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PRTICA N 3 e 4 - MODELO DE ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE COCOS GRAM-

POSITIVOS: Streptococcus e Staphylococcus



O reconhecimento da microbiota indgena (Anexo 1) pode ser feita atravs da colorao pelo
mtodo de Gram. Para constatao da presena de microbiota indgena e de indivduos portadores
de microorganismos patognicos ser feita a coleta de material da orofaringe.

a) Experimento 1 - Gnero Streptococcus (Bergey, 1986): Isolamento de estreptococos da
orofaringe humana

Os estreptococos so microrganismos esfricos dispostos em cadeias e amplamente distribudos
na natureza. Alguns so habitantes de pele, boca, nariz, garganta, trato intestinal e genital. Os
estreptococos podem ser divididos em: piognicos (hemolticos), estreptococos orais, enterococos
e os estreptococos produtores de cido ltico.

S. lactis uma espcie de grande importncia, principalmente na fermentao de leites e na
produo de derivados. Como todo microrganismo do gnero Streptococcus fermentam
carboidratos produzindo predominantemente cido ltico.

Eles produzem uma srie de substncias extra celulares como hemolisinas, enzimas e
bacteriocinas. De acordo com os tipos de hemlise em placas de gar-sangue, os estreptococos
podem ser identificados em -hemolticos, causam hemlise parcial (verde); -hemolticos,
causam hemlise total e os -hemolticos que no apresentam hemlise. Os estreptococos exigem
meios de cultura mais ricos e maiores cuidados em sua conservao no laboratrio so
necessrias.

Os estreptococos apresentam uma morfologia esfrica ou oval, Gram-positivo, agrupadas dois a
dois ou em cadeia, quando cultivadas em meio lquido. A maioria anaerbia facultativa, algumas
espcies necessitam de CO
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para o seu crescimento e no so esporulados. Carboidratos so
fermentados com a produo estrita de cido ltico. Temperatura tima de crescimento, 37
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C.
Amostra tpica: Streptococcus pyogenes.


b) Experimento no. 2 - Gnero Staphylococcus: Isolamento de estafilococos do corpo humano
ou da cavidade nasal

De acordo com o Manual Bergey (1986) a famlia Micrococcaceae formadas pelos gneros
Micrococcus, Staphylococcus, Stomatococcus e Planococcus (Tabela 1). Como os microrganismos
do gnero Staphyloccus so membros da flora normal (epiderme) do corpo humano possvel
determinar quantos estudantes so portadores para estes microrganismos, principalmente S.
aureus.

Os estafilococos so bactrias esfricas Gram-positiva, geralmente dispostas em cachos
irregulares. Anaerbios facultativos, porm crescem melhor quando incubados em aerobiose e so
catalase positivos. So microrganismos que crescem bem em meios suplementados com 10-15%
de NaCl, Mesfilos, Quimiorganotrficos, com metabolismo respiratrio e fermentativo e teor de
G:C = 30:39 mol%. O Staphylococcus aureus a amostra padro.

O gnero composto por 33 espcies, sendo que 11 destas infectam o homem embora somente
uma dessas considerada patognica, o Staphylococcus aureus pelo fato de coagularem o plasma


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(humano ou de coelho), enquanto que outros como Staphylococcus epidermidis e Staphylococcus
saprophyticus no o fazem. A espcie Staphylococcus aureus, coagulase-positiva (ECP) produz
uma srie de outras enzimas e toxinas e est envolvida em uma srie de infeces e intoxicaes
no homem e nos animais. Os estafilococos coagulase-negativa (ECN) tm sido considerados
saprfitas ou raramente patognicos. Contudo, em virtude do considervel progresso na
classificao sistemtica dos estafilococos e no desenvolvimento de mtodos para a identificao
do gnero, espcies e subespcies, tem sido feita a identificao de uma variedade de ECN
presentes em amostras clnicas identificando-as como agentes etiolgicos de uma srie de
processos infecciosos. Esses microrganismos apresentam elevado risco potencial de bacteremia,
entre recm-nascidos de baixo peso, em nosocmios, os quais so imunologicamente imaturos e
com frequncia requerem procedimentos invasivos para administrao de substncias nutritivas e
medicamentosas.

Alguns destes microorganismos so membros da flora normal da pele e das mucosas do corpo
humano e animal, outros provocam supurao e formao de abscessos, uma variedade de
infeces piognicas e at septicemia fatal. Amostras de estafilococos podem ser isoladas das vias
areas superiores e caracterizam os portadores assintomticos. Os estafilococos podem causar
tambm toxi-infeces alimentares no homem e animais.

c) Experimeto 3: Preparo de materiais e meios de cultura (demonstrao)

A finalidade demonstrao do preparo de meios e esterilizao de materiais demonstrar as
metodologias e princpios usados no laboratrio de Microbiologia, para o isolamento e identificao
de microorganismos. O preparo e montagem dos diversos materiais obedece normas
padronizadas, sendo imprescindvel a lavagem adequada e secagem de toda vidraria, antes de
mont-la. Atualmente os materiais utilizados na rotina de laboratrio de Microbiologia so de
plstico descartveis, para assegurar um maior grau de segurana, no sentido de contaminao
quer de quem os manipula ou do meio ambiente.
Os meios de cultura destinam-se ao cultivo in vitro de bactrias e fungos. Alguns vrus podem ser
propagados em culturas de clulas procariotas ou eucariotas, utilizando-se um meio adequado ao
seu crescimento.


3.1 - MATERIAL
Placas de gar hipertnico manita,
Tubos com plasma diludo 1:10,
Placas de gar DNAse,
Tubos de tioglicolato,
Frascos com soluo de Hcl 1N,
Bateria de Gram,
Zaragatoas estreis;
Lminas para microscopia,

3.2 - EXECUO:
ETAPA 1
Coletar material da mucosa de ambas as narinas com a zaragatoa e seme-lo no meio de
tioglicolato e na placa de gar hipertnico manita por esgotamento. Identificar o tubo e a placa e
incub-los a 37C por 24 horas.


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ETAPA 2
LEITURA E INTERPRETAO DA ETAPA 1

Retirar o tubo de tioglicolato da estufa e observar o crescimento no tioglicolato (turvao do meio
e/ou presena de grumos na camada aerbia);
Preparar esfregao a partir de tioglicolato e fazer o Gram;
Retirar a placa de gar hipertnico manita da estufa e observar o crescimento;
Diferenciar as colnicas quanto a pigmentao: cor branca ou amarela;
Observar se houve modificao da cor do meio de cultura, de rseo para amarelo, devido a
viragem do indicador de pH (vermelho de fenol), resultante da fermentao do manitol. Quando
no h fermentao do manitol o meio permanece inalterado (manitol negativo);
Caracterizao morfolgica: O simples crescimento em meio seletivo indicador no permite tirar
qualquer concluso quanto espcie bacteriana presente no material, havendo portanto
necessidade de se prosseguir na identificao;
Colorao de GRAM Colocar uma ala de soro fisiolgico numa lmina limpa e fazer um
esfregao fino a partir da colnia suspeita (voce poder fazer tambm de outras colnias que
cresceram no meio) Corar pelo mtodo de Gram e observar a morfologia microscpica da
colnia;
Caracterizao fisiolgica (provas de patogenicidade): comprovada a morfologia caracterstica
do gnero Staphylococcus, prosseguimos na determinao das caractersticas fisiolgicas
inerentes espcie atravs das provas de patogenicidade;

Prova de coagulase: havendo colnias manitol + transfera algumas delas para um tubo com
plasma de coelho citratado diludo 1:10, fazendo uma suspenso homognea. Incubar a 37C
por 3 horas. A leitura feita com mais de 3 horas de incubao, pode dar resultado falso-negativo.
Para evitar tal causa de erro, os tubos, aps este perodo, sero mantidos a 4C.

Prova de DNase: semear com ala de platina, em movimentos circulares, as colnias suspeitas,
na superfcie de uma placa de gar DNase. Identific-la e incub-la a 37C por 24 horas.

3.3 - RESULTADO:
Aps observao microscpica, anotar a forma bacteriana, tipo de grupamento e reao
tintorial.














Estafilococos
Estreptococos


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ETAPA 3
LEITURA E INTERPRETAO:
Retirar o tubo de plasma de coelho da geladeira e a placa de gar DNase da estufa;

Leitura da Prova de coagulase: a prova se caracteriza pela formao de um cogulo firme. Em
caso negativo, o plasma continua lquido;

Leitura da Prova de DNase: cobrir a superfcie do meio com uma soluo de HCL 1N. A prova
positiva se caracteriza pela formao de um halo claro, transparente, em torno do crescimento
bacteriano e turvao do restante do meio pela degradao do DNA pelo HCL (hidrlise cida).
Na prova negativa, a turvao ser observada tambm em redor do crescimento bacteriano,
devido no produo de DNase pelos microrganismos estando o DNA ntegro.
Recomendaes do Ministrio da Sade
http://www.scribd.com/doc/4128919/30/AGAR-DNASE

A revelao da prova pode ser feita de duas maneiras:
a) Com soluo de HCl 1N;
b) Adicionando-se base do meio de cultura azul de Toluidina O (0,01%)

Cor original do meio: azul claro

Positivo: Presena de colorao rosa na parte inferior e em volta da colnia.
Negativo: Ausncia de cor rosa. O meio permanece com a cor original, azul.



CONTROLE DE QUALIDADE

Positivo Negativo
Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus epidermidis ATCC 12228
Serratia marcescens ATCC 13880 Escherichia coli ATCC 25922




Meio de cultura contendo 10g/L manitol e, como indicador, 0.025g/L de azul de bromotimol ou 0.025g/L de
vermelho de fenol.


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3.4 - CONCLUSO
Comparar e diferenciar as espcies de Staphylococcus isolados de acordo com o quadro abaixo:

Staphylococcus Manitol Coagulase Dnase
Staphylococcus aureus + + +
Staphylococcus epidermidis - - -
Staphylococcus saprophyticus V - -


Interpretao
Cocos Gram-positivos, agrupados em cachos. Anaerbios facultativos, porm crescem melhor
quando incubados em aerobiose. Catalase positivos. So microrganismos que crescem bem em
meios suplementados com 10-15% de NaCl. Mesfilos. Quimiorganotrficos, com metabolismo
respiratrio e fermentativo.G+C = 30=39 mol%. Staphylococcus aureus a amostra tipo.

Caractersticas dos microrganismos gneros, Micrococcus, Stomatoccus, Planococcus e
Staphylococcus (Sneath et al., 1986)

Caractersticas Micro Stomato Plano Staphylo
Ttrades + - - -
Cpsulas + - - -
Motilidade V - + -
Fermen-glicose (anaer) V + - +
Resistncia a
lisostafina
R R R S
Glicina Murena - - - +
cido teiccio-par. Cel. - - - +
Mol. G+C 65-75 56-60 39-52 30-39


MICROBIOTA NORMAL DA CAVIDADE NASAL:

1. Difterides 7. Nesseria meningitis (0 a 4%)
2. Staphylococcus epidermidis 8. Streptococcus
3. Staphulococcus aureus (20 a 80% da
pop.)
9. Klebsiella spp.
4. Streptococcus pneumoniae (5 a 15% da
pop.)
10. Enterobacter spp.
5. Haemophilus influenzae (5 a 10 % da
pop.)
11. Acinetobacter (0 a 1% da
pop.)
6. Neisseria sp. (0 a 15% da populao)





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Caractersticas fenotpicas de algumas das espcies do gnero Staphylococcus.

1 Caracterstica
s
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Cresci-
mento
Aerobiose + + + + + + -(f) + + + + + + +
Anaerobiose + + (+) + (+) -f + d + (+) + -f + +
10% NaCl + f + + + f nr + + + + + nr nr
15C + + + d -f -f -f + + + -f nr nr
Temp 45C + + + + + + + -f + + - + +
Fermen
-tao

Xilose - - - - - - - + - - - - + -
Arabinose - - - - - - - + - - - D + -
Rafinose - - - - - - - - - - - + + -
Manitol + - + d D - - d + (d) - + + d
Teste Oxidase - - - - - - - - - - - + - -
Urease +f + - + - + nr + - + d - + +
Coagulase + - - - - - - - + - d - - -
Hemlise + -f -f - (+) -f -f - + - + - - -
DNAse + -f f - - - - - + - + - - +
Novobiocina-R - - - - - - - + - - - + + -
(+) 90% ou mais das amostras positivas; (-) 90% ou mais das amostras negativas; (d) 11-89% amostras positivas; (f) reao fraca; ( )
reao tardia; (nr) no realizado
1 S. Aureus 5 S. haemolyticus 9 S. carnosus 13 S. gallinarum
2 S. Epidermidis 6 S. hominis 10 S. Intermedius 14 - S. caprae
3 S. Capitis 7 S. Saccharolyticus 11 S. hyicus
4 S. Warneri 8 S. xylosus 12 - S. lentus




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Experimeto 3: PREPARO DE MATERIAIS E MEIOS DE CULTURA (demonstrao)

Os meios fornecem tanto condies nutricionais (componentes do meio), quanto condies
fsico-qumicas (pH, presso osmtica, atividade de gua, etc) adequadas ao crescimento de
microrganismos. Existem centenas de meios disponveis comercialmente e, de modo geral,
estes podem ser classificados:

a) Quanto a composio
Meios simples possuem os componentes essenciais ao crescimento de microrganismos
nutricionalmente pouco exigentes .Exemplo: Caldo simples.

Componentes Composio Concentrao (g)
Extrato de carne Substncias hidrossolveis de tecido
animal, carboidratos, compostos de
nitrognio orgnico, vitaminas, sais
3
Peptona Nitrognio orgnico, algumas vitaminas 5
NaCl ons e requerimentos osmticos 8
H
2
O Veculo/diluente (q.s.p 100mL)

Meios de enriquecimento adicionam-se aos meio base, substncias de enriquecimento
tais como sangue, soro, ovo, extrato de levedura, extrato de carne, vitaminas,etc. Exemplo:
gar sangue;
Meios seletivos inibem o desenvolvimento de determinados microrganismos, devido
adio de substncias inibidoras (antibiticos, sais biliares, azida sdica, corantes, etc);
Meios seletivos indicadores so utilizados para o isolamento e identificao presuntiva de
microrganismos. Exemplo: gar MacConkey (seletivo por conter cristal violeta e sais biliares
que inibem o crescimento de bactrias Gram positivo e Gram negativo exigentes, e indicador
da fermentao da lactose evidenciada pelo vermelho neutro);
Meios quimicamente definidos
Exemplo: meio para o cultivo de bactria heterotrfica.
Componentes Funo Concentrao (g)
Glicose Fonte de energia e de carbono 1
NH
4
H
2
PO
4
Fonte de nitrognio, tampo e ons essenciais 5
K
2
HPO
4
Tampo e ons essenciais 1
NaCl ons esseciais 5
MgSO
4
7H
2
O ons essenciais 0,2
H
2
O Veculo/diluente (q.s.p 1000mL)

b) Quanto consistncia


8
meios lquidos
meios slidos (gar 1,5% p/v )
meios semi-slidos (gar 0,75% p/v)

3.1 MATERIAL:
3.1 Demonstrativo: ala calibrada, zaragatoa ou swabs, ala de Drigalski. gar inclinado, placas
com meios de cultura prontos, frasco de gar nutriente (comercial).

3.2 Montagem
Pipetas graduadas, placas de Petri, tubos de ensaio, erlenmeyer, pinas, papel de filtro, algodo
hidrfobo e hidrfilo, gaze, fita de autoclave, papel e barbante.

3.3 Distribuio
Placas esterilizadas.
100 ml de gar nutriente pronto (banho-maria).

3.4 Preparo de Meio de Cultura

Descrio dos meios de cultura empregados nos exames microbiolgicos Mdulo IV.
Recomendao Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, Ministriio da Sade
http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_4_2004.pdf