UNIVERSIDADE DE SO PAULO

Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras de Ribeiro Preto

Departamento de Qumica









EFEITO DA TEMPERATURA NA TAXA DE CRESCIMENTO DE E. coli









Gabrielle F. Loureno
Larissa G. Justino









Ribeiro Preto-SP
26/03/2014
1. Introduo
Em microbiologia o crescimento geralmente o aumento do nmero de clulas. O
crescimento populacional pode ser entendido como uma variao do nmero de clulas
ou da massa celular por unidade de tempo. O intervalo em que uma clula origina outras
duas novas clulas chamado de gerao e o tempo necessrio para que isso ocorra
denominado tempo de gerao, que varia entre os organismos e condies ambientais.
Considerando as bactrias, algas unicelulares e leveduras que se multiplicam por
diviso binria temos que o nmero final de microrganismos, N, aps n divises, pode ser
dado por N = N
0
.2
n
onde N
0
o nmero inicial de microrganismos. Assim, o nmero de
geraes, n
g
, pode ser expresso por n
g
= 3,3 (logN logN
0
) e o tempo de gerao, G,
dado como G = t-t
0
/n.
A curva do crescimento microbiano pode ser dividida em quatro fases principais:
fase lag, fase de crescimento exponencial, fase estacionria e fase de morte, como
mostrado na figura abaixo.

Figura 1. Curva do crescimento microbiano.

A fase lag caracterizada como um perodo de adaptao da cultura onde ocorre a
mudana de meio, a reparao de clulas com danos e a preparao do complexo
enzimtico. A fase exponencial apresenta inicialmente uma taxa lenta de aumento no
nmero de clulas, mas posteriormente acelerada. Nessa fase, o nmero de clulas
duplicado a cada perodo, onde todas as clulas esto se dividindo, podendo a velocidade
ser muito varivel dependendo do microrganismo. Na fase estacionria ocorre limitao
por reduo de nutrientes e acmulo de metablitos. E na fase de morte, ocorre a lise
celular. O crescimento bem sucedido de uma populao bacteriana reflete seu grau de
adaptao composio fsica e qumica de um determinado ambiente.
possvel fazer medidas de crescimento microbiano, existindo vrios mtodos
para tal. Pela avaliao direta, feita a contagem de clulas viveis por microscopia,
filtrao e a tcnica do nmero mais provvel. E pela avaliao indireta podemos medir a
turbidez pelo espectrofotmetro, atividade metablica e peso seco.
As atividades microbianas so intensamente afetadas pelas condies qumicas e
fsicas de seus ambientes tendo 4 fatores determinantes para o seu crescimento:
temperatura, pH, disponibilidade de gua e oxignio.
A Escherichia coli, uma bactria gram negativa, patognica, presente no trato
intestinal humano, considerada como mesfila, ou seja, apresenta uma temperatura
timoa de crescimento de 25 a 40C. Por temperatura tima de crescimento entende-se
aquela em que as clulas dividem-se mais rapidamente, logo apresentam um tempo de
gerao mais curto. A E. coliDH5 usada para o experimento uma bactria modificada
geneticamente em laboratrio e por isso no um agente patognico.

2. Objetivo
Observar o efeito de diferentes temperaturas na taxa de crescimento da E. coli
atravs da medida de absorbncia.

3. Materiais e mtodo
- chapa de aquecimento
- recipiente de vidro
- erlenmeyer
- pipeta automtica
- termmetro
- cronmetro
Inoculou-se o meio com uma cultura de E. coli DH5 pr adaptada em meio LB +
20 mM glicose aproximadamente 3 horas antes do incio do experimento. Nesse momento
retirou-se uma alquota para medir o valor de absorbncia em 550 nm no tempo zero.
Montou-se o banho-maria com um bquer numa placa de aquecimento como o mostrado
na figura 1. A temperatura do sistema foi ajustada para 44C e foi mantida constante ao
longo do experimento atravs de resfriamento com gelo ou regulado no aquecedor.
Deixou-se a cultura crescer por 150minutos, repetindo a medida de absorbncia a cada
30 minutos.
















Figura 1. Esquema do banho-maria com um bquer e uma placa de aquecimento.

4. Resultados
Abaixo, encontram-se compilados os grficos de absorbncia versus tempo em
minutos, encontrado por cada grupo durante a aula experimental. Os valores referentes
temperatura 44C foram recolhidos por esse grupo.

Tabela 1. Valores de absorbncia de acordo com o tempo para 44C
t (min) A1 A2 A3 Am
0 0,175 0,179 0,182 0,178
30 0,530 0,523 0,528 0,527
60 0,800 0,801 0,793 0,798
90 1,146 1,146 1,158 1,150
120 1,373 1,386 1,388 1,382
150 1,549 1,538 1,546 1,544

Tabela 2. Absorbncia mdia descontando a absorbncia em t0
A T (min)
0,349 30
0,62 60
0,972 90
1,204 120
1,366 150

Termmetro
Erlenmayer
com LB
Agitador
magnetico
Nvel de
gua
CALOR



Figura 2. Grfico de tempo versus absorbncia para 44C.


Figura 3. Grfico de tempo versus absorbncia para 44C.


Figura 4. Grfico de absorbncia vs. tempo para crescimento em 34 C.


Figura 5. Grfico de absorbncia vs. tempo para crescimento em 38 C.


Figura 6. Grfico de absorbncia vs. tempo para crescimento em 40 C.


Figura 7. Grfico de absorbncia vs. tempo para crescimento em 48 C.

Tabela 3. Velocidade de crescimento vs. temperatura
T (
o
C) 30 34 38 40 44 48
(A.min
-1
) 9,46x10^-4 0,01142 0,0095 0,0047 0,00873 6,8x10
-4


Figura 8. Grfico velocidade de todas as velocidades de crescimento vs. Temperatura

Figura 9. Grfico velocidade de crescimento vs. Temperatura, excluindo 30C e 40C

5. Discusso
O grfico obtido na temperatura 44C de responsabilidade do nosso grupo
cresceu semelhante temperatura de 38C. Esse ponto cai fora da curva de velocidades
em funo da temperatura, uma vez que a E.Coli, microrganismo mesfilo, tem
temperatura tima de crescimento entre 25 C e 40 C. O aparato experimental usado
para manter a temperatura determinada do banho simples, mas no justifica o fato
desse crescimento frente a uma temperatura no ideal, uma vez que todos os outros
grupos usaram o mesmo aparato. uma tarefa difcil ento imaginar o que pode ter
ocorrido j que cuidados como evitar que o erlenmeyer contendo a soluo com E. Coli
tocasse diretamente na chapa aquecedora e colocar a cultura no banho apenas quando
esse alcanasse a temperatura ideal, foram tomados. Ainda, o espectrofotmetro foi
utilizado com outro grupo que tambm obteve resultados condizentes com o que se
esperava. De forma que aparentemente, a temperatura ideal de crescimento da E. Coli
34C, temperatura na qual a velocidade de crescimento atingiu maior valor, como pode
ser visto na figura 8.
Algumas etapas desse procedimento devem ser ressaltadas e analisadas com
critrio a fim de esclarecer algumas confuses, a comear pelas medidas de absorbncia
realizadas.
Medir o crescimento de bactrias em funo da absorbncia no o melhor
mtodo de se avaliar esse crescimento. Isso porque, em princpio analisa-se a turbidez
causada pelo aumento do numero de colnias e no a absorbncia da soluo. Isso
evidente quando durante as medidas, a absorbncia extrapola o valor de 1. Como a
absorbncia dada pelo inverso da transmitncia, que seria a quantidade de luz que
atravessa o meio, natural concluir que se nenhuma luz atravessar o meio, ela foi
absorvida pela amostra e esse valor no pode ser maior que um.
Ainda assim, essa tcnica rpida e simples sendo um bom meio de avaliar
qualitativamente o crescimento bacteriano. Sempre, assumindo que o que se mede na
verdade a turbidez do meio e no a absorbncia, alguns cuidados devem ainda ser
tomados. O espectrofotmetro deve ser zerado com um branco, e essa cubeta deve ser
utilizada nas outras medidas a seguir, dessa forma o erro inserido na medida propagar-
se- nas outras medidas.
Com relao aos grficos obtidos absorbncia em funo de tempo observa-se
aumento na concentrao de E. Coli conforme a permanncia em banho controlado. Se
traarmos os valores de absorbncia para a temperatura em 44C observa-se o inicio de
um patamar perto na ultima temperatura. Tal caracterstica deve ser observada para todas
as temperaturas de crescimento, condizente com uma fase estacionaria no crescimento
das bactrias.
J o grfico da figura 8 foi obtido a partir dos coeficientes angulares da regio linear
cada curva de absorbncia x tempo, conforme a formula a baixo:
A = Ao + t

Como a metodologia utilizada precria, no permitindo um bom
acompanhamento da temperatura, a velocidade de crescimento nas temperaturas 30C e
40C apresenta um perfil incomum, mas que deixa clara que a velocidade de crescimento
ideal 34C.
Devemos lembrar que isso no valido para qualquer outro microorganismo que
se queira analisar. Cada microorganismo tem uma temperatura tima de crescimento,
sendo este ltimo influenciado por outros fatores. Por exemplo, o meio utilizado para o
cultivo das E. Coli usadas nesse experimento especial para bactrias. Outros
parmetros como atividade de gua, disponibilidade de nutrientes, meio aerbio ou no
podem causar significativa influencia em sua taxa de crescimento.

7. Referncias
Crescimento microbiano. Disponvel em:
http://blog.cca.ufscar.br/lamam/files/2010/07/aula7_crescimento-micro.pdf. Acesso em 21
mar. 2014.