Unidade

Divinpolis
APOSTILA DE AULA PRTICA DE MICROBIOLOGIA
PROFESSOR(A) !a"ina Cos#a
CURSO En$en%a"ia A&'ien#al
Nome:
Instrues:
NORMAS A ATENDER NUM LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA
As aulas prticas visam ensinar aos alunos as metodologias utilizadas num laboratrio de Microbiologia.
Nessas aulas sero utilizados vrios grupos de microrganismos, bactrias e fungos, alguns dos quais podero
ser patognicos pelo que os alunos devem seguir um conunto de regras de modo a evitar qualquer tipo de
contamina!"es.
# $ A roupa deve ser sempre protegida por uma bata%
&$ No fumar nem comer no laboratrio. No levar ' boca qualquer obeto nomeadamente lpis,
canetas, etc. No umedecer etiquetas com a boca%
( $ Manter a superf)cie da bancada livre de todo o material que no for utilizar durante a e*perincia%
+ $ Antes de iniciar qualquer trabal,o bem como ao termin$lo lavar e desinfetar as mos%
- $ .esinfetar a superf)cie da bancada que ir utilizar com lcool a /01, antes e aps a e*ecu!o do
trabal,o%
2 $ 3vitar que obetos ou produtos inflamveis fiquem pr*imos da c,ama%
/ $ 4odo o material usado 5pipetas, l6minas, lam)nulas, etc...7 deve ser colocado dentro do recipiente
com desinfetante colocado na bancada para o efeito. As placas de 8etri sero colocadas dentro do
balde para posterior inativa!o%
9 $ : estudante com cabelos longos deve apan,$los, sobretudo quando o trabal,o e*ige a utiliza!o
do bico de ;unsen, de forma a no os queimar.
< $ =omunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou efetue aspira!"es indevidas
#0 $ =omunicar imediatamente qualquer acidente do gnero corte, queimadura, etc.
## $ Nunca esquecer de flamear as al!as antes de as guardar no suporte.
#&$ Antes de utilizar qualquer aparel,o deve ler as normas de utiliza!o%
#( $ : microscpio deve ser manuseado com cuidado
a7 >uardar a capa debai*o da bancada e voltar a coloc$la no final%
b7 As l6minas observadas devem ser colocadas dentro do recipiente que est em cima da
bancada para o efeito%
c7 ? dever remover a l6mina da platina, depois desloca!o da obetiva%
d7 Nunca dei*ar a lente de imerso sua de leo, limpando$a com o len!o de papel seco,
depois com o len!o embebido em *ilol e novamente com o len!o seco.
#+ $ No misturar material conspurcado com o material esterilizado.
#- $ .urante os trabal,os prticos evitar falar e deslocar$se desnecessariamente.
#2 $ 3tiquetar cuidadosamente as culturas antes de as colocar na estufa.
Observaes pessoais:
1 Aula Prtica Con!c!n"o o #icro$c%&io'
3m primeiro lugar essencial que voc con,e!a as partes pticas e mec6nicas dos microscpios@



$ No manusear o equipamento com as mos suas ou mol,adas.

$ Aamais comer ou beber pr*imo ao equipamento.

$ Na remo!o do equipamento, segure$o firmemente com uma das mos no bra!o e outra na base, ou
com as duas no bra!o, a depender do modelo. =oloque$o bem apoiado sobre a mesa de trabal,o de
superf)cie plana, evitando qualquer movimenta!o brusca. Nunca "!$lo(u! o a&ar!lo co# a
l)#&a"a ac!$a ou lo*o a&%$ t!r $i"o a&a*a"a'
$ Na observa!o de uma prepara!o, inicie sempre pela obetiva de menor aumento% para focalizar com
aquelas de &0 ou +0 vezes, proceda da seguinte forma@
3scol,a uma estrutura na prepara!o, mova a l6mina at que o obeto fique e*atamente no centro
do campo, em seguida mude para a obetiva de maior aumento, ol,ando por fora para evitar o
c,oque com a lam)nula.
:l,ar pela ocular e abai*ar o tubo ou elevar a platina com o macromtrico muito lentamente%
assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focaliza!o com o
micromtrico.
: uso da obetiva de imerso mais delicado, pois a dist6ncia focal entre a face da obetiva e a
parte superior da lam)nula, diminui quando a amplia!o aumentada.
3m primeiro lugar, assegure$se da e*istncia de algo no campo, posicionando a obetiva de menor
aumento.
=ertifique$se que a ilumina!o e o obeto esto bem centrados, suspenda o tubo e coloque uma
gota de leo no centro da opera!o% o leo deve ter o mesmo )ndice de refra!o da obetiva%
Abai*e o tubo at colocar a lente frontal em contato com a gota de leo ainda conve*a, at a
mudan!a de forma da mesma% suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com a gota,
coloque os ol,os nas oculares e abai*e o tubo muito lentamente% assim que a imagem aparecer,
complete a focaliza!o com o micromtrico.
+, Questionrio:
B7 Cual a contribui!o fornecida pelo microscpio ' cincia modernaD
BB7 Cual o significado da abreviatura M.:.=. em microscopiaD
BBB7 ?e voc estiver observando uma l6mina ,istolgica na obetiva +* e com oculares de
aumento #0*, qual o aumento da imagem proetadaD
BE7 No processo de visualiza!o ao M.:.=., qual pe!a utilizada para o auste fino da
imagemD
- Aula Prtica Pr!&aran"o u# #!io "! cultura'
I, Fundamentao terica / Meios de Cultura: :s diversos meios de cultura e*istentes podem ser
classificados de diversas formas@
Cuanto ' composi!o
Natural ?o aqueles encontrados na natureza, de origem vegetal 5p.e*.@ peda!o de
batata, de abbora7 ou animal 5p.e*.@ gema de ovo, peda!o de carne7
Artificial ?o aqueles fabricados em laboratrio, constitu)do de subst6ncias qu)micas,
podendo ser definidos ou indefinidos 5comple*os7
.efinido 8ossui composi!o definida, ou sea, se con,ece
qualitativa e quantitativa sua composi!o.
Bndefinido A sua composi!o real no con,ecida, apenas feita
uma estimativa qualitativa.
8or e*emplo@ meios suplementados com sangue, gema
de ovo, alimentos...
Cuanto ao estado f)sico F)quido ?o desprovidos de Agar a caldo
?emi$slido Apresentam em sua composi!o at #1 de Agar.
?lido Apresentam em sua composi!o de #,- a &,-1 de Agar.
Cuanto ' finalidades
caracter)sticas
?imples ? possui os nutrientes bsicos para o crescimento das bactrias em geral.
3nriquecido
Alm dos nutrientes bsicos possui elementos nutritivos a mais, como
fatores promotores de crescimento 5sangue...7, mas no espec)fico.
.e enriquecimento G suplementado com nutrientes espec)ficos para o microorganismo que se
desea pesquisar. Alm disso, possuem nutrientes agentes inibidores de
determinados microorganismos, mas no permite o isolamento da bactria,
pois um meio l)quido.
8or e*emplo@ aminocidos 5lisina ' ?almonella7
?eletivo
8ossui agentes inibidores de determinados microorganismos. 8ermite a
identifica!o e isolamento da bactria, pois um meio slido 5permite a
visualiza!o de HI=s7.
8or e*emplo@ Agar 3M; ' inibe >ramJ
.iferencial 8ermite a diferencia!o de diferentes microorganismos.
8or e*emplo@ a diferencia!o de bactrias fermentadoras e no
fermentadoras da lactose no Agar 3M;.
Bndicadores 8ossuem agentes que indicam determinadas rea!"es no meio, para a
determina!o do metabolismo das bactrias.
8or e*emplo@ ferro no meio ' pode indicar a produ!o de K&? pelo
enegrecimento do meio. 5sulfeto ferroso7
LLL geralmente o agente um indicador de pK
3stoque 8ossuem agentes que indicam determinadas rea!"es no meio, para a
determina!o do metabolismo das bactrias.
LLL geralmente o agente um indicador de pK
II, Material necessrio . 3rlenmeMer% ;alan!a% Ngua destilada% 8eptona% e*trato de carne% 4ubos de
ensaio.
Composio do agar nutritivo:
O 3*trato de carne ................................ ( g
O 8eptona .............................................. - g
O Agar ................................................... #- g
O K&: destilada ................................... #000 ml
Acertar a pK 2,9$/,0. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos
III, Preparao de agar nutritivo Como e!emplo"
#$ 8esar individualmente - g de peptona e ( g de e*trato de carne 5usar esptulas bem limpas e
limpar entre pesagens7. No voltar a introduzir o e*cesso no frasco.
&$ Adicionar os ingredientes a -00 ml de gua destilada colocada num 3rlenmeMer de &000 ml.
($ Komogeneizar cada um deles em separado e agitar a mistura at que se verifique a dissolu!o
completa dos ingredientes.
+$ Adicionar #- a &0 g de gar aos outros componentes e ,omogeneizar.
-$ Adicionar gua destilada de modo a perfazer o volume de #000 ml.
2$ Acertar a pK /.0 com ,idr*ido de sdio ou cido clor)drico #N, a uma temperatura de 20 P=.
/$ Qepartir o meio por ( bal"es de -00 ml, previamente esterilizados. Qol,ar e esterilizar em
autoclave a #&# P= durante #- minutos.
I+, #otas importantes:
A adi!o do agar aos meios deve ser sempre feita no final, depois de todos os ingredientes estarem
dissolvidos%
: meio de cultura deve ser esterilizado logo aps a sua prepara!o%
:s fracos no devem conter mais de metade do seu volume%
:s frascos no devem ter as rol,as completamente apertadas durante a esteriliza!o%
+, Questionrio:
#. Cual a diferen!a entre os meios Rde enriquecimentoS e RseletivoSD
&. Cual a finalidade da tcnica do Rspread plateS ou tcnica do espal,amentoD
(. 8or que no devemos cruzar as estrias na tcnica do esgotamento em estriasD
+. 8or que devem ser realizadas as tcnicas asspticasD
-. 8or que utilizamos diferentes meios durante a anlise de um determinado material 5p.e*.@ alimento7D
2. 8ara uma cultura que estea guardada , muito tempo 5sob refrigera!o7, qual o tipo de meio
devemos utilizar para retornar a utiliz$la numa atividade prticaD
/. 8ara determinar a presen!a de um microorganismo espec)fico num material que estea muito
contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizarD
/ Aula Prtica T0CNICAS UTILI1ADAS NA CULTURA DE
MICRORGANISMOS

I, Fundamentao terica@ : estudo de microrganismos no laboratrio envolve o seu
crescimento e manuten!o em meios de cultura. K um conunto de tcnicas bsicas de
repicagens e sementeiras de modo a preservar o organismo. 8ara isso necessrio obter em
primeiro lugar uma cultura pura do isolado 5colTnia obtida a partir de uma Unica clula7. A
principal fonte de contamina!o e*terna a atmosfera por isso a manipula!o dos organismos
ter que ser efetuada em condi!"es de assepsia.
Mor$ologia das bact%rias@
II, Material necessrio
$=ulturas de microrganismos
$8lacas de 8etri com gar nutritivo
$4ubos com caldo nutritivo
$4ubos com gar nutritivo inclinado
$4ubos com gar nutritivo
$Al!as e agul,as
$8ipetas
$3stufa
III, Procedimento: Bsolamento de colTnias em meio slido por espal,amento@
a. Qetirar 0,# ml de uma cultura l)quida para a superf)cie da placa de 8etri.
b. 3spal,ar uniformemente com au*)lio de um semeador 5vareta de vidro dobrada7 ou com
prolas de vidro esterilizadas de modo a que as clulas fiquem afastadas umas das
outras e se obten,am colTnias individualizadas.
c. Bdentificar a placa com o nome do operador e a data.
d. Bncubar as placas ' temperatura apropriada para o microrganismo em estudo.
#otas importantes:
Aps a obten!o de uma cultura pura de um isolado, a cultura deve ser mantida em laboratrio de
modo a que as clulas permane!am viveis e sem contamina!"es.
8odem ser refrigeradas a +P= ou congeladas 5$#9P=7 por per)odos curtos ou por per)odos mais
longos a $/0P= ou liofilizadas.
2 Aula Prtica Di3!r$i"a"! ! u4i(5i"a"! "o$ #icror*ani$#o$
&" Fundamentao terica @ :s microrganismos e*istem no ar, na gua e principalmente no solo. .o
solo podem ser arrastados pelo vento atravs das part)culas de poeira. .esenvolvem$se logo que as
condi!"es ambientais 5nutrientes, umidade e temperatura7 seam favorveis ao seu crescimento. =ada
organismo aparece pelo menos num ,abitat natural espec)fico no qual pode ser normalmente
encontrado, pode crescer e do qual pode ser isolado.
'ipos de col(nias:
;asicamente, as colTnias so classificadas e descritas atravs de trs critrios@ forma, eleva!o e
margem@
6or#a cirular ! #ar*!# int!ira7M!io. TSA

Serratia marcescens Staphylococcus aureus
6or#a Irr!*ular 6or#a 8ila#!nto$a

Mycobacterium smegmatis Streptomyces albus
6or#a circular9 !l!3a:;o &a&ila"a 6or#a irr!*ular9 #ar*!# on"ula"a

Pasteurella multocida Isolado desconhecido
6or#a ri<oi"! El!3a:;o &lana

Nocardia asteroides Pseudomonas aeruginosa
El!3a:;o con3!=a

Streptococcus salivarius Streptomyces albus
II, Ob)etivos:
=omprovar a diversidade e a ubiqVidade dos microrganismos
III, Material necessrio
$8lacas de 8etri com meio de gar nutritivo
$8ipetas
$3stufa
$ =otonetes W?Xab
BE7 Procedimentos@
1- Pesquisa de microrganismos do ar
Qetirar a tampa de vrias placas de 8etri com gar nutritivo e manter abertas durante -, #0 e #-
minutos. Bdentificar a placa com o nome do operador e a data. Bncubar as placas a (0P= durante ( dias.
2- Pesquisas de microrganismos das superfcies da sala de aulas
8assar um cotonete estril sobre uma superf)cie da bancada antes e aps a sua desinfec!o com lcool a
/01. 8assar o cotonete 5sXab7 sobre a superf)cie do meio de cultura. Bdentificar a placa com o nome do
operador e a data. Bncubar as placas a (0P= durante ( dias.
3- Pesquisas de microrganismos de outros ambientes
8assar um cotonete estril entre os dedos, antes e aps a lavagem das mos. 8assar o cotonete sobre a
superf)cie do meio de cultura. Bdentificar a placa com o nome do operador e a data. Bncubar as placas a
(/P= durante ( dias.
4- Pesquisas de microrganismos do solo
8ipetar #00ul da solu!o de solo e colocar numa placa de 8etri com o meio de cultura. 3spal,ar a
solu!o ' superf)cie do meio com a auda de um semeador. Bdentificar a placa com o nome do operador
e a data. Bncubar as placas a (0P= durante ( dias.
+, *esultados:
$3*aminar as placas e contar o nUmero de colTnias totais e o nUmero de colTnias diferentes em cada
placa%
$.escrever o tipo de colTnias.
$Qegistrar os resultados.
+I, Questionrio:
Cuadro Y =aracteriza!o das colTnias observadas
Caract!r>$tica$ "a$ col?nia$
+imenso mm" Cor Forma ,levao Margem *epresentao
@ Aula Prtica COLORAABO DE GRAM


I7 *e$erencial 'erico/ &nterpretao: : mecanismo da colora!o de >ram se refere ' composi!o
da parede celular, sendo que as >ram$positivas possuem uma espessa camada de peptideoglicano e
cido teicico, e as >ram$negativas, uma fina camada de peptideoglicano, sobre a qual se encontra
uma camada composta por lipoprote)nas, fosfolip)deos, prote)nas e lipopolissacar)deos. .urante o
processo de colora!o, o tratamento com lcool$acetona e*trai os lip)deos, da) resultando uma
porosidade ou permeabilidade aumentada da parede celular das bactrias >ram$negativas.
Assim, o comple*o cristal violeta$iodo 5=EB7 pode ser retirado e as bactrias >ram$negativas so
descoradas. A parede celular das bactrias gram$positivas, em virtude de sua composi!o diferente,
torna$se desidratada durante o tratamento com lcool$acetona, a porosidade diminui, a permeabilidade
reduzida e o comple*o =EB no pode ser e*tra)do.
:utra e*plica!o baseia$se tambm em diferen!as de permeabilidade entre os dois grupos de
bactrias. Nas >ram$positivas, o comple*o =EB retido na parede aps tratamento pelo lcool$
acetona, o que causa, provavelmente, uma diminui!o do di6metro dos poros da camada de
glicopept)deo ou peptideoglicano da parede celular. A parede das bactrias >ram$negativas permanece
com porosidade suficientemente grande, mesmo depois do tratamento com lcool acetona,
possibilitando a e*tra!o do comple*o =E$l.
Aquelas bactrias capazes de reter o comple*o formado pelo cristal violeta 5=E7 mais o iodo
5comple*o iodo pararosanilina7 coram$se em 3iol!ta CGra# &o$iti3o,, enquanto que as que no retm
o comple*o coram$se em 3!r#!lo CGra# n!*ati3o,'
At!n:;o. ;actrias >ram5J7 possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as
>ram5$7, conforme demonstra figura abai*o.
Iigura Y 3struturas t)picas das paredes de bactrias >ram positivas e >ram negativas
II, Ob)etivos
Aprender a preparar esfrega!o de bactrias%
Qealizar a tcnica de =olora!o de >ram%
Aprender o fundamento do mtodo de colora!o de >ram%
=omparar a estrutura da parede celular das bactrias >ram$positivas e >ram$negativas%
8arede celular constitu)da de uma camada grossa de
pept)deoglicano
Membrana plasmtica
=omple*o de membrana e*terna, com inclus"es de
lipopoliprote)nas e lipossacar)deos
8arede celular constitu)da de uma camada fina de
pept)deoglicano
Membrana plasmtica
Gra# &o$iti3a
Gra# n!*ati3a
8ermitir a observa!o da morfologia bacteriana e fornecer informa!"es a respeito do
comportamento do seu material celular diante dos corantes de >ram.

III, Procedimentos:
8reparar esfrega!os a partir de culturas puras de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e ?erratia
marcescens.
=orar os esfrega!os pelo mtodo de colora!o de >ram.
:bservar ao microscpio ptico, sob imerso e identificar a morfologia deste microrganismos e sua
rea!o frente ao mtodo de >ram.

I+, Preparo do es$regao:
8egar uma l6mina limpa no recipiente, secar e flambar rapidamente na c,ama do bico de ;unsen%
Bdentificar o lado da l6mina onde ser feito o esfrega!o%
Ilambar a al!a bacteriolgica dei*$la esfriar e colocar na l6mina uma gota de solu!o
salina fisiolgica%
Ilambar a agul,a bacteriolgica, dei*ar esfriar pr*imo a c,ama, abrir a placa com a cultura teste
e tocar a colTnia escol,ida para retirada da amostra,
3sfregar o material com movimentos de rota!o da al!a bacteriolgica, para se obter um esfrega!o
de forma oval, bem fino e uniforme%
.ei*ar secar nas pro*imidades da c,ama%
Ii*ar o esfrega!o passando a l6mina 5lado oposto ao esfrega!o7 - vezes na c,ama do bico de
;unsen 5rapidamente7.

+, M%todo de Colorao de -ram:
#7 =obrir toda a l6mina com solu!o cristal violeta 5corante ro*o7, aguardar um minuto%
&7 Favar rapidamente em gua destilada%
(7 =obrir a l6mina com solu!o de Bugol 5mordente7 por um minuto%
+7 Favar em gua destilada%
-7, Bnclinar a l6mina e gotear lcool$acetona ou lcool absoluto 5cerca de #- segundos7. Favar a
l6mina rapidamente em gua corrente%
27 =obrir com fucsina de gram e aguardar (0 segundos%
/7 Favar a l6mina em gua destilada e secar 5sem esfregar7%
97 =olocar uma gota de leo de cedro sobre a l6mina e observar em obetiva de imerso 5B::Z7.

*,./0'1+O:
Bactrias Gram-positivas: roo
Bactrias Gram-negativas: rosa!vermelho


+I, Observaes:
: descoramento para mais ou para menos resultante da incorreta diferencia!o pelo lcool$
acetona.
A idade da cultura bacteriana tem Bmport6ncia fundamental na colora!o de >ram. 3m culturas
envel,ecidas, clulas. >ram$positivas freqVentemente se tomam >ram$negativas.
?e ,ouver um questionamento acerca da >ram$positividade ou da >ram$negatividade da cultura,
uma colora!o de >ram paralela aconsel,vel. 8ara isto, deve$se usar culturas bacterianas
con,ecidas como >ram$positivas, tal como Staphylococcus aureus e >ram$negativas, tal
como Escherichia coli, como controles.
3sta colora!o o ponto de partida na identifica!o bacteriana, mas no deve nunca ser utilizada
como um diagnstico definitivo. G importante ressaltar que a colora!o de >ram somente ser um
recurso rpido e Util, quando corretamente realizada e interpretada.


+II, *esumo
.olues em ordem de aplicao
*eao do aspecto das
bact%rias -ram2positivas
*eao do aspecto das
bact%rias -ram2negativas
=ristal violeta =oradas em violeta =oradas em violeta
?olu!o de Bugol
Iorma!o do comple*o =E$B no
interior da clula, que permanece
violeta
Iorma!o do comple*o =E$B no
interior da clula, que permanece
violeta
Nlcool$acetona
.esidrata!o da parede
celular, diminui!o da
porosidade e da
permeabilidade% o
comple*o =E$B no pode sair da
clula, que permanece violeta
3*tra!o dos lip)deos da parede
celular, aumento da porosidade% o
comple*o =E$B removido da
clula
Iucsina ou safranina
A clula no afetada,
permanece violeta
A clula adquire o corante,
tornando$se vermel,a
+III, Questionrio:
#7 A bactria que apresentar na estrutura de sua parede celular uma camada e*tramembranosa, que se
RcoraS de rosa com a colora!o de >ram e que apresentam maior resistncia a antibiticos, alm de ser
potencialmente mais t*icas, classificada como@
a7 ;actria >ram 8ositiva
b7 ;actria >ram Negativa
c7 ;actria de >ram
d7 Micoplasma
e7 4odas as anteriores esto erradas
&7 =omparar a estrutura e a composi!o qu)mica das paredes celulares de bactrias >ram$negativas e
>ram$positivas.
(7 3*plicar a fun!o das porinas na membrana e*terna de clulas bacterianas >ram$negativas.
Ga4arito.
#7
A Y 3rrada Y A bactria >ram 8ositiva no apresenta as caracter)sticas citadas.
; Y =orreta Y A bactria >ram Negativa apresenta todas as caracter)sticas mencionadas.
= Y 3rrada Y A simples referncia a >ram no permite a classifica!o correta destas bactrias.
. Y 3rrada Y Micoplasma no apresentam parede celular.
3 Y 3rrada Y A alternativa ; est correta[
&7 >ram$negativas@ paredes mais finas, mais comple*as, possuem uma membrana e*terna cobrindo uma camada fina de peptideoglicano, a camada de
peptideoglicano das >ram$negativas representa somente - a #01 do peso seco da parede celular. 3sta camada encontrada no espa!o periplasmtico entre
a membrana citoplasmtica e a membrana e*terna, as paredes so constitu)das por lipossacarideos.
>ram$ positivas@ mais espessas, mais simples, tm uma quantidade maior de peptideoglicano em sua parede celular que representa -01 ou mais do peso
seco da parede de algumas espcies >ram$positiva, no possuem membrana e*terna como parte de sua parede celular e no possuem tambm o espa!o
periplasmatico.
(7 Atuam como canais para a passagem de pequenas molculas ,idrof)licas, participando assim do processo de nutri!o. As porinas podem ser especifica,
contendo s)tios de liga!o para um ou mais substratos, ou inespecifica, compondo canais aquosos.
D Aula Prtica Mor8olo*ia ! !$trutura "o$ 8un*o$
I, Fundamentao 'erica: :s fungos so organismos no$fotossintticos que podem apresentar uma
forma filamentosa 5fungos filamentosos7 ou unicelular 5leveduras7. Alguns fungos podem ser
dimrficos, apresentando uma estrutura micelial ou unicelular dependendo das condi!"es do meio.
Placa I - Fungos filamentosos
:s fungos so constitu)dos por uma massa de filamentos muito finos 5miclio7.
=ada filamento5,ifa7 assemel,a$se a um longo tubo cil)ndrico em que as clulas se distinguem umas
das outras devido ' e*istncia de septos 5,ifa septada7 ou sem separa!o das clulas 5,ifas cenoc)ticas7.
:s fungos so constitu)dos por ,ifas vegetativas designadas por talo. 3stas ,ifas penetram no substrato,
tendo algumas fun!"es semel,antes 's ra)zes das plantas 5rizides7. Qeproduzem$se por esporos que
podem ser formados se*uada ou asse*uadamente. As ,ifas frteis e*ibem normalmente as estruturas de
reprodu!o que permitem classificar e identificar os fungos.
II, Ob)etivos
:bserva!o das estruturas de vrios fungos Y ,ifas, miclio, clulas e estruturas de reprodu!o.
III, Material necessrio
$=ulturas de fungos
$Microscpio
$Ansas
$F6minas e lam)nulas
$Fupa
I+, Procedimento
=omparar macroscopicamente as colTnias de diversas culturas de fungos que l,e so fornecidos%
8ara o e*ame microscpico a fresco colocar uma gota de gua sobre a l6mina, adicionar uma
por!o de colTnia e cobrir com uma lamela. :bservar ao microscpio.
:;?.@ 8reparar l6minas com e sem adi!o de lactofenol.
+, *esultados
.escrever as caracter)sticas das colTnias observadas,
.escrever as estruturas reprodutivas dos vrios fungos 5fazer um desen,o7, ,ifas, etc.
Placa II - Leveduras
I, Fundamentao terica: As leveduras so fungos unicelulares que se reproduzem
asse*uadamente por gemula!o ou ciso. 8or vezes, as gmulas no se separam da clula me
formando longas cadeias de clulas que se designa por pseudomiclio. :utras, quando cultivadas em
determinadas condi!"es formam verdadeiro miclio 5dimorfismo7. A morfologia das leveduras
bastante variada. Apresentam clulas esfricas, ovais el)pticas, cil)ndricas, em forma de limo,
triangular e at em forma de garrafa.
II, Material #ecessrio:
$=ulturas de leveduras%
$Microscpio%
$Al!as%
$F6minas e lam)nulas%
III, Procedimento
3*aminar macroscopicamente as colTnias de diversas leveduras%
8ara o e*ame microscpico a fresco colocar uma gota de gua sobre a l6mina, adicionar
uma por!o de colTnia e cobrir com uma lamela. :bservar ao microscpio.
+, *esultados:
$3*aminar as placas e contar o nUmero de colTnias totais e o nUmero de colTnias diferentes em cada
placa%
$.escrever o tipo de colTnias.
$Qegistrar os resultados no quadro abai*o. 5vide Cuestionrio7
+I, Questionrio:
Cuadro Y =aracteriza!o das colTnias observadas
Caract!r>$tica$ "a$ col?nia$
+imenso mm" Cor Forma ,levao Margem *epresentao
E Aula Prtica Titula:;o "! u#a $u$&!n$;o "! 4act!ri%8a*o$
l>tico$ &or conta*!# "! &laca$ 8*ica$'
I, Fundamentao 'erica: :s v)rus so entidades biolgicas acelulares constitu)dos apenas por
um cido nuclico 5.NA ou QNA7 designado por nucleide, envolvido por uma cpsula protica,
designada por cpside. : conunto da cpside e nucleide designam$se por nucleocpside. Alguns
podem ainda ser revestidos por um invlucro 5envelope7 constitu)do por prote)nas e fosfol)pidos,
adquiridos da membrana da clula ,ospedeira, quando do processo de liberta!o das part)culas virais.
4odos os v)rus podem apresentar dois estados@ e*tracelular ou intracelular. : estado e*tracelular,
designado por part)cula viral, corresponde ' forma inerte do v)rus, sob a qual transmitido entre
clulas ,ospedeiras. No estado intracelular ocorre a replica!o do cido nuclico viral e a produ!o de
novas part)culas virais. .este modo, os v)rus so considerados parasitas intracelulares obrigatrios uma
vez que o processo de multiplica!o viral estritamente dependente da maquinaria da clula
,ospedeira. 3*iste uma enorme especificidade entre os v)rus e as suas clulas ,ospedeiras compat)veis.
Assim e*istem v)rus que se replicam apenas no interior de clulas animais, outros em clulas vegetais,
outros em fungos, outros em algas e outros em protozorios. :s bacterifagos#, ou simplesmente
fagos, so v)rus que se replicam apenas no interior de bactrias. A replica!o dos fagos est ainda
restrita a certas espciesWestirpes bacterianas.
: ciclo de multiplica!o dos fagos envolve as
seguintes fases@
5#7 adsor!o a receptores espec)ficos da superf)cie%
5&7 inec!o do genoma do fago para o interior da
bactria%
5(7 replica!o do genoma viral%
5+7 matura!o em que aps a forma!o de todos os
componentes virais e consequente montagem d
origem ' forma!o de novos fagos%
5-7 liberta!o dos novos fagos com ruptura da clula
infectada. 3ste processo de multiplica!o designado
por ciclo l)tico e os bacterifagos so designados por
fagos l)ticos.
8or vezes o genoma do fago no se replica mas integra$se no cromossoma bacteriano, sendo
transmitido ' descendncia bacteriana como parte integrante do seu genoma. 3ste processo designado
por ciclo lisognico e os bacterifagos so designados por fagos temperados. As bactrias que
transportam no seu cromossoma um genoma viral 5profago7 so designadas por lisognicas.
3m determinadas circunst6ncias um \profago] pode ser ativado, replicar$se e induzir o ciclo l)tico
dando origem ' liberta!o de novos fagos. :s v)rus l)ticos provocam a lise da clula bacteriana
,ospedeira quando da sua liberta!o.
8or isso podem ser detectados por dilui!o e espal,amento em superf)cies de gar inoculadas com
clulas ,ospedeiras para a forma!o de placas fgicas.
3stas placas so zonas transparentes sobre uma camada de clulas ,ospedeiras, e representam o ponto
sobre o qual uma part)cula viral infecciosa foi depositada. =omo resultado de ciclos l)ticos
subsequentes, as clulas ,ospedeiras nessas zonas so destru)das.
: taman,o das placas dependente dos tempos de replica!o quer dos v)rus quer das bactrias
,ospedeiras. A contagem de placas fgicas por isso anloga ' contagem de colTnias bacterianas em
cai*a de 8etri, e deste modo, a contagem de placas fgicas pode ser usada para determinar o t)tulo, i.e.
a concentra!o de part)culas fgicas, na suspenso inicial.
II, Ob)etivos. =ontagem de placas fgicas 5os bacterifagos so de e*trema import6ncia para a
terapia gnica e a tecnologia dos transgnicos.7
III, Material necessrio
Por grupo:
9 eppendorfs com 0.< ml de meio F;
9 tubos com - ml de meio F;ss 5mantidos em ban,o a -0 ^=7
9 tubos vazios esterilizados
# erlenmeMer com #00 ml de meio F;s 5mantido em ban,o a -0 ^=7
9 cai*as de 8etri esterilizadas
# micropipeta
# cai*a com pontas amarelas esterilizadas
# tubo com a cultura de clulas ,ospedeiras 53sc,eric,ia coli -<##7
# eppendorf com a suspenso do fago 4/&
I+, Procedimento
No )nicio da aula, distribuir o meio de cultura F;s 5slido7 pelas cai*as de 8etri formando uma camada
fina no fundo. .ei*ar solidificar.
Iundir o meio F;s 5semi$slido7 e manter os tubos em ban,o a -0 ^=. 5=onsulte o flu*ograma em
ane*o como um au*iliar durante o procedimento e*perimental7
#. 8reparar dilui!"es seriadas 5#0$# at #0$97 da suspenso fgica, adicionando 50.# ml7 da
suspenso inicial ao meio l)quido estril F; 50.< mlWeppendorf7.
&. Bdentificar os tubos vazios esterilizados com as dilui!"es realizadas. Qetirar 0.# ml de cada
dilui!o e colocar nos respectivos tubos.
(. Adicionar 0.# ml da cultura bacteriana ,ospedeira 5.:200nmZ#.07 a cada um dos tubos
anteriores.
+. Bdentificar as cai*as de petri previamente preparadas com as dilui!"es efetuadas 5#0$# at
#0$97.
-. Adicionar a cada um dos tubos - ml do meio F;s contido nos tubos mantidos em ban,o a
-0 ^=. Misturar os conteUdos dos tubos por agita!o suave 5evitar a forma!o de bol,as7 e
em seguida derramar e espal,ar uniformemente sobre a superf)cie da camada de F;s das
cai*as de petri correspondentes. 5Nota@ deve preparar # tubo de cada vez para evitar que o
meio solidifique7.
2. Bnocular 0.# ml da cultura de clulas ,ospedeiras isoladamente como controle.
/. .ei*ar que o gar solidifique e incubar as cai*as a (/ ^= durante &+ ,oras.
+, *esultados
:bservar as cai*as e determinar o n^ de placas fgicas 5Rplaque$forming unitsS$pfu7, part)culas fgicas
infecciosas, por ml da suspenso original. Apenas as cai*as contendo (0$(00 placas fgicas devem ser
consideradas@ pfuW0.# ml _ n^ de placas fgicas = fator de dilui!o
=omo apenas foram plaqueados 0.# ml deve multiplicar$se por #0 para obter pfuWml% pfuW#.0 ml _ n^ de
placas fgicas = fator de dilui!o * #0.
At!n:;o. O fago T7 um dos vrios colifagos que infecta estirpes de
Escherichia coli. Possui uma molcula linear de DNA em cadeia dupla. Apresenta cae!a" cauda curta" n#o contrctil e
pertence $ fam%lia Podoviridae (Para mais informaes consultar
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVb/ICTV!/"#$%$$$%.htm&
+I, Questionrio:
Ia!a um pequeno resumo sobre a empregabilidade do bacterifago na agricultura.
=amada de 3. =oli
=amada fgica
E Aula Prtica CONFUGAABO DE BACT0RIAS'
I, Fundamentao 'erica: A conuga!o bacteriana, descoberta por Federberg e 4atum 5#<+27
o processo Rse*ual`de transferncia de genes de uma bactria doadora para outra receptora. 3sta
clula doadora diferenciada durante a conuga!o pela presen!a de um apndice na sua superf)cie
c,amado de pili I.
8ara que uma lin,agem bacteriana sea doadora, ela deve conter um plasm)dio conugativo
5elemento e*tra$cromossTmico7. : processo de conuga!o foi descoberto em E" coli a#& e o
elemento e*tra$cromossTmico responsvel foi c,amado de fator I 5de fertilidade7 ou plasm)dio I.
K dois tipos de plasm)dios conugativos@ os plasm)dios auto$transmiss)veis e os mobilizveis.
:s autotransmiss)veis carregam um conunto de genes, os genes tra# cuos produtos promovem
a transferncia deste plasm)dio para uma clula aceptora. :s genes tra podem ser divididos em dois
grandes grupos@ um grupo, especifica prote)nas envolvidas no s na intera!o superficial 5contacto7
entre as clulas doadora e aceptora, bem como, na forma!o dos poros na membrana. : outro grupo,
refere$se aos genes mob, os quais especificam prote)nas envolvidas na mobiliza!o do .NA. A
transferncia do .NA iniciada pela a!o de um gene mob que tem a atividade em romper 5nicbing7
em uma Unica fita da molcula do .NA, em um s)tio espec)fico, c,amado de ori$ e catalisa o
desenrolamento da dupla ,lice. =omo resultado, somente uma fita, pode ser transferida para a clula
aceptora e a outra fita permanece na clula doadora. Ambas servem como molde para sintetizar a fita
complementar. =oncluindo, os produtos dos genes mob preparam o .NA para serem transferidos,
ainda que os produtos dos genes tra promovem o contacto das clulas doadora$aceptora e promovem
um conte*to f)sico 5forma!o dos poros7 para esta transferncia.
8or outro lado, os plasm)dios mobilizveis codificam, somente um dos conuntos das fun!"es
encontradas nos plasm)dios auto$transmiss)veis para concluir a transferncia. =ontudo, o plasm)dio
mobilizvel deve conter um ori 4. =omo a intera!o mob-ori$ espec)fica, o s)tio de ori$ deve ser
compat)vel com as func"es mob presentes nas clulas doadoras, para que o plasm)dio possa ser
transferido. Hm e*emplo de plasm)dio mobilizvel o plasm)do natural =ol3# ou colicinognico que
codifica as atividades dos genes mob e seu ori$.
3*perimentos genticos demonstraram que todas as trs classes de func"es de conuga!o, tra#
mob e ori$ devem estar presentes para que ocorra conuga!o entre bactrias e bactrias e leveduras.
3stes plasm)dios =ol3# codificam prote)nas c,amadas de colicinas que matam algumas lin,agens
sens)veis de E" coli.
:s plasm)dios conugativos aps serem transferidos e replicados podem permanecerem livres
5autTnomos7 ou integrarem$se ao cromossomo bacteriano 5c,amados de estado integrado7. No
primeiro caso, a lin,agem bacteriana c,amada de I
J
e no segundo Kfr 5 a integra!o do fator I
parece ser mediada por pequenas sequncias c,amadas de elementos B?7. Neste estado, o fator I media
a transferncia do cromossoma da clula Kfr para a clula I
$
. Qaramente, o cromossomo inteiro da
clula Kfr transferido.
As clulas I
J
aps contato com as clulas I
$
, transferem em alta frequncia para esta Ultima
uma rplica ou cpia do plasm)dio I, tornando$a I
J
. 8or outro lado, a lin,agem Kfr cuo fator I est
integrado ao cromossomo bacteriano, transfere, sequencialmente marcadores ou fragmentos deste
cromossomo. Qaramente, o cromossomo inteiro da clula Kfr transferido. : fator I tambm
raramente transferido.
Aps a descoberta do fator I, outros plasm)dios conugativos foram sendo descobertos como
o caso dos fatores ou plasm)dios Q ou Q4I 5fator de transferncia de resistncia7. 3stes plasm)dios
possuem marcadores para a resistncia 's drogas antibacterianas e no integram$se, normalmente no
cromossomo bacteriano. Alguns plasm)dios no promovem conuga!o, mas podem ser mobilizados
por outros plasm)dios conugativos.
II, Ob)etivo
4ranferir de Salmonella typhimurium o plasm)dio que carrega o gene que confere resistncia a
tetraciclina, para a Escherichia coli a#& . 3ste con,ecimento importante para a realiza!o de
processos de transgenia vegetal.
III, Material
4ubos de ensaio %
8lacas com meio slido%
Lina*!n$
a7 .oadora@ Fin,agem de Salmonella typhimurium M>0(# 5 lac
$
, 4et
r
7. Kospeda um plasm)dio que
carrega o marcador que confere resistncia a tetraciclina 54c
r
7.
b7 Qeceptora@ Fin,agem de Escherichia coli a#& 5lac
J
, Nal
r
7. : fentipo de resistncia ao cido
Nalid)*ico deve$se a uma muta!o cromossomal.
Anti4i%tico$
a7 Ncido Nalid)*ico 5Nal7 usar a concentra!o de #0gWml
b7 4etraciclina 54c7 usar a concentra!o de -0 gWml
I+, Procedimento
1G Dia
#. Iazer os pr$inculos das lin,agens doadoras e receptoras em +,0ml de meio 4?;. Bncubar '
temperatura de (/= por uma noite.
-GDia
#. Adicionar em um tubo de ensaio contendo #,0ml de 4?; ou F; as seguintes culturas@
#,0 ml da lin,agem S" typhimurium M>0(# 5doadora7 e
#,0 ml da lin,agem E" coli a#& 5receptora7
&. Agitar bem e incubar por # ,ora sem agita!o ' temperatura de (/=.
(. Iazer as seguintes semeaduras em placa contendo meio slido@
(.# =lula doadora@ S" typhimurium M>0(#
0,#ml 5sem dilui!o7 em meio Mac=onbeM$Nal
0,#ml 5dilui!o #0
$+
7 em meio Mac=onbeM $4c
0,#ml 5dilui!o #0
$-
7 em meio Mac=onbeM $4c
0,#ml 5dilui!o #0
$2
7 em meio Mac=onbeM $4c
(.& =lula receptora@ E" coli a#&
0,#ml 5sem dilui!o7 em meio c4$Nal$4c
0,#ml 5dilui!o #0
$+
7 em meio Mac=onbeM $Nal
0,#ml 5dilui!o #0
$-
7 em meio Mac=onbeM $Nal
0,#ml 5dilui!o #0
$2
7 em meio Mac=onbeM $Nal
(.( Mistura de conuga!o 54ransconugantes7@
0,#ml 5sem dilui!o7 em meio Mac=onbeM $Nal$4c
0,#ml 5dilui!o #0
$#
7 em meio Mac=onbeM $Nal$4c
0,#ml 5dilui!o #0
$&
7 em meio Mac=onbeM $Nal$4c
+. Bncubar em estufa ' temperatura de (/= por #2$&+ ,oras 5durante uma noite7.
+, *esultados
/GDia
Analisar os resultados e determinar a freqVncia de conuga!o. A freqVncia determinada
dividindo o nUmero de clulas transconugantes pelo nUmero total de clulas receptoras.
+I, Questionrio:
#. Alguns v)rus atacam e destroem bactrias e por isso receberam o nome de bacterifagos ou
simplesmente fagos. =om rela!o a esses v)rus afirma$se que@
a7 ?o constitu)dos quimicamente de molculas de ,idrocarbonetos
b7 8ossuem grandes quantidades de mitocTndrias e ergastoplasma essenciais para que se possam
reproduzir
c7 ?o constitu)dos de uma cpsula protica e cido nuclico o .NA, sendo apenas o .NA inetado
na bactria
d7 ?o constitu)dos de nucleoprote)na, e penetram inteiros dentro da bactria, multiplicando$se,
ento, por cissiparidade.
&. A caracteriza!o do v)rus como ser vivo est relacionada com a capacidade de@
a7 ?obreviver em meios de cultura artificiais mantidos em laboratrio
b7 Qealizar a s)ntese de prote)nas, utilizando seus prprios ribossomos
c7 Qeproduzir$se e sofrer modifica!"es nas suas caracter)sticas ,ereditrias
e7 Iabricar o seu prprio alimento, quando em vida livre, e armazen$lo, para uso, quando
cristalizado
(. No mundo dos e*cessivamente pequenos, encontram$se os v)rus, que se caracterizam por
serem@
a7 .e crescimento e multiplica!o restritos ao interior das clulas que parasitam
b7 :rganismos vivos que se apresentam sob uma mesma forma
c7 3struturalmente semel,antes 's clulas vegetais
d7 Agentes infecciosos espec)ficos de clulas animais
+. 3m uma conferncia relacionada ' ecologia, referiu$se ' e*istncia de organismos procariotos,
cua reprodu!o asse*uada e se faz atravs de estruturas especiais, os ,ormogTnios. 3sses
organismos so, tambm, capazes de fi*ar o nitrognio atmosfrico e fazer fotoss)ntese. ?ua
clorofila, no entanto, est dispersa no citoplasma. 4rata$se de@
a7 ;actrias quimiossintetizantes
b7 =ianof)ceas
c7 Algas
d7 4raquefitas
GABARITO@ # = W & = W ( A W + ;
H Aula Prtica A3alia:;o "o cr!$ci#!nto #icro4iano
I, Fundamentao 'erica: : perfil de crescimento de uma popula!o microbiana pode ser avaliado
atravs da determina!o peridica do nUmero de indiv)duos, da massa celular ou atravs da atividade
celular. : processo mais usual o de contagem direta ao microscpio, utilizando c6maras de contagem
que permitem determinar o nUmero total de clulas. 8ara distinguir clulas viveis 5com capacidade
para se multiplicar7 de no viveis necessrio cultivar as clulas num meio de cultura adequado ao
crescimento da espcie em causa. 8ara o efeito, um volume con,ecido de uma suspenso microbiana
espal,ado uniformemente ' superf)cie do meio de cultura 5tcnica de espal,amento7 ou misturado com
o meio ainda liquefeito 5mtodo de incorpora!o7. Aps alguns dias ' temperatura adequada, as
colTnias so contadas 5(0 a (007 e os resultados so e*pressos em unidades formadoras de colTnias
5ufc7. : nUmero de clulas viveis pode ser tambm estimado atravs de dilui!"es sucessivas da
suspenso em anlise 5( a - tubos para cada dilui!o7. Nas dilui!"es mais elevadas no ,aver
crescimento em todos os tubos. : clculo do nUmero mais provvel de microrganismos ser efetuado
com base no nUmero de tubos positivos, recorrendo 's $abelas de MacGrady"
A massa celular pode ser determinada diretamente atravs do peso seco ou indiretamente por
turbidimetria.
=urva que representa o crescimento microbiano em sistema fec,ado, em batc, 5sistema descont)nuo7
II, Ob)etivos:
=ompara!o de mtodos de avalia!o do crescimento microbiano.
1I A3alia:;o (uantitati3a "! u#a &o&ula:;o #icro4iana I Conta*!# !# c)#ara
III, Material necessrio
$=ulturas de microrganismos
$Microscpio
$=6mara de contagem
I+, Procedimento
=olocar na c6mara uma gota da suspenso de microrganismos%
=obrir com a lamela%
=ontar o nUmero de clulas por quadrado 5Na zona central esto gravadas duas grel,as que so
constitu)das por um quadrado dividido em +00 pequenos quadrados, cada um com uma rea de
#W+00 mm&7% 8ara que o valor sea mais preciso fazer contagens em diferentes quadrados e
determinar a mdia%
+, *esultados
: nUmero de microrganismosWml _ N % # #000
pro%undidade&reado'uadrado
N_ valor mdio de microrganismos por quadrado
Numa c6mara em que a profundidade sea de 0,# mm e a rea do quadrado de #W+00 _ 0.00&-
mmd, o nUmero de microrganismosWml ser igual ao valor mdio por quadrado * + * #02.
8rocedimento para avalia!o quantitativa de uma popula!o microbiana $ =ontagem de clulas em c6mara
+I, Questionrios:
#. =ite os fatores necessrios para o crescimento microbiano'
&. =ite a influncia dos fatores qu)micos no crescimento microbiano.
Ga4arito.
1, 6>$ico$. temperatura, 8K e presso osmtica
Ju>#ico$. gua, fontes de carbono, nitrognio, minerais, o*ignio e fatores org6nicos de crescimento.
&7 KGUA. essencial para os microorganismos com disponibilidade varivel no ambiente. :s microorganismos presentes em ambientes com menor
concentra!o de gua desenvolvem mecanismos para obter gua atrvs do aumento da concentra!o de solutos internos, sea pelo bombeamento de )ons
para o interior da clula ou pela s)ntese de solutos org6nicos 5a!ucares, lcoois ou aminocidos7.
6ONTES DE CARBONO@ essencial para a s)ntese de todos os compostos org6nicos necessrios para a viabilidade celular 5elemento estrutural bsico
para os seres vivos7
NITROGENIO9 ENLO6RE E 6OS6ORO@ s)ntese de prote)nas de .NA e QNA
OLIGMNIO. e*tremamente importante no desenvolvimento #icro4iano
:rganismos classificados em@
AERBIOS
$ 3stritos 5obrigados7@ necessitam de :&
$ Iacultativos@ no necessitam de :& mas crescem mel,or com :&
$ Microaerfilo@ necessitam de :& mas em n)veis menores
ANAERBIOS
$ Aerotolerantes@ no necessitam de :& mas crescem mel,or sem :&
$ 3stritos 5obrigados7@ no toleram :& 5letal7
N Aula Prtica A3alia:;o "o !8!ito "! al*un$ 8ator!$ 8>$ico$ no
cr!$ci#!nto #icro4iano'
I, Fundamentao 'erica: : crescimento de um microrganismo afetado pela
disponibilidade de nutrientes e por um conunto de fatores f)sicos como a temperatura, o pK, a presso
osmtica e o potencial de o*ida!oWredu!o do meio. A temperatura um dos fatores que mais afeta o
crescimento e a sobrevivncia dos microrganismos. =ada espcie, em condi!"es e*perimentais bem
definidas, caracterizada por trs temperaturas cardeais Y temperatura m)nima, m*ima e tima de
crescimento. 3stes valores permitem agrupar os microrganismos em psicrfilos, mesfilos e termfilos
e ,ipertermfilos. : comportamento dos microrganismos relativamente ao o*ignio dispon)vel
,eterogneo, e*istindo microrganismos aerbios e anaerbios estritos, aerbios facultativos,
aerotolerantes e micro$aerof)licos.
II, Ob)etivos:
Avaliar o efeito dos fatores f)sicos 5temperatura e pK7 no crescimento microiano.
III, Material necessrio
' =ulturas de microrganismos
$ 8lacas com meio de cultura
$ 4ubos com meio de cultura com diferentes valores de pK Y (, -, /, <
I+, Procedimento
1I E8!ito "o &O
Bnocular cada uma das culturas numa srie de tubos com um meio de cultura a diferentes valores
de pK%
Bncubar as placas a (0P= durante ( dias%
=omparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo.
-I E8!ito "a t!#&!ratura
Bnocular cada uma das culturas numa srie de tubos com um meio de cultura%
Bncubar a -, &- e --P= durante ( a / dias%
=omparar o crescimento observado em cada tubo, para o mesmo microrganismo.
+, *esultados
Eerificar os efeitos do pK e da temperatura no crescimento de cada um dos microrganismos.

=lassifica!o dos microrganismos com base nos valores de pK timo de crescimento.
+I, Questionrio:
1P Aula Prtica Controlo "o cr!$ci#!nto ! #ort! "o$ #icror*ani$#o$
&or #Qto"o$ 8>$ico$'
I, Fundamentao 'erica: A morte de microrganismos, isto , a perda irrevers)vel da
viabilidade, um aspecto fundamental no controlo de microrganismos no laboratrio e na BndUstria,
Iarmacutica e Alimentar. A esteriliza!o pode ser atingida por processos f)sicos e qu)micos. 3ntre os
processos f)sicos pode utilizar$se o calor, a filtra!o e as radia!"es.
II, Ob)etivos:
Avaliar o efeito letal de alguns agentes f)sicos
5 temperatura e radia!"es HE7
III, Material necessrio:
$ =ulturas de microrganismos
$ 8lacas com meio de cultura
$ 4ubos com meio de cultura l)quido
I+, Procedimento:
(- E%eito da temperatura
Bnocular cada uma das culturas numa srie de tubos com um meio de cultura%
Bntroduzir os tubos num ban,o$maria a /0 P= durante -, #0 e #- minutos%
Aps o tempo referido, semear 0,# ml de cada uma das culturas submetidas a temperaturas
diferentes para uma placa%
Bncubar as placas a (0P= durante ( dias%
:bservar o crescimento do microrganismo nas trs condi!"es.
)- E%eito das radia*+es ,-
?emear ( placas com o mesmo microrganismo%
Qetirar as tampas e colocar as placas sobre uma l6mpada HE, protegida com cartolina%
Qetirar uma placa ao fim de #0, &0 e (0 minutos%
Bncubar as placas (0P= durante ( dias%
=omparar o crescimento em cada placa.
+, *esultados
Eerificar os efeitos da alta temperatura e do tempo no crescimento de cada um dos
microrganismos.
Eerificar o efeito das radia!"es no crescimento de cada um dos microrganismos.
11 Aula Prtica I Ati3i"a"! !n<i#tica "o$ #icror*ani$#o$
I, Fundamentao 'erica: As enzimas so prote)nas promotoras de rea!"es qu)micas espec)ficas na
clula. 3stes catalisadores permitem o transporte e utiliza!o de nutrientes indispensveis ' s)ntese de
material celular e ' obten!o de energia. A utiliza!o de um determinado substrato pode ser
caracter)stica de uma dada espcie, permitindo a sua identifica!o. Algumas bactrias fermentam
,idratos de carbono simples, produzindo cidos, alcois e gs como produtos finais. :utros utilizam
molculas mais comple*as como a celulose e o amido. A capacidade de utiliza!o de substratos
espec)ficos, pela anlise dos metabolitos finais produzidos ou pela pesquisa de determinada enzima,
associada ' observa!o morfolgica das clulas microbianas e 's suas caracter)sticas culturais em
meios de cultura slidos eWou l)quidos, so alguns indicadores utilizados em microbiologia na
identifica!o de microrganismos.
II, Ob)etivos:
Avalia!o de atividades enzimticas em alguns microrganismos. Apresenta!o de alguns testes
bioqu)micos usados na detec!o e ou identifica!o de alguns microrganismos
#$ Kidrlise de pol)meros
Amilases
8roteases
&$ Qea!"es de fermenta!o
Iermenta!o de a!Ucares
8rodu!o de sulfetos
Qea!"es BmEic
($ Qea!"es respiratrias
=atalase
=itocromo o*idase
+$ :utras rea!"es
Hrase
1- Pesquisa de amilase
1' I, Fundamentao terica@ Alguns microrganismos ,idrolisam molculas org6nicas de elevado peso
molecular, como por e*emplo o amido, utilizando os seus componentes 5glucose e maltose7 nos
diversos processos metablicos. Ao untar$se uma solu!o de iodo a um meio de cultura com amido
forma$se um comple*o com cor azul se no tiver sido ,idrolisado. =aso contrrio, no , rea!o com o
iodo.
34 &&&" Material necessrio
=ulturas de Escherichia coli e Bacillus subtilis
?olu!o de iodo
8lacas de 8etri com meio de gar de amido
34 &5" Procedimentos
Bnverter uma placa de 8etri e dividi$la em duas sec!"es com um marcador.
?emear uma das sec!"es com 3. =oli e a outra com ;acillus subtilis%
Bdentificar as sec!"es%
Bncubar as placas a (/^= durante &+ a +9 ,oras%
34 5" *esultados:
Aps o aparecimento das colTnias, colocar algumas gotas de solu!o de iodo e verificar o
aparecimento ou no da cor azul.
2- Fermentao de acares simples
-'I, Fundamentao terica: :s principais critrios fisiolgicos de identifica!o de microrganismos
assentam na fermenta!o e na assimila!o de fontes de carbono. A fermenta!o de a!Ucares simples
avaliada em tubos com meio de cultura l)quido, aos quais se adiciona o a!Ucar a testar. 8ara verificar a
produ!o de gs introduzido 5antes da esteriliza!o7, um tubo .ur,am invertido. A produ!o de
cidos confirmada pela altera!o da cor do indicador.
-' II, Material necessrio
=ulturas de Escherichia coli e Proteus vulgaris%
4ubos de =aldo com vermel,o de fenol e glucose 5=om tubos .ur,am7%
4ubos de =aldo com vermel,o de fenol e lactose 5=om tubos .ur,am7%
4ubos de =aldo com vermel,o de fenol e sacarose 5=om tubos .ur,am7%
-'III, Procedimento
Bnocular separadamente cada uma das culturas nos tubos com os diferentes meios%
Bdentificar cada um dos tubos com a espcie inoculada e com a!Ucar adicionado%
Bncubar as placas a (/^= durante &+ ,oras%
-' I+, *esultados
4omar nota das rea!"es obtidas no quadro com base nos seguintes s)mbolos@
A$ produ!o de cido%
;$ alcaliniza!o do meio
>$ produ!o de gs
N$ sem modifica!o de cor do indicador
,sp%cie
Mo"o "! utili<a:;o "o$ a:ucar!$
Gluco$! Lacto$! Sacaro$!
3- ea!es respirat"rias - Pesquisa de #atalase
/'I, Fundamentao terica: 3ste teste bioqu)mico utilizado para comprovar a presen!a de catalase,
enzima que destri o per*ido de ,idrognio, originando K&: e :&. A maioria dos seres vivos possui
catalase.
A citocromo o*idase uma enzima que transfere eltrons para o :& no final da cadeia de transporte de
eltrons. A detec!o desta enzima particularmente Util para fazer a distin!o entre algumas espcies
>ram negativo. Pseudomonas aeruginosa de Escherichia coli, por e*emplo. A presen!a de citocromo
o*idase detectada pela o*ida!o de um receptor artificial de eltrons 5p-%enilenodiamina7.
/'II, Material necessrio:
F6minas%
=ulturas de ;acillus sp%
=ulturas de Factobacillus sp.%
Ngua o*igenada 5(17%
/' III, Procedimento:
=olocar numa l6mina uma por!o de cultura%
Adicionar uma gota de gua o*igenada a (1%
/' I+, *esultados:
Eerificar se , ou no desprendimento gasoso%
4omar nota dos resultados obtidos em cada uma das espcies.
8esquisa do =itocromo o*idase
Q/,.'&O#1*&O:
,m grupo: reali6ar e apresentar o seguinte e!perimento:
Qeprodu!o em cultura qualquer 5escol,er um meio e coletar7
I, Mat!rial n!c!$$rio
=ultura microbiana a testar
8apel de filtro
4etrametil$parafenildiamina.K=l 5#1 eWE em gua7.
II, Proc!"i#!nto
Misturar a cultura em estudo com uma solu!o de tetrametil$parafenildiamina.K=l numa fol,a
de papel de filtro.
III, R!$ulta"o$.
Eerificar a altera!o da cor. 3ste indicador incolor na forma reduzida e adquire uma cor
pUrpura na forma o*idada 5resultado positivo7.
,sp%cie
Cor inicial "o #!io Cor 8inal "o #!io
1- Aula Prtica I A3alia:;o "a conta#ina:;o 8!cal "! *ua$
I, Fundamentao 'erica@ A pesquisa peridica de microrganismos fecais numa rede de
abastecimento de guas essencial para se verificar a pureza da gua. Escherichia coli um bom
indicador da contamina!o fecal Y fcil de identificar, ,ospedeiro ,abitual do intestino e no
aparece normalmente na gua.
A Escherichia coli pertence ao grupo dos coliformes que se apresentam como bacilos no esporulados,
>ram negativo, anaerbios facultativos que fermentam a lactose com produ!o de gs.
II, Ob)etivos:
8esquisa de coliformes em guas e determina!o do NM8 de coliformes%
8esquisa de Escherichia coli"
III, Material necessrio:
$4ubos com caldo de lactose
$8lacas com Agar 3ndo
$4ubos com caldo MQ$E8
$4ubos com gua peptonada
$4ubos com Agar de =itrato$?immons
$Iiltros de 0,+-
1- Pesquisa de Coliformes:
#.# 4este presuntivo@ pesquisa de fermentadores de lactose
I+, Procedimento
8ipetar # ml da amostra de gua para cada um dos tubos com caldo de lactose, com tubo .ur,am
invertido. Bncubar a (- ^= durante &+ a +9 ,oras.
+, *esultados:
:bserva!o dos tubos ao fim de &+ a +9 ,oras. A presen!a de gs em pelo menos #W+ do tubo
.ur,am indicativa da presen!a de coliformes.
+I, Questionrio:
3m caso positivo fazer a determina!o do NM8 de coliformes por #00 ml de gua com base nas tabelas
de Mac>radM, em caso negativo apenas fazer o relatrio base.
Prtica Opcional:
2 - Pesquisa de $sc%eric%ia coli &membrana filtrante'
+II, Procedimento
Iiltrar #00 ml da amostra de gua para placas de Agar 3ndo% Bncubar a ++ ^= durante &+ a +9
,oras.
+III, *esultados:
: aparecimento de colTnias carmim indicativo da presen!a de Escherichia coli. .evero ser
efetuados os testes BMEi=.
1/ Aula Prtica I Si#4io$! "! #icror*ani$#o$ co# &lanta$'
B7 Fundamentao 'erica@ A disponibilidade de azoto no solo o maior fator limitante na
Agricultura, apesar da atmosfera ser constitu)da por 901 de azoto. A molcula de azoto
quimicamente muito estvel e apenas alguns procariotas tm capacidade de reduzir a uma
forma biologicamente assimilvel. A associa!o .hi/obium * leguminosa o mais eficiente
sistema de fi*a!o de azoto atmosfrico. As espcies do gnero .hi/obium so bactrias do solo
capazes de provocarem o aparecimento de rgos especializados nas ra)zes das plantas, os
ndulos, nos quais ocorre a redu!o do azoto.
As espcies do gnero .hi/obium apresentam a forma de bacilos curtos, isolados ou aos pares, no
esporulados, >ram negativo, mveis por flagelos polares, apresentando gr6nulos de poli$b$
,idro*ibutirato nas culturas mais envel,ecidas. No interior do ndulo as clulas apresentam formas
diversificadas designando$se por bacterides.
II, Ob)etivos:
:bserva!o da nodula!o em diferentes leguminosas.
:bserva!o dos bacterides.
Bsolamento de .hi/obium a partir dos ndulos.
III, Material necessrio
$Microscpio
$F6minas e lamelas
$=ai*as de 8etri esterilizadas
$Al!a, 8in!a e tesoura
$Nlcool a /01
$Ngua esterilizada distribu)da em tubos com &0ml
$?olu!o de li*)via a #1
$8lacas com Agar de Manitol$levedura
I+, *esultado/Questionrio:
:bserva!o da nodula!o em diferentes leguminosas
Bdentificar as plantas%
=ortar a parte area da planta%
Favar o sistema radicular em gua corrente%
=olocar sobre uma fol,a de papel%
:bservar e tomar nota da seguinte forma@
Plantas &orma os
'(ulos
)isposi*o ao
longo o
Constitui*o
interna
+bservaes
pessoais
sistema raicular
ANELO 1 I M!io$ "! cultura
Meio de gar nutritivo:
O 3*trato de carne ..................................... ( g
O 8eptona ................................................... - g
O Agar ........................................................ #- g
O Ngua destilada ....................................... #000 ml
Acertar a pK 2,9$/,0. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos
Caldo nutritivo:
O 3*trato de carne ..................................... ( g
O 8eptona ................................................... - g
O Ngua destilada ....................................... #000 ml
Acertar a pK final 2,9$/,0. .istribuir em tubos. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos
1gar de de!trose .abouraud
O 8eptona ................................................... #0 g
O .e*trose .................................................. +0 g
O Agar ........................................................ #- g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK -,2. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
7 Malte 1gar
O 3*trato de malte ..................................... ( g
O 3*trato de levedura ................................. ( g
O 8eptona ................................................... - g
O >lucose ................................................... #0 g
O Agar ......................................................... &0 g
O Ngua destilada ....................................... #000 ml
Acertar a pK -,0. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
7 Malte Caldo
O 3*trato de malte ..................................... ( g
O 3*trato de levedura ................................. ( g
O 8eptona ................................................... - g
O >lucose ................................................... #0 g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK -,0. .istribuir em tubos. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
1gar de amido
O 3*trato de carne ..................................... ( g
O Amido solUvel ........................................... #0 g
O Agar ........................................................ #- g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK /,0. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
Caldo com vermel8o de $enol 9 meio base
O 8eptona ................................................... #0 g
O 3*trato de carne ..................................... # g
O =loreto de sdio ....................................... - g
O Eermel,o de fenol ..................................... 0,0#9 g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK /,&. .istribuir em tubos. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
#ota: para avaliar a $ermentao de a:cares adicionar; separadamente; < g/l de glucose; lactose ou
sacarose4
1gar de ur%ia
O 8eptona ................................................... # g
O .e*trose ................................................... # g
O =loreto de sdio ....................................... - g
O Iosfato de potssio .................................... & g
O Hria ....................................................... &0g
O Eermel,o de fenol ..................................... 0,0#& g
O Ngua destilada ..................................... #00 ml
#ota: 1certar a p= >;?4 ,sterili6ar a mistura por $iltrao 1"4 ,sterili6ar a mistura de 3< g de gar
com @AA ml de gua a 3B3CC durante 3< minutos D"4 +ei!ar arre$ecer D e adicionar os 3AA ml de E
+istribuir em tubos e inclinar4
Caldo de lactose
O 3*trato de carne ...................................... ( g
O 8eptona .................................................... - g
O .$lactose ................................................. - g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK 2,<. .istribuir em tubos. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
Fgua peptonada
O 8eptona .................................................... #0 g
O =loreto de sdio ....................................... - g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK /,&. .istribuir em tubos. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
#ota: Para pesGuisar a $ermentao de a:cares adicionar 3;? ml de vermel8o de $enol4
1gar ,ndo
O 8eptona ................................................... #0 g
O .$lactose .................................................. #0 g
O ?ulfito de sdio ........................................ &,- g
O Iosfato de potssio .................................... (,- g
O ANgar ........................................................ #- g
O Iucsina bsica ........................................... 0,- g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK /,-. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
1gar de Citrato2 .immons
O ?ulfato de magnsio .................................. 0,& g
O =loreto de sdio ........................................ - g
O Iosfato de amTnio .................................... #g
O Iosfato de potssio .................................... #g
O =itrato de sdio ......................................... & g
O Agar ........................................................ #- g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK 2,9$/,0. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
Caldo M*25P
O 8eptona .................................................... / g
O Iosfato de potssio .................................... - g
O .e*trose ................................................... - g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK 2,9$/,0. .istribuir em tubos. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
1gar de Manitol2levedura
O Iosfato de potssio .................................... 0,- g
O ?ulfato de magnsio .................................. 0,& g
O =loreto de sdio ........................................ 0,# g
O Manitol ..................................................... #0 g
O 3*trato de levedura ................................. 0,+ g
O Agar ........................................................ #- g
O Ngua destilada ..................................... #000 ml
Acertar a pK 2,9$/,0. 3sterilizar a #&#P= durante #- minutos.
#ota: Podero ser adicionados; separadamente; os seguintes corantes: 5ermel8o do Congo 3H" ou
16ul de Dromotimol A;<H"4
Meio de 0D 0uria2Dertani Medium"
O 4riptona #0 g
O 3*trato de levedura - g
O Na=l #0 g
O Ngua destilada #000 ml
0gitar at a completa dissolu*1o" 02ustar o p3 a 4#5 com 6N Na73 895")ml:" Esterili/ar em autoclave
durante (6 minutos a ()(;<"
Meio de 0Dss 0uria2Dertani semi2slido"
O 4riptona #0 g
O 3*trato de levedura - g
O Na=l #0 g
O Agar / g
O Ngua destilada #000 ml
=Bss > =B ? 5"4@ 0gar
Meio de 0Ds 0uria2Dertani slido"
O 4riptona #0 g
O 3*trato de levedura - g
O Na=l #0 g
O Agar #- g
O Ngua destilada #000 ml
=Bs > =B ? ("6@ 0gar