Preparacin del Agar Vogel Johnson, Siembra de determinados microorganismos, y

preparacin de un frotis Utilizando el mtodo de Tincin de Gram. Microorganismo

aislado:
Staphylococcus aureus


Objetivos:
Identificar el uso de medios de cultivo de acuerdo al microorganismo a estudiar.
Aprender a utilizar la tcnica de tincin de Gram
Introduccin:
El Agar de Vogel Johnson es un medio utilizado para la rpida deteccin de
estafilococos coagulasa positivo fermentadores de manitol, a partir de alimentos y
otros materiales de importancia sanitaria y clnica (Medio preparado: rojo
ligeramente opalescente.)
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inoculo) en
un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y
multiplicacin. Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura
adecuada para el crecimiento.
Staphylococcus aureus, es un microorganismo patgeno presente en piel de animales
y personas, adems de en sus fosas nasales y gargantas. Pese a su amplia distribucin
y a la facilidad con la que llega a los alimentos y extiende una eventual contaminacin,
sus efectos son agudos y aparatosos pero remiten de forma rpida. Los manipuladores
de alimentos pueden favorecer su rpida extensin. Microorganismo muy resistente a
las condiciones ambientales y extremadamente difciles de erradicar.

Materiales y Reactivos:
1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml Agar de Vogel Johnson 2 Vasos de precipitado
1 Probeta de 250 ml Agua destilada 2 Mecheros
1 Esptula Cristal Violeta 2 Porta objeto
1 Vidrio de reloj Lugol 1 Soporte universal
1 Balanza analtica Alcohol-Acetona
10 Cajas de petri Safranina
Papel estraza
2 Asas bacteriolgicas

Metodologa:
1) Preparacin del medio de cultivo

Se siguen las instrucciones del rtulo del medio de cultivo de acuerdo a la cantidad a
preparar.
Gramos de Agar necesitado Mililitros de agua destilada
61gr. 1000 ml
9.15 gr. 150 ml

Se transfiere el medio a un erlenmeyer y se agrega la cantidad de
agua destilada establecida. Con ayuda de calentamiento se
disuelven los grumos que puedan formarse
Se cubre el erlenmeyer con un tapn de algodn (torunda)
envuelto en gasa recubriendo con papel estraza. Y se esteriliza en
autoclave a 121C durante 15 minutos. Si se utiliza de inmediato,
dejar enfriar a temperatura alrededor de 45C.
Vaciar aprox. 15 ml de Agar en cada caja de petri en condiciones
estriles en medio de dos mecheros (Dejar solidificar).

2) Siembra en superficie
Se obtiene la muestra en este caso la muestra es saliva tomada con un hisopo directamente de
la boca de una compaera.(No hay que olvidar limpiar el rea con benzal o alcohol)
Se utilizan las placas previamente preparadas que contienen el medio de cultivo solidificado
(unos 15 mL/ por placa).
Luego se realiza la descarga de la muestra: Primero se prende un mechero, se esteriliza el aza
bacteriolgico.
Se frota el hisopo con el asa bacteriolgica, se esteriliza la caja de petri, se abre lo menos
posible y se descarga la muestra suavemente en el medio de cultivo.
Luego de realizar la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie
de las placas, usando el aza. Utilizando las diferentes tcnicas
posibles.
En nuestro caso utilizamos dos tcnicas A) Estriado y B)
Estriado en cuadrante




Rotular la placa con el nombre del microorganismo , fecha de ingreso y salida del material.
Se llevan las placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubacin elegidos vara segn
el tipo de microorganismos).
Pasado el tiempo de incubacin las colonias habrn crecido sobre la superficie del agar.

3) Tincin de gram

Extensin: En un porta objetos bien limpio (con alcohol, papel de filtro y flameado) se coloca
una gota de agua destilada a la que. con el asa de siembra, previamente esterilizada a la llama,
se lleva una pequea cantidad de suspensin de bacterias o, en su caso, de una colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre el porta y se fija la extensin por el calor,
calentando suavemente a la llama del mechero hasta que se seque.
Coloracin:
a) 1 minuto en cristal violeta de Hucker (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) Se enjuaga con agua destilada
e) Se decolora con alcohol-Acetona de 95 (decolorante)
e) se lava con agua destilada
f) 1 minuto de safranina (colorante de contraste)
g) se lava con agua destilada o corriente




Esquema


Observacin del frotis: Al llevar el frotis al microscopio se pudo observar la diferencia entre las
bacterias gran positivas que estaban teidas de color violeta y las bacterias gran negativas de color
rosado.

Conclusin: