ANLISE MICROBIOLGICA

A contaminao das guas por excretas de origem humana ou animal pode torn-las um veculo na
transmisso de agentes de doenas infecciosas. Dessa forma, a vigilncia da qualidade microbiolgica da
gua essencial, sendo requerida pelas legislaes aplicadas nos mais diversos usos da gua. Somente
pessoas e animais infectados eliminam microorganismos patognicos, que podem estar em concentraes
extremamente baixas nas amostras de gua e requerem mtodos especficos de concentrao.
Na rotina para monitoramento da gua e atendimento das regulamentaes de sua qualidade so
realizadas as anlises dos microrganismos indicadores de poluio fecal, os quais podem indicar o risco da
presena de microrganismos enteropatognicos.
A coleta de amostras de gua para exame microbiolgico apresenta tcnica diferenciada em gua
bruta e tratada e deve ser realizada sempre antes da coleta de qualquer outro tipo de ensaio ou
determinao de campo, a fim de se evitar o risco de contaminao do local de amostragem com frascos ou
amostradores no estreis.
O objetivo do exame microbiolgico da gua fornecer subsdio a respeito da sua potabilidade, isto
, ausncia de risco de ingesto de microorganismos patognicos (causadores de doenas), geralmente
provenientes da contaminao pelas fezes humanas e outros animais de sangue quente. Os
microorganismos patognicos incluem vrus, bactrias, protozorios e helmintos.
Em geral no se devem retirar amostras prximas s margens de rios, canais e no ponto de
lanamento de despejos, exceto quando essas regies so de interesse especfico, pois a qualidade, em tais
pontos, geralmente no representativa de todo o corpo dgua. No caso da contribuio dos tributrios
(afluentes), importante acompanhar a qualidade de suas guas, e como ela afeta o corpo principal, por
meio da coleta de amostras em ponto prximo da sua desembocadura (foz) ou de acordo com o objetivo do
trabalho.


COLETA DA AMOSTRA

Material necessrio
1. Frascos de coleta ou bolsa de coleta;
2. Caixa trmica com gelo reciclvel;
3. Kit para dosagem de cloro residual livre;
4. Formulrio de Coleta (3 vias para cada ponto de coleta);
5. Caneta esferogrfica;
6. Papel toalha;
7. Luvas de procedimento;

Os frascos para anlises microbiolgicas devem ser submetidos descontaminao em autoclave,
temperatura de 121C e presso de 1ATM, durante 30 minutos. Aps a autoclavagem, deve-se proceder a
lavagem dos frascos observando-se a seguinte seqncia: limpar a parte externa com uma esponja;
adicionar uma gota de detergente lquido, no txico, no interior de cada frasco e escovar a parte interna
com auxlio de uma escova; enxaguar 10 vezes com gua corrente e, em seguida, mais 3 vezes com gua
destilada; aps a lavagem deixar os frascos emborcados numa estufa a 80/100C durante 1 hora para
secagem.
Aps a secagem, o frasco deve ser preparado previamente no laboratrio, estril e conter:
1. EDTA em quantidade necessria para complexar metais pesados que possam estar presentes na
amostra (por exemplo, cobre), e
2. tiossulfato de sdio, se houver a suspeita da presena de cloro livre, este frasco no deve ser
ambientado e a coleta deve ser pontual, ou seja, a amostra para ensaio microbiolgico no deve ser
composta.

NOTA: O prazo de validade de frascos esterilizados de 60 dias. Se no forem utilizados neste perodo
devem ser devolvidos para nova esterilizao.


Procedimento de coleta
1. Lavar as mos e sec-las, se possvel utilizar luvas de procedimento;
2. Numerar os frascos e o formulrio de coleta correspondente;
3. Abrir a torneira, deixando a gua escoar por cerca de 3 minutos ou o tempo suficiente para eliminar
a gua estagnada na tubulao;
4. Ajustar a abertura da torneira em fluxo baixo de gua e coletar o volume necessrio para os
ensaios: Para anlise microbiolgica (Deve ser sempre a primeira coleta realizada).


Tcnicas de preservao e armazenamento de amostras
Os frascos e as tampas devem ser de material resistentes s condies de esterilizao e ao
solvente da gua e no devem liberar compostos txicos, como bactericidas ou bacteriostticos durante a
esterilizao. Podem ser de vidro neutro, de vidro borossilicato ou plstico autoclavvel, com boca larga
(mais ou menos 4cm) para facilitar a coleta e a limpeza.


PROCEDIMENTOS DE COLETA DE AMOSTRAS PARA ENSAIO MICROBIOLGICO

Para coleta em residncias
lavar as mos com gua e sabo;
limpar a torneira do usurio com um pedao de algodo embebido em lcool, 70% e/ou hipoclorito
de sdio 100mg/L;
abrir a torneira e deixar escorrer a gua durante 1 ou 2 minutos;
coletar a amostra de gua;
encher com pelo menos 3/4 de seu volume;
tampar o frasco, identific-lo, anotando endereo, hora, e nome do coletor, etc;
marcar o frasco com o nmero da amostra, correspondente ao ponto de coleta;
preencher a ficha de identificao da amostra de gua;
colocar o frasco da amostra na caixa de isopor com gelo;
lacrar, identificar e enviar a caixa para o laboratrio.
O tempo de coleta e a realizao do exame no devem exceder 24 horas.
Nota: Alm de residncias as amostras podem ser coletadas em hospitais, escolas, torneiras
pblicas e pontos considerados vulnerveis. No caso de utilizao do hipoclorito de sdio para
desinfeco da torneira, deve-se remov-lo completamente antes da coleta.







Para coleta em guas superficiais:

As amostras para anlises microbiolgicas devem, preferencialmente, ser recolhidas diretamente
nos frascos esterilizados que sero enviadas para anlise; ou em baldes esterilizados.
Remover a tampa do frasco, juntamente com o papel alumnio protetor, tomando cuidado para
evitar a contaminao da amostra pelos dedos das luvas ou outro material;
Manter a tampa sobre o frasco no momento da coleta a uma distncia de aproximadamente 10
centmetros, para evitar a contaminao da parte interna da tampa ou queda de qualquer material
no interior do frasco;
Encher o frasco com a amostra at aproximadamente (trs quartos) do seu volume, para
possibilitar sua homogeneizao durante o processo de ensaio no laboratrio (Fig. 65);
Fechar imediatamente o frasco, fixando muito bem o papel alumnio protetor em volta da tampa;
Identificar a amostra;
Acondicionar e transportar a amostra em caixa trmica, sob refrigerao (Fig. 66).








A Portaria n 2.914/2011 do Ministrio da Sade estabelece que para garantir sua potabilidade seja
verificada, na gua para consumo humano, a ausncia de coliformes totais e Escherichia coli e determinada
a contagem de bactrias heterotrficas.
Determina ainda que a contagem de bactrias heterotrficas deva ser realizada como um dos
parmetros para avaliar a integridade do sistema de distribuio (reservatrio e rede), devendo ser feita em
20% das amostras mensais de coliformes totais nos sistemas de distribuio, recomendando que no deva
exceder a 500 Unidades Formadoras de Colnias por 1 mililitro de amostra (500 UFC/mL).
Para a conformidade do padro microbiolgico de potabilidade obrigatrio a ausncia de
coliformes totais em 100 mL de amostra na sada do tratamento. No entanto, conforme Anexo I da Portaria
MS n 2.914/2011, admite-se a presena de coliformes totais em apenas 1 amostra mensal para sistemas
ou solues coletivas que abastecem menos de 20.000 habitantes e em 5% das amostras mensais em
sistemas ou solues coletivas que abastecem mais de 20.000 habitantes. Ressalta-se que em ambas as
situaes no so permitidas a presena de Escherichia coli na gua para consumo humano.


Anexo I Portaria 2914/2014


As bactrias do grupo coliforme so consideradas os principais indicadores de contaminao fecal.
Todas as bactrias coliformes so gram-negativos, no esporulados, aerbios ou anaerbios e esto
associadas com as fezes de animais de sangue quente e com o solo. Existem dois grandes gneros do grupo
coliforme: totais e fecais (ou termotolerantes).


Bactrias do grupo coliforme
Conceitos:
Coliformes totais (bactrias do grupo coliforme) - bacilos gram-negativos, aerbios ou anaerbios
facultativos, no formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de desenvolver na presena de sais
biliares ou agentes tensoativos que fermentam a lactose com produo de cido, gs e aldedo a 35,0
0,5C em 24-48 horas, e que podem apresentar atividade da enzima - galactosidase. A maioria das
bactrias do grupo coliforme pertence aos gneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter,
embora vrios outros gneros e espcies pertenam ao grupo.


Coliformes fecais ou termotolerantes

Os coliformes fecais so tambm conhecidos como termotolerantes por suportarem uma temperatura
superior 40C, convivem em simbiose com humanos, bois, gatos, porcos e outros animais de sangue
quente. So excretados em grande quantidade nas fezes e quando esto no trato digestivo. Neste grupo
est presente a bactria gram-negativa Escherichia coli, e ao se ingerir alimentos por ela contaminados, os
resultados desagradveis (como gastrenterite, por exemplo) podem ser brandos ou desastrosos,
dependendo do grau de contaminao. Os coliformes fecais, por serem termotolerantes, no se multiplicam
fora dos intestinos dos animais de sangue quente. As bactrias coliformes termotolerantes reproduzem-se
ativamente a 44,5 - 45,5C e so capazes de fermentar a lactose com produo de gs em 24 horas.


Escherichia coli - bactria do grupo coliforme que fermentaa lactose e manitol, com produo de cido e
gs a 44,5 0,2C em 24 horas, produz indol a partir do triptofano, oxidase negativa, no hidroliza a ureia
e apresenta atividadedas enzimas galactosidase e glucoronidase, sendo considerado o mais especfico
indicador de contaminao fecal recente e de eventual presena de organismos patognicos.


Estreptococos
A pesquisa de estreptococos, o mais caracterstico o Streptococcus faecalis, pode servir para confirmar a
origem fecal da contaminao em casos duvidosos. Os estreptococos fecais podem aparecer nas fezes em
nmero variado, geralmente inferior ao nmero de E.coli, e na gua morrem e desaparecem em proporo
semelhante de E.coli, e mais rapidamente que outros membros do grupo coliforme. Portanto, se numa
amostra de gua se encontram bactrias coliformes, mas no E.coli, a presena de estreptococos fecais
confirma a origem fecal da contaminao. Os estreptococos fecais so aplicados nos estudos de correlao
com coliformes fecais em levantamentos sanitrios e investigaes sobre poluio de cursos dgua, para
verificar se a poluio de origem animal ou humana. Sabe-se que:

Estreptococos fecais/coliformes fecais < 0,7 indica poluio de origem animal

Coliformes fecais/estreptococos fecais > 0,4 indica poluio de origem humana




EXAMES


Antes de iniciar os exames:
1. Desinfetar a bancada do laboratrio usando uma soluo de lcool etlico a 70% ou outro
desinfetante que no deixe resduo;
2. Todas as amostras a serem examinadas devem ser homogeneizadas pelo menos 25 vezes;
3. No esquecer de flambar a boca dos tubos de ensaio contendo meios de cultura, antes de us-
los;
4. O tiossulfato de sdio a 10% colocado nos frascos de coleta para neutralizar a ao do cloro;
5. As placas de Petri devem ser colocadas na posio invertida para evitar a condensao de gua
na superfcie do gar;
6. Fazer a contagem padro de bactrias heterotrficas, sempre em duplicata.



COLIFORMES TOTAIS
MTODO DOS TUBOS MLTIPLOS (TM)



Execuo do teste

Teste presuntivo
1. Tomar uma bateria contendo 15 tubos de ensaio distribudos de 5 em 5;
2. Nos primeiros 5 tubos, (os que contm caldo lactosado de concentrao dupla) inocular, com
pipeta esterilizada, 10 mL da amostra de gua a ser examinada, em cada tubo. (Diluio 1:1);
3. Nos 10 tubos restantes (os que contm caldo lactosado de concentrao simples), inocular nos 5
primeiros 1 mL da amostra (Diluio 1:10) e nos 5 ltimos tubos,
4. Inocular 0,1 mL da amostra, em cada tubo. (Diluio 1:100);
5. Misturar;
6. Incubar a 35 0,5C durante 24/48 horas;
7. Se no final de 24/48 horas, houver a formao de gs dentro do tubo de Durhan, significa que o
teste presuntivo foi Positivo. Neste caso, fazer o teste confirmativo. Se no houver a formao de gs
durante o perodo de incubao, o exame termina nessa fase e o resultado do teste considerado negativo.
Observao: No lugar do caldo lactosado pode ser usado o caldo Lauril Triptose.

Teste confirmativo
1. Tomar o nmero de tubos do teste presuntivo que deram Positivos (formao de gs) nas 3
diluies 1:1; 1:10 e 1:100;
2. Tomar igual nmero de tubos contendo o meio de cultura verde brilhante Bile a 2%;
3. Com a ala de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo uma poro de
amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio verde brilhante. Esse procedimento chama-se
repicagem;
4. Identificar os tubos;
5. Incubar durante 24/48 horas a 35 0,5C;
6. Se no final do perodo de 24/48 horas houver a formao de gs dentro do tubo de Durhan o
teste considerado positivo. Caso no haja formao de gs, o teste considerado negativo.









Expresso dos resultados
1. Resultados so expressos em NMP (Nmero Mais Provvel) /100 mL de amostra.
2. Para se determinar o NMP, verifica-se a combinao formada pelo nmero de tubos positivos que
apresentaram as diluies 1:1; 1:10 e 1:100 no Teste Confirmativo.

Exemplo:
a) nos 5 tubos da diluio 1:1, obtiveram-se 3 tubos positivos;
b) nos 5 tubos da diluio 1:10, obtiveram-se 2 tubos positivos;
c) nos 5 tubos da diluio 1:100, obteve-se 1 tubo positivo;
d) formou-se, portanto, a combinao 3-2-1;
e) determina-se o NMP consultando a Tabela 1.

Se no quiser trabalhar com 15 tubos para determinar o NMP. Fazer apenas 5 tubos na diluio 1:1 (10 mL
do meio de cultura + 10 mL da amostra) e calcular o NMP. Consultando a tabela 2.
















COLIFORMES TERMOTOLERANTES
MTODO DOS TUBOS MLTIPLOS (TM)

Execuo do ensaio
1. Tomar todos os tubos do Teste Presuntivo que deram Positivos (Formao de gs) e todos os tubos
negativos em que houve crescimento aps 48 horas, nas 3 diluies (1:1; 1:10 e 1:100);
2. Transferir, com ala de platina flambada e fria, uma poro para os tubos de ensaio contendo o
meio EC;
3. Misturar e deixar todos os tubos em banho de gua durante 30 minutos;
4. Incubar em banho-maria a 44,5 0,2C durante 24 2 horas;
5. Se no final de 24 horas ou menos houver a formao de gs, est indicada a presena de coliformes
termotolerantes;
6. Calcular o NMP consultando a tabela 1.

NOTA: Esse ensaio deve ser realizado simultaneamente ao Teste Confirmativo para Coliformes Totais.

OBSERVAO: Fazer esse exame toda vez que forem realizados testes confirmativos para coliformes totais.



COLIFORMES TOTAIS
MTODO DA MEMBRANA FILTRANTE (MF)

Execuo do ensaio
1. Com a pina, colocar cuidadosamente na placa de Petri um carto absorvente;
2. Com pipeta esterilizada colocar 1,8 mL do meio de cultura no carto absorvente e tampar a placa;
3. Colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a pina previamente flambada e fria;
4. Agitar o frasco contendo a amostra, pelo menos 25 vezes;
5. Destampar e flambar a boca do frasco;
6. Verter, cuidadosamente, 100 mL de amostra no porta-filtro, evitando que a gua respingue sobre as
bordas superiores;
7. Ligar a bomba de vcuo (seringa) e fazer a suco;
8. Depois de filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes do funil com gua de diluio estril com
pores de 20 mL aplicando vcuo;
9. Aps a lavagem e filtrao, aliviar o vcuo e remover o funil do suporte;
10. Com a pina flambada e fria, remover o filtro do suporte e coloc-lo na placa de Petri, antes
preparada, com o lado quadriculado para cima;
11. Tampar a placa de Petri e incub-la invertida a 35C durante 24 2 horas;
12. Aps o perodo de incubao, examinar o filtro fazendo a contagem das colnias.


Leitura dos resultados
As colnias indicativas de coliformes totais tpicas tm uma cor rosa a vermelho escuro, com brilho metlico.
O brilho pode aparecer no centro ou na periferia da colnia. As no coliformes aparecem com colorao
vermelho-clara ou escura sem o brilho metlico caracterstico.

OBSERVAO: s vezes, quando o disco est muito mido e a fonte de luz muito intensa, as colnias de
no coliformes podem aparecer com um brilho falso, causando erros. Isso poder ser contornado usando-se
fonte de luz mais difusa ou secando o filtro antes de ser examinado.


Preparo do meio de cultura

TCNICA
1. Pesar 4,8 gramas do meio desidratado;
2. Transferir para o Erlenmeyer;
3. Adicionar aos poucos 100 mL de gua destilada contendo 2 ml de lcool etlico a 95%;
4. Aquecer em banho-maria ou no bico de Bunsen at o incio da fervura (no deixar ferver);
5. Deixar esfriar;
6. Distribuir 1,8 mL em cada placa.

OBSERVAES: Preparar somente a quantidade necessria para uso. Esse meio pode ser adquirido em
ampolas de 2 mL, porm o custo muito elevado. mais econmico prepar-lo no laboratrio. Em
substituio ao meio m Endo Broth MF poder ser utilizado o meio slido (LES Endo agar).







COLIFORMES TERMOTOLERANTES
MTODO DA MEMBRANA FILTRANTE (MF)


Execuo do ensaio
1. Com a pina, colocar cuidadosamente na placa de Petri um carto absorvente;
2. Com pipeta esterilizada colocar 2,0 mL do meio de cultura no carto absorvente e tampar a placa;
3. Colocar a membrana filtrante no porta-filtro, com a pina previamente flambada e fria;
4. Agitar o frasco contendo a amostra, pelo menos 25 vezes;
5. Destampar e flambar a boca do frasco;
6. Verter, cuidadosamente, 100 mL de amostra no porta-filtro, evitando que a gua respingue sobre as
bordas superiores;
7. Ligar a bomba de vcuo (seringa) e fazer a suco;
8. Depois de filtrada a amostra, lavar 3 vezes as paredes do funil com gua de diluio estril com
pores de 20 mL aplicando vcuo;
9. Aps a lavagem e filtrao, aliviar o vcuo e remover o funil do suporte;
10. Com a pina flambada e fria, remover o filtro do suporte e coloc-lo dentro da placa de Petri, com o
lado quadriculado para cima;
11. Tampar a placa de Petri e incub-la invertida a 44,5 0,2C durante 24 2 horas;
12. Encerrado o perodo de incubao, examinar o filtro fazendo a contagem das colnias;
13. As colnias indicativas de coliformes termotolerantes aparecem de cor azul. As no coliformes
aparecem com colorao clara ou rsea.


Esterilizao do conjunto de filtrao no campo
1. Umedecer cuidadosamente o anel de asbesto situado na base do suporte, com meia tampa de lcool
metlico (tampa do frasco de lcool);
2. Atear fogo;
3. Colocar a cuba de ao por cima do funil quase o tampando;
4. Aps aquecer a cuba at o suportvel pela mo, tampar o suporte;
5. Esperar 15 minutos, aproximadamente e ento remover a cuba e lavar o funil com gua de diluio
estril a fim de remover qualquer resduo txico.

OBSERVAES: A combusto incompleta do metanol provoca a formao de aldedo frmico que o agente
esterilizante. O suporte do filtro deve estar estril no incio de cada srie de filtrao e essa srie no deve
ultrapassar mais de 30 amostras. A cada srie de filtrao efetuar o exame de 100 mL da gua de diluio
para controle da esterilidade do porta-filtro. Os meios de cultura preparados para uso com membrana
filtrante valem por 96 horas quando guardados em refrigerador com temperatura entre 2 a 10C. O
conjunto de filtrao tambm pode ser esterilizado em autoclave.



COLIFORMES TOTAIS E ESCHERICHIA COLI

Teste de presena/ausncia

MTODO DO SUBSTRATO CROMOGNICO

A opo da metodologia para a realizao dos exames bacteriolgicos da gua recai naquele
procedimento que melhor se adequar s condies do laboratrio, devendo-se, no entanto, adotar como
padro as metodologias, frequncias e interpretao de resultados estabelecidas e recomendadas pela
legislao em vigor. Os mtodos de Tubos Mltiplos (TM) e Membrana Filtrante (MF) ainda so largamente
utilizados, entretanto a opo pelo mtodo de Substrato Cromognico-Fluorognico Definido comumente
adotado pela facilidade de manuseio, bem como por ter relativo custo/benefcio j comprovado.
O mtodo baseado nas atividades enzimticas especficas dos coliformes ( galactosidade) e E.
coli ( glucoronida-se). Os meios de cultura contm nutrientes indicadores (substrato cromognico) que,
hidrolisados pelas enzimas especficas dos coliformes e/ou E. coli, provocam uma mudana de cor no meio.
Aps o perodo de incubao, se a cor amarela observada, coliformes totais esto presentes.
Se a fluorescncia azul observada sob luz ultravioleta (UV) 365 nm, E. coli est presente.
Alm da maior preciso, esse mtodo tem como vantagem o tempo de resposta, j que a
determinao simultnea de coliformes (totais) e E. coli efetuada aps incubao das amostras a 35C por
24 horas, no havendo necessidade de ensaios confirmativos.

Execuo do ensaio
1. Coletar a amostra (100mL) em um frasco estril ou saco de coleta contendo tiossulfato de sdio a
10% para gua tratada;
2. No prprio frasco ou saco adicionar o contedo de 1 (um) frasconete contendo o substrato
cromognico;
3. Fechar o frasco ou o saco e agitar levemente, no precisa dissolver totalmente, essa dissoluo
ocorrer de forma natural;
4. Incubar a 35,0 0,5C durante 24 horas.

Interpretao e expresso dos resultados
Decorridas 24 horas de incubao, retirar da estufa o material e observar visualmente o frasco ou
saco. Se apresentar colorao amarelada, o resultado presena de Coliformes Totais na amostra.
Com o auxlio de uma lmpada ultravioleta 365 nm, observar se existe fluorescncia azul nas amostras que
desenvolveram colorao amarelada aproximando a lmpada ao frasco. Se a amostra apresentar colorao
amarelada e fluorescncia com a luz UV-365 nm significa que h presena de Escherichia coli na amostra
examinada. Caso a amostra permanea transparente, o resultado negativo, tanto para Coliformes Totais
como para E. coli. Expressar o resultado como: Presena ou Ausncia de Coliformes Totais ou Escherichia
coli.

NOTA: A fluorescncia azul ocorre somente na presena da luz ultravioleta, ao tirar o frasco da frente da luz
ele volta a ficar amarelo.

Aps a realizao de todas as coletas e exames os materiais devem ser esterilizados: frascos de
coleta de amostra, pipetas, placas de Petri de vidro, frascos e tubos com gua de diluio e meios de
cultura.