Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Ciencias. Biologa

Fermentacin alcohlica por Saccharomyces cerevisiae en jugo de uvas
Falcn Ortiz Valeria, Gmez Ilescas Ameyalli, Gaona Gamboa Magda Abril, Lpez Oropeza Sofa Grecia,
Moncada Garca Andrea Irais

INTRODUCCIN
La fermentacin alcohlica es una de las etapas principales utilizadas en la industria para obtener
bebidas alcohlicas (Vincent, 2006). La fermentacin implica el empleo de microorganismos para llevar a
cabo transformaciones de la materia orgnica catalizadas por enzimas, comnmente se realiza por la
levadura Saccharomyces cerevisiae, que es la levadura corriente del pan o la cerveza, quien convierte un
90% del azcar en cantidades equimoleculares de alcohol y CO2 (Vzquez, 2007).
La fermentacin a grandes rasgos se compone de la gluclisis ms las reacciones que generan NAD+
transfiriendo electrones del NADH al piruvato o derivados del piruvato. El NAD+ puede, entonces,
emplearse de nuevo para oxidar azcares mediante la gluclisis, que rinde dos molculas de ATP por
cada fosforilacin a nivel de sustrato (Campbell & Reec, 2007). La Fermentacin alcohlica se define
como el proceso bioqumico anaerbico por el cual las levaduras transforman piruvato en Etanol, CO2 y
energa. (Wang, 1979)
El oxgeno es el desencadenante inicial de la fermentacin, ya que las levaduras lo van a necesitar en su
fase de crecimiento.El primer paso libere dixido de carbono del piruvato, que se convierte en el
compuesto de dos carbonos acetaldehdo; en el segundo paso, el acetaldehdo es reducido por el NADH
a etanol, esto regenera la provisin de NAD+, necesaria para que contine la gluclisis (Campbell &
Reec,, 2007).
La fermentacin alcohlica es un proceso exotrmico, es decir, se desprende energa en forma de calor.
Es necesario controlar este aumento de temperatura ya que si ste ascendiera demasiado (25 - 30) las
levaduras comenzarn a morir detenindose el proceso fermentativo. Otro producto resultante de la
fermentacin es el anhdrido carbnico (CO2) en estado gaseoso, lo que provoca el burbujeo, la
ebullicin y el aroma caracterstico de una fermentacin (Vzquez, 2007).
Uso de la fermentacin alcohlica
El empleo principal de los procesos de fermentacin por parte del ser humano ha ido dirigido, desde
muy antiguo, a la produccin de etanol destinado a la elaboracin de bebidas alcohlicas como el vino,
la cerveza, la sidra, etc. Dentro de los estudios de biotecnologa se ha intentado emplear el etanol
resultante de la fermentacin alcohlica de los desechos agrcolas (biomasa) en la obtencin debido a
combustibles empleados en los motores de vehculos. Los usos del etanol en la industria son amplios y
van desde la elaboracin de productos cosmticos, productos de limpieza, etc. No obstante el empleo
de la fermentacin alcohlica tiene un xito potencial en el tratamiento de los residuos de la industria
alimenticia. (Vzquez, 2007).



OBJETIVOS
Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentacin realizada por la levadura
de Saccharomyces cerevisiae.
Comprobar la produccin de fermentacin alcohlica a travs de la la concentracin de
azcares reductores, la produccin de alcohol de las muestras y el pH de las mismas.

HIPTESIS
La Fermentacin alcohlica y produccin de alcochol por S. cerevisiae en el macerado de uva, podr
corroborarse por medio de la disminucin de azcares reductores en solucin, el aumento del pH y la
medicin de los grados de alcohol.

MATERIAL Y MTODO

Se inici macerando dos kilos de uvas moradas utilizando un procesador de alimentos, hasta obtener
litro y medio de jugo; este se verti en dos frascos de aluminio, uno de un litro (no se llen hasta el
tope) y otro de medio litro (con 250 mL de jugo de uva), y se colocaron en una autoclave para esterilizar
a 120 C durante 15 minutos. Despus, en la botella de 500 mL se sembr el inculo de Saccharomyces
cerevisiae utilizando una asa; se dej incubar a 30 C durante una semana. Y la botella de 1000 mL se
almacen a 4 C.
Una semana despus se llev a cabo la inoculacin e incubacin. Primero se esteriliz el garrafn en
donde se vertieron los 500 mL del inculo cultivado anteriormente y adems se le agreg el jugo de uva
de la botella de 1000 mL, se agit manualmente para homogeneizar y se guardaron 5 mL de esta
mezcla. El jugo restante fue incubado a 29 C mantenindolo lejos de la luz y dejando liberar un poco de
gas cada tercer y agitando dos o tres veces al da (oxigenacin).
Se tomaron 10 mL de la botella de 750 mL antes de inocularlo y de la botella de 250 mL se tomaron 10
mL de inculo y se pasaron a tubos de centrfuga. Se centrifugaron a 600 rpm durante 7 minutos. Se
determin el pH de las muestras inicial y final por duplicado.
Se prepar una solucin de DNS al 0.5% y una solucin de glucosa estndar con 2.0 mg/ml. Se marcaron
10 tubos de ensaye donde se depositaron las soluciones como se muestra en la tabla 1.


Tabla 1. Datos para la preparacin de las soluciones utilizadas en la curva de calibracin. Con base a
una solucin de glucosa con concentracin conocida (2.0 mg/mL) se prepararon 6 tubos para realizar la curva de
calibracin (Tubos 1-6). Con el fin de determinar la concentracin de glucosa en las muestras se realizaron dos
soluciones por duplicado con las muestras del macerado, inicial y final (Tubos 7-10).


En seguida se agitaron los tubos en vortex durante un tiempo entre 30 y 60 segundos
aproximadamente, despus de lo cual los tubos tapados fueron incubados durante 5 minutos a bao
Mara a una temperatura de 87.9C. all sacar los tubos se les agregaron 5 ml de agua destilada. y se
agit nuevamente en vortex para homogeneizar. Finalmente se pas una pequea muestra de cada
tubo al espectrofotmetro a 540 nm.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Determinacin de la concentracin de azcares.
Para conocer la concentracin de azcares presentes en las muestras se realizaron diluciones a partir de
una solucin estndar de glucosa 2.0 mg/ml y se utiliz DNS como indicador colorimtrico de azcares
reductores en solucin. En la (Tabla 2) pueden observarse los valores de absorbancia obtenidos en las
diluciones. Para cada dilucin se realizaron 5 replicados, de los cuales se obtuvieron resultados poco
homogneos.


Tabla. 2. Datos de absorbancia (nm) obtenidas para las curvas de calibracin. Los tubos (1-5) equivalen a
las diluciones establecidas (Tubos 2-6, Tabla 1) y las diferentes replicaciones (Eq.1 - Eq. 5). A pesar de partir de la
misma concentracin de glucosa, las replicaciones no muestran resultados iguales.

Con los datos obtenidos para la absorbancia y utilizando la frmula [C1V1=C2V2] se calcul la
concentracin de glucosa presente en cada dilucin. Los resultados de la absorbancia y la concentracin
se graficaron (Grfico 1) para obtener la curva de calibracin.


Grfico 1. Curvas de concentracin de glucosa. Se realizaron 5 curvas de calibracin (Eq. 1, 2, 3, 4, 5), una por cada
equipo de laboratorio. Eq.2 es la curva ms cercana a la tendencia lineal y se utiliz en los anlisis posteriores. Se
muestra la ecuacin y la regresin lineal (Lineal Eq. 2) para la curva Eq.2, con una R
2
=0.9971.
Se puede observar la diferencia entre las rplicas, y en especial Eq.2 con R2= 0.9971, muestra una mayor
tendencia lineal. Al ser necesaria dicha relacin para determinar la concentracin de las muestras, se
utiliz la ecuacin de la curva para calcular las concentraciones (Tabla 3) a partir de la absorbancia
obtenida previamente.


Tabla 3. Concentracin de azcar obtenida en el macerado libre de levadura (Jugo) y en el macerado que contena
el inculo de levadura (Inculo).

Determinacin de pH
Con el fin de observar las diferencias en el pH durante el proceso de fermentacin, se realiz una
medicin previa a la incubacin y una segunda medicin, posterior al proceso de incubacin.

Tabla 4. Determinacin del pH de las muestras. Se hicieron dos mediciones de pH: al inicio del tratamiento (Ti),
antes de mezclar Inculo y Jugo en un solo contenedor, y despus del tratamiento (Tf), con ambas muestras en un
solo contenedor.

Determinacin del grado de alcohol.

Para la determinacin del grado de alcohol de las muestras, se utiliz un alcoholmetro. Debido a un mal
uso del instrumento, se hizo una medicin errnea, tomando el volumen desplazado por el
alcoholmetro al ser introducido a la muestra:

Inculo = 85 mL desplazados

Posteriormente, se realizaron diluciones de una muestra de Tequila, con un grado de alcohol conocido
(32), en cada dilucin se tomaba el volumen desplazado ( no se muestran los datos). Obteniendo al final
una dilucin 1/16 con 75 mL de volumen desplazado y 5 de alcohol. Haciendo la conversin, el volumen
desplazado en la muestra final corresponde
Inculo = 85 mL desplazados = 5.6 alcohol
Es importante sealar, que para los clculos se utilizaron las mediciones realizadas con el alcoholmetro
de 0-20 ya que haba una variacin entre ste y el alcoholmetro 0-10. posteriormente, se realiz la
medicin de alcohol en agua, como control. El resultado (1 alcohol) se utiliz para ajustar el observado
en la muestra, con un resultado final:

Inculo = 85 mL desplazados = 4.6 alcohol

DISCUSIN

Para obtener la curva de calibracin y conocer las concentraciones de glucosa presentes en las muestras
de inculo y jugo, se realiz la prueba de determinacin de azcares reductores por el mtodo de DNS,
este mtodo implica una reaccin colorimtrica y una reaccin tipo redox entre el DNS y los azcares de
las muestras. La oxidacin del azcar ocurre en el hidroxilo libre del carbono 1, mientras que el cido 3,5
dinitrosaliclico (DNS) se reduce en el NO2 del lugar 3 o 5.

A pesar de que cada una de las rplicas se realiz partiendo de una misma solucin, al graficar los
resultados (Grfico 1) se observaron variaciones entre los equipos, estas diferencias pudieron haber
ocurrido por el error humano durante el pipeteo o la medicin errnea de los volmenes empleados.
Debido a esta heterogeneidad en los resultados y a que fue la curva en la que ms puede apreciarse una
tendencia lineal se eligi la curva con mejores resultados (Equipo 2) para obtener la concentracin de las
muestras.

Las concentraciones de glucosa que se obtuvieron para el inculo y el jugo segn la curva de calibracin
fueron de 0.68 y 3.95 respectivamente, lo que era de esperarse ya que en el jugo (donde no se inocul
levadura) los azcares no se haban degradado o empleado en ninguna ruta metablica por lo cual su
concentracin deba ser mucho ms alta, mientras que en la muestra donde se permiti proliferar la
levadura, la concentracin de glucosa es menor. Al inicio y al final del experimento se registraron los
datos de pH, obteniendo un aumento en el pH del inculo de 3.39 a 4.38, esto puede deberse a la
presencia de etanol como producto de la actividad metablica de S. cerevisiae, ya que el etanol puro es
neutro, un aumento en el pH supone un aumento en la cantidad de alcohol de la muestra con respecto
al inicio del la inoculacin. Se encontraron problemas tcnicos al determinar el grado de alcohol de las
muestras, ya que el mtodo empleado en un principio no fue el adecuado, ambos alcoholmetros
difieren en los resultados y no se realizaron ajustes de temperatura. Por ello, los grados de alcohol no
pueden tomarse como datos enteramente confiables.

Un problema que ocurri con frecuencia en el grupo fue que el proceso de fermentacin se detuvo, esto
debe muy probablemente a que la concentracin de glucosa y fructosa en los preparados era diferente,
en general, los azcares fermentables ms usados para S. cerevisiae son la glucosa y la fructosa, pero
existe un empleo preferencial de la glucosa sobre la fructosa, y se ha llegado a explicar que el proceso
de fermentacin se detiene cuando el azcar disponible es en su mayora fructosa, adems los azcares
son consumidos primordialmente durante la fase estacionaria, conforme avanza el proceso, el
nitrgeno se reduce gradualmente y dada su importancia, el metabolismo celular baja, al mismo tiempo
que se acumula alcohol, haciendo txico el ambiente, y difcil la asimilacin de fructosa, parando la
fermentacin, esto a niveles industriales representa un problema cifrado en millones de dlares
anuales.


CONCLUSIONES

Se logr la obtencin del alcohol como metabolito primario de la fermentacin realizada por la levadura
ms comnmente usada en la industria, Saccharomyces cerevisiae, en el mosto o jugo de uva que
realiza la degradacin de glucosa como parte de su metabolismo para la obtencin de energa,
generando como producto de desecho el alcohol.
Se evalu el grado de fermentacin alcohlica a travs de la medicin de los grados de alcohol con
ayuda del alcoholmetro, y la presencia de azcares reductores usando DNS, as como tambin se
pudieron observar las preferencias de la levadura por la glucosa y las limitaciones que esta tiene en
cuanto a las concentraciones de oxgeno para la degradacin de fructosa. Otro de los indicadores para
corroborar la accin de la levadura fueron los cambios en el pH asociados con la produccin del mismo
alcohol y la degradacin de la glucosa.


BIBLIOGRAFA
- Campbell, N., & Reec, J., . (2007). Biologa. Mdica Panamericana. Madrid. Espaa.
- Dumont, A., Raynal, C., Raginel. F., Ortiz-Julien, A., Surez, C. y Heras, J. M.Ed. Lallemand.
(2008). La capacidad de las bacterias enolgicas para consumir fructosa.
- Owen P. Ward. (1991). Biotecnologa de la fermentacin: principios, procesos y productos Ed.
Acribia.
- Vzquez, H.J., .(2007)."Fermentacin alcohlica: Una opcin para la produccin de energa
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- Vela-Vicent, M., Blanco-lvarez, et. Al. (2006) Qumica industrial orgnica.
- Wang, D.,Cooney, et. Al. (1979). Fermentation and enzyme technology Ed. Wiley John &
Sons, Inc.