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Discusin de Resultados

En la tcnica de Perclorato de sodio se utilizan Buffer de Lisis 1 y 2 que se utilizan para lisar primero a los glbulos
rojos que son los ms abundantes en sangre perifrica, pero que carecen de ncleo (lugar donde reside el DNA
en las clulas) para evitar su interferencia; se centrifuga y se realizan los lavados correspondientes. Despus se
lisan a los leucocitos con buffer de lisis 2 y SDS, para la liberacin del contenido celular y con esto el ncleo. El
NaCl y perclorato de sodio crean una alta concentracin de sales en la muestra y actan como quelantes del
DNA, y con isopropanol se promueve que el DNA precipite, por el cambio de constante dielctrica del agua,
permitiendo separar al DNA de la fase acuosa. Finalmente con etanol al 70% se remueven sales, SDS e
isopropanol, para poder tener solamente DNA en agua estril. (Giraldo, G. 2010).
En la tcnica de Fenol/cloroformo no se lisan los eritrocitos del todo, ya que se transfiere directamente la
capa de glbulos blancos a otro tubo para hacerle el tratamiento adecuado con RCLB (Buffer de lisis de
eritrocitos) para lisar los eritrocitos que se hayan pasado con la trasferencia de la capa leucocitaria, despus
hacer los lavados correspondientes para su eliminacin. La lisis de leucocitos se debe al SDS 10% para liberacin
del material gentico y de igual manera el NaCl acta como agente quelante del DNA, pero a diferencia de la
tcnica de perclorato, la separacin de DNA se realiza con una extraccin fenlica. Esta solucin contiene
Fenol, Cloroformo y alcohol isoamlico. ste ltimo previene la formacin de espuma y facilita observar las fases
acuosa y orgnica para una mejor separacin. Se utiliza Isopropanol para precipitar el DNA y separarlo de la
fase acuosa y la remocin de los dems componentes con Etanol 70%. (Zumbo,2011)
Con base en los resultados obtenidos, se puede observar que la extraccin superior de ADN fue con la
tcnica de fenol-cloroformo, como se puede observar en la tabla No.1. Sin embargo la relacin de DO 260/280
obtenida (2.082), fue notablemente superior al rango de 1.7-1.91.8, como se encuentra en la literatura, lo que
nos indica que la muestra de DNA no es pura; y, debido a que la relacin se encuentra ms elevada, nos orilla a
pensar una posible contaminacin con RNA.
El ADN puro tiene una razn ADN/protena (D260/DO280) de 1.8 (Sambrook & Russell, 2001). Si la razn es
mucho menor a este nmero hay contaminacin por protenas. Si es mayor a 2.0 hay contaminacin por ARN.
De acuerdo al CIMMYT, en vez de un nmero hay un rango de 1.8 2.0 en el que se cree que la absorcin es
causada por cidos nucleicos, aqu se afirma que una relacin inferior a 1.8 indica que pueden existir protenas
y/u otros elementos absorbentes de UV en la muestra. En ese caso, es conveniente volver a precipitar el ADN.
Una relacin superior a 2.0 indica que las muestras pueden estar contaminadas con cloroformo o fenol y se
debe volver a efectuar la precipitacin con etanol (CIMMYT, 2006).
En el caso de la tcnica de perclorato, como s puede observar en la table No. 1, la relacin DO DO
260/280 obtenida (1.78) fue ligeramente menor al rango 1.8-2.0 de acuerdo al DIMMYT, debido a
contaminacin por protenas, como se mencion anteriormente. Sin embargo se considera el ADN extrado por
perclorato como el ms puro ya que es ms cercano a 1.8.
Para caracterizar el DNA que se tena se utiliz la electroforesis en gel de agarosa que es una de las ms
utilizadas, ya que forma geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no
inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la
ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el
tamao del poro.5 sta funciona como un filtro en el que los fragmentos de menor tamao (en este caso de
DNA) migran hacia el nodo ms rpidamente que los de mayor tamao, permitiendo de esta manera la
separacin, purificacin e identificacin de DNA en la muestra, debido a que el DNA est cargado
negativamente por los grupos fosfatos de la molcula, La electroforesis en gel de agarosa es un mtodo
bastante utilizado para separar, identificar y purificar fragmentos de DNA (Uruena, C. 2009)
Por otro lado la agarosa tiene la propiedad de mantenerse en estado slido a temperatura ambiente
pero que a altas temperaturas se torna lquida, adems de que no es un compuesto txico a diferencia de la
acrilamida y permite el anlisis de cidos nucleicos con pesos moleculares muy variados. Sin embargo, su poder
de resolucin es menor que el de los geles de poliacrilamida. La concentracin a usar se escoge segn el
tamao del cido nucleico a analizar.(3) ,esto porque la concentracin de agarosa define el tamao de los
poros de la matriz, a mayor concentracin, menor el tamao de los poros y viceversa.
Como se puede observar en la imagen 1 en el primer carril se coloc el marcador de peso molecular que son
fragmentos de DNA de tamao conocido con el fin de calcular el tamao aproximado del DNA.(4)
En los siguientes carriles se cargaron 10 L (8 L de muestra + 2 L de buffer de carga, y colorante Gel
Red que permite visualizar la muestra con luz U.V.). (En los reactivos ocupados no se utiliz Bromuro de etidio
como solucin de revelado, debido a sus caractersticas txicas, el cual se cambi por Gel Red).
El buffer de carga contiene glicerol, EDTA, Azul de Bromofenol y Xilencianol el cual tiene como objetivo
aadir una parte del color a la muestra que pueda desplazarse tambin en el campo elctrico al que se le va a
someter, aumentar la densidad de la muestra ya que deben caer uniformemente dentro del pocillo de
electroforesis (cubierto por solucin tampn) ya que de lo contrario no se quedara dentro de ste.(7)
En cuanto a la placa obtenida de la electroforesis, para el corrimiento de nuestras muestras ubicadas en
el carril 2 y 3, por el mtodo de perclorato de sodio, el desplazamiento no es tan representativo, sin embargo es
evidente su presencia; esto se debe a que el tamao de las molculas que permite separar el gel de agarosa
son de mayor tamao, lo que se confirma con el corrimiento del marcador de peso molecular ubicado en el
primer carril, el cual mostro el recorrido esperado para muestras de tamao molecular ms pequeo; para las
muestras tratadas, el material gentico extrado representaba el DNA genmico, es decir la totalidad del
genoma en las clulas tratadas, por lo tanto el desplazamiento en el gel es escaso o nulo.
Se puede estimar la aproximacin de las pb en los fragmentos obtenidos, en el caso de perclorato de
sodio es mayor a 11,000 pb (11kb) ya que est por encima del rango mayor de los marcadores de peso
molecular tomando en cuenta el % de agarosa usado. En lo que se debe a la muestra de fenol/cloroformo, hay
dificultad para la estimacin, por motivos de contaminacin mencionados anteriormente.
Para cualquier determinacin deben tenerse en cuenta las condiciones de trabajo ya que el ms
mnimo error puede afectar los resultados, este seguimiento conlleva desde la preparacin del material a
emplear en las extracciones hasta la emisin de resultados, esto es que desde las soluciones a emplear para
extraer el material gentico deben prepararse con las concentraciones exactas para as asegurar su
funcionamiento y el material debe cumplir especificaciones de lavado para eliminar cualquier contaminacin,
pues el material gentico que se extraer puede no ser de la muestra que deseamos y pertenecer a
contaminantes (bacterias o clulas provenientes del personal que maneja la muestra.