Tcnicas de anlise de DNA aplicadas a diagnstico

INTRODUO
A histria da gentica mdica foi revolucionada pelo trabalho de Watson e Crick, em 1953, onde foi
proposta a estrutura de dupla hlice de !A" urante os #ltimos $% anos a tecnologia do !A recombinante
tem vindo a desenvolver tcnicas muito poderosas e sens&veis 'ue s(o usadas no estudo e na identifica)(o de
anomalias moleculares"
* ob+ectivo deste trabalho abordar algumas dessas tcnicas de an,lise de !A, nomeadamente-
./ol0merase Chain 1eaction2 3/C14, .enaturing 5radient 5el 6lectrophoresis2 35564, .1estriction
7ragment 8ength /ol0morfism2 3178/4, 9ibrida)(o in situ e .:ariable !umbers of ;adem 1epeats2
3:!;14, 'ue permitam, de certa forma, a identifica)(o de genes relacionados com doen)as genticas
espec&ficas, abrindo a possibilidade de diagnstico"
As principais ,reas de aplica)(o destas tcnicas moleculares de diagnstico reflectem<se ao n&vel das
doen)as infecciosas, do cancro, das doen)as genticas, dos transplantes e da patologia cl&nica"
TCNICAS DE ANLISE DE DNA
PCR
O que a PCR?
A /C1 31eac)(o de /olimeri=a)(o em Cadeia4 uma metodologia 'ue se baseia na amplifica)(o
e>ponencial selectiva de uma 'uantidade redu=ida de !A de uma #nica clula" 6sta tcnica revolucionou o
mundo cient&fico e as suas aplica)?es s(o imensas- usada no diagnstico mdico, mapeamento gentico,
detec)(o de doen)as heredit,rias, clonagem de genes, testes de paternidade, identifica)(o de .impress?es
digitais2 genticas@ e facto, a /C1 revolucionou v,rias ,reas como a Aiologia Bolecular, /atologia,
7arm,cia, AotCnica, Bedicina 7orense e valeu o prmio !obel, em 1993, a Dar0 Bullis"
Objectivo
* ob+ectivo da /C1 produ=ir uma 'uantidade apreci,vel de um segmento espec&fico de !A a partir
de uma 'uantidade m&nima" * !A molde sofre uma amplifica)(o controlada por en=imas, obtendo<se
%
milh?es de cpias do fragmento de !A de interesse" * molde pode ser 'ual'uer forma de !A de cadeia
dupla, como o !A genmico- pode usar<se uma
gota de sangue, um fio de cabelo, uma clula do
epitlio oral, um blastmero@
E que co!"i"te u cic#o $e PCR?
Em ciclo de /C1 37ig"14 consiste em trFs
fases- desnatura)(o do !A molde 3a 95GC4, liga)(o
3.annealing24 dos primers 3a HIGC4 e polimeri=a)(o
do !A 3a J$GC4" !a 1K etapa fa=<se a separa)(o das
cadeias de dupla hlice de !A atravs do calor"
6sta separa)(o essencial para 'ue, na $K fase, dois
primers de oligonucletidos se liguem Ls se'uFncias dos pares de bases complementares da cadeia molde"
6stes primers s(o desenhados e sinteti=ados de modo a ligarem<se Ls e>tremidades opostas de cada uma das
cadeias de !A molde 'ue se pretende amplificar" *s primers servem, portanto, de ponto de partida para a
replica)(o de !A e, na #ltima etapa, fa=<se a sua e>tens(o" A en=ima respons,vel por esta polimeri=a)(o
a !A polimerase termo<est,vel 3;a'4, tendo sido isolada a partir da bactria termof&lica Thermus aquaticus
'ue vive em elevadas temperaturas" M essencial 'ue a en=ima usada se+a est,vel ao calor, uma ve= 'ue os
ciclos de /C1 tFm lugar a temperaturas situadas entre os HIGC e 95GC" /ara e>ecutar este ciclo usa<se um
termociclador, 'ue fa= variar de forma rigorosa o tempo e a temperatura ao longo do ciclo" !ormalmente s(o
repetidos cerca de 3% ciclos, o 'ue demora apenas algumas horas"
Assim, duas novas cadeias s(o sinteti=adas a partir da cadeia molde em cada ciclo completo de /C1
logo d,<se um crescimento e>ponencial, havendo ao fim de n ciclos $
n
ve=es mais cpias do 'ue no in&cio"
%a!ta&e!" e #iita'(e"
* segredo do sucesso da /C1 reside na capacidade 'ue ela tem de amplificar uma se'uFncia precisa
de !A aliada L sua simplicidade, rigor, elevada sensibilidade e especificidade" !(o necess,rio isolar o
!A 'ue se pretende amplificar 3mesmo 'ue se encontre misturado com !A de outras espcies4, uma ve=
'ue a especificidade da /C1 dada pelos primers" M uma tcnica r,pida, barata e segura"
1
7ig" 1 N Ciclo do /C1"
Contudo, a /C1 tambm tem limita)?es, como a necessidade de conhecer a se'uFncia de !A a
amplificar para 'ue possam ser sinteti=ados primers espec&ficos" *utras desvantagens s(o a relativa
facilidade com 'ue ocorre contamina)(o da amostra por !A estranho 3uma ve= 'ue se trata de uma tcnica
muito sens&vel4 e a limitada e>tens(o da se'uFncia 'ue poss&vel amplificar 3 dif&cil aplicar a /C1 a
se'uFncias maiores do 'ue 5kb4" /ode tambm ocorrer incorpora)(o errnea de bases durante a replica)(o"
A)#ica'(e"
*s resultados da /C1 s(o #teis no diagnstico, prognstico, determina)(o da terapia a ser utili=ada, e
at mesmo na avalia)(o da susceptibilidade a doen)as" A /C1 fre'uentemente utili=ada na detec)(o de
polimorfismos, muta)?es pontuais e infec)(o por microorganismos bacterianos ou virais antes da
e>teriori=a)(o patolgica da sua presen)a" M particularmente importante na detec)(o do OPA, pois
consegue detectar o v&rus 9P: nas primeiras semanas aps a infec)(o e mais rapidamente do 'ue o mtodo
normalmente utili=ado, o teste 68POA" A /C1 procura directamente pelo !A do v&rus en'uanto 'ue o teste
68POA mais indirecto, pois procura anticorpos 'ue o organismo possa ter produ=ido contra o v&rus"
*utro e>emplo de aplica)(o da /C1 no /P 3diagnstico pr<implantatrio4 e no /! 3diagnstico
pr<natal4" A /C1 pode ser usada em /! em idades gestacionais t(o precoces como as 9 semanas,
permitindo, por e>emplo, a detec)(o de clulas de um feto masculino em circula)(o no sangue materno,
ainda 'ue e>ista em 'uantidades muito redu=idas, e averiguar a compatibilidade entre o grupo sangu&neo da
m(e e do feto" /ermite ainda a detec)(o de v,rias anormalidades cromossmicas como a trissomia $1" 6ste
e>ame ao diagnosticar previamente certas doen)as, possibilita 'ue os pais e e'uipa de sa#de decidam
antecipadamente a melhor atitude a tomar em rela)(o a cada caso"
D**E
O que a D**E?
A electroforese em gel de gradiente desnaturante 35564 um mtodo de separa)(o electrofortico
baseado em diferen)as no comportamento de desnatura)(o de fragmentos de !A de cadeia dupla"
I)o+t,!cia $a D**E
$
A 556 uma poderosa tcnica de an,lise gentica 'ue pode ser usada para detectar directamente
modifica)?es de uma #nica base e polimorfismos em !A genmico, !A clonal e !A amplificado por
/C1"
Coo "e )+oce""a?
As molculas do !A desnaturam em
segmentos espec&ficos designados dom&nios de
desnatura)(o, 'uando a temperatura ou a
concentra)(o do desnaturante se elevam 37ig"
$4" A temperatura de fus(o de uma cadeia dupla
de !A influenciada simultaneamente pelas
pontes de hidrognio 'ue se estabelecem entre pares de bases complementares e pela atrac)(o entre bases
ad+acentes da mesma cadeia" Pnicialmente, envolve a mistura de uma sonda de !A de cadeia simples
marcada radioactivamente com a cadeia dupla de !A a ser e>aminado, sendo a #ltima previamente
a'uecida de modo a tornar<se de cadeia simples" * !A 'ue idFntico com a sonda de !A formar, um
homoduple>, o 'ual, sob as condi)?es desnaturantes do gel, permanecer, hibridi=ado" Etili=ando um gel de
poliacrilamida, 'ue contm um gradiente linear de desnaturante 3ureia ou formamida4 poss&vel distinguir os
homoduple> mutantes dos normais devido Ls diferentes propriedades de fus(o das molculas de !A"
Assim, 'ual'uer m, combina)(o do !A em estudo com a sonda de !A resultar, no aparecimento de um
heteroduple>, o 'ual, L medida 'ue atravessa o gradiente desnaturante do gel, se desagregar,, tornando<se de
cadeia simples num dado ponto" a'ui resulta uma estrutura ramificada 'ue apresenta menor mobilidade
'uando comparada com a do homoduple>, o 'ue pode ser detectado por colora)(o ou por autorradiografia" A
separa)(o completa da cadeia impedida pela presen)a de um dom&nio de fus(o elevado, 'ue geralmente
criado artificialmente numa e>tremidade da molcula pela incorpora)(o de uma bra)adeira<5C, 'ue nunca
desnatura nas circunstCncias escolhidas para a e>periFncia" Psto reali=ado durante a amplifica)(o de /C1
usando um primer de /C1 com uma e>tremidade 5Q 'ue consiste numa se'uFncia de 5C<I%"
%a!ta&e!"
3
7ig" $ N A liga)(o de !A em dom&nios discretos"
-. ;a>a e sensibilidade de detec)(o elevadas" /. A metodologia simples e usa<se um mtodo de
detec)(o n(o radioactivo" 0. *s fragmentos de /C1 podem ser isolados a partir do gel e ser usados em
reac)?es de se'uencia)(o"
Liita'(e"
-. Ao elaborar a 556 desde o =ero e>ige<se a an,lise por computador bem como e>periFncias
prvias" /. M re'uerida a compra de e'uipamento espec&fico" 0. *s primers s(o mais caros devido ao 5C<I%"
Primers adicionais podem ser #teis na se'uencia)(o" 1. A an,lise de fragmentos /C1 com mais de I%%pb
menos bem sucedida" 2. *s genes e>cepcionalmente ricos em 5C n(o s(o analisados fLcilmente por 556"
3. * mtodo envolve o uso do formamida"
A)#ica'(e"
Algumas das mais valiosas utilidades da 556 na gentica humana s(o a detec)(o directa de
muta)?es numa #nica base causadoras de doen)a, a detec)(o de polimorfismos com sondas de !A e a
descoberta dos pontos de desnatura)(o de fragmentos de !A"
O(o conhecidos casos em 'ue a 556, associada a outras tcnicas como a /C1, foi o tipo de an,lise
mutacional directa utili=ado na avalia)(o de fetos em risco de apresentarem deficiFncia na en=ima reductase
da dihidropteridina 39/14" 6sta uma doen)a heredit,ria autossmica recessiva causada por muta)?es no
gene R1/ e resulta em hiperfenilalaninmia e deficiFncia em diversos neurotransmissores no O!C, sendo
imprescind&vel o diagnstico pr<natal nas fam&lias afectadas"
A 556 tambm um dos mtodos de pes'uisa gentica de muta)?es respons,veis pela s&ndrome de
neoplasia endcrina m#ltipla tipo1 3B6!14, uma doen)a autossmica dominante, caracteri=ada por tumores
endcrinos da glCndula pituit,ria anterior, glCndulas para<tiroides e pCncreas" 6sta doen)a provocada por
muta)?es do gene B6!1, um gene supressor tumoral"
Ema muta)(o de clulas germinativas +, conhecida no gene da prote&na precursora amilide bem como
muta)?es novas no gene /O<1 foram detectadas por 556 em pacientes com doen)a de Al=heimer"
R4LP
I
O que o R4LP?
178/ 31estriction 7ragment 8ength /ol0morfism4 uma tcnica em 'ue os organismos podem ser
diferenciados pela an,lise de padr?es derivados da clivagem do seu !A" Oe dois organismos diferirem na
distCncia entre os s&tios de clivagem de uma endonuclease de restri)(o, o comprimento dos fragmentos
produ=idos vai diferir 'uando o !A for digerido com uma en=ima de restri)(o"
5eto$o#o&ia
/ara a detec)(o de 178/Ss, pode ser usada a metodologia de .Ohouthern Alotting2, descrita em 19J5
por 6dmund Oouthern" Aps restri)(o en=im,tica os fragmentos de !A genmico s(o su+eitos a
electroforese em gel e posteriormente transferidos para um suporte slido de nitrocelulose atravs do
arrastamento por capilaridade" Aps hibridi=a)(o com sondas radioactivas este processo possibilita a
identifica)(o, entre milhares de fragmentos de restri)(o obtidos, de se'uFncias bem determinadas"
A)#ica'(e"
Com o aumento da informa)(o da se'uFncia gentica um grande n#mero de doen)as genticas podem
ser determinadas atravs da an,lise do 178/-
14 A a!eia 6a#ci6o+e uma doen)a gentica em
'ue ambos os genes no paciente substituem um ; por um A
na posi)(o do meio do cod(o H" Psto converte o cod(o 5A5
3para o glutamato4 ao cod(o 5;5 3para a valina4 e elimina e
se'uFncia reconhecida 3C;5A55 'ue comum aos cod?es
5, H e J4 e cortada por uma das en=imas de restri)(o"
Ruando o gene normal 3beta a4 digerido com uma en=ima de restri)(o e os fragmentos s(o separados por
electroforese a sonda liga<se a um pe'ueno fragmento 3entre as setas vermelhas4" Ruando o gene doente
3beta s4 a en=ima n(o pode cort,<lo neste s&tio, ent(o a sonda liga<se a um fragmento muito maior 37ig" 34"
!este e>emplo, uma mudan)a de um #nico nucleot&dio produ= o 178/" Psto uma causa comum de 178/Ss
e estes polimorfismos s(o actualmente referidos como O!/Ss 3Oingle !ucleotide /ol0morphisms4"
$4 A 6ib+o"e c7"tica 37C4 uma doen)a heredit,ria 'ue fa= certas glCndulas produ=irem secre)?es
anormais, resultando disso v,rios sintomas, os mais importantes afectando o trato digestivo e os pulm?es" A
7C uma doen)a recessiva, pelo 'ue 'ual'uer pessoa com 7C deve ser
5
7ig" 3 < 8inhagem de uma fam&lia em 'ue o filho
o #nico a possuir anemia falciforme"
7ig"I N An,lise do 178/ para a 7C"
homo=igtica para os alelos da doen)a" Oe os progenitores re'uererem aconselhamento gentico recorre<se L
an,lise de 178/ 'ue reali=ada ao seu !A" *s 178/Ss para a 7C s(o conhecidos, portanto f,cil
determinar se uma pessoa homo=igtica normal, hetero=igtica portadora ou homo=igtica com 7C 37ig"
I4"
Liita'(e"
-. As muta)?es 'ue causam a maior parte das doen)as genticas humanas s(o mais variadas do 'ue a
#nica muta)(o associada L anemia falciforme" /. 6>istem muitas doen)as 'ue resultam de v,rios genes
mutantes trabalhando +untos para produ=ir o fentipo da doen)a" 0. Ainda e>istem doen)as genticas para as
'uais o gene ainda n(o foi descoberto" At o gene poder ser locali=ado, clonado e se'uenciado nenhuma
sonda pode ser feita para o detectar directamente"
8ib+i$a'9o i! "itu
O que a :ib+i$a'9o i! "itu?
A hibrida)(o in situ um mtodo 'ue permite identificar o locus cromossmico onde se locali=a uma
determinada se'uFncia de !A previamente clonada" 6ste mtodo tem como princ&pio a complementaridade
das bases 'ue reage a organi=a)(o de !A"
Coo 6u!cio!a?
* !A de um esfrega)o metaf,sico e o !A de uma sonda s(o transformados em se'uFncias
monocatenares atravs da desnatura)(o e posteriormente s(o postos em contacto em condi)?es de
hibrida)(o" Assim a sonda vai hibridar com a se'uFncia cromossmica onde se locali=am as bases
complementares" :isto 'ue a sonda previamente marcada 3com um fluorocromo4, o local de liga)(o torna<
se vis&vel o 'ue permite identificar especificamente o local do cromossoma onde se locali=a o gene ou a
se'uFncia n(o codificadora em causa"
A reali=a)(o desta tcnica pode ser feita usando uma #nica sonda ou at mesmo v,rias sondas, cada
uma marcada com um fluorocromo diferente" 6sta #ltima tcnica chama<se 7PO9 .multiple>2"
*s padr?es de bandas de um cromossoma s(o diversos e depende da tcnica usada e do corante"
H
Po$e+ $e +e"o#u'9o
* poder de resolu)(o de 7PO9 limitado a cerca de $ a 3 Bpb, em cromossomas metaf,sicos" /orm,
em cromossomas interf,sicos, a resolu)(o poss&vel para valores acima de 5% Dpb" Oe os cromossomas
interf,sicos forem tratados de forma a libertar fibras cromossomas das molculas proteicas associadas os
limites de resolu)(o pode aumentar at valores da ordem de 5 Dpb"
A)#ica'(e" a $ia&!;"tico
A tcnica 7PO9 permite detectar delec)?es de um locus autossmico espec&fico, em clulas
interf,sicas" M tambm uma tcnica muito #til para detec)(o r,pida de altera)?es numricas dos
cromossomas em clulas interf,sicas, recorrendo a sondas centromtricas" Com .7PO9 multiple>2 e
cariotipagem espectral poss&vel detectar rearran+os cromossmicos comple>os"
8ib+i$a'9o &e!;ica co)a+ativa
A tcnica assenta na hibrida)(o competitiva de uma mistura e'uimolar de dois tipos de !A marcados
com fluorocromos diferentes"
/ermite detectar delec)?es ou duplica)?es de regi?es cromossmicas espec&ficas" !(o detecta
anomalias estruturais e'uilibradas como transloca)?es reciprocas, invers?es ou inser)?es"
%NTR
O que o %NTR?
* :!;1 3:ariable !umber of ;andem 1epeats4 uma metodologia 'ue se baseia na e>istFncia de
uma se'uFncia repetitiva espec&fica activa em diferentes indiv&duos de uma popula)(o ou nos dois
homlogos diferentes do cromossoma num indiv&duo diplide"
Ema repeti)(o em srie 3.tandem repeat24 uma se'uFncia curta do !A 'ue repetido na forma de
.head<to<tail2 num locus cromossmico espec&fico" As repeti)?es em srie s(o evidenciadas ao longo de todo
o genoma humanoT sendo 'ue algumas se'uFncias s(o encontradas em somente um local N um #nico locus N
e o n#mero de unidades repetidas varia entre indiv&duos" ;ais loci s(o denominados :!;1s" Em :!;1 nos
seres humanos uma se'uFncia de 1J pb do !A repetida entre J% e I5% ve=es no genoma" * n#mero total
de pares de bases neste locus pode variar de 119% a JH5%"
I)o+t,!cia
J
-. /ermite au>iliar no diagnstico de determinadas doen)as, nomeadamente- diabetes tipo P,
fenil'ueton#ria, cancro, entre outras" /. Constitui um contributo na investiga)(o forense na an,lise de
impress?es digitais"
A)#ica'9o
-< 37ig"54 A4 !esta an,lise encontram<se
se'uFncias de !A repetidas, tal como,
CACACA@, as 'uais se locali=am em v,rias
posi)?es 3loci4 no genoma humano" * n#mero de
repeti)?es em cada srie pode ser altamente vari,vel
na popula)(o, nomeadamente, de I a I% em
diferentes indiv&duos" A srie de nucleot&deos
repetidos deste tipo geralmente denominada como
se'uFncia microsatlite hipervari,vel 3hypervariable
microsatellite sequence), tambm conhecido como se'uFncia
:!;1" evido L variabilidade nesta se'uFncia em cada
locus, os indiv&duos herdam diferenciadamente dos seus pais e das suas m(es de tal modo 'ue dois
indiv&duos diferentes nunca contFm o mesmo par de se'uFncias" Ema an,lise de !A utili=ando primers
'ue ladeiam o locus produ= um par de bandas de !A amplificado de cada indiv&duo, uma banda a
representar a vari,vel materna e outra a vari,vel paterna" A e>tens(o do !A amplificado e a posi)(o das
bandas 'ue esse produ= aps electroforese depende do n#mero e>acto de repeti)?es no locus"
A4 * e>emplo es'uem,tico ilustrado evidencia 'ue os mesmos trFs loci :!;1 s(o analisados
3re'uerendo trFs pares diferentes de primers oligonucleot&deos seleccionados especialmente4 provenientes de
trFs su+eitos 3indiv&duos A, A e C4 produ=indo seis bandas de !A por cada pessoa depois de reali=ada a
electroforese em gel de poliacrilamida" 6mbora alguns indiv&duos tenha algumas bandas em comum, a maior
parte dos moldes s(o distintos" As bandas referidas podem servir como impress(o digital para identificar
minuciosamente cada indiv&duo como #nico" * 'uarto caso 374 contm o produto da mesma reac)(o levada a
cabo por uma amostra forense" * material de an,lise para a reali=a)(o do /C1 pode ser um simples fio de
cabelo ou uma gota de sangue" Ruando analisada a variabilidade de 5 a 1% loci :!;1 diferentes, a
U
7ig" 5 N An,lise de impress?es digitais na
investiga)(o forense"
probabilidade de dois indiv&duos diferentes possu&rem os mesmos moldes genticos , apro>imadamente, 1
em 1% bili?es" este modo, analisando os resultados evidenciados poss&vel concluir 'ue os indiv&duos A e
C podem ser eliminados da lista de suspeitosT en'uanto o indiv&duo A possivelmente cometeu o crime"
Ema abordagem semelhante , nos dias correntes, fre'uentemente utili=ada para testes de paternidade"
/" /ara identificar alguns dos factores genticos 'ue contribuem para a obesidade nas crian)as da
6uropa Central e do !orte de Vfrica foi estudada a rela)(o entre a transmiss(o de alelos no locus da insulina
e o in&cio precoce da obesidade" * polimorfismo no :!;1 do gene da insulina est, associado a varia)?es na
e>press(o deste gene" Assim, crian)as 'ue receberam um alelo classe P dos seus pais 3e n(o das suas m(es4
tinham um risco relativo de ser precocemente obesas de H5<J%W, sendo poss&vel concluir 'ue a transmiss(o
paternal do alelo :!;1 classe P P!O 3gene da insulina4 predisp?e a obesidade infantil"
CONCLUSO
A tecnologia de an,lise de !A possibilitou o diagnstico de in#meras doen)as genticas" !este
momento, desempenha um papel crescente na pes'uisa e diagnstico deste tipo de patologias" Buitas ve=es,
o diagnstico de uma doen)a n(o re'uer somente o uso de uma tcnica, mas sim a con+uga)(o de v,rias,
visto e>istir complementaridade entre elas" * aumento de conhecimento e o desenvolvimento da tcnica tFm
vindo a ser e>plorados e rapidamente transferidos para os laboratrios cl&nicos" /orm, a difus(o e a
transferFncia destas formas de tecnologia necessitam do desenvolvimento de protocolos e da e'ua)(o dos
problemas ticos associados"
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