PRODUO DE CELULASE,

POLIFENOLOXIDASE E TANASE POR FUNGOS

FILAMENTOSOS
Darne Germano de Almeida
1
, Maria da Glria Conceio da Silva
1
, Fernando Santana de Souza
1
, Diana Duarte de Lira
e Silva
1
, Carla do Couto Soares Maciel
1
, Galba Maria de Campos Takaki
1
e Norma Buarque de Gusmo
1

________________
1. Departamento de Antibiticos da Universidade Federal de Pernambuco-UFPE. Centro de Cincias Biolgicas. Rua Acadmico Morais Rgo,
1234, Cidade Universitria CEP: 50940-000 - Recife, PE Brasil. E-mail: darnebio@yahoo.com.br.
Introduo
A industrializao em grande escala, o aumento de
produo, a grande concentrao populacional em
determinadas regies e a intensa atividade agrcola
contribuem para o aumento significativo de
lanamentos de despejos e resduos nos cursos dgua
[1]. O lanamento indevido de resduos slidos,
lquidos e gasosos de diferentes fontes ocasiona
modificaes nas caractersticas do solo, da gua e do
ar, podendo poluir ou contaminar o meio ambiente. A
poluio ocorre quando esses resduos modificam o
aspecto esttico, a composio ou a forma do meio
fsico, enquanto o meio considerado contaminado
quando existir a mnima ameaa sade de homens,
plantas e animais [2].
A biorremediao uma tecnologia que utiliza
microrganismos para minimizar ou remover poluentes
de hidrocarbonetos de petrleo do ambiente [3]. Esta
tecnologia utiliza microrganismos para degradar
poluentes ambientais e pode ser definida como uma
reao catalisada biologicamente, que transforma
compostos quimicamente complexos em compostos
mais simples. No caso de compostos orgnicos, pode
ocorrer a converso dos constituintes do composto
original em produtos inorgnicos, processo esse
denominado de mineralizao [4].
Desde a dcada de 50, microrganismos com
capacidade degradadora de poluentes vm sendo
isolados. Dentre os fungos selecionados, os dos
gneros: Aspergillus, Penicillium, Cunninghamella,
Chrysolporium, Cndida e Rhodotorula destacam-se
[5]. Eles so reconhecidos decompositores naturais,
apresentando a capacidade de degradar polmeros
complexos como lignina e celulose, o que faz com que
sejam produtores de enzimas no especficas que
podem auxiliar na oxidao dos hidrocarbonetos [6].
Devido ao grande nmero de enzimas envolvidas na
degradao de xenobiticos, a maioria dos
microrganismos no possui a capacidade de degradar
os HPAs, o que justifica a necessidade de se selecionar
microrganismos degradadores, visando a sua utilizao
na biorremediao de ambientes contaminados [7]. O
interesse na pesquisa de enzimas lignocelulolticas
fundamenta-se na utilizao destas na reciclagem de
resduos da agricultura e/ou rejeitos urbanos e tambm no
tratamento de solos e efluentes diversos. Estas enzimas
possuem vantagens na remediao de diversos tipos de
contaminantes, por no possurem alta especificidade com
os substratos, uma vez que a estrutura da lignina apresenta
diversos modelos [8].
A degradao de compostos fenlicos tem uma estreita
relao com a decomposio da lignina, sendo assim muitas
das tcnicas aplicadas para seleo de microrganismos
ligninolticos podem ser utilizadas para triagem de
organismos degradadores de compostos fenlicos, e vice-
versa [8].
Os fungos secretam uma grande diversidade de eficientes
enzimas no ambiente que so utilizadas para auxiliar sua
nutrio, desta maneira so responsveis pela deteriorao
de vrios materiais naturais, refinados ou processados. Nas
ltimas dcadas, a utilizao dos fungos filamentosos e
seus metablitos nos processos de biorremediao vem
crescendo, em virtude do alto potencial degradativo,
biossortivo (metais pesados e corantes) e dos mecanismos
de resistncia em condies ambientais adversas [8].
Dentre as enzimas de importncia industrial produzidas
por fungos e abordadas neste trabalho, esto as celulases,
fenoloxidases e tanases. As celulases so as enzimas mais
utilizadas na indstria txtil e de papel e celulose. Atuam
na hidrlise de substratos celulsicos e compreendem um
complexo de enzimas celulolticas compostas por
endoglucanase ou endo-1,4--glucanase, exoglucanase ou
exo-1,4--glucanase, celobiase ou -glucosidase e
exoglucosidase ou exo- 1,4- -glucosidase [9]. A tanase
uma enzima que hidrolisa steres e ligaes laterais de
taninos hidrolisveis produzindo glicose e cido glico
[10]. Ela principalmente utilizada para produo de cido
glico, chs instantneos, na estabilizao da cor do vinho,
processo de tratamento de couro, detanificao de
alimentos, produo de antioxidantes e para tratamento de
efluentes na indstria de couros [11]. Polifenoloxidases so
enzimas que contm cobre no centro ativo e catalisam dois
tipos de reaes, ambas envolvendo oxignio. A
primeira reao corresponde hidroxilao de
monofenis formando orto-difenis e a segunda
oxidao de orto-difenis formando orto-quinonas. As
polifenoloxidases atuam sobre uma grande variedade
de substratos. Cita-se p-cresol, tirosina e cido p-
cumrico como substratos monofenlicos, enquanto
catecol, diidroxifenilalanina e cido clorognico
substratos difenlicos [12].
Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo
avaliar o potencial de fungos isolados de locais
poludos em produzir enzimas degradadoras de
polmeros complexos, mostrando-se importantes tanto
na indstria quanto na Biorremediao ambiental.
Material e mtodos
A. Microrganismos
Foram utilizados neste trabalho 12 fungos
filamentosos isolados de local poludo em Suape-
Pernambuco e Manguezal na Bahia. Estes
microrganismos esto estocados na Coleo de
Culturas do Departamento de Antibiticos, UFPE.
B. Produo enzimtica
Foram realizados ensaios para verificao da
produo de enzimas relacionadas com a
biodegradao de hidrocarbonetos.
Para verificar a produo da enzima
polifenoloxidase, foi utilizado o meio de gar malte
acrescido de cido glico 0,5%. O material foi
incubado a 28C + 1 e durante 5 dias foi feita a
progresso do halo e a intensidade da cor mbar,
caracterstica da "Reao de Bavendamm". Nesta
reao, o cido glico, sob ao das fenoloxidases
fngicas forma quinonas, que so identificadas pela
formao de um halo de cor mbar em torno do
miclio [8].
Para testar a produo de celulase, foi empregado
meio de cultura com carboximetil celulose (CMC)
como nica fonte de carbono. Os fungos foram
inoculados no centro da colnia e incubados por 5
dias a 28C + 1. Para a visualizao da ocorrncia de
produo da enzima, foi utilizado vermelho congo
com tampo Tris HCl, com posterior lavagem em
NaCl. Revelando-se as placas de gar-CMC com
corante Vermelho do Congo, a zona clara em forma
de halos indica a ao enzimtica da celulase,
enquanto que a parte no afetada pela enzima cora-se
de vermelho [13].
A produo de tanase foi observada de modo
qualitativo atravs da inoculao de meio de cultura
contendo cido tnico como exclusiva fonte de
carbono e com pH 5.8. Os fungos foram inoculados
no centro das placas e em seguida incubados por 72
horas a 28C + 1. Aps este perodo halos
translcidos em volta das colnias foram
visualizados, indicativos da degradao e conseqente
consumo de cido tnico.
Resultados e Discusso
Dos doze fungos estudados, 100% apresentaram
formao de halo para Polifenoloxidase (atravs da Reao
de Banvendamm). A produo de enzimas do grupamento
polifenoloxidase de extrema importncia biotecnolgica,
pois so enzimas responsveis pela quebra da lignina e de
polmeros complexos como efluentes industriais e
hidrocarbonetos do petrleo. Microrganismos produtores
desta enzima podem ser facilmente empregados em
processos de descontaminao de ambiente poludo [14].
Cerca de 83,34% dos fungos apresentaram halo de
hidrlise da celulase (Fig. 1). RUEGGER e TAUK-
TORNISIELO [15] encontraram uma zona mais clara ao
redor das colnias, correspondente ao halo indicador da
degradao da CMC para as 36 linhagens de fungos
estudados, ou seja, 45%. J os fungos estudados por
SOUZA e OLIVEIRA [9], foram todos capazes de produzir
celulases.
Em relao produo de tanase, 41,6% dos fungos
foram produtores da enzima. BATTESTIN [16] obteve de
500, 7% de linhagens potencialmente produtoras de tanase
atravs da seleo induzida pela presena de cido tnico,
mostrando que a concentrao deste no meio de cultura
fator chave na produo da tanase.
Estes microrganismos so considerados potencialmente
aplicveis em processos industriais, sendo necessria a
otimizao da produo destas enzimas visando um
melhoramento do processo.
Agradecimentos
Os autores agradecem FACEPE.
Referncias
[1] ZAGATTO, P.A.; BERTOLETTI, E. (Ed.). Ecotoxicologia Aqutica
Princpios e Aplicaes. So Carlos, SP RIMA Editora, 2006. 478
p.
[2] PEREIRA, J. A. Gerao de resduos industriais e controle
ambiental. Centro Tecnolgico da Universidade Federal do Par.
Par, 2002.
[3] AUTRY, A. R. & ELLIS, G. H. (1992) Environmental prog., v. 11,
p. 318-323.
[4] SAMANTHA, S.P.2006. Biodegradabilidade de n-Hexadecano por
bactrias livres e imobilizadas em Quitosana. Dissertao de
mestrado, curso de Ps-graduao em Biotecnologia de Produtos
Bioativos, UFPE, Recife.
[5] PEREIRA, L.T.C.; LEMOS, J.L.S. 2003. Otimizao das condies
de cultivo para o fungo filamentosos envolvido na biorremediao
de solos impactados por leo cru. In:Reunio anual da sociedade
brasileira de qumica, Poos de Caldas, AB-009.
[6] LEIVIN, L.; VIALE, A.; Forchiassin, A. Degradation of organic
pollutants by the white rot basidiomycete Trametes trogii.
International Biodeterioration and biodegradation, 52:1-5, 2003.
[7] KREPSKY, N.; SOBRINHO, F. S.; CRAPEZ, M. A. C.
Biodetergentes para limpeza do petrleo, Cincia Hoje,
38(223):70-73,2006.
[8] CONCEIO, D. M.; ANGELIS, D. A.; BIDOIA, E. D.;
ANGELIS, D. F. Fungos filamentosos isolados do rio Atibaia,
SP e refinaria de petrleo biodegradadores de compostos
fenlicos. Arq. Inst. Biol., So Paulo, v.72, n.1, p.99-106,
jan./mar., 2005.
[9] SOUZA, H. Q.; OLIVEIRA, L. A.; ANDRADE, J. S. Seleo
de Basidiomycetes da Amaznia para produo de enzimas de
interesse biotecnolgico. Cinc. Tecnol. Aliment., Campinas,
28(Supl.): 116-124, dez. 2008.
[10] BATTESTIN, V. ; MATSUDA, L. K.; MACEDO, G. A. Fontes
e Aplicaes de Taninos e Tanases em alimentos. Alim. Nutr.,
Araraquara, v.15, n.1, p.63-72, 2004.
[11] BANERJJE, D.; MONDAL, K.C.; PATI, B.R.
Production and characterization of extracellular and
intracellular tannase from newly isolated Aspergillus aculeatus DBF
9. J. Basic Microbiol. (41): 313-318, 2001.
[12] GOMES, M. R. A.; OLIVEIRA, M. G. A.; CARNEIRO, G. E. S.;
BARROS, E. G.; MOREIRA, M. A. Propriedades Fsico-Qumicas
de Polifenoloxidase de feijo (Phaseolus vulgaris L.). Cinc.
Tecnol. Aliment., Campinas, 21(1): 69-72, jan.-abr. 2001.
[13] MULLINGS, R. Measurement of saccharification by cellulases.
Enzyme and Microbial Technology, v. 7, p. 586-591, 1985.
[14] ESPOSITO, E.; AZEVEDO, J.L. Fungos uma introduo biologia,
bioqumica e biotecnologia. Cap. 7, .EDUCS, 2002.
[15] RUEGGER, M. J. S.; TAUK-TORNISIELO, S. M. Atividade da
celulase de fungos isolados do solo da Estao Ecolgica de Juria-
Itatins, So Paulo, Brasil. Revista Brasil. Bot., V.27, n.2, p.205-211,
abr.-jun. 2004.
[16] BATTESTIN, V. Produo, purificao, caracterizao e aplicao
da tanase de Paecilomyces variotii. Tese de Doutorado, curso de
Ps-graduao em Cincia de Alimentos, Faculdade de Engenharia
de Alimentos, da Universidade Estadual de Campinas, SP, 2007.
Figura 01. A- Halo de hidrlise da celulose promovida pelo fungo F2 e B- Reao de Banvendam evidenciando a produo de
enzimas do grupo polifenoloxidases por F1.
Maciel, C.C.S.
Maciel, C.C.S.
A B