UNIVERSIDAD DE ORIENTE - NCLEO DE BOLVAR

ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD Dr. FRANCISCO BATTISTINI

DPTO. DE BIOQUIMICA - LABORATORIO DE BIOQUMICA









PRCTICA 2
SALADO (SALTING OUT) DE PROTENAS, SU
APLICACIN EN LA SEPARACIN Y DETERMINACIN
DE ALBMINA Y GLOBULINAS EN SUERO O PLASMA
SANGUNEO





Las protenas son unas de las molculas mas abundantes en las clulas,
constituyen un total de 50% de su peso y se encuentran en todas las partes de
esta, tambin participan en procesos catalticos, es decir, aceleran reacciones.

En esta segunda practica utilizaremos la tcnica de SALTING OUT este
es el mtodo mas utilizado para la separacin de protenas, se basa
principalmente en que las protenas son menos solubles a altas concentraciones
de sal, causando la precipitacin de las protenas.

La solubilidad de una protena es una funcin compleja de la naturaleza,
depende de los individualmente de los distintos tipos de protenas, pH,
temperatura, y concentracin de sales usadas.

Es muy importante describir la Albumina, ya que sta es una protena
plasmtica (al igual que la globulina), que tiene carga neta negativa, tiene una
funcin importante como transporte (de hormonas y frmacos), y tiene funciones
en la presin onctica.

La albumina es coagulable por el calor, los cidos minerales, el alcohol y el
ter y es soluble en agua as como en soluciones diluidas de sal. Esta protena
esta presente en tejidos animales como en claras de huevos, leche, el musculo y
el plasma sanguneo.

Por otra parte las Globulina tambin pertenece a las protenas sanguneas y
se encuentra tanto en tejido animal como en el vegetal entre las ms importantes
tenemos: la Seroglobulina (sangre), Lactoglobulina (leche), Ovoglobulina (huevos).

La globulina es un componente muy importante en la sangre en especial en
el plasma sanguneo y existen diferentes grupos de globulina como la globulina
alfa 1, la globulina alfa 2, la globulina beta, la globulina gamma.

La presente practica se realiza con el objetivo de aplicar la tcnica Salting
Out para separar la albumina del suero sanguneo, luego cuantificar las protenas
totales y tambin de la albumina y globulinas en el suero a travs del mtodo
colorimtrico de biuret, y la realizacin de una curva de calibracin la cual
permitir determinar la concentracin de las protenas totales y albumina en el
suero extrapolando los datos de la absorbancia obtenidos en el espectrofotmetro
de los valores de la albumina y protenas totales con los valores de protenas a
distintas concentraciones conocidas.
RESULTADOS
Despus de haber realizado todos los pasos y procedimientos indicados en
la prctica, los resultados de la absorbancia obtenidos despus de la lectura con el
espectrofotmetro a 540mu fueron los siguientes:
N de Tubo Absorbancia
Tubo X
1
346
Tubo X
2
186
Tubo 3 170
Tubo 4 269
Tubo 5 396
Tubo 6 530
Tubo 7 000
Tabla 1. Datos no procesados
Seguidamente se realiz una curva de calibracin utilizando la lectura de
los tubos 3, 4, 5 y 6. Dicha grfica se hizo de Absorbancia (eje Y) vs miligramos
(mg) de protena (eje x).
La absorbancia se obtuvo mediante las lecturas del espectrofotmetro, pero
los miligramos se calcularon a partir de una serie de cuentas basadas en reglas de
tres, las cuales se colocan y explican a continuacin:
Cada tubo (del 3 al 6) contena una cantidad especfica de una solucin de
protenas a una concentracin de 8
mg
/
ml
, es decir, por cada mililitro de la
solucin hay 8mg de protena.
Los tubos tenan las siguientes cantidades (en mililitros) de solucin de
protenas a 8
mg
/
ml
:
- Tubo 3: 0,25ml de protena.
- Tubo 4: 0,50ml de protena.
- Tubo 5: 0,75ml de protena.
- Tubo 6: 1,00ml de protena.
Para el tubo 3:
1ml_____8mg x= 0,25ml x 8mg/ 1ml
0,25ml___x x= 2mg
Para el tubo 4:
1ml_____8mg x= 0,50ml x 8mg/ 1ml
0,50ml___x x= 4mg

Para el tubo 5:
1ml_____8mg x= 0,75ml x 8mg/ 1ml
0,75ml___x x= 6mg
Para el tubo 6:
1ml_____8mg x= 1ml x 8mg/ 1ml
1ml_____x x= 8mg
Resumen de los puntos a graficar:
N de Tubo Absorbancia Protenas
Tubo 3: 0 170 2mg
Tubo 4: 0 269 4mg
Tubo 5: 0 396 6mg
Tubo 6: 0 530 8mg
Tabla 2. Datos procesados
Los datos la tabla 2 fueron graficados en una curva de calibracin Abs vs
[mg] protena anexada en el informe. En la grafica se puede observar que los
puntos no hacen una recta, pero se trazo la recta promediando los puntos.
Tambin se confirma que la absorbancia es directamente proporcional a la
concentracin de protenas, es decir, a mayor concentracin mayor ser la
cantidad de luz absorbida por la sustancia.
Luego se ubico en la curva de calibracin las respectivas absorbancias de
los tubos X
1
y X
2
, extrapolando los datos de dichos tubos para conocer la
absorbancia de ellos.
Este proceso se realiza para obtener las cantidades de albmina, globulina
y protenas totales del suero humano que se est estudiando, entonces se dice
que X
1
representa las protenas totales y X
2
representa la albmina.
Los datos obtenidos fueron los siguientes:
N de Tubo Absorbancia Protenas
Tubo X
1
(protenas totales) 346 5mg
Tubo X
2
(Albmina) 186 2,5mg
Tabla 3. Datos de tubos X
1
y X
2
luego de extrapolar la absorbancia

Ahora, ya al tener todos los datos, vamos a convertir dichos datos a una unidad
distinta,
g
/
dL
g%, a travs de una serie de clculos matemticos que se llevarn a
cabo a travs de reglas de tres:
Datos:
El tubo X
1
, contiene 0,5ml de suero con 9,5ml de Na
2
SO
4
al 23%, para un
total de 10ml de solucin inicial; de los cuales se extrajeron 2ml en un tubo
para constituir el Tubo X
1
, cabe destacar nuevamente que esta muestra
representa las protenas totales que hay en el suero.
De ese tubo de 10ml de solucin inicial se extraen 4ml y se combinan con
2ml de ter, esta mezcla se centrifug a 1.500 r.p.m por 10 minutos,
finalmente con una pipeta de volumtrica se extrajeron 2ml de la solucin
que estaba al fondo del centrifugado (excluyendo la capa blanca de
globulinas), esta ltima extraccin se coloc en tubo, el cual es nuestro tubo
X
2
, esta representa las albminas del suero.
De esta forma, se procede a los clculos:
Protenas totales (X
1
):
2ml solucin inicial (X
1)
_____5mg de protenas totales.
10ml de solucin inicial_____ X
X= (10ml x 4mg)/2ml
X= 25mg de protenas totales.
0,5ml de suero_____25mg de protenas totales.
100ml de suero____ X
X= (100ml x 25mg)/0,5ml
X= 5000mg de protenas totales5
g
/
dL
g% de protenas totales.
(5000mg/1000mg/g=5g)
Albmina (X
2
):
2ml_____2,5mg de albmina
10ml____ X
X= (10ml x 2.5mg)/2ml
X= 12,5mg de albmina en los 10ml de solucin inicial.
0,5ml de suero____12,5mg de albmina
100ml de suero____ X
X = (100ml x 12,5mg)/0,5ml
X= 2,500mg de albmina 2,5
g
/
dL
g% de albmina.
(2500mg/1000mg/g= 2,5g)

Obtenidos los g% de las protenas totales y de la albmina se pueden
calcular los de la globulina, a travs de la siguiente frmula:

[Protenas totales] =[albmina] + [Globulina]
[Globulina]= [Protenas totales] [albmina]
Globulina= 5g% - 2.5g%

Globulina = 2,5g%

Para finalizar, se calcular la relacin entre la albmina y la globulina, a
travs de la ecuacin:

Relacin
A
/
G
= A/G
R
A
/
G
=

R
A
/
G
= 1















DISCUSIN DE RESULTADOS
La sangre humana es un tejido fluido que circula en los capilares, arterias y
venas de todos lo vertebrados e invertebrados. En humanos esta constituida en un
45% por elementos formes (clulas y derivados de ellas) y el otro 55% por el
plasma sanguneo. Entre sus funciones tenemos el transporta el oxgeno desde
los pulmones al resto del organismo, el transporte de anhdrido carbnico desde
todas las clulas del cuerpo hasta los pulmones, el transporte de los nutrientes
contenidos en el plasma sanguneo, como glucosa, aminocidos, lpidos y sales
minerales desde el hgado, procedentes del aparato digestivo a todas las clulas
del cuerpo, transporte de hormonas, defiende el cuerpo, coagulacin de la sangre,
homeostasis, respuesta a lesiones que producen inflamacin, entre otras.
El plasma sanguneo esta constituido principalmente por suero sanguneo y
fibringeno.
En el suero sanguneo podemos encontrar protenas, como la albumina y
las globulinas. Los valores normales de protenas en suero sanguneo segn la
Biblioteca Nacional de Medicina de los EE.UU. MEDLINE PLUS, son los
siguientes:
Protenas totales: 6.4 a 8.3 g/dL
Albmina: 3.5 a 5.0 g/dL
Globulinas: 2,0 a 3,5 g/dL
Alfa-1 globulina: 0.1 a 0.3 g/dL
Alfa-2 globulina: 0.6 a 1.0 g/dL
Beta globulina: 0.7 a 1.2 g/dL
Gammaglobulina: 0.7 a 1.6 g/dL
Los datos obtenidos en la prctica indican que se tienen niveles bajos tanto
en los valores de protenas totales como en los valores de albmina. En los casos
clnicos mas frecuentes las patologas causan un descenso de los niveles de
protenas, albumina o globulinas, mientras que en escasos casos se presenta un
aumento de dichos niveles.
El valor de las protenas totales en suero sanguneo fue de 5g/dL, mientras
que el valor normal es de entre 6,4 8,3 g/dL. Por lo tanto hay una disminucin de
protenas totales presentes en la sangre, esto puede presentarse por muchas
patologas, es mas frecuenta una disminucin que un aumento de estos valores,
adems orinar muchas veces al da, deshidratacin, defecar en exceso, causan
generalmente un aumento de los valores de las protenas, ya que disminuyen los
niveles acuosos del organismo aumentando las concentraciones de las protenas.
Caso contrario, tomar mucha agua, no orinar, no defecar, alimentarse
inadecuadamente, puede causar una deficiencia de protenas en la sangre. Entre
las principales patologas que causan un descenso de los valores normales de
protenas totales tenemos:
- Desnutricin: Es una afeccin que ocurre cuando su cuerpo no recibe
los nutrientes suficientes. Sus posibles causas son: dieta inadecuada o
balanceada, problemas con la digestin o la absorcin, o por ciertas
afecciones mdicas. Entre los sntomas generales se pueden mencionar
fatiga, mareo y prdida de peso. En cuanto al tratamiento, ste consiste
en la reposicin de los nutrientes que faltan, tratar los sntomas en la
medida de lo necesario y cualquier afeccin subyacente.

- Sndrome Nefrtico: Es un grupo de sntomas que abarca protena en la
orina (que excede 3.5 gramos por da), bajos niveles de protena en la
sangre, niveles altos de colesterol e hinchazn. La orina puede contener
tambin grasa que se puede observar bajo el microscopio. El sndrome
nefrtico es causado por diversos trastornos que producen dao renal,
particularmente la membrana basal del glomrulo, lo cual ocasiona de
inmediato excrecin anormal de protena en la orina. Entre los sntomas
tenemos: hinchazn (edema) general alrededor de los ojos, en las
extremidades, especialmente en los pies y los tobillos, abdomen
inflamado, apariencia espumosa en la orina, aumento de peso
(involuntario) por retencin de lquidos, poco apetito e hipertensin
arterial. Los medicamentos corticosteroides, inmunodepresores,
antihipertensivos y diurticos pueden ayudar a controlar los sntomas.
Asimismo, se puede necesitar antibiticos para controlar las infecciones.
Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA)
pueden reducir significativamente el grado de prdida de protena en la
orina y, por lo tanto, frecuentemente se prescriben para el tratamiento
del sndrome nefrtico.

- Enteropata por prdida de protenas gastrointestinal: es una prdida
anormal de protenas del tubo digestivo o la incapacidad de ste para
absorber las protenas.Los sntomas pueden abarcar diarrea, fiebre y
dolor abdominal.El tratamiento consiste en curar la afeccin que
ocasion la enteropata perdedora de protenas.

- Hemocromatosis: enfermedad asociada con un recuento de la protena
de la sangre baja. Segn el Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y
enfermedades renales o NIDDK, hemocromatosis es el tipo ms comn
de enfermedad de sobrecarga de hierro. Hemocromatosis hace que el
cuerpo absorber y almacenar cantidades excesivas de hierro.
Demasiado hierro en los rganos del cuerpo puede causar dao a los
rganos importantes. Existen dos tipos principales de hemocromatosis:
primaria y secundaria. Hemocromatosis primaria, tambin conocido
como la hemocromatosis hereditaria, es un trastorno hereditario,
Considerando que la hemocromatosis secundaria es causada por otras
condiciones, tales como la anemia y el alcoholismo. Signos y sntomas
asociados con hemocromatosis comunes incluyen los niveles de
albmina de suero baja, dolor en las articulaciones, dolor abdominal,
fatiga, disminucin de la libido, enfermedad heptica, problemas de
pncreas, anomalas cardacas, deficiencia de tiroides y trastornos de la
glndula suprarrenal.

- Enfermedad de Wilson: trastorno hereditario asociado con un recuento
de la protena de la sangre baja. Tambin conocido como la
degeneracin hepatolenticular, implica la acumulacin de cantidades
excesivas de cobre en el hgado, el cerebro y otros rganos. El cobre es
importante para el desarrollo de los nervios, huesos, colgeno y
melanina o el pigmento en la piel. En la mayora de las personas,
cualquier exceso absorbido por el cuerpo de cobre se excreta a travs
de la bilis, una sustancia generada en el hgado y se almacena en la
vescula. Segn MayoClinic.com, si no se trata, la enfermedad de
Wilson puede ser fatal. Signos y sntomas asociados con la enfermedad
de Wilson comunes incluyen disminucin de albmina, torpeza,
depresin, dificultad para hablar, caminar o ingestin, babeo, fatiga,
dolor en las articulaciones, prdida de apetito, erupciones, hinchazn de
los brazos o las piernas y la ictericia.
La albmina es la protena ms abundante en el plasma. La albmina es la
protena ms abundante del plasma y es producida exclusivamente por el hgado.
En el organismo hay aproximadamente 500 g de albmina, con una produccin
diaria de 15 g, que puede aumentar al doble cuando hay prdidas y el hgado
funciona normalmente.
La hipoalbuminemia (disminucin de los niveles plasmticos de albmina)
puede ser signo de un dao heptico crnico. Sin embargo, la disminucin de la
albmina no es especfica de las enfermedades hepticas.
Los valores resultantes de la Albumina en la prctica fueron de 2,5g/dL,
siendo los valores normales de entre 3,5 5,0 g/dL, se tiene una disminucin de
albumina en el suero sanguneo, una hipoalbuminemia.
Algunos de los sntomas y efectos secundarios de la hipoalbuminemia son
los siguientes:
- Es posible que no tenga ningn sntoma, a menos que los niveles de
albmina en sangre sean muy bajos. En este caso, es posible que no
est comiendo bien. Puede tener inflamacin de todo el cuerpo o una
parte del mismo (como las piernas)
- Puede tener debilidad muscular, fatiga o calambres
- Es posible que tenga poco apetito y no est comiendo bien. An
personas que ingieren muchas protenas en su dieta pueden tener
niveles bajos de albmina en la sangre.
- Si tiene problemas en el hgado que pueden haber causado su
hipoalbuminemia, notar su abdomen distendido con fluidos (llamado
ascites).
La hipoalbuminemia puede ser causada por diversos factores o patologas,
las principales son las siguientes:
Despus de una ciruga para bajar de peso.
Dietas bajas en protenas.
Quemaduras (extensas).
Enfermedad de Crohn: Es una forma de enfermedad intestinal inflamatoria
(EII) que afecta por lo regular a los intestinos, pero puede ocurrir en
cualquier parte desde la boca hasta el extremo del recto (ano).Los
principales sntomas de la enfermedad de Crohn son dolor abdominal (rea
del vientre) con clicos, fiebre, fatiga, inapetencia, dolor con las
deposiciones (tenesmo), diarrea acuosa y persistente.Actualmente la
enfermedad de Crohn no es curable, pero s controlable, y la mayora de las
personas pueden hacer una vida normal.
Espre (celiaqua): Es una enfermedad que daa el revestimiento del
intestino delgado e impide la absorcin de partes de los alimentos que son
importantes para permanecer saludables. El dao se debe a una reaccin
por ingerir gluten, el cual se encuentra en el trigo, la cebada, el centeno y
posiblemente la avena. Los sntomas gastrointestinales abarcan dolor
abdominal, distensin, gases o indigestin, estreimiento, disminucin del
apetito (tambin puede aumentar o permanecer inalterable), diarrea, sea
constante o intermitente, intolerancia a la lactosa, nuseas y vmitos. La
celiaqua no se puede curar. Sin embargo, los sntomas desaparecern y
las vellosidades en el revestimiento de los intestinos sanarn si usted sigue
una dieta libre de gluten de por vida. No consuma alimentos, bebidas ni
medicamentos que contengan trigo, centeno, cebada o posiblemente avena.
Enfermedad de Whipple: Es una rara afeccin que le impide al intestino
delgado absorber los nutrientes en forma apropiada. Esto se denomina
malabsorcin. Los sntomas generalmente comienzan de manera lenta. El
dolor articular es el sntoma inicial ms comn. Luego empieza el dolor
abdominal, diarrea, fiebre, coloracin de la piel marrn griscea, prdida de
la memoria, prdida de peso, etc. Las personas con la enfermedad de
Whipple necesitan tomar antibiticos por tiempo prolongado para curar
cualquier infeccin del sistema nervioso central y del cerebro. Se administra
un antibitico llamado ceftriaxona a travs una vena, seguido de otro
antibitico, como trimetoprima con sulfametoxazol, que se toma por va oral
hasta por un ao.
Enfermedad de Wilson (descrita anteriormente)
Cirrosis heptica: Es la cicatrizacin y el funcionamiento deficiente del
hgado: la fase final de la enfermedad heptica crnica.Los sntomas
pueden presentarse gradualmente y tambin es posible que no se
presenten, entre ellos tenemos, confusin o problemas para pensar,
impotencia, prdida del inters sexual y desarrollo de mamas en los
hombres (ginecomastia), inapetencia, nuseas y vmitos, hemorragia nasal
o encas sangrantes, heces de color plido o color arcilla, entre otros.
Todos los pacientes con cirrosis se pueden beneficiar de ciertos cambios en
el estilo de vida, incluyendo la suspensindel consumo de alcohol., limitar la
sal en la dieta, consumir una alimentacin nutritiva, hacerse vacunar contra
la influenza, la hepatitis A y B, y la neumona por neumococo (si el mdico
la recomienda).

Sndrome nefrsico (nefrtico): Se refiere a la prdida de albmina por el
rin, frecuentemente secundario a diabetes mellitus. El sndrome nefrtico
habitualmente se acompaa de elevaciones marcadas de los lpidos
sanguneos y niveles variables de insuficiencia renal.

Enfermedades crnicas: Cualquier enfermedad crnica con compromiso
nutricional puede asociarse a hipoalbuminemia, por ejemplo neoplasias,
insuficiencia cardiaca y enfermedades intestinales entre otras.
En cuanto a un aumento en la concentracin de albumina en la sangre, no
se han descrito enfermedades especficas que se asocien a niveles elevados de
albmina, por lo que su hallazgo en exmenes de rutina no es indicador de
anormalidad, sino ms bien es un hallazgo relativamente frecuente en personas
jvenes bien nutridas.

A continuacin se presenta una lista de las principales patologas que
causan una disminucin o aumento de los distintos tipos de globulinas:

- El aumento de las protenas alpha-1 globulina puede indicar:

Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea,
LES)
Enfermedad inflamatoria aguda
Malignidad

- La disminucin de las protenas alfa-1 globulinas pueden indicar:

Deficiencia de alfa-1 antitripsina

- El aumento de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:

Inflamacin aguda
Inflamacin crnica

- La disminucin de las protenas alfa-2 globulinas puede indicar:

Hemlisis

- El aumento de las protenas beta globulinas puede indicar:

Hiperlipoproteinemia (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar)
Terapia de estrgenos

- La disminucin de las protenas beta globulinas puede indicar:

Trastorno de coagulacin congnito
Coagulopata de consumo
Coagulacin intravascular diseminada

- El aumento de las protenas gama globulinas puede indicar:

Mieloma mltiple
Enfermedad inflamatoria crnica (por ejemplo artritis reumatoidea,
LES)
Hiperinmunizacin
Infeccin aguda
Macroglobulinemia de Waldenstrom
Enfermedad heptica crnica































CONCLUSION
El suero humano es la parte liquida de la sangre, es de color amarillo claro
que se obtiene despus de la eliminacin del coagulo de fibrina y otros
elementos celulares. Es muy importante al momento de estudiar las
concentraciones totales de protenas, y de albuminas y globulinas presentes en
ella. Durante su estudio en la prctica de laboratorio a travs de su anlisis se
obtuvieron valores inferiores en las concentraciones de protenas totales de
(5g/dL) siendo su rango normal de (6.4 a 8.3 g/dL). Los niveles inferiores a los
normales pueden deberse a: Enfermedad heptica, Desnutricin, Enteropata por
prdida de protenas.
Mientras que las concentraciones de albumina obtenidas, fueron muy bajas
de (2,5 g/dL). Es decir que este valor esta por debajo de su valor normal de (3,5 a
5,0 g/dL). La albumina es sintetizada en el hgado as que una disminucin de
ella puede ser producto de: Cirrosis heptica, o Enfermedades genticas,
Trastornos intestinales. A diferencia de las globulinas sus concentraciones
encontradas fueron normales de (2,5 g/dL). El estudio del suero humano es de
gran importancia por que no solo contiene anticuerpos que combaten a los
organismos que producen enfermedad, si no que tambin permite que las
protenas totales presentes en ella puedan separarse en dos grandes grupos las
albuminas y globulinas.
La albmina es la protena de mayor concentracin en la sangre, transporta
muchas molculas pequeas (bilirrubina, progesterona, y medicamentos), y tiene
tambin la funcin de mantener la presin sangunea ya que favorece la presin
osmtica coloidal para mantener lquidos en el torrente sanguneo y que no pasen
a lostejidos, manteniendo un equilibrio. Por su parte las globulinas son un
importante componente de la sangre, especficamente del plasma, se dividen en
varios grupos: globulinas alfa 1 y 2, globulinas beta,globulinas gamma.
La determinacin de protenas totales se realiza para evaluar la posible
presencia de enfermedades nutricionales, estado nutricional tras intervenciones de
ciruga, o enfermedades del rin o del hgado, o bien que el cuerpo no absorba
bien suficientes protenas. Si el valor de las protenas totales est alterado, es
decir, si hay un aumento o disminucin como en nuestro caso se debe realizar un
estudio pormenorizado de cada grupo, albmina, alfa-1, alfa-2, beta y gamma
globulinas, para saber cul es el desequilibrio existente en el paciente y luego
aplicar el tratamiento correspondiente.


BIBLIOGRAFA


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