destes retrovrus
endgenos (ERVs) tm defeito. O sequenciamento do genoma humano revelou a presena de quase 100
000 sequncias humanas ERV (HERV).
Alguns ERVs esto intimamente relacionados a retrovrus normais (retrovrus exgenos);
Estes vrus integram em clulas de tecidos especficos.
altamente provvel que os ERVs tenham tido origem em retrovrus exgenos que infetaram as clulas
da linha germinal (espermatozides e/ou dos ovos). Se uma dessas clulas, com um provrus integrado,
sobreviveu ao processo reprodutivo, posteriormente as clulas descendentes iro conter uma cpia do
provrus no seu genoma. Ao longo do tempo o ERVs criou cpias noutros locais no genoma, dando
origem a famlias de elementos VER relacionados.




Slide 32, T6: Retrovrus endgenos humanos (HERV) tm uma estrutura semelhante dos provrus de
retrovrus infeciosos, mas tipicamente contm muitas mutaes de inativao incluindo mutaes
pontuais (bandas escuras), alteraes no quadro de leitura e delees (particularmente em env).
Frequentemente, a poro central inteira foi perdida por recombinao homloga, deixando para trs
um 'LTR solitrio'.
Embora quase todos os HERVs tenham defeito, os LTRs podem ainda estar ativos, e a
transcrio de HERVs comum principalmente no tecido fetal e em doenas inflamatrias e
cancro.
Em alguns casos, a competncia de codificao para o gene env foi retida, mesmo quando
genes virais adjacentes esto muito mutados, sugerindo que as presses seletivas tm mantido
esses quadros de leitura abertos, porque eles tm uma funo celular.
Esta pode ser a origem dos HERVs - integrao do provrus benignos em clulas germinais
originando os retrovrus endgenos, transmissveis verticalmente.
1% a 8% do genoma humano constitudo por retrovrus endgenos (HERV).

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Trs provrus integrados com
diferente potencial oncognico.
2. Tumorignese
Grande parte dos vrus responsveis pelo desenvolvimento de cancro so vrus de RNA; estes vrus
interferem com as protenas reguladoras do ciclo celular (slide 34, T6)
Cinco classes principais de proto-oncogenes (slide 35):
Um proto-oncogene um gene normal que se torna um oncogene devido a uma mutao ou ao
aumento de expresso gnica. As protenas resultantes podem ser denominadas "onco-protenas. Os
proto-oncogenes codificam protenas que ajudam a regular o crescimento e a diferenciao celular.
1. Fatores de crescimento extracelulares: homlogos de fatores de crescimento normais.
2. Recetores de fator de crescimento: protenas de membrana que captam sinais extracelulares
estimulando o crescimento das clulas.
3. Transdutores de sinal intracelular: transmitem sinais iniciados pelo fator de crescimento de
ligao a recetores.
4. Fatores de transcrio nuclear: regulam a expresso do gene.
5. Genes supressores de tumor: reguladores negativos do crescimento celular; not picked up by
retroviruses.
Retrovrus transformam as clulas por trs mecanismos:
O mecanismo base de ativao da tumorignese pelos retrovrus consiste numa interao (ativao)
com os oncogenes.
1. Formao rpida de tumor (exemplo: RSV; 2 semanas):
a. RSV ativa o seu oncogene viral no seu genoma:
vRSV;
b. Este oncogene dominante e um gene adicional
que torna o vrus complexo;
c. As protenas so produzidas imediatamente,
quando o vrus se replica.

2. Cintica intermediria de formao de tumores (exemplo: ALV; meses):
a. ALV no portador de nenhum oncogene dominante v-ONC;
b. Ativao-cis a integrao do provrus ativa a expresso de oncogenes endgenos
perto do local de integrao.

3. Cintica lenta de formao de tumores (exemplo: HTLV;
anos):
a. HTLV no portador de nenhum oncogene
dominante v-ONC;
b. No provoca uma ativao-cis de oncogenes
locais;
c. Uma protena de regulao viral ativa os
oncogenes por ativao-trans.
Os vrus que promovem uma formao/ativao lenta de
tumores so retrovrus simples que ativam oncogenes da clula
hospedeira.
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Mecanismos de captura de oncogene: Tumorignese por vrus de transformao rpida
Os vrus que no possuem oncogenes virais e promovem uma ativao lenta da tumorignese podem
adquirir oncogenes celulares no seu genoma por recombinao com o hospedeiro, originando um novo
vrus. Este novo vrus tem capacidade de originar tumores de forma rpida, visto que j possui no seu
genoma viral um oncogene.


Importante - Slide 41, T6:Apenas uma cadeia linear do vrus lento capta o oncogene da clula
hospedeira. Desta forma, posteriormente, h recombinao com a outra cadeia e ligeiras modificaes
no oncogene, para que as duas cadeias de RNA adquiram ambas o oncogene e o retrovrus se
transforme num vrus de Tumorignese rpida.
3. Ao citoptica
Alguns retrovrus, contudo, so mais patognicos: uma pequena poro de retrovrus so diretamente
citopticos, e muitas das clulas infetadas morrem. Estes agentes podem, assim, destruir os tecidos
infetados e provocar danos diretos nas suas funes.
Estes vrus incluem os vrus citopticos avirios e, provavelmente, o vrus da SIDA, HIV-1.
3.1 HIV-1 e HIV-2
Existem dois tipos de vrus da imunodeficincia humana (HIV-1 e HIV-2). Ambos os vrus surgiram no
final do sculo 20. A infeo por HIV danifica o sistema imunolgico, deixando o corpo do hospedeiro
suscetvel a infees por uma ampla variedade de bactrias, vrus, fungos e protozorios.
HIV-1 muito mais prevalente do que o HIV-2; o HIV-1, que em grande parte responsvel
pela pandemia da SIDA, enquanto o HIV-2 bastante restrito frica Ocidental.
Os anticorpos de um individuo com HSV-1 reagem com o HSV-2 e vice-versa.

HIV-2 menos virulento e transmissvel do que o HIV-1.
o As protenas membranares do HIV-2 partilham homologia com as do SIV (Simian
immunodeficiency viroses, infetam primatas no-humanos).
o Humanos infetados com HIV-2 possuem anticorpos que cross-react com o SIV.
Caractersticas gerais:
O virio tem as caractersticas gerais de retrovrus, mas, em contraste com a maioria dos
retrovrus, o capsdeo em forma de cone.
Envelope.
Genoma: cadeia simples de RNA; 9.3Kb.
Vrus complexo com 6 genes auxiliares.
o Estes genes auxiliares tm vrias funes no controlo da expresso de genes virais,
transporte de componentes do vrus para dentro da clula e modificao da resposta
imune da clula hospedeira.
Protenas auxiliares do HIV-1:
o Tat (fator de transcrio);
o Rev (expresso de genes tardios);
Vrus Lento + Oncogene do genoma da clula hospedeira Vrus Rpido
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o Nef (protege do sistema imunitrio);
o Vif (previne a incorporao em viries com protenas celulares danificadas);
o Vpr (conduz o complexo de pr-integrao para o ncleo);
o Vpu (virion budding).
Slide 44, T6 : A comparao de sequncias fornece uma viso das origens dos HIVs.
Os vrus de Chimpanzee (SIVcpz) e Mandrill (SIVmnd) esto intimamente relacionados com o
HIV-1.
Sooty mangabey vrus group (SIVsm) esto intimamente relacionados com o HIV-2.
HIV-1 e HIV-2 esto filogeneticamente distantes.
1. Ligao e entrada na clula hospedeira: O recetor celular para o HIV-1 de CD4, que encontrado em
vrios tipos de clulas, incluindo clulas T auxiliares e alguns macrfagos
As clulas T CD4+ so as principais clulas-alvo.
Contudo, o HIV-1 necessita de se ligar a um co-recetor na superfcie da clula. As molculas que atuam
como co-recetores tm sete domnios transmembranares e so recetores de quimiocinas.
Durante as respostas imunitrias estes vrus ligam-se s quimiocinas; estas interaes
permitem controlar o trfico de leuccitos e diferenciao das clulas T.
Os recetores das quimiocinas so designados CCR e CXCR e os co-recetores utilizados pelo HIV-1 so o
CCR5 e CXCR4.
Indivduos que no expresso CCR5 nas suas clulas (mutantes homozigticos) apresentam alta
resistncia para a infeo por HIV-1.
A ligao do HIV-1 ao seu recetor CD4 e co-recetor CCR5 ou CXCR4 permite a sua entrada na clula
hospedeira. O contedo do envelope do virio libertado no citoplasma e desenvolve-se o complexo de
transcrio reversa, o qual contm as protenas MA, Vpr, RT e IN, bem como o genoma do vrus.
2. Transcrio reversa e transporte para o ncleo: Contrariamente maioria dos pr-vrus de retrovrus,
que so inteiramente de dsDNA, no caso do HIV e outros lentivrus, estes possuem uma sequncia curta
de tripla cadeia que desempenha uma papel crucial na fase inicial (early) da infeo.
Aps a transcrio reversa, o complexo de pr-integrao, que contm protenas do hospedeiro, bem
como protenas de vrus, transportado ao longo dos microtbulos em direo ao ncleo.
O complexo de pr-integrao do HIV capaz de entrar no ncleo de uma clula T ou
macrfago em repouso, atravs de um poro nuclear entrada independente da diviso celular.
3. Expresso de genes precoce (early) Fase reguladora:
Muitas das transcries do genoma resultam de splicing e em trs classes de transcritos virais de
tamanhos diferentes.
Os RNAs pertencentes classe maior so RNAs com o comprimento do genoma
(aproximadamente 9,3 kb), enquanto as outras duas classes de tamanho so cada um
composto por um nmero de espcies de mRNA que foram submetidos a splicing.
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Expresso gnica precoce de HIV-1
Funes do Rev e Tat.
No incio da infeo a maior parte dos transcritos primrios so multiplamente sujeitos a splicing e estes
RNAs so convertidos em protenas Nef, Tat e Rev.

3.1 Proteina Nef (fator de regulao negativa): protena que estimula a replicao. Em clulas infetadas,
o Nef altera o trfico endossomal, reduzindo a expresso na superfcie de clulas T de CD4 e protenas
MHC de classe I e II. Estas mudanas protegem as clulas infetadas da vigilncia imunolgica.
Reduz o trfico proteico para a membrana celular.
3.2 Protena Tat (Transativador de transcrio): desempenha um papel importante na estimulao da
transcrio. Um sinal de localizao nuclear dirige a Tat para o ncleo, onde se liga a uma sequncia na
extremidade 5no transcrito do vrus: esta sequncia conhecida como TAR, assegurando que o
genoma do vrus inteiro transcrito.
Tat funciona como um fator de transcrio que no se liga ao DNA, mas sim ao RNA. Na
ausncia de Tat a maioria dos transcritos so incompletos, embora no incio da infeo so
concludos o suficiente para permitir a sntese de uma pequena quantidade de Tat, que, em
seguida, aumenta significativamente a sntese de RNA do genoma inteiro.
3.3 Proteina Rev (regulador de expresso de protenas de virio): tem um sinal de localizao nuclear.
Como a Rev se acumula no ncleo, provoca uma mudana da fase precoce (early) para tardia (late) de
sntese proteica, atravs da ligao ao elemento de resposta a Rev (RRE) no RNA do vrus.
O RRE est presente nos transcritos que no sofreram splicing e nos transcritos singly spliced
(sofreram splicing individual), mas est ausente em transcritos multiply spliceddas (sofreram
mltiplos splicings).
O Rev auxilia o transporte do mRNA para o citoplasma, onde as protenas tardias so
traduzidas. O Rev, porteriormente, reciclado para o ncleo.
Os genes tardios so traduzidos a partir do genoma total e transcritos obtidos por splicing individual,
mas estes mRNAs no so transportados a partir do ncleo, antes de se ligarem a ele mltiplas cpias de
Rev.
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4. Expresso de genes tardia Fase estrutural: Gag e Gag-Pol so traduzidos a partir de transcritos que
no sofreram splicing.
As protenas do vrus restantes (Vif, Vpr, Vpu e
Env) so traduzidas a partir de transcritos que
sofreram splicing alternativo. Vpu e Env so
traduzidas no retculo endoplasmtico rugoso a
partir de uma transcrio bicistrnica.
Vpu uma protena associada
membrana e necessria para um
budding eficiente de viries a partir da
membrana plasmtica.
Vpr encapsidada.
5. Montagem e sada da clula:
As protenas Vif so incorporadas no virio e funcionam como um mecanismo de defesa do
vrus. Estas protenas asseguram que o APOBEC3F no incorporado no virio.
o O APOBEC3F constitui um mecanismo de defesa das clulas hospedeiras, provocando
mutaes no genoma do retrovrus.
APOBEC3F origina mutaes durante a transcrio reversa.
o Desta forma, o retrovrus assegura que o APOBEC3F no ir interferir com a replicao
na prxima clula hospedeira, impedindo que ele seja incorporado no virio.















Ciclo de replicao do HIV-1
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Slide 54, T6: Curso varivel da infeo por HIV-1
Evoluo tpica
o Fase primria: ao do sistema imunitrio, mas no h eliminao total do vrus.
o Fase de latncia: dura anos.
o Fase tardia = SIDA: aparecimento dos sintomas com infees oportunistas.
Evoluo rpida: no existe fase de latncia.
No h progresso: tem infeo mas nunca entra numa fase tardia, fica sempre em latncia.
Seleo para a sobrevivncia dentro do hospedeiro
Na fase final da SIDA, os bilhes de viries que sobrevivem tm tropismo para clulas T, com
recetor CXCR4.
Quando a infeo passada para um novo hospedeiro, a replicao inicial do genoma viral tem
tropismo para Macrfagos, cujo recetor CCR5.
Progeny genomes have passed through a bottleneck, only a few pass on.
Viries que finalmente destroem o sistema imunitrio no so os mais aptos para a infeo de
novos hospedeiros.
APONTAMENTOS:
HIV-1 um retrovrus muito complexo. Existe um padro de splicing muito complexo.
Infeo inicial do HIV-1: macrfagos, que possuem recetores CCR5.
Infeo tardia do HIV1: Clulas T, que possuem recetores CXCR4.
Na fase de regulao (fase early) os genes que codificam para as protenas Tat e Rev so os
mais importantes.
Quando h uma acumulao de Rev, deixa praticamente de haver splicing. Desta forma, entra-
se na fase tardia, na qual existe um splicing com produo apenas de env.
11.2 Vetores Retrovirais
A capacidade de carga dos retrovrus de, aproximadamente, 6kB
Uma caracterstica que distingue estes vrus dos restantes a sua capacidade de integrar no
genoma do hospedeiro se necessitar de homologia, e promover uma expresso gnica estvel;
contudo a integrao aleatria.
Retrovrus:
Gama-retrovrus: s infecta clulas mitticas porque no capaz de atravessar os poros do
ncleo. Tm de entrar no ncleo da clula durante o ciclo mittico quando o ncleo est
desagregado.
Lentivrus: so capazes de promover a expresso de genes em clulas mitticas e ps-mitticas
(clulas neuronais, hemcias e clulas da retina).
Construo de um vetor viral:
O maior problema com vetores retrovirais a formao de uma replicao competente de retrovrus.
Para os retrovrus serem usados como vetores:
Tem de haver eliminao de protenas acessrias vif, vpr, vpu, nef;
Genes essencias: tm de estar presentes na clula produtora;
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Otimizao da sequncia de genes essenciais: eliminao da homologia, para que no haja
recombinao.
Desenho do vector Split packaging vector
Mtodo que impossibilita a recombinao para formao de vrus capazes de replicao Segurana

PPT Sinal de
empacotamento ().



Para construir um vector para a transferncia de genes (sem capacidade de replicao) criam-se dois
modelos de plasmdeos, um plasmdeo-cis e um plasmdeo trans.
O plasmdeo-cis Vector DNA - contm o gene de interesse, assim como as LTRs e o promotor.
As ORFs para os genes gag, pol e env so separadas deste plasmdeo e inseridas no plasmdeo-
trans Helper DNA.
O DNA helper no tem o sinal de empacotamento () e, desta forma, no pode ser empacotado numa
partcula viral, impedindo que saia da clula produtora. Contrariamente o vector DNA contm a cassete
de expresso teraputica, flanqueada pelas LTR, assim como o sinal de empacotamento, garantindo
apenas o seu empacotamento de forma eficiente na partcula viral.
Como os genes gag, pol e env so codificados por plasmideos helper, que no tem capacidade
para sofrer empacotamento, no saem da clula promotora, assegurando que o vetor contm
apenas o gene de interesse e no tem capacidade de replicao, ou seja, no patognico.
O facto de os genes gag, pol e env estarem em dois plasmdeos trans constitui uma vantagem
porque dificulta a insero destes genes no genoma do vetor viral.





RSL: aumenta os niveis de RNA citoplasmticos;
SD, SA: localizados na regio do promotor e rodeando o sinal de empacotamento, podem
aumentar mais os niveis citoplasmticos de RNA.
PBS: estrutura formada em U5;
PRE (elemento regulatrio ps-transcripcional): localizado nos enhances retrovirais em 3 UTR;
aumenta a estabilidade do mRNA.
Esquema de um vetor LTR e o seu RNA correspondente (abaixo)
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o O mRNA tem um tempo de vida curto, por isso, adiciona-se o PRE, que aumenta o
tempo de vida do mRNA e a probabilidade deste ser reconhecido por um ribossoma.
Como o 5 LTR retroviral funciona como um promotor, um vetor simples desenhado utiliza o LTR para
induzir a expresso transgnica. Em adio, a utilizao de promotores heterlogos colocados
internamente na unidade transcricional retroviral aumentam a flexibilidade da expresso gnica,
constitutiva, induzida ou especifica de tecidos.
A atividade transcricional do LTR em alguns casos pode provocar problemas, interferindo com a
atividade dos promotores internos. Estes problemas podem ser reduzidos pelo uso de vetores
retrovirais SIN (Self Inactivating), onde as sequncias extensivas de LTR so eliminadas para silenciar
efetivamente este promotor.
Sel Inactivating vectors - Vectores retrovirais SIN: retiram sequncias reguladoras de forma a dar
especificidade a um tecido alvo.
Sem sequncias reguladoras upstream, incluindo TATA box;
Usam promotor INTERNO para iniciar a transcrio da cassete de expresso;
Promotor escolhido pela especificidade para o tecido-alvo e nveis de expresso;
Combinado com LTR 5 quimrica impossvel formar um vrus WT.
Os vetores retrovirais SIN so
desprovidos de promotor/enhancer na
regio 3U3 e, por isso, so
dependentes de um promotor interno.
Este promotor interno pode ser
escolhido de acordo com a
especificidade do tecido e a fora de
expresso necessria para a aplicao
deste vetor.
Os promotores presentes em U3 podero promover a ativao de proto-oncogenes do hospedeiro. Por
isso, muitas vezes elimina-se o U3 e introduz-se um outro ptomotor.

Ver slide 6, T7;
A linha celular ,
frequentemente, derivada de
clulas T 293.




VSV-G: substitui o env; o seu recetor muito generalizado para as clulas humanas, conferindo ao vetor
a capacidade de infetar vrios tipos de clulas pseudo-taping.
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12. Replicao e expresso de vrus de RNA sem atividade de Transcriptase Reversa
(RT) Classe III, IV e V








No caso dos vrus de RNA sem atividade de transcriptase reversa, as enzimas envolvidas na replicao
so as mesmas que esto envolvidas na produo de mRNA.
Aspetos comuns na replicao e expresso de vrus de genoma de RNA sem atividade de RTase
Classe III, IV e V
Converso de RNA em RNA e replicao de RNA: Assim como a transcrio de DNA para RNA e a
sntese de novo DNA, a nova cadeia de RNA sintetizada de 5 para 3, antiparalelo com a cadeia
modelo. Contudo a elevada estabilidade trmica do dsRNA leva a complicaes.
A maior complicao que a nova cadeia de RNA
sintetizada tem de ser desnaturada e removida da cadeia
modelo para evitar que colapse com a formao da nova
cadeia dupla.
Uma segunda complicao a produo de uma cadeia
de ssRNA com o mesmo cdigo de leitura que o genoma viral
e, para isso, tm de se formar dois intermedirios.
o A cadeia positiva serve de molde para
formar a cadeia negativa que, por sua vez, serve de molde
para formar outras cadeias positivas.

Neste tipo de replicao, se houver um erro este propagado at ao fim, visto que no existem
mecanismos de reparao do RNA proofreading.
Nota: muitas vezes, durante a replicao pode haver a ligao da cadeaia transcrita com a cadeia molde,
criando uma molcula de RNA de cadeia dupla designada de bicatenrio, que muito mais estvel.
O RNA bicatenrio induz a produo de interfero.
Atividades enzimticas das replicases:
Polimerase - reconhecimento do promotor e alongamento da cadeia;
Helicase - desenrolamento usando ATP;
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55
Guanilil transferase (Gtase);
Metil transferase (Mtase).
o A Gtase e Mtase esto envolvidas no cap (que no existem em alguns vrus):
Ligao GpppA;
Mtase metilao.
12.1 Vrus de Classe IV vrus com genoma com atividade mesageira
Genomas de Classe IV
Os vrus desta classe podem
apresentar dois tipos diferentes
de genoma
1. Com uma protena viral
G na extremidade 5;
2. Com o cap na
extremidade 5.

Os genomas de vrus de classe IV so policistrnicos.
O que distingue a traduo nos procariontes e eucariontes:
Procariotas: mRNA policistrnico, ou seja, uma molcula de mRNA codifica diversos
polipeptdeos, que so traduzidos;
Eucariotas: mRNA monocistrnicos, ou seja, cada molcula de mRNA codifica apenas
uma protena.
No entanto, tanto num caso como no outro, a partir do momento em que um ribossoma liberta o stio
de iniciao da traduo, aps a leitura de 100 a 200 nucleotdeos, outro ribossoma pode iniciar a
traduo. Assim se formam polirribossomas, que traduzem em simultneo, mas em fases diferentes do
alongamento, vrios polipeptdeos a partir da mesma molcula de mRNA.
Se o mRNA for policistrnico (procariontes) formam-se vrias cpias de vrios polipeptdeos.
Se o mRNA for monocistrnico (eucariontes) formam-se vrias cpias de um nico
polipeptdeo.
O facto de nestes vrus de classe IV o mRNA ser policistrnico e nos eucariotas ser monocistrnicos
constitui um problema na traduo do mRNA do vrus:
Para a traduo de um mRNA monocistrnico, nos eucariotas, necessria uma extremidade
5livre para os constituintes ribossmicos serem montados no mRNA.
A necessidade desta extremidade a 5 livre para o incio da traduo impede que as ORFs
internas de um mRNA policistrnico do vrus sejam traduzidas num organismo eucariota.



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56
Solues para a NO traduo de ORFs internas:
Genoma segmentado em ORFs em vez de ser ter um mRNA com vrias ORFs, tem-se vrios
mRNAs cada um com uma ORF. Estes mRNA resultam de um genoma segmentado.
o Este genoma segmentado apresenta uma desvantagem: na encapsidao podem faltar
alguns segmentos do genoma, tornando-o no funcional.

Expresso de poliprotena como se existisse uma nica ORF; o codo STOP no lido
permitindo fazer uma nica traduo de todo o mRNA, produzindo uma nica protena que,
posteriormente cortada para se obter as protenas pretendidas desta traduo.

Transcrio sub-genmica - as ORFs internas no so traduzidas; h produo de novos
mRNAs de cadeia positiva correspondentes s ORFs no traduzidas, e a partir daquele que foi
traduzido.
12.1.1 Vrus de classe IV com Expresso da Poliprotena Picornavrus









Capsdeo icosadrio.
O genoma do picornavrus ssRNA - composto por uma 7-8 kb.
o Covalentemente ligado extremidade 5do RNA existe uma pequena protena
conhecida como VPg (protena do vrus); a 3 final do RNA encontra-se a cauda poliA
(poliadenilada).
O genoma constitudo por uma grande ORF
flanqueado por regies no traduzidas.
Dentro da regio no traduzida na extremidade 5,
h muita estrutura secundria.
o Por exemplo, no RNA de poliovrus no
possui cap e, em vez disso, possui uma
estrutura secundria, com seis domnios,
cinco dos quais formam um local de
entrada de ribossoma interno (IRES),
dispensando o cap no reconhecimento
pelo ribossoma.
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1. Entrada na clula hospedeira
Existem vrios modos de entrada do genoma do picornavrus na clula
hospedeira.
Um modo envolve a transferncia do RNA do virio para dentro do
citoplasma na membrana plasmtica, deixando a cpside na
superfcie da clula.
Outros modos envolvem a endocitose, seguida por libertao da
cpside aps rutura da membrana do endossoma, ou a libertao
de RNA a partir da cpside com transporte atravs da membrana
do endossoma.
Quando o genoma se encontra livre no citoplasma a VPg removida da
extremidade 5. Por uma enzima da clula.
2. Traduo e modificaes ps-traducionais
O genoma do vrus funciona como mRNA,. A subunidade ribossmica 40S no liga na extremidade 5 do
RNA, mas internamente aos IRES.
O genoma codifica uma nica poliprotena, que
sofre uma srie de clivagens para dar origem a
todas as protenas estruturais e no estruturais.
Proteases codificadas pelo vrus executam as
clivagens. A poliprotena primeiro cortada para
se obter o P1 (protenas da cpside), P2 e P3
(protenas no estruturais).
P1 torna-se no terminal N miristilada,
antes de ser clivado para se obter a VP0, VP1 e
VP3, as protenas que iro formar a pr-cpside.
VP0 ser posteriormente clivado para
produzir a VP2 e VP4.
Outros produtos de clivagem incluem 3B
(VPg), 2C (uma ATPase) e 3D (RNA-polimerase).

Uma vez que a replicao de RNA est em curso, quantidades significativas de (+) RNA so produzidas;
algumas das funes deste RNA como mRNA e grandes quantidades de protenas do vrus so ento
sintetizados. Como o RNA grande (7-8 kb) podem existir at 60 ribossomas em simultneo a traduzir
um mRNA.
3. Replicao/Transcrio do genoma
Para que o vrus exera a sua funo infeciosa, o RNA (+) tem de ser replicado, vrias cpias de RNA(-)
tm de ser transcritas e, em seguida, utilizadas como moldes para a sntese de RNA(+).
O primer para a sntese de RNA (-) e RNA(+) o mesmo, a protena viral VPg -, que se vai ligar cauda
poliA e iniciar a replicao.
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1. Produo de Cadeias de RNA (-) a partir de um molde de RNA (+);
2. Produo de Cadeias de RNA (+) a partir das cadeias de RNA (-) produzidas no passo 1.
Grande parte do RNA nos complexos de replicao est presente como intermedirios replicadores
(RIS). Um RI uma associao de molculas de RNA que consiste num RNA modelo e vrios RNAs
crescentes de comprimento varivel. Assim, alguns RIs consistem num RNA(+) associado a um RNA (-)
em crescimento (-) ARN, enquanto que outros Ris consistem num RNA(-) associado a um RNA (+) em
crescimento. Tambm est associado com RIs esto cpias da RNA polimerase.














Por fim, as novas cadeias de RNA (+) podem:
Transformar-se em cadeias de mRNA para serem traduzidas, se perderem a protena viral VPg;
Serem encapsidadas para formar novas partculas virais, se no perderem a protena viral VPg.
4. Montagem e sadada clula
Cada pr-capsde (cinco cpias de cada um dos VP0, VP3 e VP1) adquire uma cpia do genoma do vrus,
com a VPg ainda ligada na extremidade 5. Nesta altura, as 60 cpias de VP0 so clivados em VP4 e VP2.
Inibio da expresso do gene hospedeiro
Logo aps a infeo, a expresso de genes das clulas hospedeiras inibida. Em clulas infetadas com
poliovrus, foi demonstrado que todas as trs polimerases de RNA so rapidamente inibidas, terminando
a transcrio. A traduo de mRNAs pr-existentes nas clulas tambm inibida, como resultado da
clivagem de fatores de iniciao (Ief4) da traduo pela protease2A do vrus.
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A sntese da protena do vrus no afetada uma vez que iniciada por um mecanismo independente
de cap.
Tem sido demonstrado que o poliovrus pode replicar-se em clulas anucleadas, indicando que o vrus
no requer nenhuma exigncia do ncleo (Importante: slide 16, T8).













Mecanismo de evaso do poliovrus:
um vrus que normalmente no provoca doena, no entanto se o vrus conseguir passar do intestino
delgado para a corrente sangunea ou para os ndulos linfticos pode chegar at ao SNC. Se grandes
quantidades de vrus se instalarem no SNC, pode ocorrer a morte dos neurnios e levar paralisia.
12.1.2 Vrus de classe IV com Estratgia de expresso por transcrio sub-genmica Sindbis
vrus
1 ORF: protenas no
estruturais:
2 ORF: protenas
estruturais.

Togavrus so vrus de RNA, com envelope, que exibem um complexo padro de expresso gnica
durante a replicao. O vrus Sindbis o exemplo melhor estudado.
Este vrus transmitido por insetos e provoca doenas (raras) muito suaves em seres humanos, contudo
o seu tamanho e relativa facilidade de manipulao tornaram-no num modelo de laboratrio til para o
grupo como um todo.
Ciclo de replicao do Picornavrus
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Togavrus Sindbis vrus (transmitido por insetos) Transcrio sub-genmica
Clivagem proteoltica.








Estgios iniciais da infeo pelo vrus sindbis:
essencial que os genes no estruturais
replicase estejam na primeira ORF. Estes genes
estruturais so necessrios para a transcrio
A. Endocitose mediada por recetor,
levando fuso da membrana viral com a
membrana da vescula endocitica e permitindo a
libertao do genoma do vrus (mRNA) no
citoplasma da clula hospedeira.

B. Transcrio do RNA do vrus, resultado
na expresso de precursores no estruturais
(replicase e outras protenas virais), codificadas
na ORF a 5.
Na ORF1 h um codo de terminao
supressvel, isto , quando o ribossoma chega ao
codo de terminao liga-se ao tRNA que est
carregado com um aminocido para o codo
STOP, que existem em muito pouca quantidade,
e suprime aquele codo STOP, permitindo a
produo de uma protena maior.
A parte da molcula depois do codo STOP no
to importante como a primeira. A segunda
parte codifica a RNA polimerase que
necessria em menor quantidade que as
outras protenas no estruturais.
Para a transcrio da segunda ORF, ou a
replicase se liga e transcreve toda a molcula, dando
origem a uma cadeia de ssRNA, ou a transcrio feita
atravs da ligao da replicase a um promotor interno,
que se encontra na regio intergnica, imediatamente
antes da ORF2.
Promotor
interno
Comentrio [J2]: Este promotor
inserido no RNA quando h produo da
cadeia de RNA (-) a partir da cadeia de RNA
(+).
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Sntese de protenas estruturais do sindbis vrus:
Depois da transcrio das protenas estruturais, estas podem dar origem a protenas da cpside e
protenas que contm uma sequncia de sinal que as encaminha para o reticulo endoplasmtico rugoso
e para o Complexo de Golgi, de modo a serem transportadas (em vesculas) para a membrana da clula
hospedeira.
Estas protenas representam os anti-recetores
que so adquiridos pelo virio atravs do
processo de budding quando o vrus abandona a
clula hospedeira.
As protenas estruturais so traduzidas como um
nico precursor.
Quando a regio N-terminal da protena
da cpside sofre clivagem do precursor, uma
sequncia de sinal (signal sequence) associa-se
com o reticulo endoplasmtico. Esta associao
permite que a poro da protena do precursor
seja inserida no lmen do reticulo
endoplasmtico. Posteriormente, e porque a
protena se mantm no lmen do reticulo
endoplasmtico, sofre clivagem em pequenas
protenas, por enzimas celulares, que tambm
promovem a glicosilao destas pequenas
protenas.

A partir das protenas da cpside pode-se obter dois produtos diferentes:

Protenas constituintes da cpside;
Protenas da superfcie da cpside.

O processo de replicao de togavrus mais complexo do que para os picornavrus.
A maior mudana citoptica a alterao da superfcie da clula hospedeira. Esta alterao pode levar
sua fuso com clulas vizinha para que o vrus se possa disseminar sem ter de sair da primeira clula
infetada. Esta alterao na superfcie da clula tambm envolve alteraes antignicas na clula. Este
tipo de citopatologia provocada por vrios vrus de RNA com envelope.
ss-RNA vrus de plantas: os vrus de plantas tm uma protena, protena de movimento (que no existe
nos vrus de animais), que regula o tamanho dos canais que ligam uma clula vegetal a outra
plasmodesmos.
Coronavrus: expresso sub-genmica mais complicada (representao esquemtica slide 22, T8)
o nico grupo de vrus de RNA (+) com uma nucleocpside em hlice.
12.2 Vrus de Classe V vrus com genoma sem atividade mensageira
Vrus cujo genoma no tem atividade mensageira requerem transcrio do RNA atravs de uma
polimerase de RNA, RNA dependente, como passo inicial da infeo.
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A RNA polimerase dependente de RNA , obrigatoriamente transportada pelo virio.
Orthomyxoviridae 5 gneros
Influenza A - humanos, porcos, cavalos, aves;
Influenza B humanos;
Influenza C - humanos, porcos;
Thogotovirus - Artropodes, vrios vertebrados;
Isavirus peixes.

Influenza A e B 8 segmentos;
Influenza C, Thogotovirus (Dori virus) - 7 segmentos;
Thogotovirus 6 segmentos
Nota: Apresentam replicao nuclear e splicing; tm envelope e nucleocapsdeo helicoidal.
Cada um dos seus segmentos codifica para uma protena.
Ciclo de vida do vrus Influenza:
1. O vrus entra na clula hospedeira por endocitose com posterior fuso do seu envelope com a
membrana da vescula.
2. Libertao de ribonucleoprotenas (RNP) cada um contm um segmento especifico de RNA (-),
que migra para o ncleo, onde a transcrio para uma cadeia de RNA (+) ocorre, usando uma
transcriptase associada ao virio.
3. A transcrio e a formao do mRNA requer o roubo dos caps de mRNAs celulares, atravs de
um mecanismo de trans-splicing.
4. Dois dos pr-mRNAs formados desta forma so, posteriormente, sujeitos a um ou dois cis-splicing
alternativos, usando maquinaria celular, de forma a que cada um origina dois mRNAs.
5. A traduo produz protenas virais que promovem modificaes na clula e na sua membrana
celular. As protenas virais associadas com nucleocapsdeo RNPs migram para o ncleo onde iro
mediar a sntese de uma cadeia de RNA (+) total modelo e uma de RNA (-).
6. As protenas associadas membrana viral so traduzidas no retculo endoplasmtico rugoso e
processadas no Complexo de Golgi.
7. Formam-se novos viries atravs da associao dos nucleocapsdeo com a membrana modificada
pelo vrus e budding nessa regio da membrana modificada.

NA: neuramidase;
HA: hemaglutinina.
So ambas molculas que se encontram na
superfcie do vrus, funcionando como um
anti-recetores que permitem a entrada do
vrus em clulas hospedeiras.
A enzima que transcreve o RNA no tem
capacidade de produzir caps, por isso, os
mRNAs roubam essa poro a mRNAs
celulares j existentes.
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Nota: o facto de estes vrus necessitarem de splicing e de roubar os caps a mRNAs celular justifica a
sua necessidade de replicao no ncleo.
12.2.1 Epidemiologia e Vrus Influenza:
Antigenic shift
3
x Antigenic drift
4

Alteraes antignicas das glicoproteinas da superficie
do vrus Influenza A entre 1933 e 1968.
Este vrus transmitido atravs do aerossol.
Existem zonas de mudana gradual e zonas de mudana
brusca, sendo que estas ltimas esto associadas a
epidemias, pois os antignios so completamente
novos para o sistema imunitrio.
Mudanas brutas nestes antignios (antigenic shift) so
resultado de uma mistura de infees e captao
aleatria dos segmentos de genoma no
nucleocapasdeo, formando novos genomas. Estas
mudanas bruscas verificam-se quando existem
epidemias no mundo.
Como o vrus da Influenza A tem um genoma segmentado, se houver duas clulas com dois genomas
diferentes, poder dar origem a um novo genoma, pela juno de diferentes segmentos dos dois
genomas. Para alm disso, este vrus no tem grande controlo sobre o que encapsidar, por isso, pode
haver encapsidaes mistas.
Como o vrus Influenza A tem dois tipos de anti-recetores e esses anti-recetores podem ter subtipos de
cada um, pode haver uma combinao entres eles e so essas mudanas que do origem a epidemias,
porque o nosso organismo no tem defesas contra as novas combinaes.
Reservatrio do vrus Influenza A: as aves aquticas selvagens constituem o principal reservatrio do
vrus influenza A.
Transmisso do vrus tem sido relatada a partir de
aves aquticas selvagens para aves, mamferos
marinhos, porcos, cavalos e seres humanos.
Os vrus so igualmente transmitidos entre porcos
e humanos e de aves para os seres humanos.
O vrus da influenza equina foi recentemente
transmitidos aos ces.




3
Antigenic shift: mudanas bruscas;
4
Antigenic drift: mudanas graduais.
Comentrio [J3]: preciso saber o que
est nos slides 29 e 30 da T8?
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13. Estratgias Moleculares de Agricultura
Porque produzir protenas em plantas?
Custo alternativo eficaz ao sistema de expresso em bactrias e mamferos;
Capacidade das clulas de plantas para realizar elevada modificaes ps-traducionais;
Ausncia de patognicos animais;
Escalabilidade fcil;
Velocidade (gene de protena) em sistemas transientes;
Alto rendimento: at ~ g / kg peso fresco.
Plantas transgnicas no mercado biofarmacutico

Tipos de Plantas:
Nicotiana tabacum (tobacco);
Nicotiana benthamiana;
Medicago sativa (Alfafa), entre outras.
Slide 5, T9 - Consideram-se dois grandes grupos de produtos expressos em plantas:
Produtos com elevado valor Utilizada biomdica;
Produtos com baixo valor mas que so produzidos em elevadas quantidades Utilizados a nivel
industrial.
13.1 Estratgias para Agricultura Molecular
1. Transformao nuclear estvel (planta transgnica);
2. Transformao de plastdio (planta transgnica);
3. Transformao transiente por Agrabacterium tumefaciens;
4. Vetores virais;
5. Magninfection (vetores virais + Agrobacterium);
6. Superao do RNA silencing.
13.1.1 Plantas transgnicas: integrao nuclear de transgene estvel
A maioria dos sistemas de transformao baseada na Agrobacterium.
Agrabacterium tumefaciens, uma planta patognica que se tornou numa ferramenta
biotecnolgica.
Agrobacterium bem conhecida pela sua capacidade de transferncia de DNA entre si e as
plantas e, por esta razo, tem-se tornado numa ferramenta importante para a engenharia
gentica.
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Esta bactria utiliza a transferncia horizontal de genes para provocar tumores em plantas.
A forma mais clssica de introduzir um gene no genoma de uma planta atravs de um agente
patognico, nomeadamente uma bactria.
A Agrobacterium uma bactria que infeta as plantas entrando pelas suas razes.
Os tumores de plantas no so como os tumores em humanos, no matam as plantas.










A agrobacterium faz uma integrao ineficiente no genoma da clula vegetal, integrando apenas uma
parte do seu genoma.
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Slide 12, T9: Uso da A. tumefaciens como ferramenta para a transferncia de um gene de interesse
(GOI) no ncleo de uma clula.
Utilizao de um vetor binrio, manipulado em E.coli, com o nosso gene de interesse.
Este vetor binrio posteriormente introduzido na clula de Agrobacterium.
A clula de Agrobacterium ir conter um plasmdeo trans (o seu suposto genoma), com a
regio do T-DNA removida.
Final: Agrbacterium com dois genomas plasmdeo trans e vetor binrio, que contm o gene de
interesse e que vai funcionar como T-DNA.
o O T-DNA o que a bactria introduz dentro da clula vegetal.
Slide 13, T9: Obteno de uma linha transgnica de plantas atravs de uma integrao nuclear estvel.
1. Inicia-se isolando pedaos de uma planta, que so incubados 24 horas com a Agrabacterium
modificada geneticamente (slide anterior).
2. Selecionam-se os pedaos de folha nos quais houve a transferncia do transgene da bactria
para as clulas.
3. A partir dessa folha origina-se uma planta portadora do gene de interesse.
Slide 14, T9: Devido natureza da juno de extremidades no homlogas (Non-homologous end
joing - NHEJ) cada linhagem de clulas com o transgene ser diferente.
A imagem, atravs das bandas, permite caracterizar cada linhagem transgnica, atravs do
nmero de inseres, produes, etc.
Posteriormente, seleciona-se a linhagem de interesse e procede-se sua multiplicao.
Nota: Slide 15, T9 - O primeiro produto para agricultura molecular foi obtido em plantas transgnicas
atravs da transformao de Agrobacterium.
13.1.2 Transformao de Cloroplastos
Produo de elevado rendimento de protena teraputica humana em cloroplastos do tobacco (slide
18, T9).
Uma alternativa transferncia de genes a Gene Gun: bombardeamento de microprojcteis.
Micropartculas, como ouro e tungstnio, associadas ao gene de interesse, so disparadas
contra clulas;
Usado em clulas vegetais; gene gun foi criado para que os genes conseguissem ultrapassar a
parede celular das clulas vegetais;
Slide 18, T9: Recorre-se a um vetor genrico de E.coli.
O gene de interesse inserido numa regio do vetor flanqueada por regies homlogas ao
genoma do cloroplasto, permitindo a transferncia do gene de interesse do vetor da E.coli
para o genoma do cloroplasto por recombinao homloga.
A Agrobacterium no consegue infetar o genoma dos cloroplastos, por isso que se tem de recorrer
Gene Gun. Aps a ao da Gene Gun importante certificarmo-nos que apenas o genoma dos
cloroplastos incorporou o gene de interesse e no tambm o genoma da clula.
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Ensaios de expresso transiente so facilmente
convertidos para uma grade escala
Verifica-se que se ao alterar-
se um lado do genoma do
cloroplasto o outro lado
corrigido, ou seja, produz-se
uma cpia do gene de
interesse do outro lado do
genoma, como correo.



A utilizao do genoma dos cloroplastos apresenta algumas vantagens:
Est livre dos mecanismos de silenciamento gnico ps-transcricional (PTGS post-
trancriptional gene silencing).
Elevada produo proteica: 100 cpias/plastdio x 100 plastidios/clula;
Mais seguro do que a transformao nuclear, devido disseminao do plen.
o A transformao nuclear ir provocar modificaes no genoma de todas as clulas da
planta, inclusive no plen, que, assim como a planta, ser plen transgnico.
o A capacidade de disseminao do plen torna a transformao nuclear das clulas de
plantas um risco porque o plen transgnico ir atingir outras clulas normais,
podendo criar transgnicos no desejados, com caractersticas desconhecidas.
o A transformao do genoma de cloroplastos no constitui este perigo porque
independente do genoma da clula e transmitido pela me, uma caracterstica
materna.
Possui locais especficos para recombinao homloga. No aleatrio, como na integrao
nuclear.
13.1.3 Expresso transiente mediada por Agrobacterium
A maioria das molculas de T-DNA transferidas da Agrobacterium para as clulas vegetais no so
integradas no genoma e permenecem viveis durante alguns dias. Durante estes dias que permanecem
nas clulas so transcritas, revelando uma expresso transiente.
Esta expresso transiente permitiu criar um novo mtodo de produo de produtos de interesse sem se
ter necessariamente de fazer uma transformao nuclear mtodo transiente atravs de
Agroinfiltrao.
A Agroinfiltrao consiste na introduo da Agrobacterium com o gene de interesse diretamente dentro
da planta (slide 23, T9). Desta forma, e contrariamente transformao nuclear, no necessrio
esperar que haja regenerao da planta porque a infiltrao realizada numa planta j desenvolvida.
Slide 24, T9: em conjunto com o gene de interesse,
introduz-se o gene que codifica para o GFP; isto
permitir identificar se a expresso do produto est
ocorrer ou no de forma eficiente, atravs da
emisso de fluorescncia verde (com incidncia de
UV).
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Comparao das caractersticas da Expresso Transiente mediada por Agrbacterium e
Transformao Estvel

13.1.4 Vetores Virais de Plantas
Slide 29, T9: Famlia e Gneros de Vrus que infetam plantas
Os vetores mais usados a nivel industrial so: tobacco Mosaic Virus (TMV), potato vrus X
(PVX), alfalfa mosaic vrus (AMV), cowpea mosaic vrus (CPMV).
Tobacco Mosaic Virus (TMV):
A entidade que originou inicialmente o conceito de vrus.
Caractersticas do TMV:
ssRNA (+) linear, com 6.3-6.5 Kb;
No tem envelope;
Contm rgidas hastes helicoidais
com uma simetria helicoidal;
18nm de dimetro e 2300-310
nm de comprimento;
A extremidade 3 tem uma
estrutura semelhante a um tRNA
e a extremidade 5 um cap.
Expresso gnica:
O RNA genmico funciona como mRNA. RNAs subgenmicos podem ser sintetizados durante a
replicao do RNA-3 (ver slide 31, T9) .
A pequena replicase est envolvida na replicao e actua como um supressor do RNA silencing.
O ribossomal readthrough no RNA-1 produz a RNA polimerase dependente de RNA.
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As protenas de movimento (MV) e da cpside (CP) so expressas a partir de um mRNA
subgenmico.
Quatro funes essenciais:
Replicao/transcrio do genoma RdRp (ORF1);
Movimento de clula para clula MP (ORF3);
Disperso sistmica CP (ORF4);
Supresso do RNA silencing (ORF2).
Slide 32, T9: Ciclo de Replicao do TMV
Movimento do TMV de clula para clula (ver slide 34, T9)











Primeira Gerao de Vetores
2-3 semanas para mxima expresso;
Protenas < 30kDa ou eptopos < 25 aa.
O gene de interesse pode ser fundido
com o gene que dar origem s
protenas da cpside, permitindo
tambm uma maior disperso.
o Exemplo: o gene para a vacina da Hepatite B pode ser fundido com o gene que codifica
para as protenas da cpside; desta forma, expresso na superfcie do vrus eptopos
correspondentes hepatite B, criando imunizao para este vrus.
Limitaes:
A expresso no uniforma (slide 37, T9 manchas visveis nas folhas das plantas);
A infeo no sincronizada;
Folhas mais velhas no so infetadas, porque normalmente o fluxo faz-se destas clulas para as
mais novas;
O vetor instvel, podendo haver perda do gene de interesse.
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70
13.1.5 Magninfection, vrus desconstrudos ou de segunda gerao
Diagrama do genoma e estratgia de expresso do TRV





As caixas representam os genes do vrus. As linhas acima dos genes do RNA-1 mostram a localizao de
duas proteinas, com genes da replicase sobrepostos.
A protena de 134K contm o motivo para a MT (metiltransferase) e a HEL (helicase).
A regio C-terminal da protena de 194K contm o motivo para a polimerase de RNA
dependente de RNA (RDRP).
O * representa o codo STOP para a protena de 134K e que ultrapassado na traduo para se
poder obter a protena de 194K.
A protena do movimento MP tambm designada por 29K ou gene 1.
Para o RNA-2, o CP representa o gene para as protenas do capsdeo. As linhas a picotado abaixo do RNA
representam os RNAs sub-genmicos que se pensa que existam.
Os genes 2b e 2c so necessrios para a transmisso nematodes.
Entrega atravs da Agrobacterium VIGS (vrus induced gene silencing silenciamento gnico
induzido pelo vrus)
(a) Organizao genmica do TRV.

(b) (b) TRV baseado num vetor VIGS. Os clones de cDNA de TRV so colocados entre o promotor
duplicado CaMV 35S (2x35S) e um terminador de nopalina sintetase (NOSt), no vetor de T-DNA.
LB e RB referem-se s extremidades esquerda e direita, respetivamente, do vetor T-DNA.

Nota: necessria a sincronizao de uma infeo para obter o mximo de produto.
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Virologia Aplicada
3 Ano, 2 Semestre Joana Canadas, N42351


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Representao esquemtica de uma
Agroinoculao de entrega de vetores TMV
usada na infeo de plantas.
Slide 43, T9: comparao da transfeco localizada de agrobacterium com a transfeco em toda a
planta. Verifica-se que a transfeco em toda a planta com agrobacterium realmente mais eficiente,
at as folhas mais velhas so infetadas.
Tornando o estilo de vida citoplasmtico mais nuclear
Um TMV RNA nativo reconhecido no ncleo pela
maquinaria de processamento do pr-mRNA e
ineficientemente exportado para o citoplasma ou
degradado.
(a) A infeo da planta com um vetor no-
modificado (nativo) resulta em pouca
fluorescncia-GFP emitida por poucas
clulas nas folhas das plantas;

(b) Por outro lado, a infeo com um vetor
modificado resulta na emisso de
fluorescncia-GFP pela maioria das
clulas da folha.

Slide 45, T9: Montagem de vetores em plantas
Eficiente montagem por recombinao de mdulos de DNA entregues pela Agrobacterium.
Slide 46, T9: Vrus desconstrudos
Funes virais indesejadas so eliminadas dos vetores; os genes mais eficientes so fornecidos
em trans pela planta (se for transgnica) ou por um vrus helper.
Os vetores virais so construdos com o objetivo de formar diversos mdulos importantes.

Slide 48, T9: Outros usos de vrus de plantas: vrus de plantas podem ser usados como nanoparticulas
para a entrega de drogas.
Slide 49, T9: Do gene vacina em 3 semanas

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Em Resumo: Vantagens e Desvantagens das diferentes estratgias de expresso proteica em
plantas
Os parmetros mais importantes para a expresso de protenas recombinantes, em particular
biofrmacos, incluem:
1. Produo da protena recombinante,
uma produo relativa para a
percentagem total de protena solvel;
2. Pesquisa de velocidade e no
desenvolvimento (R&D) suportado
pela plataforma;
3. Capacidade de expressar grandes
genes e protenas complexas;
4. Capacidade de processamento ps-
transcripcional;
5. Escalabilidade.