MICROBIOLOGA AGRCOLA

Y AMBIENTAL


2014






Facultad de Agronoma
Universidad de Buenos Aires
2

CRONOGRAMA DE MICROBIOLOGA AGRCOLA Y AMBIENTAL 2014
Turnos Mircoles 9-12h y 14 -17h
Fecha Tema / Actividad
12/3

Temas tericos: Los microorganismos y el ambiente. Caractersticas anatmicas de la clula
(procariota y eucariota). Nutricin microbiana.
19/3

Temas tericos: Efectos de las condiciones ambientales sobre el desarrollo de los
microorganismos. Control del crecimiento. Resolucin de Problemas de nutricin y control del
crecimiento.
Comienzo del trabajo prctico (T.P.) microorganismos en el ambiente (LABORATORIO)
26/3 Temas tericos: Caractersticas de la multiplicacin celular. Concepto de colonia. Cultivo puro y
aislamiento. Resolucin de Problemas de crecimiento.
Finaliza TP microorganismos en el ambiente: Observacin placas. (LABORATORIO).
9/4 Temas tericos: Clasificacin taxonmica y filogenia microbiana. El suelo como ambiente para
los microorganismos. El agua como ambiente para los microorganismos. Resolucin de
problemas.
16/4 Comienza TP de aislamiento: Siembra en medios de cultivo y aislamiento a partir de una
muestra de suelo. (LABORATORIO).
Resolucin de Problemas.
Parcialito 1.
23/4 Temas tericos: Ciclo del carbono.
Contina TP de aislamiento: siembra de la segunda placa de aislamiento (LABORATORIO)
30/4 Temas tericos: Ciclo del nitrgeno. Mineralizacin. Nitrificacin. Desnitrificacin.
Contina TP de aislamiento: siembra de tubos pico de flauta. (LABORATORIO).
7/5 Temas tericos: Continuacin de ciclo del nitrgeno. Fijacin biolgica de nitrgeno.
Finaliza TP de aislamiento: Coloracin de Gram. (LABORATORIO).
14/5 Temas tericos: Ciclo del fsforo. Bacterias solubilizadoras de fsforo. Micorrizas.
Observacin de preparados de micorrizas. (LABORATORIO)
Parcialito 2.
21/5 Temas tericos: Transformaciones microbianas del azufre y del hierro.
Comienzo del T.P. de aislamiento de rizobios a partir de ndulos y observacin de
bacteroides. (LABORATORIO)
28/5 Temas tericos: Otros nichos microbianos de importancia econmica: ensilado de forrajes,
compost, rumen y biogs.
Contina T.P. aislamiento de rizobios: observacin de placa de aislamiento y siembra de una
segunda placa. (LABORATORIO)
4/6

Temas tericos: Biorremediacin. Resolucin de problemas.
Contina T.P. aislamiento de rizobios: siembra de tubos pico de flauta. (LABORATORIO)
11/6 Finaliza T.P. aislamiento de rizobios: coloracin de Gram.
Parcialito 3.
18/6 Elaboracin de informes de los trabajos prcticos (duracin 2 h). Repaso y consultas.
25/6 PARCIAL INTEGRADOR
2/7 RECUPERATORIOS
3

CRONOGRAMA DE MICROBIOLOGA AGRCOLA Y AMBIENTAL 2014
CURSADA Turnos Jueves 8:00 -11:00 h, 13 - 16 h y 18 21h
Fecha Tema / Actividad
13/3

Temas tericos: Los microorganismos y el ambiente. Caractersticas anatmicas de la clula
(procariota y eucariota). Nutricin microbiana.
20/3

Temas tericos: Efectos de las condiciones ambientales sobre el desarrollo de los
microorganismos. Control del crecimiento. Resolucin de Problemas de nutricin y control del
crecimiento.
Comienzo del trabajo prctico (T.P.) microorganismos en el ambiente (LABORATORIO)
3/4 Temas tericos: Caractersticas de la multiplicacin celular. Concepto de colonia. Cultivo puro y
aislamiento. Resolucin de Problemas de crecimiento.
Finaliza TP microorganismos en el ambiente: Observacin placas. (LABORATORIO).
10/4 Temas tericos: Clasificacin taxonmica y filogenia microbiana. El suelo como ambiente para
los microorganismos. El agua como ambiente para los microorganismos. Resolucin de
problemas.
17/4 Comienza TP de aislamiento: Siembra en medios de cultivo y aislamiento a partir de una
muestra de suelo. (LABORATORIO).
Resolucin de Problemas.
Parcialito 1.
24/4 Temas tericos: Ciclo del carbono.
Contina TP de aislamiento: siembra de la segunda placa de aislamiento (LABORATORIO)
8/5 Temas tericos: Ciclo del nitrgeno. Mineralizacin. Nitrificacin. Desnitrificacin.
Contina TP de aislamiento: siembra de tubos pico de flauta. (LABORATORIO).
15/5 Temas tericos: Continuacin de ciclo del nitrgeno. Fijacin biolgica de nitrgeno.
Finaliza TP de aislamiento: Coloracin de Gram. (LABORATORIO).
22/5 Temas tericos: Ciclo del fsforo. Bacterias solubilizadoras de fsforo. Micorrizas.
Observacin de preparados de micorrizas. (LABORATORIO)
Parcialito 2.
29/5 Temas tericos: Transformaciones microbianas del azufre y del hierro.
Comienzo del T.P. de aislamiento de rizobios a partir de ndulos y observacin de
bacteroides. (LABORATORIO)
5/6 Temas tericos: Otros nichos microbianos de importancia econmica: ensilado de forrajes,
compost, rumen y biogs.
Finaliza T.P. aislamiento de rizobios: coloracin de Gram. (LABORATORIO
12/6

Temas tericos: Biorremediacin. Resolucin de problemas.
Elaboracin de informes de los trabajos prcticos (duracin 2 h). Repaso y consultas.
19/6 Parcialito 3.
26/6 PARCIAL INTEGRADOR
3/7 RECUPERATORIOS


4

NDICE
Identificacin de la asignatura 6
Temas de investigacin de los integrantes de la ctedra y del INBA.... 11
MICROBIOLOGA GENERAL.

Captulo 1: La clula microbiana... 15
Captulo 2: Control del crecimiento... 23
Captulo 3: Nutricin microbiana y aislamiento
Observacin de los microorganismos
Tipos de tinciones
Coloracin de Gram...
23
32
32
33
Captulo 4: Caractersticas de la multiplicacin celular de los microorganismos
Captulo 5: Clasificacin taxonmica y filogentica
Captulo 6: Ecologa microbiana..
Captulo 7: Descomposicin de la Materia Orgnica
Humificacin
Deshumificacin...
Produccin de Biogs.
36
51
62
102
107
109
113
Captulo 8: Nitrgeno
Captulo 9: Micorrizas
El fsforo: Importancia biolgica, ciclo e interaccin con micorrizas
118
149
159
Captulo 10: Transformaciones microbianas del azufre y del hierro.

161

Captulo 11: Nichos ecolgicos especiales
Ensilado
Compost...

171
171
176
Captulo 12: Biorremediacin

187

Bibliografa ...

199


5

INFORMACIN GENERAL DE LA MATERIA. CONTENIDOS. RGIMEN DE
APROBACIN.
1. IDENTIFICACIN DE LA ASIGNATURA.
Nombre: MICROBIOLOGA AGRCOLA Y AMBIENTAL.
Ctedra: Microbiologa Agrcola.
Departamento: Biologa Aplicada y Alimentos.
Carreras: Ingeniera Agronmica y Ciencias Ambientales.

2. CARACTERSTICAS DE LA ASIGNATURA.
Ubicacin en el Plan de Estudio: en el tercer ao del Ciclo General de las carreras de
Ingeniera Agronmica y Licenciatura en Ciencias Ambientales (plan 2008).
Duracin: cuatrimestral, 3 horas semanales.

Profesor responsable: Profesora Asociada Ing. Agr. MSc. Olga S. Correa
Profesores Adjuntos:
Dra. Viviana Chiocchio
(1)

Ing. Agr. Ph. D. Ins Garca de Salamone
Dr. Marcelo Soria
Jefes de Trabajos Prcticos:
Dra. Victoria Criado

Ayudantes Primeros:
Dra. Marcela S. Montecchia Lic. Federico Spagnoletti
Ing. Agr. Oksana Sydorenko Lic. Jimena A. Vogrig
Ing. Agr. Micaela Tosi Lic. Agustina Fernndez Di Pardo
Ing. Agr. Luciana Di Salvo Lic. Jhovana Escobar Ortega
Dra. Irma Roberts Ing. Agr. Eliana Wassermann
Dra. Ester Simonetti

Ayudantes Segundos:
Martina Gonzlez Mateu
Damin Ortiz
Agustn Martinez
Juan Orlowski

Asistentes Alumnos:
Jessica Edith Tarche
Fernando Javier Ureta Suelgaray
Sharon Leila Fingier
(1)
Coordinadora de la Cursada 2014-2015. Consultas al correo electrnico
chiocchi@agro.uba.ar o en la Ctedra de Microbiologa Agrcola.
6

Sede de la Ctedra
Pabelln Microbiologa, situado al final del camino paralelo a las vas del ferrocarril y
enfrentado al andn de la estacin Arata. Edificio 19 en el plano de la FAUBA
http://www.agro.uba.ar/ubicacion/plano).

3. FUNDAMENTACIN
Esta materia pretende otorgar al estudiante los conocimientos bsicos sobre la biologa
y ecofisiologa de los microorganismos. Para la formacin de los futuros egresados es de
fundamental importancia conocer el rol de los microorganismos en el ambiente que nos rodea,
su participacin en los ciclos biogeoqumicos, sus interacciones con otros microorganismos,
animales o plantas, y su relacin con los procesos agropecuarios y ambientales.
4. OBJETIVOS
Introducir al alumno en el conocimiento del mundo microbiano y la participacin de los
microorganismos en ecosistemas naturales y antrpicos.
Objetivos particulares:
1. Adquirir conocimientos bsicos de microbiologa: crecimiento, nutricin, esterilizacin,
aislamiento, taxonoma y ecologa microbiana.
2. Discutir la distribucin de los microorganismos en la naturaleza, los nichos ecolgicos
que pueden ocupar y su diversidad metablica.
3. Conocer la accin biotransformadora de los microorganismos sobre el ambiente y su rol
en los ciclos biogeoqumicos del carbono, nitrgeno, azufre, fsforo, hierro, etc.
4. Adquirir conocimientos sobre las interacciones microorganismo-planta y su aplicacin
prctica en sistemas agrcolas.
5. Analizar el rol de los microorganismos en nichos ecolgicos especiales con relevancia
agronmica y ambiental, tales como suelos, aguas, el ensilado de forrajes, compostaje y
rumen.
5. CONTENIDOS
1. Las caractersticas anatmicas de la clula procaritica (bacterias y arqueas) y sus
diferencias fundamentales con las clulas eucariticas (hongos y levaduras) y con los
virus. Componentes de la clula procaritica: estructura y composicin de la
membrana, estructura de la pared en bacterias Gram positivas y Gram negativas.
Estructuras de resistencia: formacin de endosporas. Estructuras responsables de la
movilidad: flagelos. quimiotaxis y fototaxis. Estructuras de la superficie bacteriana:
fimbrias, pilis, cpsulas y capas mucosas. Componentes del citoplasma celular:
nucleoide bacteriano, sustancias de reserva (poli--hidroxibutirato, glucgeno,
polifosfatos, grnulos de azufre y magnetosomas). Transporte de sustancias a travs de
las membranas bacterianas y su importancia en la nutricin. Mecanismos de transporte:
difusin simple y facilitada, transporte activo, traslocacin de grupo. Mecanismos de
recombinacin gentica en bacterias: conjugacin, transformacin y transduccin.
Regulacin de la expresin de genes: el opern lactosa. Genes regulados por la
densidad celular (quorum sensing). Hongos. Su biologa. Metabolismo. Intervencin
en ciclos biogeoqumicos. Su importancia para la agricultura.
7

2. Control del crecimiento microbiano: esterilizacin por calor, por radiacin y por
filtracin. Diferentes mtodos y su aplicacin a distintos materiales. Control qumico
del crecimiento bacteriano: antibiticos, bactericidas, bacteriostticos, desinfectantes y
antispticos.
3. Nutricin bacteriana. Elementos esenciales: macro y micronutrientes, y factores de
crecimiento. Formas en que estos elementos se encuentran en la naturaleza y formas en
que se proveen en los medios de cultivo. Medios de cultivo: clasificacin en base a su
composicin y a la diversidad de microorganismos que pueden desarrollar en l.
Categoras nutricionales de los microorganismos establecidas en base a: fuentes de
energa, fuentes de carbono, y dadores de electrones. Cultivo puro de microorganismos.
Tcnicas de aislamiento: estra en superficie o diluciones sucesivas con o sin
enriquecimiento previo.
4. Caractersticas de la multiplicacin celular de los microorganismos. Mtodos de
determinacin del crecimiento celular y parmetros que lo caracterizan. Cultivo
diuxico. Efecto de las condiciones ambientales sobre el desarrollo de los
microorganismos: temperatura, concentracin salina, pH, tensin de oxgeno, formas
txicas del oxgeno y enzimas que las eliminan.
5. Clasificacin taxonmica y filogentica. Dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya,
caractersticas diferenciales. Taxonoma convencional y molecular. Identificacin y
nomenclatura. Definicin y concepto de especie. Taxonoma numrica y agrupamiento
jerrquico. Taxonoma molecular: composicin de bases e hibridizacin de cidos
nucleicos.
6. Ecologa microbiana: los microorganismos y su microambiente, ecosistemas, hbitats,
nichos ecolgicos. Superficies y biofilms. Competencia y cooperacin. El suelo como
ambiente para los microorganismos. Importancia de la ocupacin de diferentes nichos
ecolgicos naturales por parte de los microorganismos y la resultante modificacin de
los mismos. Nichos ecolgicos de importancia agrcola. Microorganismos del suelo y
factores que afectan su distribucin. Rizosfera: microorganismos de la rizosfera y su
interaccin con la planta. Actividad microbiana y fertilidad del suelo. Microbiologa de
ambientes acuticos. Ambientes de aguas dulces y saladas. Alteraciones de los
ambientes acuticos. Ejemplos.
7. Ciclo del Carbono. Importancia de la fotosntesis en el ciclo del Carbono.
Descomposicin de la materia orgnica. Utilizacin de hexosas, pentosas y
polisacridos. Formacin y degradacin de la materia orgnica del suelo: humificacin
y deshumificacin. Transformaciones de hidrocarburos. Metanognesis y sintrofa.
Hbitats metanognicos. Metanognesis en los ocanos. El ecosistema microbiano del
rumen. Las bacterias, protistas y hongos del rumen. Dinmica del ecosistema del
rumen. Otros animales herbvoros. Produccin de Biogs.
8. Ciclo del nitrgeno. Utilizacin del nitrgeno por los microorganismos: formas
nitrogenadas orgnicas e inorgnicas del suelo. Mineralizacin: aminizacin,
amonificacin. Inmovilizacin. Nitrificacin. Desnitrificacin. Fijacin biolgica
simbitica de nitrgeno: mtodos de medicin. Biologa de Rhizobium y
Bradyrhizobium. Grupos de inoculacin cruzada. Mecanismo de infeccin en la
interaccin rizobio-leguminosa. Regulacin gnica de la nodulacin. Regulacin de la
fijacin de nitrgeno. Produccin de inoculantes para leguminosas. Otras asociaciones
microbianas de importancia agrcola. Fijacin simbitica de nitrgeno: Frankia.
Fijacin no simbitica de nitrgeno: Azospirillum, Azotobacter.
8

9. Micorrizas. Clasificacin de las micorrizas. Aspectos nutricionales. Efectos benficos.
Preparacin de inoculantes. Ciclo del P.
10. Transformaciones microbianas del azufre. Ciclo biolgico del S. Mineralizacin.
Inmovilizacin. Oxidacin del S mineral. Reduccin del S orgnico. Transformaciones
microbianas del hierro. Procesos de reduccin- oxidacin. Transformaciones directas
del hierro de la forma orgnica a la forma inorgnica y viceversa. Procesos de
reduccin, solubilizacin y precipitacin del Fe mediados por microorganismos en
algunos tipos de suelo.
11. Nichos ecolgicos especiales de utilidad agrcola. La fermentacin lctica como
mtodo de conservacin de forrajes en el ensilado. Biologa y microorganismos del
compost.
12. Biorremediacin. Biorremediacin in situ y ex situ de suelos. Biorremediacin de
aguas. Demanda biolgica de oxgeno. Hidrocarburos. Residuos slidos: su disposicin
en vertederos controlados. Pesticidas o xenobiticos.

6. METODOLOGA DIDCTICA
La materia se imparte bajo la modalidad terico-prctica, con clases de discusin de
temas tericos y de resolucin de problemas que permiten aplicar los conocimientos tericos
adquiridos. Adems, en el laboratorio se llevan a cabo distintos trabajos prcticos dirigidos a la
observacin macro- y microscpica de microorganismos y al aislamiento de los mismos a partir
de fuentes naturales (suelo, aguas, vegetales, etc.) y de ndulos de leguminosas.
Las clases tericas son desarrolladas por los Profesores y Jefes de Trabajos Prcticos a
cargo de los respectivos turnos, con la participacin de ayudantes de primera debidamente
formados. Las prcticas de laboratorio se desarrollan con la asistencia de los ayudantes de la
Ctedra. Las estrategias didcticas utilizadas incluyen el uso de presentaciones en formato
PowerPoint para ilustrar situaciones en las que el uso del pizarrn es insuficiente (estructuras
celulares, coloraciones, etc.) y fundamentalmente para aquellos temas que por su complejidad o
costo no se pueden desarrollar en los Trabajos Prcticos. Las clases de resolucin de problemas
se alternan con las actividades en el laboratorio y se resuelven fomentando la interaccin de los
alumnos en grupos reducidos con asistencia de los docentes.Se estimula la discusin entre
docentes y alumnos para llegar a la resolucin de los ejercicios planteados. En esta instancia
son actores principales los ayudantes de primera y se prioriza el uso del pizarrn para presentar
figuras, cuadros, esquemas, etc. En todas las instancias se pretende que los alumnos construyan
y se apropien del conocimiento.

7. MTODO DE EVALUACIN
El curso tiene 4 evaluaciones intermedias (tres parcialitos cortos ms un informe de laboratorio)
y un examen integrador. Es posible aprobar la materia por promocin sin examen final.
Para mantener las posibilidades de promocionar, el promedio de las cuatro evaluaciones
intermedias tiene que ser mayor o igual que 7, independientemente de las notas individuales en
cada una.
- Durante la cursada se realizarn trabajos prcticos de laboratorio. Una vez finalizados
se deber redactar un informe individual en clase, que a los efectos de la promocin o
regularizacin contar como la cuarta evaluacin intermedia.
9

- Al final del cuatrimestre se rendir un examen integrador. Aquellos alumnos con una
calificacin igual o mayor que 7 en este integrador y un promedio igual o mayor que 7
en las evaluaciones intermedias, promocionan la materia.
- Si la nota del integrador es igual o mayor que 4, pero menor que 7, la condicin final es
regular, y se pierde la posibilidad de promocionar.
- Si la nota del integrador es menor que 4, se deber rendir un examen recuperatorio para
mantener la regularidad. Aun cuando la nota en este examen recuperatorio fuera mayor
que 7, ya no es posible aprobar por promocin la materia. Una nota menor que 4 en el
examen recuperatorio implica perder la regularidad.
- Aquellos alumnos que no cumplan con una asistencia al 75% de las clases, o no
alcancen un promedio 4 en las evaluaciones intermedias, quedarn en condicin libre.
Nota final de la materia en el caso que el alumno promocione.
Nota promocin = 0,3 x promedio de las evaluaciones intermedias + 0,7 x nota del parcial
integrador
Asistencia a las clases: Es obligatoria la asistencia al 75% de las clases.
Alumnos con asistencia cumplida: aquellos alumnos cuya nota promedio de las 4
evaluaciones intermedias o en el examen integrador sea inferior a 4 (cuatro) puntos pero hayan
cumplido el 75% de asistencia a las clases de la materia.
Alumnos libres: aquellos alumnos cuya nota promedio de las 4 evaluaciones intermedias o en
el examen integrador sea inferior a 4 (cuatro) puntos y tengan menos del 75% de asistencia a
las clases de la materia.
Requisitos necesarios para rendir en condicin de alumno Libre.
El alumno deber avisar, por nota dirigida al Profesor Responsable de la Ctedra de
Microbiologa Agrcola, su intencin de rendir examen libre, 30 das antes de la fecha de
exmen a la que aspira presentarse. En ese momento acordar con el profesor a cargo el da en
que comenzar su examen, el cual constar de tres partes:
a) Un cuestionario completo de los temas de trabajos prcticos, que deber aprobar con
una nota mnima de 6 (seis) puntos para poder continuar con el examen.
b) Una prctica de laboratorio y respuestas a preguntas relacionadas con el tema en
cuestin, que tambin deber aprobar con una nota no inferior a 6 (seis) puntos.
c) Un examen escrito en la fecha correspondiente, que se aprobar con 4 (cuatro) puntos.
Si el alumno reprobara cualquiera de las tres partes, en el acta de examen llevar la calificacin
de insuficiente.

8. BIBLIOGRAFA
Al final de la gua se encuentra el apartado de la bibliografa complete aconsejada para leer y
estudiar los distintos captulos del programa de la materia.

- Aleff K, Nannipieri P. 1995. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry.
Academic Press Inc, NY.
- Alexander M. 1980. Introduccin a la Microbiologa del Suelo. AGT, Mxico.
10

- Haynes RJ. 1986. Mineral nitrogen in the plant soil system. Academic Press Inc, NY.
- Lengerer JW, Drwes G, Schlegel H. 1999. Biology of the Prokaryotes. Thieme, NY.
- Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los Microorganismos, 8
a

edicin. Prentice Hall.
- Paul EA. 2007. Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, NY. 3
rd
Edition.
- Singleton P, Sainsbury D. 1978. Dictionary of Microbiology. Wiley and Sons.
- Tate R. 2000. Soil Microbiology, 2
nd
Edition, Wiley.
- Varmay A, Hock B. 1998. Mycorrhiza. Springer, NY.

CMO EST ORGANIZADO MATERIAL DIDCTICO DE ESTA GUA

Los contenidos TERICOS estn organizados en captulos. Cada captulo consta de:
1. Los ttulos de los temas y la bibliografa de lectura OBLIGATORIA correspondiente.
2. Material didctico preparado por los docentes de la ctedra para ALGUNOS de los
temas.
Los contenidos PRCTICOS: preguntas y problemas para resolver y los protocolos de trabajos
prcticos, se encuentran en una entrega separada: Gua de Actividades Prcticas de
Microbiologa Agrcola y Ambiental.

La mayor parte de los temas tericos de la materia debern estudiarse del libro: Brock Biologa
de los microorganismos, mientras que algunos se complementan con material preparado por
los docentes de la materia.
11

TEMAS DE INVESTIGACIN DE LOS INTEGRANTES DE LA CTEDRA DE
MICROBIOLOGA AGRCOLA Y DEL INBA
(1)
(1)
Instituto de Investigaciones en Biociencias Agrcolas y Ambientales, CONICET/UBA.

Estudio de las comunidades microbianas y su contribucin al diagnstico de la calidad del
suelo.
Nuestro objetivo general es contribuir a un mayor conocimiento de la dinmica y biodiversidad
microbiana de los suelos argentinos, analizando atributos microbiolgicos, bioqumicos y
fisicoqumicos de los suelos en distintos agroecosistemas. Analizamos el efecto de distintos
manejos (desmonte, labranzas y fertilizaciones) y cultivos sobre las comunidades microbianas
del suelo en la regin de las Yungas y del oeste de la Provincia de Buenos Aires. Asimismo,
evaluamos la utilidad de diversas caractersticas de las comunidades microbianas como
indicadores microbiolgicos para el monitoreo de la calidad de los suelos en ambas regiones.
Por ltimo, seleccionamos un conjunto mnimo de variables para el desarrollo de un ndice de
calidad de suelos, para ambas regiones.
Este estudio contribuir a un mayor conocimiento del impacto del cambio de uso sobre la
dinmica y biodiversidad microbiana de los suelos argentinos y permitir profundizar en el
conocimiento de cmo el recurso suelo se ve afectado por su uso agrcola.

Investigadores responsables:
- Ing. Agr. MSc Olga S. Correa correa@agro.uba.ar
- Dra. Marcela S. Montecchia mmontecc@agro.uba.ar
- Dr. Marcelo A. Soria soria@agro.uba.ar

Integrantes del grupo:
- Dra. Viviana Chiocchio
- Ing. Agr. Micaela Tosi
- Ing. Agr. Oksana Sydorenko
- Lic. Jimena Vogrig
- Ing. Agr. Juan Orlowski


Control biolgico de enfermedades fngicas en plantas de inters agrcola.
El control biolgico de fitopatgenos permite, en esquemas de produccin convencional,
reducir la dosis de aplicacin de productos de sntesis qumica y reemplazar a los mismos en
sistemas de produccin orgnica. El propsito general de este proyecto es el empleo de
bacterias seleccionadas y sus productos para el control de enfermedades que perjudican el
crecimiento y productividad de diferentes cultivos. Estudiamos los mecanismos responsables de
la actividad bacteriana antifngica, el impacto de los agentes de biocontrol sobre las
comunidades microbianas del suelo y su efecto sobre el crecimiento vegetal. Asimismo,
desarrollamos formulaciones y tecnologas de aplicacin posibles.

Investigadores responsables:
- Ing. Agr. MSc Olga S. Correa correa@agro.uba.ar
- Dra. Marcela S. Montecchia mmontecc@agro.uba.ar
- Dr. Marcelo A. Soria soria@agro.uba.ar
- Estudiante Agustn Martinez
- Estudiante Damin Ortiz
- Lic. Martina Gonzalez Mateu
- Estudiante Jessica Edith Tarche
- Estudiante Fernando Javier Ureta Suelgaray
12

Integrantes del grupo:
- Ing. Agr. Oksana Sydorenko.
- Ing. Agr. Miriam Asselborn. Fitopatologa. EEA Concepcin del Uruguay-INTA.
- Dra. Virginia Pedraza. Fitopatologa. EEA Concepcin del Uruguay-INTA.

Bacterias promotoras del crecimiento vegetal para una agricultura sustentable.
Uno de los desafos de este milenio es la produccin agrcola sustentable. Dentro de ese
esquema la utilizacin de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (BPCV) permite reducir
o reemplazar la aplicacin de fertilizantes qumicos sin prdidas en el rendimiento. Nuestro
objetivo es seleccionar y evaluar bacterias que sean capaces de promover el crecimiento vegetal
y rendimiento de cultivos de inters agrcola. Adems, estudiar los mecanismos responsables de
tal actividad, determinar dosis y forma de aplicacin, y evaluar el impacto sobre otros
microorganismos del suelo y de la filosfera y sobre aspectos nutricionales de los cultivos
tratados con dichas BPCV.

Investigadores responsables:
- Ing. Agr. MSc Olga S. Correa correa@agro.uba.ar
- Dra. Marcela S. Montecchia mmontecc@agro.uba.ar

Integrantes del grupo:
- Estudiante Brenda Parolin
- Ing. Agr. MSc Esteban J. Rubio. EEA AMBA-INTA
- Ing. Agr. Alejandro Perticari. Lab. BPCV-IMYZA-INTA Castelar

Factores externos y mecanismos internos que regulan la removilizacin de nutrientes en
cebada cervecera y su implicancia sobre la calidad de los granos.
Se estudian los procesos fisiolgicos, bioqumicos y moleculares que determinan las
fluctuaciones en la removilizacin de nutrientes ante los estreses abiticos que ms
frecuentemente limitan el rendimiento del cultivo de cebada en la regin Pampeana. Asimismo,
se evala la capacidad de diferentes microorganismos simbiticos para mitigar dichos estreses.
Se otorga especial nfasis al efecto de estos procesos sobre los parmetros que determinan la
calidad de los granos.

Investigadoras responsables:
- Dra. Victoria Criado criado@agro.uba.ar
- Dra. Irma Roberts iroberts@agro.uba.ar
- Dra. Carla Caputo

Integrantes del grupo:
- Dra. Mariela Echeverria
- Lic. Cintia Veliz

13

Efecto de la rotacin de cultivos en sistemas de siembra directa.
El objetivo de este proyecto es establecer los efectos de los cultivos dentro de la rotacin en
sistemas de siembra sobre la actividad y diversidad biolgica de la microbiota del suelo en
distintas regiones de la regin pampeana. Se busca establecer relaciones entre variables
biolgicas entre s y con variables qumicas y fsicas a fin de obtener indicadores de calidad
edfica.
Biorremediacin de suelos.
Estudio de la dinmica de las poblaciones microbianas en suelos contaminados con petrleo y
derivados.
Interacciones Bacteria-Planta: promocin del crecimiento vegetal producida por
rizobacterias. Efectos sobre las comunidades microbianas rizosfericas.
Aislamiento y caracterizacin fisiolgica y gentica de rizobacterias para su utilizacin como
promotoras del crecimiento vegetal (PGPR).
Estudio de mecanismos involucrados en la respuesta de plantas forrajeras y cereales tales como
arroz, maz y trigo a la inoculacin con rizobacterias en condiciones de campo. Evaluacin de
inoculantes.


Investigadora responsable:
- Ing. Agr., M.Sc., Ph.D. Ins E. Garca de Salamone igarcia@agro.uba.ar


Integrantes del grupo:
- Ing. Agr. Luciana Di Salvo
- Lic. Jhovana Escobar Ortega

Hongos saprobios de suelo y endfitos de raz (micorrizas y hongos septados oscuros).
Este grupo de trabajo se ocupa de investigar las relaciones que se establecen entre los hongos y
los distintos grupos de plantas dentro del agroecosistema. Los estudios se encuentran
focalizados en la utilizacin de estos microorganismos como biorremediadores, removilizadores
y translocadores de nutrientes dentro de la planta (P, N) y en su rol frente a estreses abiticos.


Investigadores responsables:
- Dra. Viviana M. Chiocchio chiocchi@agro.uba.ar
- Ing. Agr. Ral Lavado

Integrantes del grupo:
- Lic. Federico Spagnoletti
- Lic. Agustina Fernndez di Pardo
14

INTRODUCCIN A LA
MICROBIOLOGA
15

CAPTULO 1
LA CLULA MICROBIANA

Caractersticas anatmicas de las clulas procariticas (bacterias y arqueas) y sus diferencias
fundamentales con las clulas eucariticas (hongos y levaduras) y con los virus. Viroides y
priones. Componentes de la clula procaritica: estructura y composicin de la membrana
celular. Estructura de la pared en bacterias Gram positivas y Gram negativas. Estructuras de
resistencia y formacin de endosporas. Estructuras responsables de la movilidad: flagelos.
Quimiotaxis y fototaxis. Estructuras de la superficie bacteriana: fimbrias, pilis cpsulas y capas
mucosas. Componentes del citoplasma celular: nucleoide bacteriano, sustancias de reserva
poli-hidroxibutirato, glucgeno, polifosfatos, grnulos de azufre y magnetosomas. Transporte
de sustancias a travs de las membranas bacterianas y su importancia en la nutricin.
Mecanismos de transporte: difusin simple y facilitada, transporte activo, translocacin de
grupo.
Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los
Microorganismos, 8
a
edicin. Prentice Hall.
Clula bacteriana: Captulos: 1 (completo) y 3 (completo)
Virus: Captulo 8 (8.1 a 8.7 y 8.23)
Hongos y levaduras: Captulo 18 (18.2 y 18.3)

Biologa de los hongos
Hongos. Su biologa. Metabolismo. Intervencin en ciclos biogeoqumicos. Su importancia para
la agricultura.
Introduccin
Los hongos son un grupo de microorganismos que cuenta con aproximadamente 69.000
especies descriptas, sobre aproximadamente 1.500.000 especies existentes. Se encuentran en la
naturaleza cumpliendo mltiples funciones y establecen relaciones con el resto de los
microorganismos. Son ubicuos, los podemos encontrar en el aire en forma de esporas, en la
tierra o en ambientes acuticos de agua dulce o salada.
Los hongos tienen importancia econmica para la industria debido a su utilizacin para
la produccin de enzimas. stas son utilizadas como bioblanqueadores, en panificacin, en la
extraccin y purificacin de jugos, en la elaboracin de alimentos para animales, etc. Tambin
son productores de terpenos, cidos grasos (ergosterol) y derivados de aminocidos (penicilina,
cefalosporina). Asimismo, las levaduras son utilizadas en procesos fermentativos involucrados
en la produccin de cervezas y vinos, produccin comercial de cido ctrico, de sustancias que
le dan sabores a los quesos y tambin son utilizados en la cocina como un ingrediente selecto.
Algunas especies de hongos pueden estar en la naturaleza como organismos patgenos
invadiendo maderas, colonizando a otros hongos, a animales o humanos. Su principal funcin,
junto con las bacterias, es la de descomposicin. Intervienen en el ciclaje del C, N y O.
Su ubicacin taxonmica fue inicialmente dentro de las talfitas junto con las plantas y
los animales. Actualmente se considera que pertenecen a un reino propio. Por qu creemos que
renen las caractersticas suficientes para conformar un reino propio? Son organismos
16

eucariotas, inmviles en su inmensa mayora, tienen una pared celular formada principalmente
por quitina junto con otros polisacridos, lpidos y protenas y carecen de clorofila.

El reino de los hongos se encuentra dividido en cinco Phyla:
a) Phylum Chytridiomycota: el cual posee un micelio cenoctico y se puede reproducir
sexual o asexualmente. Las esporas son flageladas (zoosporas).
b) Phylum Zygomycota: el micelio es cenoctico y puede formar esporas sexuales
(zigosporas) en el interior del zigosporangio y esporas asexuales dentro del
esporangio.
c) Phylum Glomeromycota: el micelio tambin es cenoctico. Establecen una simbiosis
obligada con las races de las plantas (micorrizas arbusculares).
d) Phylum Ascomycota: tienen micelio septado con formacin de esporas sexuales
llamadas ascosporas formadas dentro de ascos que se encuentran rodeados de una
estructura derivada de hifas fngicas llamadas ascocarpos (cleistotecio, peritecio,
apotecio).
e) Phylum Basidiomycota: tiene un micelio septado con formacin de esporas sexuales
llamadas basidiosporas las cuales se producen sobre basidios que se encuentran en una
estructura llamada basidiocarpo.
f) Grupo de Deuteromycota o de hongos mitospricos tambin llamados hongos
imperfectos por desconocerse de muchos de ellos la fase sexual. El micelio es septado
y las esporas asexuales son llamadas comnmente conidios. Estos conidios pueden
formarse sobre hifas especializadas o dentro de una estructura derivada de hifas
fngicas.
Cules son las estructuras vegetativas de los hongos?
Dentro del reino de los hongos existe una diferencia cualitativa y cuantitativa en cuanto
a la composicin qumica de las clulas fngicas respondiendo a las diferencias en morfologa,
hbitat y tamaos; llegando a observarse diferencias entre cepas de una misma especie. Para
una misma cepa pueden a su vez registrarse diferencias en su composicin qumica al comparar
por ejemplo micelio vegetativo y esporas.
El contenido celular tiene un 85 a 90% de agua, el carbono total es de 40 a 50% del
peso seco, el contenido de nitrgeno puede variar entre 2,27 a 5,13%, siendo protenas slo el
60-70% del nitrgeno presente. Las otras formas de nitrgeno no-proteicas corresponden a la
quitina de la pared celular, aminocidos libres y cidos nucleicos. De los componentes
minerales, el fsforo y el potasio son los ms abundantes.
Los hongos de acuerdo a su morfologa o estructura pueden clasificarse en dos grupos:
los hongos unicelulares y los hongos filamentosos, siendo estos ltimos los de mayor
representatividad. Los hongos estn formados por hifas siendo la hifa una estructura tubular. El
conjunto de hifas se encuentran fusionadas o formando una red que se denomina micelio. El
crecimiento de las hifas es apical, donde tiene lugar la formacin de nueva pared celular junto
con la membrana citoplasmtica. Cmo ocurre este crecimiento? Las vesculas, que se
producen en el retculo endoplasmtico y que derivan del aparato de Golgi, se encuentran en
mayor proporcin en la zona apical de la hifa y son las que llevan en su interior enzimas
encargadas de romper las uniones de los monmeros de la pared celular convirtindola as en
17

una estructura ms plstica. Las vesculas se fusionan con la membrana plasmtica y los
precursores de la nueva pared se secretan a partir de la membrana plasmtica hacia la pared.
Las hifas cenocticas son aquellas en las cuales la estructura tubular no est delimitada
por septos. Slo ocurre la aparicin de septos en las zonas ms viejas del micelio o cuando est
formndose alguna estructura que cumple con alguna funcin en particular (formacin de
conidios, formacin de esporangios). Contrariamente, las hifas septadas son aquellas en que se
delimitan clulas por medio de un septo. Segn el grupo de hongos, los septos pueden resultar
de mayor o menor complejidad en su estructura, permitiendo una conexin citoplasmtica entre
las clulas y donde pueden migrar tambin algunas organelas y ncleos.
La presencia de organelas como las mitocondrias se dan en lugares de activo
crecimiento o metabolismo, ramificaciones de hifas o divisin nuclear. Cuenta, por ser un
organismo eucariota, con ncleo y nucleolo. Tambin podemos encontrar los peroxisomas que
contienen enzimas relacionadas con la oxidacin, rompiendo lpidos y produciendo acetil-CoA.
Particularmente podemos mencionar los glioxisomas que no son ms que los peroxisomas pero
con una funcin adicional como es el ciclo del glioxilato. Finalmente, los cuerpos de Woronin
cuya funcin es la de tapar el poro de los septos con el objetivo de evitar la prdida de
citoplasma en respuesta a daos en las hifas (Fig. 1C). Las vacuolas resultan conspicuas en la
zona de mayor edad del micelio.
Los hongos son capaces de crecer sobre sustratos con altas concentraciones de azcares
(hasta un 10%) por no ser sensibles a la presin osmtica elevada y resisten condiciones de
acidez marcada (pH 2).
La pared celular de los hongos, de acuerdo al grupo taxonmico involucrado, puede
estar formada principalmente por quitina o por celulosa, acompaadas en todos los casos por
glucanos (polisacridos de unidades de glucosa unidas de diferentes manera, lo cual las hace
resistentes a distintos pH). Este componente constituye entre el 80-90% de la pared y la
glucosamina (quitina) entre el 5-10%, encontrndose en menor proporcin lpidos y protenas.
(Fig.1 A y B). Recientemente, se han realizado estudios en donde se demostr que en un mismo
hongo se pueden encontrar quitina y celulosa.


18


Figura 1. Esquema de clula fngica (A) de pared y membrana celular (B) y de los
distintos tipos de septos (C). Fuente: http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx

Requerimientos nutricionales
Los hongos son mayoritariamente aerbicos, aunque pueden tener otro tipo de relacin
con respecto al oxgeno, como las levaduras que son ser aerbicas facultativas. Crecen bien en
un marco de pH entre 4 y 8.
El carbono provee los requerimientos energticos, nutricionales y estructurales para la
clula fngica. La mayora de los hongos pueden utilizar distintas fuentes carbonadas como
cidos orgnicos, polisacridos (como celulosa o quitina), monosacridos, alcoholes,
compuestos policclicos, etc. Los polisacridos son insolubles y los hongos usan como
estrategia la excrecin de enzimas que degradan esos polisacridos a monosacridos solubles
que pueden ser incorporados a la clula fngica.
El nitrgeno es tomado como amonio, in orgnico y nitrato y es un componente
esencial en la formacin de protenas, purinas y pirimidinas. Otros elementos requeridos en la
nutricin, pero en pequeas cantidades, son los sulfuros para la formacin de ciertos
aminocidos y vitaminas como tiamina y biotina. Resulta de gran importancia la presencia de
fsforo como fosfato de potasio para la formacin de ATP, cidos nucleicos y fosfolpidos de
membrana. El potasio es el metal por excelencia ya que cumple la funcin de cofactor en
algunas reacciones enzimticas. Por su parte el magnesio activa muchas enzimas e interviene
en el metabolismo del ATP. Dentro del grupo de los elementos trazas o microelementos est el
hierro, constituyente de la enzima catalasa y de los citocromos; el zinc, que interviene en la
actividad de muchas enzimas como alcohol dehidrogenasas; el manganeso que participa en la
activacin de enzimas y sntesis de cidos nucleicos; y el cobre que es necesario para la enzima
tirosinasa (polifenol oxidasa). El molibdeno resulta tambin necesario si se utiliza nitrato como
fuente de nitrgeno, para la enzima flavoprotena nitrato reductasa que inerviene en la reaccin
de reduccin del nitrato al in amonio. El calcio, el cual es requerido por las plantas, no resulta
indispensable para los hongos, slamente en el caso de los ascomycetes para formar los cuerpos
fructferos (peritecios).
Las vitaminas (compuestos orgnicos) no son utilizadas como fuente de energa ni en la
formacin de estructuras celulares, sino que cumplen funciones anlogas a las coenzimas. Los
hongos tienen requerimientos nutricionales que pueden hacer que necesite una o ms vitaminas
y este requerimiento es una medida indirecta de la incapacidad del hongo para producirla,
siendo necesario incorporarla al medio de cultivo para suplementar lo que le falta para un
correcto crecimiento. Las vitaminas ms requeridas por los hongos son, en orden de
importancia, la tiamina (para los basidiomycetes), la biotina, el cido nicotnico, el cido
19

pantotnico y el cido p-amino benzoico. Las dos primeras actan como coenzimas en el
metabolismo de los carbohidratos (cocarboxilasa).
Requerimientos fsicos
No slo los requerimientos nutricionales son importantes a la hora de lograr un buen
crecimiento fngico, tambin son de igual importancia los requerimientos fsicos como: luz,
temperatura, humedad, aireacin y gravedad. Dado que estos factores se manejan en un rango
de valores, los mismos son descritos con tres parmetros cardinales: valor mximo, valor
ptimo y valor mnimo. Estos valores pueden variar de acuerdo a la edad del micelio, la cepa
utilizada y las condiciones de cultivo.
Cmo medimos el crecimiento de estos microorganismos?
En el caso de hongos unicelulares se trabaja en medio lquido, con un cultivo en fase
exponencial o logartmica y podemos proceder del mismo modo que lo hacemos con un cultivo
de bacterias. Los hongos filamentosos cuando crecen en cultivos lquidos sin agitacin forman
una pelcula superficial, en cambio en cultivo lquido con agitacin se dispersan o forma pellets
de micelio agregado, segn la especie, el tamao del inculo, la tasa de agitacin o la aireacin.
Como resulta impracticable definir la zona apical de micelio que est creciendo y contabilizar
con precisin la produccin de conidios o esporas, se realizan cultivos lquidos, con agitacin
para permitir una correcta utilizacin de los nutrientes por parte del hongo y para airear
correctamente el cultivo. Utilizando esta metodologa el peso seco del micelio se considera un
buen indicador de la biomasa producida en un perodo de tiempo determinado. Otra manera de
medir el crecimiento de los hongos filamentosos es a partir de la colonia fngica producida en
cajas de Petri con medio agarizado, en este caso se considera una tasa de crecimiento lineal. Sin
embargo, con esta metodologa, no puede medirse el crecimiento en las tres dimensiones.
Curvas de crecimiento de los hongos
Si colocamos un hongo filamentoso o una levadura en un medio de cultivo y se incuba
en condiciones ptimas de crecimiento, en general, se obtiene una curva de crecimiento tpica
para un cultivo en batch, al igual que ocurre con las bacterias. Esta curva tpica de crecimiento
se inicia con un perodo lag, seguida de una fase exponencial y concluyendo con una fase
estacionaria. La primera fase presenta un crecimiento nulo de la poblacin ya que en ella ocurre
la adaptacin celular a las nuevas condiciones fsicas y qumicas de ese ambiente de
crecimiento (sntesis de ribosomas y enzimas); en la fase logartmica o exponencial hay un
crecimiento neto o formacin de biomasa miceliar donde las clulas desarrollan un
metabolismo primario. Luego de este perodo, el cultivo ingresa en una fase de crecimiento
nulo dando inicio a la fase estacionaria, la cual se debe a la produccin de metabolitos txicos,
bajo pH, alta concentracin de CO2, baja concentracin de O2

y alta temperatura. Ya avanzada
esta fase las clulas pueden producir metabolitos secundarios no esenciales para el crecimiento
pero involucrados en la supervivencia del organismos, morir o sufrir autolisis.
Que tipo de reproduccin tienen los hongos?
1.- Reproduccin sexual
En la reproduccin sexual se da la unin de dos ncleos de dos hifas de micelios
compatibles. Se pueden resaltar tres eventos en esta unin sexual: 1) la plasmogamia que es la
fusin de los protoplastos, 2) la cariogamia que consiste en la fusin de ncleos y 3) la meiosis
que es la divisin reduccional de ncleos que dan como resultado la formacin de ncleos
haploides. Este tipo de reproduccin permite la variacin en la especie, por ejemplo, dando
20

caractersticas de mayor adaptabilidad a una situacin ambiental particular (Figs. 2 y 3). Esta
tipo de reproduccin asegura la continuacin de la especie bajo condiciones cambiantes.
2.- Reproduccin asexual
Los hongos pueden reproducirse asexualmente de 4 maneras diferentes:
- Por fragmentacin de un talo multicelular, tcnica empleada frecuentemente en el laboratorio
para mantener un cultivo.
- Fisin de clulas somticas para dar clulas hijas como es el caso de las levaduras.
- Gemacin de clulas somticas o de esporas, tambin en las levaduras donde cada yema da
lugar a un nuevo individuo.
- Produccin de esporas. A partir de la germinacin de las mismas se genera un nuevo
individuo.
Las esporas asexuales pueden generarse de forma interna en la hifa, rodearse de una
gruesa pared y luego desprenderse (clamidiosporas) o pueden formarse en el interior de una
estructura denominada esporangio que al madurar se rompe liberando las esporas
(esporangiosporas). Tambin pueden generarse de forma externa en una hifa diferenciada
(conidiforos) en el extremo de la cual se desarrollan las esporas asexuales (conidiosporas).
Existe una gran variedad de las estructuras productoras de esporas, las cuales se utilizan como
caractersticas en la clasificacin del hongo. Pueden variar en color, tamao, forma y medida.
Pueden tener o no flagelos. La reproduccin asexual permite una amplia distribucin de las
especies, tantas como condiciones adecuadas para la existencia del genotipo.
Algunas esporas asexuales tienen caractersticas especiales para la supervivencia del
hongo en ambientes extremos. Por ejemplo, las clamidosporas tienen paredes gruesas formadas
a partir de clulas vegetativas que acumulan sustancias de reserva y por ello son capaces de
sobrevivir a condiciones adversas de desecacin, temperatura, etc. Pueden presentarse solitarias
o en cadena y su ubicacin en la hifa puede ser intercalar o terminal.
Existen hongos que producen esclerocios (no son esporas) que son estructuras muy
duras formadas por tejido fngico capaces de sobrevivir a condiciones de estrs y germinar
bajo condiciones favorables.
Muchas de las unidades reproductivas formadas son fcilmente diseminadas y germinan
rpidamente dando as la posibilidad de ocupar una amplia rea en un corto tiempo. Las
condiciones ambientales pueden jugar un rol negativo en la germinacin y diseminacin de
estas unidades.
Con respecto a los ciclos de vida de los hongos, stos pueden ser distinguidos en dos
grupos (Fig. 3).
Las especies homotlicas, las cuales poseen en un mismo micelio ncleos complementarios
que pueden conjugarse, formndose un nico tipo de esporas.
Las especies heterotlicas, las cuales requieren ncleos provenientes de micelios diferentes
para completar el ciclo sexual, formndose diferente tipo de esporas.
El fenmeno de la parasexualidad comprende la fusin de las hifas y la formacin de un
heterocarion que contienen ncleos haploides provenientes de ambas hifas. A veces estos
ncleos se funden y originan ncleos diploides heterocigticos, cuyos cromosomas homlogos
sufren recombinacin durante la mitosis.
21



Figura 2. Esquema de los ciclos de vida sexual y asexual de los hongos. Fuente:
http://www.fq.edu.uy

Figura 3. Ciclos de vida de los hongos filamentosos. Fuente: http://agricolasonline.es

Espora de
reproduccin
asexuada
Micelio
o
levadura
Espora de
reproduccin
sexuada
Fusin de ncleos
Estado diploide
Estado
heterocaritico
Haploide (n)
Diploide (2n)
Heterocaritico(n+n)
Reproduccin
sexual
Germinacin
Plasmogamia
(fusin de
citoplasma)
Cariogamia
Reproduccin
asexual
Germinacin
Meiosis (recombinacin
Gentica)
Mitosis
22

Control hormonal
El trmino hormona o feromona es usado en los hongos en su sentido clsico como un
componente que se produce en un lugar del organismo para ser transferido a otra parte del
mismo donde acta. La actividad hormonal ha sido documentada en la formacin de oogonios y
anteridios en hongos acuticos, ahora ubicados en el reino Protista (OomycetesAchlya), como
as tambin en el acercamiento de los talos compatibles y la formacin de los progametangios
que van a dar origen a la zigospora en los zygomycetes (Fig. 4). En el caso de los
basidiomycetes no se ha demostrado el rol hormonal de algunas sustancias producidas sin
embargo, han sido detectadas hormonas vegetales como auxinas, giberelinas y etileno dentro
de representantes de este grupo.

Figura 4. Ciclo de vida de Rhizopus stolonifer (Zygomycetes). Fuente: http://www.aloj.us.es





Figura 5. Estructura de conidiforos y condios de algunos hongos imperfectos.
23

Relaciones que establecen los hongos con otros organismos
Tanto en el agua, suelo u otros hbitats terrestres, los hongos llevan adelante su
existencia en presencia de otros organismos vivientes. El crecimiento microbiano en el suelo es
transitorio y depende de la disponibilidad de nutrientes y condiciones fsico-qumicas
adecuadas.
Las relaciones que pueden establecer con otros organismos son:
a.- Parasitismo. Los hongos obtienen sus nutrientes a partir de un hospedante vivo sobre el
cual crecen. Algunas veces son parsitos obligados y no pueden vivir sin su hospedante y en
otros casos el parasitismo es facultativo, obteniendo los nutrientes de hospedantes vivos o
saprofticamente.
b.- Mutualismo. Ambos participantes de la relacin se benefician. En los casos donde uno solo
de los participantes se beneficia, mientras que para el otro la relacin es indiferente, se
denomina Comensalismo. Tanto los lquenes como las micorrizas son relaciones en las que
ambos componentes de dicha relacin se benefician.
Los lquenes estn compuestos por: un alga (ficobionte-cianobacteria) y un hongo
(micobionte - asco o basidiomycete). En este caso el hongo provee agua y fijacin al sustrato y
el alga le provee al hongo los compuestos carbonados para su subsistencia.
Las micorrizas es una asociacin que tiene lugar entre las races de las plantas de la
mayora de las taxas de las plantas vasculares y los hongos glomeromycota (ver Cap. 9).
c.- Saprofitismo: El hongo obtiene sus requerimientos nutricionales a travs de fuentes
orgnicas no vivas (por ejemplo, restos vegetales).


CAPTULO 2
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Control del crecimiento bacteriano: esterilizacin por calor, por radiacin y por filtracin.
Diferentes mtodos y su aplicacin a distintos materiales. Control qumico del crecimiento
bacteriano: antibiticos, bactericidas, bacteriostticos, desinfectantes y antispticos.
Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los
Microorganismos, 8
a
edicin. Prentice Hall.
Captulo 11 (11.1 a 11.10)


CAPTULO 3
NUTRICIN MICROBIANA
Nutricin microbiana. Elementos esenciales: macro y microelementos y factores de
crecimiento. Forma en que los elementos se encuentran en la naturaleza y formas en que se
proveen en los medios de cultivo. Medios de cultivo: clasificacin en base a su composicin y a
la diversidad de microorganismos que pueden desarrollar en ellos. Categoras nutricionales de
los microorganismos establecidas en base a: fuentes de energa, fuentes de carbono y dadores
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de electrones. Cultivo puro de microorganismos. Tcnicas de aislamiento: estra en superficie o
diluciones sucesivas, con o sin enriquecimiento previo.
Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los
Microorganismos, 8 edicin, Prentice Hall.
Captulo 4 (seccin 4.1 a 4.3 inclusive), seccin 4.6 y 4.7; seccin 4.16 y 4.18; seccin
13.1, 13.2, 13.4, 13.13, 13.14 y 13.20.

Introduccin
Para la identificacin y el estudio de cualquier especie bacteriana es necesario observar
caractersticas a partir de poblaciones de microorganismos. Un requisito importante es que la
poblacin sea pura, es decir, que est formada por solo un tipo de microorganismos. Esto es lo
que se conoce como cultivo puro.
Para obtener cultivos puros, independientemente de la clase de microorganismo que se
desee cultivar, es necesario realizar dos clases de operaciones: el aislamiento, que consiste en
la separacin de un microorganismo particular a partir de las poblaciones mixtas que existen en
la naturaleza, y el cultivo, es decir el crecimiento de poblaciones de microorganismos en
ambientes artificiales (medios de cultivo), bajo condiciones de laboratorio.
Las pequeas dimensiones de los microorganismos obligan a estudiar poblaciones de
10
9
hasta 10
10
clulas en un tubo de ensayo, un frasco o en una caja de Petri. Estos son los
envases ms comnmente empleados para cultivar microorganismos y es fundamental que se
encuentren estriles (libres de microorganismos).
Para obtener una poblacin abundante de microorganismos es necesario favorecer su
desarrollo en un medio nutritivo adecuado, el medio de cultivo. Como hay microorganismos en
todas partes, las condiciones para obtener un cultivo puro en el medio adecuado son:
a) Esterilizar el medio de cultivo, o sea, destruir o eliminar los microorganismos presentes en el
medio, antes de sembrar en l las clulas de la especie que se quiere cultivar.
b) Prevenir la entrada de microorganismos extraos en todas las operaciones posteriores.
1. Fundamentos de la nutricin microbiana
Las clulas estn constituidas por molculas pequeas y macromolculas. Las
macromolculas son sintetizadas a partir de las molculas pequeas y stas pueden ser
obtenidas directamente del ambiente o bien ser sintetizadas a partir de molculas ms simples.
Los medios de cultivo son soluciones acuosas que contienen los elementos qumicos que
componen la clula en forma de compuestos que puedan ser asimilados por las clulas que se
desean cultivar.
1.1. Elementos esenciales
El crecimiento de los microorganismos depende de la disponibilidad de agua. Los
hongos se desarrollan a partir de un contenido de agua en el sustrato del 12%, las bacterias slo
cuando el contenido es superior al 20%.
Deben estar en el medio todos los elementos que se requieren para la formacin de
sustancia celular. La materia slida de las clulas contiene adems de hidrgeno y oxgeno
(obtenibles metablicamente del agua), carbono, nitrgeno, fsforo y azufre en orden
decreciente de abundancia. Estos elementos representan aproximadamente el 95% del peso
celular.
25

Los estudios nutricionales muestran que casi todos los microorganismos requieren
magnesio, calcio, hierro, manganeso, cobalto, cobre, molibdeno y zinc. Potasio, magnesio,
calcio y hierro se requieren en grandes cantidades, por eso se los llama macronutrientes, y son
agregados en forma de sales en los medios de cultivo. Los dems, se necesitan en cantidades tan
pequeas que a menudo resulta difcil demostrar su esencialidad, porque podran encontrarse
presentes como contaminantes de los constituyentes del medio. A estos nutrientes se los llama
micronutrientes o elementos traza.
Algunos grupos biolgicos tienen requerimientos minerales especficos. Las diatomeas
y otras algas sintetizan paredes impregnadas de slice y tienen requerimiento especfico de
slice. Algunas bacterias marinas, las cianofceas y algunas bacterias fotosintticas requieren
concentraciones relativamente altas de sodio.
1.2. Factores de crecimiento
Algunas bacterias y hongos necesitan compuestos orgnicos que no son capaces de
sintetizar a partir de una fuente de carbono ms simple. Estos compuestos deben ser provistos al
medio de cultivo adems de la fuente de carbono correspondiente y reciben el nombre de
factores de crecimiento. La mayora de esos factores de crecimiento son aminocidos, purinas o
pirimidinas y vitaminas.
Los microorganismos que requieren algn factor de crecimiento se denominan
auxtrofos. Si la auxotrofa ha surgido por mutacin, la cepa de tipo salvaje que no requiere
suplementos se llama prottrofa. Al mutante auxtrofo se lo identifica con el nombre
abreviado de la sustancia que es incapaz de sintetizar acompaado del signo menos, por
ejemplo una bacteria trp
-
, es incapaz de sintetizar el aminocido triptofano y necesita que este
compuesto se encuentre presente en el medio de cultivo.
2. Forma qumica en que los elementos sirven como nutrientes
Como se vio anteriormente los metales y tambin el fsforo pueden ser asimilados en
forma de sales inorgnicas. Las necesidades de los organismos por C, N, S y O difieren en
cuanto a la forma qumica en que pueden ser asimilados.
2.1. Requerimiento de carbono
Los microorganismos fotosintticos y las bacterias que obtienen su energa de la
oxidacin de compuestos inorgnicos usan generalmente la forma ms oxidada del C (CO2)
como fuente principal o nica de carbono. La conversin del CO2 para formar los constituyentes
celulares involucra un proceso de reduccin con gasto de energa proveniente de la luz o de la
oxidacin de compuestos inorgnicos reducidos. Todos los dems organismos obtienen el
carbono de nutrientes orgnicos. Como la mayora de las sustancias orgnicas tienen un nivel
de oxidacin igual o semejante al de la materia celular, no deben sufrir una reduccin inicial.
En general los sustratos orgnicos cumplen una doble funcin nutricional: sirven al mismo
tiempo como fuente de carbono y como fuente de energa. Los organismos difieren en cuanto a
la clase y al nmero de compuestos orgnicos que pueden usar como principal fuente de
carbono y energa. Algunos de ellos estn muy especializados y otros son muy verstiles, por
ejemplo las bacterias metiltrofas slo pueden usar como fuente de carbono, metano o metanol
en cambio algunas especies de Pseudomonas pueden usar hasta 90 compuestos distintos como
nica fuente de carbono y energa. Adems, dentro de una misma especie pueden existir cepas
que por mutacin hayan perdido la capacidad de metabolizar una determinada fuente de
carbono y se identifican por el nombre del azcar que no pueden metabolizar acompaado de
un signo menos, por ejemplo una cepa lac
-
ha perdido la capacidad de utilizar lactosa como
26

nica fuente de carbono, porque no puede degradarla. En estos casos el agregado de lactosa al
medio de cultivo resulta ineficaz para su crecimiento y es necesario reemplazar este azcar por
otra fuente de carbono para que la bacteria desarrolle. Sin embargo, la cepa salvaje de la cual
proviene es lac
+
, es decir que esta cepa puede utilizar la lactosa como nica fuente de carbono y
energa. Probablemente, todos los organismos que utilizan fuentes de carbono orgnicas
tambin requieren CO2 como nutriente en pequeas cantidades. La remocin total de CO2 a
menudo demora o impide el crecimiento de los microorganismos en medios orgnicos.
2.2. Requerimiento de nitrgeno y azufre
El nitrgeno y el azufre existen en los compuestos orgnicos de las clulas en forma
reducida como grupos amino (-NH2) o sulfhidrilo (-SH2).
La mayora de los organismos fotosintticos y muchas bacterias y hongos asimilan
estos dos elementos como sales inorgnicas oxidadas, nitratos (NO3
-
) y sulfatos (SO4
2-
) y luego
son reducidos por la clula. Los organismos que no pueden reducir estos compuestos, requieren
estos elementos en su forma reducida. El nitrgeno debe ser provisto como sales de amonio
(NH4
+
) y el azufre como sulfuro (S
-
) o cualquier compuesto orgnico que lleve un grupo
sulfhidrilo (por ejemplo, cistena). Este requerimiento es bastante frecuente para la fuente de N
y mucho ms raro para el S.
Algunas bacterias son capaces de asimilar el N2 de la atmsfera, mediante el proceso
denominado fijacin biolgica de nitrgeno.
2.3. Requerimiento de oxgeno
La necesidad y la tolerancia a la concentracin de oxgeno deben ser tenidas en cuenta
cuando se desea cultivar una dada bacteria. A causa de su baja solubilidad en agua, la cantidad
de O2 presente en una solucin es usada rpidamente por las bacterias aerbicas an a bajas
densidades de poblacin. Para evitar esta limitacin los cultivos aerbicos se realizan en frascos
erlenmeyers que para un dado volumen de solucin presentan una mayor superficie de
exposicin al aire. En estos frascos el medio debe ocupar un volumen igual a 1/10 del volumen
total y la cmara de aire los 9/10 restantes y la incubacin debe, a su vez, ser realizada con
agitacin constante para favorecer el intercambio. Alternativamente, puede airearse otro tipo de
recipientes, burbujeando oxgeno a travs de un filtro de aire estril, para ello generalmente se
utiliza un dispositivo poroso. Si se desea cultivar bacterias aerobias en un medio slido la
muestra debe sembrarse sobre la superficie del medio en un recipiente con una alta relacin
superficie/volumen como las cajas de Petri. La exclusin del oxgeno atmosfrico constituye
una condicin necesaria para el crecimiento de las bacterias anaerobias estrictas. Las tcnicas
anaerbicas de cultivo presuponen el uso de soluciones nutritivas a las que se les ha hecho
vaco en frascos cerrados sin burbujas de aire o la utilizacin de compuestos qumicos que
absorban el oxgeno (pirogalol alcalino, ditionito o cloruro cuproso). Se pueden adicionar
medios reductores (cido ascrbico, tioglicolato de sodio, cistena) a las soluciones nutritivas.
Alternativamente, puede reemplazarse la atmsfera del medio burbujeando algn gas inerte
como nitrgeno, helio o argn. En el caso que el cultivo sea en un medio slido, la muestra se
siembra en el interior del medio (por puncin o antes de que solidifique el agar). A veces resulta
til, agregar una capa de aceite o parafina ms agar semislido sobre la superficie expuesta.
3. Categoras nutricionales
La clasificacin nutricional de los microorganismos se basa fundamentalmente en dos
aspectos: la naturaleza de la fuente de energa y la naturaleza de la fuente principal de carbono.
27

Teniendo en cuenta la naturaleza de la fuente de energa se distinguen dos tipos de
organismos: los fottrofos que obtienen energa de la luz y los quimitrofos que la obtienen
de la oxidacin de compuestos qumicos. A su vez, entre los quimitrofos pueden distinguirse
los quimiolittrofos que obtienen la energa de compuestos inorgnicos y los
quimiorgantrofos que la obtienen de compuestos orgnicos.
De acuerdo a la naturaleza de la sustancia que sirve como fuente principal del carbono,
se distinguen dos tipos de organismos: aquellos que son capaces de usar CO2 o carbonatos (es
decir una fuente inorgnica de carbono) como fuente principal se llaman auttrofos y los que
usan compuestos orgnicos para proveer carbono a sus clulas se llaman hetertrofos.
De acuerdo a estos criterios, los organismos se pueden agrupar en cuatro categoras
nutricionales principales:
1. Fotoauttrofos: usan luz como fuente de energa y CO2 como fuente de carbono. Incluye a
las plantas superiores, las algas y muchas bacterias fotosintticas.
2. Fotohetertrofos: usan luz como fuente de energa y un compuesto orgnico como fuente
de carbono. Incluye a ciertas bacterias fotosintticas.
3. Quimioauttrofos: usan un compuesto qumico como fuente de energa y CO2 o carbonato
como fuente de carbono. La energa la obtienen de la oxidacin de un compuesto
inorgnico reducido como NH4
+
, NO2
-
, H2, H2S, S2O3
-
o Fe
2+
. Entre ellos se encuentran
algunas de las bacterias (bacterias nitrificantes, bacterias del Fe, etc.).
4. Quimiohetertrofos: utilizan un compuesto qumico como fuente de energa y un
compuesto orgnico como fuente de carbono. Generalmente tanto la energa como el
carbono provienen de un nico compuesto orgnico. Entre ellos se encuentran los
Metazoos, Protozoos, hongos y la mayor parte de las bacterias.
Para la preparacin de un medio de cultivo adecuado, es importante tener en cuenta la
provisin de aquellas sustancias que funcionan como dadores y aceptores ltimos de electrones
durante los procesos de oxidorreduccin que forman parte del metabolismo bacteriano.
En los procesos de obtencin de energa por las bacterias quimitrofas, se produce una
transferencia de electrones desde el compuesto reducido, que funciona como proveedor de
energa y electrones, hasta un compuesto que funciona como aceptor de electrones. De acuerdo
a la naturaleza del compuesto aceptor de electrones, el metabolismo oxidativo por el cual se
obtiene la energa se denomina: fermentacin, cuando el aceptor es un compuesto orgnico o
respiracin, cuando el aceptor es un compuesto inorgnico. A su vez, la respiracin puede ser
aerobia cuando el aceptor es el O2 o anaerobia cuando el aceptor es un compuesto
inorgnico distinto del O2. En este ltimo caso, los aceptores pueden ser NO3
-
(bacterias
desnitrificantes), SO4
2-
(bacterias reductoras del sulfato) o CO2 (bacterias metanognicas).
En el caso de los organismos fottrofos, la energa proviene de la luz, pero los
electrones necesarios para obtener los componentes celulares a partir de la fuente de carbono; se
obtienen de compuestos que funcionan como dadores de electrones. El dador de electrones
puede ser un compuesto orgnico (bacterias verdes y prpuras no sulfurosas), H2S (bacterias
verdes y prpuras sulfurosas) o H2O (algas y cianobacterias).
4. Clasificacin de los medios de cultivo
De acuerdo a su composicin, los medios de cultivo pueden clasificarse en dos tipos:
a) Sintticos o definidos: la solucin nutritiva se prepara a partir de compuestos qumicos
conocidos con concentracin definida.
28

b) Complejos: contienen productos naturales de composicin no definida. Estos comprenden
los medios que contienen extractos de levadura, de carne o de malta y/o peptonas o
triptonas de levadura o de carne. Los extractos contienen componentes celulares solubles y
son fuente de vitaminas y coenzimas. Las peptonas y triptonas contienen los productos
solubles de la digestin proteoltica por pepsina o tripsina, respectivamente, de carne,
pescado o levadura.
De acuerdo a la diversidad de los microorganismos que son capaces de desarrollar
en ellos, los medios se pueden clasificar en:
1. Generales: permiten el desarrollo de la mayor parte de los microorganismos presentes en
una muestra. Son medios ricos y en ellos, los organismos crecen de acuerdo a su
abundancia en la muestra y a su velocidad de crecimiento y no por la exigencia de sus
requirimientos nutricionales.
2. De enriquecimiento: la composicin del medio favorece el crecimiento de determinados
microorganismos. Se preparan teniendo en cuenta las caractersticas nutricionales y
metablicas del organismo que se quiere enriquecer. Son siempre lquidos.
3. Selectivos: la composicin del medio es suficiente para el desarrollo de determinado
microorganismo y se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de otros, por ejemplo
antibiticos, colorantes, sales, etc. Variando las sustancias aadidas, se vara el tipo y grado
de selectividad.
4. Diferenciales: se usan para revelar caractersticas especiales de las bacterias que permitan
su identificacin. Estos medios de cultivo son siempre slidos. Por ejemplo, el agar sangre
que contiene 5% de sangre de caballo u oveja, se usa para evidenciar la produccin de
hemolisinas. Para evidenciar la capacidad de fermentar un azcar determinado se emplean
medios slidos con colorantes indicadores, tales como la mezcla de eosina y azul de
metileno (Medio EMB), el cual en presencia del cido resultante de la fermentacin, el
colorante cambia de color y precipita de manera que slo la colonia que fermenta queda
teida. Estas placas deben contener otros nutrientes adems del azcar fermentable para
permitir el crecimiento de los organismos no fermentadores. El medio YMA para el
crecimiento de rizobios contiene un colorante, el rojo Congo, el cual permite discriminar
entre las colonias de los rizobios (rosadas y mucosas) y las de los contaminantes que se
tien de color rojo.
Cualquier medio de cultivo puede prepararse como medio lquido o slido. Un medio
slido se obtiene agregando a la solucin nutritiva un agente solidificante. Un solidificante ideal
es el agar, un polisacrido reticular de composicin compleja que comienza a fundir a 100C
pero al enfriarse se mantiene lquido hasta 42C y solidifica a temperatura ambiente. Se le
aade a las soluciones acuosas a una concentracin de 1,5 a 2% y slo es atacado por muy
pocas bacterias. La mayora de los microorganismos no atacan el agar. Cuando se requieren
medios de cultivo slidos sin componentes orgnicos, se usa gel de slice como solidificante.
Los medios slidos se utilizan cuando es importante aislar colonias u observar la forma de las
colonias. Tambin son indispensables cuando es necesario hacer recuento de clulas viables.
5. Cultivo puro de microorganismos
En general, el aspecto ms difcil en la obtencin de un cultivo puro es separar el
microorganismo que nos interesa de otros con los cuales aparece mezclado en la naturaleza. El
procedimiento por el que se logra esta separacin se denomina aislamiento.
No existe ningn medio de cultivo ni conjunto de condiciones que permita el
crecimiento de todos los microorganismos que se encuentran en la naturaleza. Por este motivo
29

cuando se inocula un cultivo mixto (cultivo en donde se encuentran representados ms de un
tipo de microorganismo) en un dado medio de cultivo slo se reproducirn aquellos que sean
capaces de crecer en ese medio mientras que los dems sern eliminados. Este principio permite
utilizar ciertos medios y/o condiciones para obtener un determinado microorganismo en cultivo
puro.
Existen diversos mtodos para el aislamiento microbiano. La eleccin del mtodo
adecuado depende del tipo de microorganismo que se desea obtener en cultivo puro y de su
abundancia en la mezcla de la cual se parte.
Algunos de los mtodos ms utilizados para la separacin de un microorganismo
determinado a partir de una poblacin mixta son:
- Aislamiento por diluciones sucesivas
- Aislamiento por estra en superficie
Dependiendo de la concentracin del microorganismo que se desea aislar en la mezcla
inicial, cualquiera de estos dos mtodos de aislamiento se pueden utilizar con o sin un
enriquecimiento previo. Si el microorganismo que se desea aislar se encuentra en muy pequea
proporcin en la mezcla, debe hacerse un enriquecimiento previo para poder aislarlo.
Cualquiera de los dos mtodos de aislamiento se aplica cuando el organismo que se trata de
aislar se encuentra representado en mayor nmero que los otros organismos presentes en la
mezcla. Ambos mtodos implican una dilucin de la mezcla original, donde las diluciones ms
altas, slo contendrn la especie ms abundante.

6. Tcnicas de aislamiento
6.1 Aislamiento por diluciones sucesivas
Para este procedimiento se toman varios tubos con un medio agarizado apropiado para
el desarrollo del organismo que se pretende aislar. Se funde el medio contenido en los tubos, se
deja enfriar hasta 42C y se mantienen a esa temperatura en un bao termosttico. Este
procedimiento aprovecha la propiedad del agar de fundir a altas temperaturas y permanecer en
estado lquido hasta los 42C.
Se toma con el ansa material de la muestra de partida, se siembra en el primer tubo y se
mezcla. Se carga el ansa en el primer tubo y se siembra en el segundo tubo y se mezcla. Este
procedimiento se repite un nmero de veces suficiente como para obtener en algunos de los
ltimos tubos un nmero de bacterias tan bajo que permita obtener colonias aisladas luego del
crecimiento en placa. El contenido de cada tubo se vuelca en una placa de petri, luego de
homogeneizar la mezcla.
En las placas con las diluciones ms altas las colonias estarn suficientemente
separadas entre s y alguna/s de ellas contendrn colonias provenientes slo de la especie ms
abundante (Fig. 1).
Una variacin de este mtodo consiste en realizar las diluciones en solucin fisiolgica
o medio de cultivo lquido estril y luego dispersar un volumen determinado de las ltimas
diluciones sobre una placa de Petri.

30



Figura 1. Aislamiento por el mtodo de las diluciones sucesivas.


6.2 Aislamiento por estra en superficie
En este procedimiento el medio de cultivo agarizado fundido se vuelca aspticamente
en una placa de Petri y, una vez solidificado, se inocula introduciendo el ansa en la suspensin
microbiana de la cual se parte, distribuyendo este material sobre la superficie del medio slido.
Las clulas quedarn fijas en distintos puntos del medio slido y luego de la incubacin de la
caja sembrada, se observarn las colonias. Si se parte de un cultivo mixto muy concentrado
conviene descargar el inculo realizando varias pasadas sucesivas (estras) sobre uno de los
bordes de la placa, luego quemar el ansa, tomar material de una de las ltimas estras realizadas
y continuar la siembra sobre el resto de la superficie del medio teniendo cuidado de no pasar
dos veces el ansa por el mismo lugar (Fig. 2). Luego se procede a la incubacin a una
temperatura adecuada para la especie que se quiere aislar.
Con esta metodologa se obtendrn zonas en la placa donde las colonias estn bien
separadas. Se toma material de una de estas colonias y se repite todo el procedimiento hasta
obtener una placa que contenga slo colonias de igual aspecto.
Muchas de las colonias que aparecen en la primera placa son colonias mixtas formadas por dos
o ms tipos de bacterias que crecen juntas. Por este motivo resulta fundamental repetir el
proceso de aislamiento.
31


Figura 2. Aislamiento por el mtodo de estriado en superficie. A. Se flamea el ansa. B. Se
obtiene el inculo. C. Se siembra el inculo. D. Se incuba y se observan las colonias aisladas.
Aislamiento con enriquecimiento previo
Cuando el organismo que se quiere obtener en cultivo puro est presente en el cultivo
mixto del cual se parte en muy baja proporcin, la probabilidad de obtener colonias que
provengan de estas clulas por los mtodos anteriores es muy baja. Por este motivo es
imprescindible enriquecer la muestra en el organismo de inters antes de proseguir con el
aislamiento. Esta operacin se denomina enriquecimiento.
Consiste en cultivar la muestra en condiciones que favorezcan el crecimiento del
organismo deseado. Estas condiciones pueden quedar establecidas por la composicin del
medio (en cuanto a fuente de carbono, nitrgeno, etc.) u otras condiciones del medio o la
incubacin (pH, contenido de oxgeno, luz, temperatura, etc.).
Se eligen condiciones adecuadas para el crecimiento del organismo de inters y/o
aquellas que desfavorezcan el crecimiento de otros organismos acompaantes. De esta forma,
en ese cultivo, el organismo tiene menos o ningn competidor y aumenta su abundancia relativa
de manera que es posible proseguir con el procedimiento de aislamiento siguiendo alguno de
los mtodos descriptos.


32

7. Observacin de los microorganismos
Introduccin
Los microorganismos poseen un ndice de refraccin muy cercano al del agua y en su
mayora no poseen color. Por lo tanto, la principal dificultad para observarlos con un
microscopio ptico es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea. El mtodo
ms sencillo para aumentar el contraste es teirlos utilizando colorantes. Los colorantes son
compuestos orgnicos que tienen una afinidad particular por componentes celulares especficos.
Los colorantes pueden clasificarse en:
Bsicos. Muchos de los colorantes utilizados comnmente estn cargados positivamente (son
catinicos) y se combinan fuertemente con los componentes celulares cargados negativamente
como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. El azul de metileno, el cristal violeta y la
safranina son ejemplo de colorantes catinicos.
cidos. Estn cargados negativamente y se combinan con constituyentes celulares cargados
positivamente como las protenas bsicas. Ejemplos: rojo Congo, eosina, fucsina cida.
Liposoluble. Se combinan con las sustancias de carcter lipdico mostrando as su presencia y
localizacin. Ejemplo: Negro Sudn.
Mordientes. Algunos colorantes son ms efectivos cuando las clulas han sido tratadas con
otro compuesto qumico que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se llama
mordiente. Los mordientes forman un complejo insoluble con el colorante llamado laca, que
fija el colorante a la estructura celular. Ejemplos: cido tnico, fenol, lugol, sulfato de amonio.
7.1 Tipos de tinciones.
Se las puede clasificar en dos grupos:
1. Por el nmero de colorantes utilizados
Simple. Consiste en la utilizacin de un solo colorante. Ejemplos: azul de metileno y
fucsina fenicada. Se utiliza para aumentar el contraste y detectar la presencia bacteriana, la
morfologa, etc. Las clulas se tien uniformemente. Si los microorganismos se tien, por
ejemplo, con azul de metileno, muestran en el interior de las clulas algunos grnulos
metacromticos, ms intensamente teidos que el resto de la clula, lo que indica la
presencia de entidades qumicas activas que tienen mayor afinidad por el colorante que el
resto de la clula en conjunto. Ejemplos: tincin de la flora del yoghurt con azul de
metileno y tincin de bacteroides con fucsina fenicada.
Compuesta. Consiste en la utilizacin de ms de un colorante. Ejemplo: tincin de Gram,
tincin de esporas.
2. Por alguna particularidad determinada, independientemente del nmero de colorantes
utilizados.
Tincin diferencial. Son los procedimientos que utilizan ms de un colorante y que ponen
de manifiesto diferencias entre las clulas bacterianas. Ejemplo: tincin de Gram.
Tincin especial. Pueden ser simples o compuestas. Se caracterizan por ser coloraciones
que manifiestan estructuras celulares determinadas y especficas. Ejemplos: tincin de
pared celular, de polisacridos bacterianos, de flagelos y cilias, de esporas, de ncleo, etc.
Tincin negativa. Este procedimiento es la inversa de la tincin usual. Las clulas quedan
sin teir pero se colorea el medio que las rodea. Se ve por lo tanto el perfil de las clulas.
33

Los microorganismos quedan transparentes delimitados por un fondo oscuro. Los
materiales que se utilizan en este tipo de tincin suelen ser materiales opacos que no tienen
afinidad por los componentes celulares. Ejemplo: tinta china para teir cpsulas.
7.2 Pasos esenciales en una coloracin.
1. Preparacin del extendido
Colocar con ayuda de un ansa, una gota de agua, preferentemente estril sobre un
portaobjetos limpio.
Transferir una pequea cantidad del cultivo a analizar proveniente de una colonia y
mezclar hasta obtener una suspensin dbilmente opalescente.
Dejar secar al aire.
2. Fijacin de un extendido
Pasar dos o tres veces el portaobjetos con el extendido hacia arriba por la llama del
mechero.
Dejar enfriar.
La fijacin por calor que se acaba de describir, es la ms comnmente utilizada aunque
tambin puede llevarse a cabo con sustancias qumicas como formaldehdo, alcohol
metlico o etlico, etc. La fijacin provoca habitualmente un achicamiento de las clulas, la
tincin por el contrario, hace aparecer las clulas de mayor tamao que el real, de manera
que la medicin de las clulas que han sido fijadas y/o teidas no se puede hacer con
exactitud.
El desarrollo de los pasos 1 y 2 da como resultado la obtencin de un frotis.
3. Tincin propiamente dicha
Consiste en la aplicacin de uno o ms colorantes sobre el frotis.

7.3. COLORACIN DE GRAM
Adems de permitir la observacin de morfologas y agrupamiento, esta coloracin
tiene valor taxonmico ya que permite distinguir dos grandes grupos de microorganismos que
difieren en la composicin de su pared celular.
Soluciones que se utilizan:
- Solucin de cristal violeta
- Lugol
- Alcohol 96%
- Safranina
Procedimiento:
1. Preparar frotis de los microorganismos.
2. Cubrir con el colorante cristal violeta. Dejar 1 min en contacto y luego lavar con agua.
En este paso, tanto las clulas Gram+ como las Gram se tien de violeta.
3. Cubrir con Lugol. Dejar en contacto 1 min.
34

El Lugol es una solucin acuosa de I2/IK que tiene la funcin de hacer de mordiente. El
principio activo es el I2, que solubilizado en agua por la presencia de IK, penetra en la clula y
forma una laca con el colorante. Esta laca es insoluble en agua y soluble en alcohol y acetona.
Todas las clulas mantienen el color violeta.
4. Lavar con alcohol 96% durante 15-30 segundos. Lavar con agua.
El lavado con alcohol solubiliza la laca y decolora a las clulas que son Gram y no a las que
son Gram+. La diferencia fundamental entonces entre estos dos tipos de clulas es su
resistencia a la decoloracin; esta resistencia radica en la naturaleza diferente de la pared
celular de ambos tipos de bacterias. Las bacterias Gram+ tienen paredes celulares muy
gruesas que se deshidratan con el alcohol. Esto lleva al cierre de los poros de la pared
evitando que el alcohol penetre en las clulas y por los tanto los complejos insolubles cristal
violeta/yodo no salen de las clulas. En las bacterias Gram la delgada capa de
peptidoglucano de la pared no evita el paso del solvente y en consecuencia la laca se lava de
las clulas.
5. Cubrir con safranina.
Esta etapa, coloracin de contraste, se utiliza para poner de manifiesto las clulas Gram que
fueron decoloradas en el paso anterior y no seran visibles sin esta coloracin. Se puede
utilizar tambin fucsina. Las clulas Gram adoptan una coloracin rosada y las Gram+
permanecen violeta.
6. Lavar con agua. Secar al aire.
7. Observar en microscopio con objetivo de inmersin.

Caractersticas del cultivo bacteriano cuyas clulas van a ser sometidas a tincin de Gram.
Se deben tener presentes las siguientes precauciones:
Estado fisiolgico del cultivo bacteriano. La tincin se debe realizar sobre clulas procedentes
de un cultivo joven, es decir de 24 h o menos de desarrollo ya que ciertas bacterias son slo
Gram+ durante el curso de su crecimiento activo y pierden la capacidad de retener el complejo
cristal violeta-iodo cuando el crecimiento cesa.
Desarrollo del cultivo en medio agarizado. La coloracin se debe realizar sobre clulas
provenientes de un cultivo realizado en medio agarizado. Si los microorganismos se han
desarrollado en medio lquido al tomar la muestra se arrastran componentes del mismo que
pueden reaccionar con los colorantes y dificultar la observacin.

COMPOSICIN DE LAS SOLUCIONES UTILIZADAS EN LA COLORACIN DE
GRAM

Solucin de cristal violeta
Cristal violeta....................................10 g
Oxalato de amonio..............................4 g
Etanol..............................................100 ml
Agua destilada................................400 ml

35

Solucin de lugol
Iodo......................................................1 g
Ioduro de potasio................................ 2 g
Etanol.................................................25 ml
Agua destilada.................................300 ml

Solucin de safranina
Safranina 2,5% en etanol....................10 ml
Agua destilada................................. 100 ml
36

CAPTULO 4
CARACTERSTICAS DE LA MULTIPLICACIN CELULAR DE LOS
MICROORGANISMOS.
Caractersticas de la multiplicacin celular de los microorganismos. Mtodos de determinacin
del nmero de clulas o la masa de una poblacin bacteriana y parmetros que lo caracterizan.
Velocidad especfica de crecimiento. Tiempo de duplicacin. Nmero de generaciones en un
dado tiempo. Existencia o no de una fase de latencia. Nmero de clulas en fase estacionaria.
Rendimiento del crecimiento. Coeficiente de rendimiento. Efecto de la concentracin de
nutrientes sobre la velocidad de crecimiento. Cultivo diuxico. Efecto de las condiciones
ambientales sobre el desarrollo de los microorganismos: temperatura, concentracin salina, pH,
tensin de oxgeno, formas txicas de oxgeno y enzimas que las eliminan. Regulacin de la
expresin de genes: el opern lactosa. Genes regulados por la densidad celular (quorum
sensing).
Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los
Microorganismos, 8
a
edicin. Prentice Hall.
Captulo 5, completo.

Definicin de crecimiento bacteriano
Es el aumento irreversible de materia viva que por lo general se efecta mediante el
incremento y la divisin de las clulas. En la mayora de los microorganismos procariticos, el
aumento contina hasta que las clulas se dividen en dos clulas hijas mediante un proceso
llamado fisin binaria. El crecimiento bacteriano da como resultado el aumento del nmero de
clulas, donde las clulas hijas alcanzan el mismo tamao que la clula original. En general se
estudia el crecimiento de una poblacin de clulas y no de una clula individual, por lo que las
respuestas obtenidas reflejan una situacin promedio de todas las clulas de la poblacin.
En un medio de cultivo adecuado al que las clulas de una poblacin estn
completamente adaptadas (crecimiento balanceado), el aumento de la biomasa est acompaado
por un incremento comparable de todas las otras propiedades medibles de la poblacin
(protena, DNA, RNA, agua intracelular). En otras palabras, los cultivos que sufren un
crecimiento balanceado, mantienen una composicin qumica constante.
El fenmeno de crecimiento balanceado simplifica la manera de medir la velocidad de
crecimiento de un cultivo bacteriano, ya que la velocidad de incremento de todos los
componentes de la poblacin es la misma, la medida de cualquier componente es suficiente
para determinar la velocidad de crecimiento.
La cintica de crecimiento de una poblacin bacteriana est determinada por factores
genticos y ambientales, que incluyen las condiciones y la modalidad del cultivo. Entre las
condiciones se destacan: la composicin del medio de cultivo, el pH, la temperatura de
operacin, etc. La modalidad del cultivo se refiere a la forma en la que se realiza. As, se puede
distinguir:
1. Cultivo en "batch" o cultivo por lote
2. Cultivo en "fed-batch" o cultivo por lote alimentado
3. Cultivo contnuo
37

Medicin del crecimiento bacteriano
Existen diferentes mtodos para seguir el crecimiento bacteriano.
A. Mtodos de determinacin del nmero de clulas o la masa de una poblacin
bacteriana
1. Determinacin de peso hmedo. Se lleva a cabo separando las clulas del medio por
centrifugacin, se las lava y luego se las pesa. Tal determinacin es relativamente poco
sensible.
2. Determinacin de peso seco. Se inicia de la misma manera que el mtodo anterior, slo que
deben llevarse a peso seco constante. Esta determinacin adems de ser poco sensible, requiere
mucho tiempo. En general, el peso seco es entre el 20 y el 25% del peso hmedo.
3. Determinacin de la masa de un componente celular. La determinacin de la cantidad de
protena bacteriana es un mtodo de uso frecuente. Utilizando el mtodo colorimtrico de
Biuret es posible obtener buenos resultados.
4. Recuento microscpico directo. El pequeo tamao de la mayora de los microorganismos
y su gran densidad de poblacin hace necesario emplear cmaras especiales como la de Petroff-
Hausser (Fig. 1) para contar el nmero de clulas de una muestra. Existen tres aspectos que son
limitantes en el empleo de estas cmaras:
a) Es un mtodo que por sus caractersticas se hace poco prctico para una gran cantidad de
muestras.
b) Es poco sensible debido a que se requiere una concentracin bacteriana de 1 milln de
clulas bacterianas/ml para observar al menos una clula en el campo microscpico.
c) Se cuentan tanto clulas vivas como muertas.

5. Determinacin de la turbidez del cultivo. Es un mtodo ptico y representa la tcnica ms
rpida para medir la masa celular de los microorganismos unicelulares. Consiste en la
determinacin de la cantidad de luz difractada por una suspensin de clulas. Esta tcnica se
basa en el hecho de que las partculas pequeas difractan la luz de manera proporcional a su
concentracin, dentro de ciertos lmites. Cuando un haz luminoso pasa a travs de una
suspensin bacteriana, la reduccin de la cantidad de luz transmitida como consecuencia de la
difraccin, es una medida de la densidad celular. Tales mediciones se hacen habitualmente con
un espectrofotmetro. Este aparato es adecuado para estimar la densidad poblacional (nmero
de clulas/unidad de volumen de la suspensin celular) y cuando se calibra con suspensiones
bacterianas de densidad y peso seco conocido, resulta un mtodo exacto y rpido para estimar el
peso seco de bacterias por unidad de volumen de un cultivo (Fig. 2).
B. Mtodos para recuento viable de microorganismos.
Mtodo de recuento en placa. Este es el nico mtodo que permite contar slo clulas viables
de una poblacin. Existen dos variantes, ambas se basan en la posibilidad que tiene una clula
viable, puesta en un medio agarizado, con nutrientes apropiados, de formar una colonia. De este
modo, lo que se cuentan son colonias, cada una de ellas derivadas de una sola clula viable.
1. Por estra con esptula de Drigalski o distribucin con perlas de vidrio, sobre la
superficie de una placa conteniendo un medio slido apropiado. Se coloca una muestra de
volumen pequeo (0,1 ml) y se extiende lo mejor posible sobre toda la superficie de la placa, se
incuba a temperatura adecuada y se cuentan las colonias. Para poder contar las colonias, stas
38

deben estar bien separadas, para ello se deben hacer diluciones apropiadas de la muestra
original. Se expresa como nmero de clulas viables por ml de cultivo.


Figura 1. Cmara de Petroff-Hauser




Figura 2. Curvas de absorbancia vs. peso seco/ml
2. Mezclando la suspensin bacteriana con el medio agarizado fundido. En este caso se
mezcla la suspensin bacteriana (un volumen mayor que en 1.) con el medio agarizado fundido
y enfriado a 42-45C y luego se lo vuelca en la placa. Se incuba a temperatura adecuada y se




39

cuentan las colonias, que de este modo estarn distribuidas en el seno del agar y no slo en la
superficie como en 1. El primer mtodo es mejor. En ambos casos la suposicin que se hace es
que cada colonia procede de una sola clula, por lo tanto es importante hacer diluciones
adecuadas para contar un nmero de colonias tambin adecuado. Estos mtodos son apropiados
para seguir el crecimiento de un cultivo puro de un microorganismo.
CONDICIONES REQUERIDAS PARA EL CRECIMIENTO DE LA BIOMASA DE
UN CULTIVO
1. Inculo viable
2. Presencia de una fuente de energa
3. Presencia de nutrientes que provean los elementos esenciales para sintetizar la biomasa
4. Ausencia de inhibidores del crecimiento
5. Condiciones fsico-qumicas adecuadas (temperatura, pH, tensin de oxgeno, etc.)
PARMETROS QUE CARACTERIZAN EL CRECIMIENTO DE UN CULTIVO
1. Velocidad especfica de crecimiento
2. Tiempo de duplicacin
3. Nmero de generaciones/hora
4. Existencia o no de una fase de latencia en el crecimiento
5. Nmero de clulas en fase estacionaria. Biomasa mxima.
6. Rendimiento del crecimiento

1. Velocidad especfica de crecimiento
Si se satisfacen todos los requerimientos mencionados arriba (1-5), entonces durante un
intervalo de tiempo suficientemente pequeo (dt), se espera que el crecimiento de la biomasa
(dx) sea proporcional a la masa (x) y al intervalo de tiempo (dt).
dx = x dt (1)
De aqu:
dx/dt = x (2)
dx/dt es el aumento de masa por unidad de tiempo, expresa la velocidad de crecimiento de la
poblacin.
El parmetro = dx/dt. 1/x representa, el cambio de masa por unidad de tiempo y por unidad de
masa, o sea la velocidad especfica de crecimiento y tiene unidades de tiempo
-1
(hora
-1
).
Reacomodando la ecuacin (1):
1/x dx = dt o 1/N dN = dt
e integrando entre x y xo el primer trmino de la igualdad y entre t y to el segundo trmino,
donde xo es la masa al tiempo to (inicio de la reaccin) y x es la masa al tiempo t, resulta:
ln x - ln xo = (t - to) = t t0 = 0
Si se cuentan clulas:
ln N - ln No = (t - to) = t
Pasando ln xo o ln No a la derecha, resulta:
40


o (3)

Si se representa ln x o ln N en funcin de t se obtiene una recta de pendiente y ordenada al
origen ln x0 o ln N0.









Si se transforma ln en log, la ecuacin (3) se convierte en:

(4)

ya que el logaritmo de 10 (log 10) es 1 y el logaritmo natural, en base de e, (ln 10) es 2,303.

Para determinar la velocidad especfica de crecimiento (), cualquiera sea el parmetro que se
utilice para seguir el desarrollo de la poblacin bacteriana, siempre se debe representar el log
del parmetro en funcin del tiempo. Si se utiliza un papel semilogartmico, entonces se
representa directamente el parmetro en la escala logartmica, en funcin del tiempo en la
escala lineal.
La ecuacin (3) puede ser escrita de la siguiente manera:
ln (x/xo) = t (5)
Tomando antilogaritmos resulta:
x/xo = e
t

Pasando xo a la derecha queda:
(6)

Si se representa x N (y no el log) en funcin de t, se obtiene una curva exponencial. Por esta
razn se habla de crecimiento exponencial o logartmico.
ln N = ln No + t
ln x = ln xo + t
log x = log xo + /2,303 t
x = xo e
t
41


2. Tiempo de duplicacin
El tiempo de duplicacin (tD), se define como el tiempo que tarda la masa xo o el nmero de
clulas No, en duplicarse.
Cuando x = 2 xo, entonces t = tD.
Si en la ecuacin (5) se reemplaza x por 2 xo y t por tD, resulta:
ln (2 xo/xo) = tD ln 2 = tD


Despejando tD:
(7)
Despejando :
(8)
Como se ve tD vara inversamente con y viceversa.
Supongamos que la bacteria A tiene un tD = 1h, es decir que la poblacin tarda 1 h en
duplicarse, mientras que la bacteria B tiene un tD = 2h, es decir que la poblacin de B tarda ms
en duplicarse (el doble del tiempo), si tratamos de deducir cmo son sus velocidades de
crecimiento, fcilmente llegaremos a la conclusin que A crece ms rpido que B, es decir que
la velocidad de crecimiento de A es mayor que la de B.
3. Nmero de generaciones en un dado tiempo
Se puede calcular el nmero de generaciones, es decir el nmero de veces que la poblacin se
duplica en un dado tiempo t.
Nmero de clulas Nmero de clulas
(expresado como potencia de 2)
Generacin
1 2
0
0
2 2
1
1
4 2
2
2
8 2
3
3
. . .
. . .
. . .
N 2
n
n
tD = ln 2 / = 0,693 /
= ln 2 / tD = 0.693 / tD
42


N = No 2
n
o x = xo 2
n

Tomando logaritmos queda:
log N = log No + n log 2 o log x = log xo + n log 2
Despejando n, nmero de generaciones, queda:

o

Cmo se calcula n en un determinado tiempo si se conoce el tD?
(9)
Es decir que n es el nmero de veces que el tD cabe en el tiempo t.
Si se despeja tD, resulta:
tD = t / n (10)
Algunos autores expresan la velocidad de crecimiento como el nmero de generaciones por
unidad de tiempo, por ejemplo por hora. A ese nmero se lo llama .
De la ecuacin (9) resulta:
= n / t = 1 / tD (11)
Qu diferencia existe entre y ?
1 / = ln 2 /
= ln 2. (12)

(13)

Las unidades de y son iguales (hora
-1
), el valor numrico es diferente. Se pueden usar las
dos maneras de medir la velocidad con la que crece un cultivo, pero debe especificarse.
Representacin grfica del crecimiento de un cultivo en batch
v = / ln 2
n = t / tD
n = (log x - log xo) / log 2 n = (log N - log No) / log 2
log N clulas
viables/ml
tiempo
A
B
C
D
A: Fase de latencia
B: Fase exponencial
C: Fase estacionaria
D: Fase de muerte



D: Fase de muerte
43

La fase exponencial o logartmica de crecimiento se caracteriza por la constancia de la
velocidad de divisin de las clulas del cultivo, que es una medida caracterstica de cada
especie y que depende del medio. Las enterobacterias se dividen cada 15-30 minutos, E. coli lo
hace a 37C cada 20 minutos, en aerobiosis y en un medio con glucosa como fuente de carbono.
En otras bacterias el tiempo de duplicacin es notablemente superior, alcanzando algunas
bacterias del suelo 60-150 min y 5-10 h en el caso de Nitrosomonas y Nitrobacter. El tamao
de la clula y su contenido en protenas es constante durante la fase logartmica de muchas
bacterias. Cuando sto sucede se dice que el cultivo est formado por clulas estndar. Si sto
es as y el incremento del nmero de clulas, de protena, del peso seco, etc., presenta la misma
velocidad, es fcil imaginar que el crecimiento puede seguirse midiendo cualquiera de estas
magnitudes y que el resultado obtenido ser el mismo. Debido a la constancia de la velocidad
de crecimiento durante la fase logartmica, es en esta fase en la que debe determinarse la
velocidad de crecimiento. Para estudiar el efecto de factores ambientales como pH,
temperatura, potencial redox externo, aireacin, etc., as como la utilizacin de diferentes
sustratos, se sigue el incremento del nmero de clulas o la turbidez del cultivo durante la fase
exponencial de crecimiento.

4. Existencia o no de una fase de latencia
La fase de latencia comprende el intervalo entre la inoculacin y el momento en que se alcanza
la tasa de divisin mxima. La duracin de la fase de latencia depende especialmente del
cultivo previo y de la edad del inculo as como de lo adecuado que sea el medio. Si el inculo
procede de un cultivo en fase estacionaria de crecimiento, antes de alcanzar las nuevas
condiciones de crecimiento, la clula debe recuperarse de los daos sufridos en la fase
estacionaria, seguramente deber sintetizar RNA, ribosomas, enzimas, etc., y sto le demanda
cierto tiempo. Tambin pueden presentar fase de latencia si la fuente de carbono y energa del
medio de cultivo nuevo es diferente de la del cultivo previo, la adaptacin a las nuevas
condiciones se halla a menudo ligada a una sntesis de novo de enzimas que no eran necesarias
en el medio de cultivo anterior y que por lo tanto no haban sido sintetizadas. La sntesis de
estas enzimas nuevas es inducida por la presencia del nuevo sustrato.
Los cambios cuantitativos que se producen en la composicin de la clula bacteriana durante la
fase de latencia se reflejan sobre todo en el contenido de RNA, que se multiplica unas 10 veces.
Este incremento en el contenido de RNA indica su participacin as como la de los ribosomas
en la sntesis de protenas enzimticas.
Si en el inculo hay clulas esporuladas, stas deben germinar para poder dividirse. Si el
inculo posee algn inhibidor del crecimiento, las clulas no podrn dividirse hasta que no se
inactive o metabolice de alguna manera dicha sustancia.
Resumiendo, las causas de la aparicin de una fase de latencia son:
a) Cambio del medio de cultivo: sntesis de nuevas enzimas.
b) Presencia de un inhibidor: inactivacin del inhibidor.
c) Presencia de esporas: germinacin de las esporas.
d) Estado del inculo: edad del cultivo.
Para acortar suficientemente la fase de latencia, el inculo debe ser transferido de fase
logartmica y a un medio lo ms semejante posible al del inculo.
44

5. Nmero de clulas en fase estacionaria
La fase estacionaria es aquella en donde las clulas dejan de crecer. La velocidad de
crecimiento depende de la concentracin del sustrato, consecuentemente cuando disminuye la
concentracin del mismo, disminuye la velocidad de crecimiento. El paso de la fase
exponencial a la fase estacionaria, se efecta poco a poco. Adems de la limitacin que impone
la concentracin del sustrato, la alta densidad de la poblacin, una presin parcial de oxgeno
ms baja y la concentracin de productos del metabolismo de carcter txico pueden reducir la
velocidad de crecimiento e iniciar la fase estacionaria. En la fase estacionaria an pueden
utilizarse los productos de reserva, tambin pueden degradarse una parte de los ribosomas y
algunas enzimas. Todos estos factores dependen individualmente de la variable que est
limitando el crecimiento. Slo las clulas muy sensibles mueren instantneamente. Las clulas
permanecern viables en esta etapa slo si pueden obtener la energa necesaria para su
mantenimiento, que es muchsimo menor que la necesaria para dividirse.
Resumiendo, las causas por las que un cultivo entra en fase estacionaria son:
a) Agotamiento de algn nutriente (slo si est en concentracin limitante).
b) Inhibicin del crecimiento por liberacin de toxinas.
c) Estrs fsico y/o qumico: cambio de pH, temperatura, etc.
En la fase estacionaria temprana el tamao celular alcanza un mnimo; en la fase estacionaria
tarda o fase de declive ocurren formas de involucin (distorsionadas o hinchadas). Este hecho
refleja daos de la pared o de la membrana por enzimas lticas o una regulacin pobre de los
componentes celulares. La prdida de la condicin de Gram positivas de las bacterias en la fase
estacionaria es una prueba de ello. Tambin la resistencia a estrs qumico o fsico, por ejemplo,
medio hipotnico, enfriamiento, calentamiento, etc. es mayor en la fase estacionaria. Estas
diferencias indican que la estructura de la clula cambia. En algunos grupos bacterianos la
formacin de endosporas o exosporas ocurre en esta fase.
El conocimiento de la cintica de crecimiento y de la produccin de metabolitos resulta
fundamental en el tratamiento cuantitativo de los procesos biotecnolgicos, ya que permite
predecir el curso de una fermentacin, evaluar las velocidades, el rendimiento y la
productividad. El conocimiento de estos parmetros permite optimizar el proceso de
produccin.

6. Rendimiento del crecimiento. Coeficiente de rendimiento.
La obtencin de la masa mxima de una bacteria en un medio dado est determinada por varios
factores:
a) Agotamiento de un nutriente esencial.
b) Desarrollo de un pH adverso.
c) Acumulacin de productos finales del metabolismo que al pH del medio pueden
resultar txicos para el microorganismo e impedir su crecimiento.
Si se considera que los factores 2 y 3 no son limitantes del crecimiento y que las
concentraciones de todos los nutrientes potencialmente limitantes estn en exceso, con
excepcin de uno de ellos, entonces se establece una relacin lineal entre el crecimiento
mximo (poblacin en fase estacionaria) y la concentracin de ese dado nutriente. Esta relacin
es constante hasta que otros factores diferentes de la concentracin del nutriente en cuestin,
limiten el crecimiento.
45

La determinacin del crecimiento mximo en funcin de la concentracin de un dado nutriente
tiene una extensa aplicacin en la determinacin cuantitativa de aminocidos, vitaminas del
grupo B, purinas y pirimidinas (bioensayos). Estos mtodos de anlisis microbiolgicos son
especficos y extremadamente sensibles.
La relacin lineal observada significa que:


En donde Y es el coeficiente de rendimiento.
Si la concentracin del nutriente limitante se expresa en trminos de molaridad, se obtiene Ym o
rendimiento molar, es decir, peso de clulas por mol de sustrato consumido. Si el sustrato es
utilizado como fuente de material celular y como fuente de energa, conociendo el rendimiento
en ATP del camino metablico se puede expresar el rendimiento como YATP, es decir gramos de
clulas por ATP consumido.
Si Xo y So representan respectivamente la biomasa y la concentracin iniciales del sustrato
limitante y X y S los correspondientes valores durante el crecimiento, se cumple que:
X - Xo = Y (So S)
Para un sustrato que es limitante del crecimiento, cuando el cultivo alcance su biomasa mxima
(Xm), S tender a cero y entonces se puede escribir:
Xm - Xo = Y So
Despejando Xm, queda:


Esta ecuacin nos muestra como vara la biomasa mxima con la concentracin del nutriente
limitante que se utilice en el cultivo.
Si se grafica Xm (biomasa mxima) en funcin de So (concentracin inicial del nutriente
limitante), se obtendr una recta de pendiente Y y ordenada de origen Xo.

Efecto de la concentracin de nutrientes sobre la velocidad de crecimiento
El crecimiento bacteriano puede compararse, en muchos aspectos, a una reaccin qumica
en la cual los componentes del medio de cultivo (sustratos) producen nuevas clulas (producto
de la reaccin), un proceso catalizado por la poblacin bacteriana. Si bien la velocidad de las
peso de bacteria formada (g/l) / peso de nutriente limitante consumido (g/l) = Y
X
m
= X
o
+Y S
o

S
o
(mg/ml)
X
m

X
o

46

reacciones qumicas viene determinada por la concentracin de los sustratos, la velocidad de
crecimiento bacteriano permanece constante hasta que en el medio prcticamente se haya
agotado el nutriente limitante. Esta aparente paradoja se explica por la accin de las permeasas
que son capaces de mantener concentraciones intracelulares saturantes de nutrientes con un
amplio margen de concentraciones externas. No obstante, a concentraciones extremadamente
bajas de nutrientes externos, los sistemas de las permeasas no son ya capaces de mantener las
concentraciones intracelulares saturantes por lo que disminuyen las velocidades de crecimiento.
Las curvas que relacionan la velocidad de crecimiento con la concentracin de nutrientes son
tpicamente hiperblicas y responden a la ecuacin:



en donde es la velocidad especfica de crecimiento a la concentracin de nutriente limitante s,
mx es la velocidad de crecimiento a la concentracin saturante y ks es una constante anloga
a la constante de Michaelis-Menten en cintica enzimtica; ks es la concentracin de sustrato
que produce la mitad de la velocidad mxima. Los valores de ks para la utilizacin de la
glucosa y el triptofano por E. coli son de 1 x 10
-6
y 2 x 10
-7
respectivamente, es decir valores tan
bajos como 0,18 y 0,03 g/ml. Estos valores tan bajos se deben a las elevadas afinidades
caractersticas de muchas permeasas bacterianas, lo que puede considerarse como una
adaptacin evolutiva al crecimiento bacteriano en medios naturales altamente diluidos.
Si se grafica la velocidad de crecimiento en funcin de la concentracin del nutriente se
obtiene una hiprbola:

En el grfico siguiente se muestran varias curvas de crecimiento a diferentes concentraciones de
sustrato limitante, donde puede verse que si bien la cosecha mxima cambia, la velocidad de
crecimiento se mantiene constante y slo decrece a concentraciones muy bajas del sustrato.
= mx s / ks + s

S ( mg/ml)

5 g/l
3 g/l
0.5 g/l
0.1 g/l
0.05 g/l
5 mg/l
0.1 mg/l
1.0 g/l
log Ncel/ml
tiempo
47

REGULACIN DE LA EXPRESIN DE GENES DEBIDO A LA PRESENCIA DE
DIFERENTES FUENTES DE CARBONO EN EL MEDIO.
EL CULTIVO DIAUXICO

En ciertos casos se pueden encontrar curvas de crecimiento ms complejas. El caso ms
conocido presenta dos fases de crecimiento exponencial separadas por una fase de latencia. Este
fenmeno, denominado diauxia o doble crecimiento, se observa cuando ciertas bacterias son
cultivadas en medios conteniendo cantidades limitantes de dos carbohidratos diferentes (en
general una es qumicamente ms compleja que la otra), o de un carbohidrato y de un cido
orgnico, como fuentes carbonadas. Tambin se observa diauxia cuando se trata de dos fuentes
nitrogenadas diferentes. La primera fase de crecimiento corresponde a la utilizacin exclusiva
de uno de los compuestos hasta su agotamiento seguida por un perodo de adaptacin antes que
el otro sustrato sea metabolizado y reinicie el crecimiento.
Si se trata de glucosa y lactosa, la pregunta que surge es cual de los dos azcares se utilizar
primero. La respuesta a esta pregunta viene del conocimiento de la regulacin del metabolismo
de la degradacin de la lactosa.
Las enzimas necesarias para la degradacin de la lactosa son inducibles, es decir slo se
expresan si el inductor (lactosa u otros galactsidos) est presente. La informacin gentica
para la sntesis de estas enzimas (las de la degradacin de la lactosa) est presente, lo que
determina la presencia del inductor es su expresin fenotpica.
Toda la informacin gentica para la degradacin de la lactosa est en una unidad funcional que
es el opern lactosa (Fig. 2). Este opern tiene tres genes estructurales (z, y, a) que son
correlativos y estn regulados conjuntamente. Inmediatamente vecino al gen z se encuentra el
gen operador O y el gen promotor P. El operador es la regin del opern que acta como
receptor especfico de la sustancia reguladora.
Fuera del opern lactosa se encuentra el gen cI que determina que las enzimas de este opern
sean inducibles. El gen cI, gen regulador, codifica para una sustancia que es un represor interno,
que se sintetiza constitutivamente, en general a poca velocidad, y que impide la transcripcin
del opern en ausencia del inductor.
El represor es una protena (protena alostrica reguladora) con dos sitios de interaccin. Por
uno de ellos se une al inductor y se transforma, por modificacin alostrica, en una sustancia
inactiva. El segundo centro es activo en ausencia del inductor y reacciona con el operador
inhibiendo la transcripcin. La accin que ejerce el represor se denomina control negativo.
Tambin existen efectores positivos que incrementan la velocidad a la cual la RNA polimerasa
se une al promotor y transcribe la informacin del gen.
La base de la regulacin positiva del fenmeno de diauxia es una represin por catabolito (Fig.
3). La glucosa reprime la sntesis de las enzimas de la degradacin de la lactosa. Esta regulacin
se ejerce a travs de un control positivo. Una sola protena llamada protena activadora del
catabolito (CAP) es la responsable de la regulacin de varios sistemas enzimticos, entre ellos
el opern lactosa. El efector de la protena CAP es el c-AMP, cuya concentracin en la clula
vara inversamente al suministro de ATP. El c-AMP se une a la protena CAP y hace que sta
experimente una transicin alostrica que le permite unirse al promotor y estimular la
transcripcin. Cuando la bacteria est consumiendo glucosa para crecer, se forma mucho ATP,
el nivel de c-AMP es bajo y la protena CAP est inactiva, entonces no se sintetizan las enzimas
para la degradacin de la lactosa. Cuando se consumi toda la glucosa, aumenta el nivel de c-
AMP, ste se une a la protena CAP, el complejo CAP-cAMP se une al promotor y se activa la
48

transcripcin de los tres genes estructurales del opern lactosa, sintetizndose las enzimas
correspondientes.


Figura 2. Mapa gentico del operon lactosa. Modelo de Jacob y Monod de la regulacin
transcripcional del opern lac por el represor lac. Tomado de Lodish et al., (2000).


49

Figura 3. Regulacin a travs del complejo CAP-cAMP. Control transcripcional positivo
del opern lac por el complejo cAMP-CAP. Tomado de Lodish et al., (2000).

Regulacin de la expresin de genes mediada por la densidad poblacional. Quorum
sensing
Las bacterias, a pesar de ser unicelulares, han evolucionado mecanismos sofisticados
para regular la expresin de ciertos genes mediante la percepcin de molculas difusibles
sintetizadas por individuos de la misma especie. Esta regulacin de la expresin gnica es
dependiente de la densidad celular y permite coordinar la expresin de genes a nivel de la
poblacin y tambin de la comunidad. Este mecanismo regulatorio se denomina quorum
sensing (QS), la palabra qurum en este contexto significa suficiente en nmero. De esta
manera, un nmero suficiente de individuos estar presente antes de iniciarse una respuesta que
depende de la densidad celular para tener un efecto. El caso ms claro es el de una bacteria
patgena que secreta una toxina que no tiene efecto cuando hay solamente una clula
bacteriana. La produccin de la toxina bajo esas condiciones significara un derroche de
recursos. En cambio, si hay un nmero suficiente de clulas bacterianas se acumular una
molcula seal, la cual regular la expresin coordinada de la toxina para iniciar la enfermedad.
Este es un fenmeno ampliamente distribuido entre bacterias Gram negativas y tambin Gram
positivas. Cada especie sintetiza una molcula seal especfica que se denomina autoinductor.
Esta seal difunde al medio y alcanza altas concentraciones cuando hay muchas clulas
cercanas produciendo la misma seal. En ese caso el autoinductor penetra las clulas y se une a
una protena activadora que dispara la transcripcin de genes especficos. En la Figura 4 se
50

presenta un esquema de este fenmeno para una bacteria Gram negativa cuya molcula seal es
acil-homoserina-lactona (AHL).



Figura 4. Clulas bacterianas expresando acil-homoserina-lactona (AHL).
Adaptado de Brock, Biologa de los microorganismos, 12
va
edicin, 2009.

Existen diferentes clases de autoinductores. Los primeros que se identificaron fueron
las ya nombradas acil-homoserina-lactonas (AHLs), las cuales presentan grupos acilo de
longitud variable y son producidas por diferentes especies de bacterias Gram negativas. En
cambio en bacterias Gram-positivas funcionan como autoinductores ciertos pptidos de cadena
corta.
El mecanismo de QS se describi por primera vez regulando la produccin de bioluminiscencia
por bacterias. La bacteria marina Aliivibrio fischeri puede emitir luz debido a la actividad de
una enzima llamada luciferasa. Los operones lux que codifican para las protenas necesarias
para la bioluminiscencia estn bajo el control de una protena activadora LuxR y son inducidos
cuando la concentracin de una AHL producida por la bacteria es lo suficientemente elevada en
el medio, y ello ocurre cuando la poblacin celular es alta. Esta bacteria puede vivir de forma
libre sobre materia orgnica en descomposicin, pero adems establece relaciones simbiticas
con varios peces marinos y calamares. En el caso del calamar Euprymna scolopes, ste tiene un
rgano emisor de luz con clulas ciliadas que atraen a las bacterias simbiticas. La bacteria
coloniza ese rgano porque all encuentra un ambiente rico en nutrientes. Al alcanzar un
nmero elevado de clulas A. fischeri emite luz, esa luz determina que el calamar no produzca
sombra en las noches de luna y as sus presas no se escapan cuando el calamar sale a
alimentarse. La luminiscencia parece seguir un ritmo circadiano, siendo ms brillante durante la
noche que durante el da. A la maana el calamar expulsa hasta un 90% de las bacterias
simbiticas en un proceso conocido como "ventilacin". Se cree que el objetivo de la
ventilacin es proporcionar la fuente de inculo de vida libre para calamares recin nacidos.
Luego, el proceso de multiplicacin celular de la bacteria se repite. Otros organismos marinos
que tambin contienen bacterias usan la bioluminiscencia para encontrar pareja, defenderse de
los depredadores, atraer a sus presas, o comunicarse con otros organismos (Widder, 2010).
51

Existen muchos genes regulados por QS, algunos tienen roles importantes en bacterias
del suelo. Por ejemplo, el nmero de copias del plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens se
regula por seales de QS.Tambin diferentes aspectos la nodulacin de las plantas leguminosas
por rizobios estn regulados por este mecanismo. Entre otros, la eficiencia de la nodulacin, el
desarrollo del simbiosoma, la produccin de polisacridos y la fijacin de nitrgeno han sido
ligados a fenmenos de QS (Gonzlez y Marketon, 2003).
Existen estudios que han demostrado que clulas de mamferos, plantas y algas secretan
molculas que pueden activar o inhibir mecanismos de QS. Por ejemplo, una molcula seal de
defensa de las plantas, el cido saliclico, activa la expresin de una enzima que degrada la
AHL producida por A. tumefaciens (Williams, 2007).


CAPTULO 5

FILOGENIA Y CLASIFICACIN TAXONMICA DE LOS MICROORGANISMOS
Clasificacin taxonmica y filogentica. Dominios: Bacteria, Archaea y Eukarya.
Caractersticas diferenciales. Taxonoma convencional y molecular. Identificacin y
nomenclatura. Definicin y concepto de especie. Taxonoma numrica y agrupamiento
jerrquico. Taxonoma molecular: composicin de bases e hibridacin molecular.
Material de consulta adicional: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de
los Microorganismos, 8
a
edicin. Prentice Hall.
Captulo 6, pg. 188-194 y Captulo 15 (15.5 a 15.9)
Definiciones
Evolucin: Es el proceso de cambio de los caracteres hereditarios en poblaciones de
organismos a lo largo de las generaciones que se suceden en el tiempo.
Filogenia: es el estudio de las relaciones evolutivas entre grupos de organismos.
Sistemtica: Es el estudio de la diversificacin de los seres vivos a lo largo del tiempo, sus
adaptaciones ambientales y sus relaciones evolutivas.
Taxonoma: Es una rama de la sistemtica que se ocupa de describir y clasificar organismos en
grupos de acuerdo a similitudes en su origen (genotpicas) o en sus estructuras (fenotpicas). La
taxonoma incluye tambin el diseo de las reglas de nomenclatura que se usan para nombrar
organismos.
Homologa: Se denomina as a la existencia de genes o caracteres codificados genticamente en
dos organismos diferentes y que se heredaron de un ancestro comn.
1. Introduccin
En microbiologa, tal como sucede en zoologa o botnica, los organismos se clasifican en
sistemas jerrquicos. Un objetivo importante de la sistemtica biolgica es establecer
clasificaciones que reflejen la filogenia del grupo de organismos en estudio. De esta manera,
dos especies que pertenezcan al mismo gnero sern genticamente ms similares entre s y
tendrn una historia evolutiva compartida ms larga que dos especies de gneros diferentes y
que slo comparten la pertenencia a una categora superior, como puede ser una familia. En una
perspectiva ms prctica, el desarrollo de sistemas taxonmicos y la correcta clasificacin de
los organismos son fundamentales por ejemplo al monitorear microorganismos patgenos en el
campo y descubrir sus nuevas variantes, desarrollar marcadores biolgicos en estudios
52

ambientales o identificar con precisin los organismos que se usan en procesos biotecnolgicos
para cumplir con regulaciones legales.
Comenzaremos este captulo con una discusin sobre el origen de la vida sobre el planeta y la
posterior evolucin de los grupos microbianos. Luego analizaremos algunas de las tcnicas
utilizadas para establecer relaciones fenotpicas y filogenticas entre microorganismos, y
cerraremos el captulo con una introduccin a las metodologas de la taxonoma microbiana.
2. El origen de la vida sobre el planeta
Nuestro planeta se form hace unos 4.500 millones de aos. Sin embargo, las muy altas
temperaturas en la superficie, la ausencia de agua lquida y el bombardeo de gran cantidad de
objetos provenientes del espacio, hicieron imposible el desarrollo de la vida durante los
primeros cientos de millones de aos que siguieron a la formacin de la Tierra. Ms tarde, las
condiciones para el desarrollo la vida se volvieron ms favorables.
Existen dos hiptesis sobre las condiciones especficas que llevaron al surgimiento de
los primeros seres vivos. La primera hiptesis plantea que el origen de la vida fue en la
superficie del planeta, al acumularse compuestos orgnicos e inorgnicos en medios acuosos
que fueron reaccionando de manera compleja para formar estructuras qumicas cada vez ms
sofisticadas, hasta llegar a vesculas separadas del medio externo por una membrana y con un
metabolismo muy bsico en su interior. La principal crtica de esta teora es que las condiciones
desfavorables debidas al impacto de meteoros, nubes de polvo, tormentas y reactividad qumica
de la atmsfera se mantuvieron cientos de millones de aos, dificultando los procesos de
evolucin qumica.
Una hiptesis alternativa propone que el origen de la vida ocurri en el lecho de los
ocanos, cerca de fuentes surgentes hidrotermales. Este habra sido un ambiente menos hostil y
mucho ms constante, con una amplia disponibilidad de energa qumica. En este caso la
formacin de vesculas con un metabolismo primitivo se habra visto favorecida.
Tambin existen diferentes teoras con respecto al metabolismo primitivo presente en
las vesculas. Una teora sostiene que ese metabolismo estaba mediado por diferentes molculas
de ARN con funciones enzimticas (funcin metablica) y de almacenamiento y replicacin de
la informacin. Esta teora se apoya en el hecho de que hay virus actuales que usan el ARN
como material gentico de almacenamiento, que en todos los seres vivos las variantes de ARN
juegan un papel fundamental en la transcripcin y traduccin y que adems existen molculas
de ARN con capacidad cataltica. La otra teora sostiene que dentro de las vesculas podran
haber existido un alto nmero de molculas, sobre todo polmeros y que debido a las
condiciones fsico-qumicas del ambiente de la Tierra primitiva, esas molculas podran haber
interactuado de manera cada ms compleja, hasta desarrollar un metabolismo bsico con
capacidad de autoreplicacin. Luego, en una etapa posterior se incorpora el ARN como material
gentico.
Evolucin temprana
En cualquier caso, estos complejos, llamados progenotes, no se consideran verdaderos
seres vivos. Este progenote, o ms probablemente, un conjunto de variantes de progenotes,
continu evolucionando y adquiriendo nuevas propiedades, hasta alcanzar un estado propio de
un ser vivo, con un metabolismo organizado, controlado por un genoma compuesto por ADN o
ARN, capacidad de autoreplicarse y responder a estmulos del ambiente. El genote o
comunidades de genotes, probablemente prosperaron por decenas de millones de aos, hasta
que surge el ltimo ancestro universal comn, un microorganismo a partir del cual
evolucionaron los tres grandes dominios que abarcan la totalidad de los seres vivos que habitan
53

la Tierra: Bacteria, que corresponde a las eubacterias de la actualidad, y un tronco que se
separ rpidamente en Archaea, organismos unicelulares sin ncleo similares a bacterias y
adaptados a ambientes extremos y Eukarya, que comprende a los animales, plantas, hongos y
protistas.
Los primeros seres vivos tienen que haber sido anaerobios y probablemente
quimiolitotrficos explotando las fuentes abundantes presentes de H2S (sulfuro de hidrgeno) y
FeS (sulfuro de hierro). Las fermentaciones y la respiracin aerobia aparecieron apenas ms
tarde junto con la fotosntesis oxignica y anoxignica. Las primeras evidencias fsiles de vida
tienen una antigedad de 3.500 millones de aos y corresponden a estromatolitos, unas
estructuras macroscpicas similares a los tapetes microbianos que discutiremos en las clases de
microbiologa de ambientes acuticos. Los microorganismos que formaron estos estromalitos
fsiles eran bacterias filamentosas, probablemente fotosintticas anoxignicas.
Una importante consecuencia de la aparicin del O2 generado por la fotosntesis
oxignica fue la formacin del O3 (ozono), una sustancia que hace de barrera para prevenir la
intensa radiacin ultravioleta del sol sobre la tierra. El ozono se forma por la accin de la luz
UV sobre el O2. Hasta que apareci el ozono, se cree que la vida sobre la tierra slo ocurri en
ambientes protegidos de la radiacin UV, como por ejemplo debajo de las rocas o en los
ocanos.
Transferencia de material gentico
En la evolucin de las bacterias y arquibacterias jug un papel importante la
transferencia lateral de material gentico. Esto es, el movimiento de fragmentos de longitud
variables de ADN desde un microorganismo procaritico a otro diferente. El resultado de este
proceso es un organismo que combina material gentico de especies que pueden estar muy
distanciadas por su historia evolutiva. Los fenmenos de transferencia lateral de material
gentico constituyen una forma muy efectiva de incorporar nuevas funcionalidades.
Aparentemente la transferencia lateral de genes fue muy frecuente en los inicios de la historia
evolutiva, y luego su importancia fue disminuyendo. Hoy en da es un fenmeno detectable,
pero sobre todo entre grupos de microorganismos con algn grado de parentesco filogentico.
Por ejemplo, en la actualidad la transferencia lateral de genes es una de las causas que explican
la rpida aparicin de bacterias con resistencias a mltiples antibiticos.
Especializacin de los organismos primitivos
Respecto a la formacin de organelas en los organismos eucariotas, existen evidencias
para creer que el ncleo y el aparato mittico surgieron como una necesidad de asegurar la
replicacin y la particin del ADN cuando el tamao del genoma increment tanto que la
replicacin de una sola molcula (como en procariotas) ya no fue suficiente. El origen del
ncleo hace posible manipular el enorme genoma necesario para codificar todas las funciones
de un organismo multicelular y tambin hace posible la recombinacin del genoma a travs de
la reproduccin sexual. Con respecto al origen de las mitocondrias y los cloroplastos, la teora
de la endosimbiosis, sugiere que probablemente surgieron de la endosimbiosis de organismos
procariotas dentro de los eucariotas.
3. Sistemtica microbiana
El estudio de la filogenia de los microorganismos, sus adaptaciones al ambiente y
patrones de diversificacin resulta ms complicada que en botnica o zoologa por la escasa
presencia de registro fsil microbiano, la enorme diversidad y adaptabilidad de los
microorganismos y la antigedad de su origen, que antecede al de plantas y animales en algunos
54

miles de millones de aos y coincide, como vimos en la seccin anterior con el surgimiento de
la vida sobre el planeta. Sin embargo, desde hace unas dcadas, la sistemtica microbiana est
avanzando a grandes pasos, gracias a los avances en biologa molecular, genmica y
bioinformtica.
Actualmente existen diferentes mtodos moleculares, stos son los ms modernos, y en
general, los ms confiables. Hoy en da, la mayora de los trabajos que se realizan en el campo
de la sistemtica incluyen los anlisis comparativos de genes o protenas seleccionados que se
conocen como relojes o cronmetros moleculares. Existen diferentes tcnicas de laboratorio
para determinar la secuencia de genes especficos. Mediante aplicaciones informticas se puede
determinar el grado de similitud de dos o ms secuencias de nucletidos o aminocidos. La
mayora de estos mtodos requieren un paso de amplificacin del ADN, que se logra utilizando
diversas variantes de la tcnica de PCR (reaccin en cadena de la polimerasa).
Aunque es menos frecuente, y ms costoso, actualmente tambin es posible obtener la
secuencia completa del genoma de un microorganismo. Por ejemplo, a mediados de febrero de
2011 existan 1.453 genomas microbianos completamente secuenciados, y la informacin se
encuentra disponible en forma pblica en bases de datos que se acceden va Internet. La
disponibilidad de estos datos gener un inters en desarrollar nuevos mtodos de estimacin
filogentica que usan toda la secuencia del genoma, en lugar de algunos marcadores
seleccionados.
Cronmetros para la evolucin
Las variaciones que se observan en la secuencia de aminocidos de ciertas protenas o
en las secuencias de nucletidos de algunos genes son buenos indicadores de los cambios que
ocurrieron en el proceso evolutivo. El estudio comparativo de las secuencias mostr que la
distancia evolutiva entre dos especies se puede medir por la cantidad de cambios que ocurren en
dichas secuencias. Esto es as porque el nmero de diferencias en la secuencia de una molcula
es proporcional al nmero de cambios mutacionales estables que ocurrieron en la secuencia de
ADN desde que esas especies divergieron de un ancestro comn.
Eleccin de los marcadores o cronmetros moleculares. Ejemplos.
Para determinar la distancia en la evolucin entre dos especies, es esencial elegir la molcula
correcta para estudiar la secuencia. Esto es importante por varias razones:
a) La molcula debe estar universalmente distribuida en el grupo elegido para el estudio.
b) Debe ser homloga funcionalmente para cada organismo, es decir, las comparaciones
filogenticas deben comenzar con molculas de funcines idnticas. No se puede
comparar las secuencias de molculas de enzimas que llevan a cabo funciones
diferentes, ya que no se puede esperar que molculas no relacionadas funcionalmente
tengan secuencias semejantes.
c) Es crucial en la comparacin de las secuencias, poder alinear las dos molculas que se
estn comparando para identificar regiones de secuencias homlogas y de secuencias
heterlogas.
d) La secuencia de la molcula elegida debe cambiar a una velocidad conmensurable con
la distancia en la evolucin que se quiere medir. As cuanto ms amplia sea la distancia
a ser medida, tanto ms pequea debe ser la velocidad a la cual la secuencia cambia.
Una molcula que sufre muchos cambios en su secuencia no sirve como herramienta
para determinar las relaciones evolutivas porque podran haberse perdido regiones de
secuencia homloga.
55

Secuencia del ARN ribosomal 16S. Uno de los primeros marcadores que se usaron, y se
continan usando, para estudios filogenticos, es la secuencia del gen que codifica para la
subunidad 16S del ribosoma de los procariotas, o para la subunidad 18S en el caso de los
eucariotas. Esto se debe a que esta molcula rene prcticamente todas las condiciones que
requiere un marcador filogentico:
a) Distribucin generalizada.
b) El producto de este gen realiza la misma funcin en todos los organismos.
c) Baja frecuencia de transferencia lateral.
d) Estructuras con baja tasa de mutacin, y otras con tasas ms altas.
e) Existen bases de datos que almacenan un nmero muy grande de secuencias diferentes
para este gen.
Es comn determinar las relaciones filogenticas entre microorganismos utilizando
exclusivamente este marcador, pero en aos recientes esta prctica ha recibido crticas y se
observa una tendencia a complementar los trabajos de investigacin con otros marcadores.
Aunque es importante destacar que la base de estos estudios contina siendo el anlisis de la
secuencia del rRNA 16S, motivado, entre otras razones por la enorme cantidad de secuencias
depositadas en las bases de datos y disponibles para comparacin.




Arbol filogentico universal determinado comparando las secuencias de los ARN
ribosomales 16S y 18S. Adaptado de Madigan y col., 2000.

BACTERIA ARCHAEA
EUCARIOTA
Bacterias verdes
Entamoebas
Cianobacterias
Bacterias prpuras
Cloroplastos Gram +
Thermoproteus
Pyrodictium
Methanosarcina
Methanobacterium
Methanococcus
Halfilas
extremas
Mohos
Animales
Hongos
Plantas
Flavobacterias
Thermotoga
Aquifex
Thermococcus
Thermoplasma
Methanopirus
Ciliados
Flagelados
Tricomonas
Progenote
Diplomonas
Microsporidia
Mitocondrias
56

Genes de funcin conservada. Los estudios comparativos de genomas procariotas
permitieron descubrir un conjunto de alrededor de 40 genes conservados que tambin se pueden
usar como marcadores filogenticos. Estos genes codifican molculas como otros rRNA, - y
tambin la regin intergnica entre genes para rRNAs-, y diversas protenas tales como factores
de iniciacin y elongacin de la traduccin, protenas ribosomales, sintetasas de aminoacil-
tRNAs, polimerasas de ARN, protenas de resistencia al estrs calrico y enzimas involucradas
en la recombinacin del ADN. Este ncleo de genes no son blancos frecuentes de los procesos
de transferencia lateral, y constituyen una alternativa vlida para estudios filogenticos.
Otros mtodos moleculares
Contenido genmico de G+C: Este fue uno de los primeros mtodos para caracterizar
el material gentico de un microorganismo.
Es relativamente fcil de determinar experimentalmente: se calienta suavemente ADN
extrado de un cultivo microbiano y se mide la absorbancia de la muestra a 260 nm. Al alcanzar
la temperatura en que las dobles cadenas se separan, se observa un aumento rpido de la
absorbancia. Esta temperatura es el llamado punto de fusin del ADN; a partir del cual y
mediante una frmula matemtica se estima el contenido relativo de G+C, expresado como un
porcentaje (%G+C). A mayores puntos de fusin del ADN, les corresponden mayores valores
de %G+C. La desventaja de este mtodo es que tiene poco valor filogentico: dos especies con
contenidos similares de G+C pueden estar emparentadas o no. Aunque en el caso contrario, s
se puede afirmar que dos especies con valores muy diferentes de %G+C tienen entre s una
relacin filogentica distante.
Actualmente slo se utiliza como un dato adicional en la descripcin de un organismo.
Puede servir para confirmar la pertenencia de un microorganismo a una de las categoras
taxonmicas superiores, como divisin o clase. Para microorganismos cuyos genomas fueron
completamente secuenciados, el contenido de G+C se determina por mtodos informticos.
Hibridacin cuantitativa de ADN: Este mtodo tambin existe desde hace muchos
aos. Sus variantes ms modernas continan utilizndose, aunque ya no ocupan el papel
fundamental que tenan antes de que aparecieran los mtodos de comparacin directa de
secuencias.
El principio de la versin moderna de esta tcnica es formar hbridos de ADN doble
cadena utilizando muestras extradas de los dos microorganismos que se quieren comparar. Una
forma prctica de lograr sto es obtener ADN de cadena simple de un cultivo puro de uno de los
microorganismos e inmovilizarlo sobre una superficie plstica. Luego se extrae ADN del otro
microorganismo y se preparan molculas de ADN de cadena simple que se marcan
qumicamente con nucletidos radiactivos o nucletidos modificados que emiten fluorescencia
(Fig. 1). Se enfrenta este segundo ADN al que previamente se haba inmovilizado y tras una
serie de pasos, esencialmente lavados, se determina cuanta marca -radiactiva o fluorescente-
queda unida al ADN inmovilizado. Cuanto mayor es la marca, mayor es el grado de parentesco
evolutivo entre las especies. Por ejemplo, un criterio comn es que si el ADN de dos
microorganismos muestra hibridaciones del 70% o ms, pertenecen a la misma especie.





57


Figura 1. Esquema de la hibridacin de ADN de cuatro orgenes diferentes


4. Taxonoma microbiana
El objetivo de la taxonoma es la identificacin y descripcin de las unidades
taxonmicas bsicas, las especies, y el desarrollo de mtodos que permitan ordenar y catalogar
las especies. La nomenclatura es una subdisciplina de la Taxonoma que contribuye a la
identificacin de los organismos.

Clasificacin de los microorganismos
Los organismos pueden clasificarse en grupos tales que los miembros de un grupo estn
ms relacionados filogenticamente entre s que con los miembros de otro grupo. Para agrupar
los organismos se emplea una sucesin ordenada de categoras taxonmicas:
Especie: organismos de una y la misma clase.
Gnero: grupo de especies afines.
Familia: grupo de gneros afines.
Orden: grupo de familias afines.
Clase: grupo de rdenes afines.
58

Phylum o Divisin: grupo de clases afines.
Dominio: grupo de phyla afines.
Esta ordenacin jerrquica contiene los principales taxones de clasificacin de los
organismos. Cada categora, en la serie ascendente, agrupa a un nmero cada vez mayor de
unidades taxonmicas. Es importante notar que el gnero ocupa una posicin de importancia
especial, ya que de acuerdo a las reglas de la nomenclatura, una especie no puede designarse sin
estar incluida en un gnero. En algunos casos, especialmente con grupos muy extensos, se
emplean taxa complementarias, en las cuales se agregan prefijos sub o super a las taxa
mencionadas, por ejemplo subfamilia, subgnero. En el caso de la especies, es comn
identificar tambin una variedad. Tambin, aunque no forma parte estrictamente de la
categorizacin taxonmica, en microbiologa es comn trabajar con la categora cepa, que es
una poblacin clonal -originada de un nico individuo- dentro de una especie.
Las especies como unidades de clasificacin
El concepto de especie microbiana es complejo y no tiene definicin objetiva. Aqu
debemos tener en cuenta que en otros grupos biolgicos, como las plantas o los animales, la
definicin de especie no es slo un concepto operativo, sino que tiene un fundamento biolgico,
ya que la especie est formada por conjuntos de poblaciones cuyos individuos tienen la
capacidad de cruzarse sexualmente entre s, dando una descendencia frtil, y al mismo tiempo
estn sexualmente aislados de otras especies. Entre los procariotas la recombinacin sexual es
prcticamente inexistente, y para complicar el panorama tambin hay que considerar la
existencia de fenmenos de transferencia lateral de material gentico entre grupos con poco
parentesco filogentico.
Durante las primeras pocas de la microbiologa el concepto de especie adoptado fue
operativo y basado en caracteres fenotpicos, fundamentalmente morfologa celular, tipo de
tincin Gram, estilo de vida y caracteres metablicos, como requerimientos nutricionales y
capacidad de utilizacin de fuentes de C y N. Ms tarde se agregaron los datos de contenido de
G+C y las relaciones de homologa de ADN. El resultado de este proceso es un sistema de
clasificacin que no siempre reflej la filogenia de cada grupo.
La incorporacin de tcnicas moleculares sofisticadas est conduciendo a una revisin
extensiva de la clasificacin de bacterias, arquibacterias, hongos y otras formas de vida
microscpicas. Sin embargo, todava no se alcanz a redefinir el concepto de especie
microbiana de forma que sta se corresponda con la unidad de evolucin e incluya
consideraciones ecolgicas.
Nomenclatura de los microorganismos
La nomenclatura biolgica est gobernada por un rgido y complejo conjunto de reglas
diseadas para mantener dicha nomenclatura lo ms estable posible. Conforme al sistema
binomial de nomenclatura se asigna a cada especie biolgica un nombre compuesto por dos
palabras. La primera indica el gnero al cual pertenece la especie y la segunda palabra es un
epteto especfico. Ambas conforman el nombre de la especie. Por ejemplo, Bacillus es el
gnero y Bacillus subtilis la especie (y no subtilis slamente). La primera palabra se escribe con
mayscula y puede ser una palabra latina, griega o el nombre latinizado de una persona (ej.:
Pasteurella, en honor de Luis Pasteur). La segunda palabra, la designacin especfica, se
escribe con minscula. En los casos en que hay variedades, sta se indica a continuacin del
nombre de la especie, por ejemplo: Streptococcus lactis var. maltigenes.
59

Existen varias formas en que se puede llevar a cabo la clasificacin microbiana:
taxonoma clsica, taxonoma numrica y taxonoma gentica o molecular. Aunque los mtodos
moleculares son los ms sofisticados y los que permiten mayor precisin los otros mtodos
todava no han desaparecido. Hay varias causas para que sto sea as. En muchos grupos
biolgicos todava no se desarrollaron los sistemas de clasificacin apropiados para reemplazar
a los preexistentes. En otros grupos, ya existe una caracterizacin de su filogenia a nivel
molecular, pero se mantienen otros sistemas paralelos. Un ejemplo tpico es la clasificacin de
especies fitopatgenas, en donde las relaciones filogenticas pueden ser bien conocidas, pero la
clasificacin fenotpica por tipos de virulencia es la que le resulta til al fitopatlogo en el
campo.
Taxonoma clsica: Se basa en la determinacin de una variedad de caractersticas de los
distintos organismos y se los separa por grupos que comparten estas caractersticas. Un grupo
de cepas que tienen todas o la mayora de las caractersticas fenotpicas iguales se clasifican en
especies nicas y las especies afines se clasifican en el mismo gnero. Las caractersticas de
valor taxonmico que se evalan en este tipo de estudio son la morfologa, clasificacin
nutricional, qumica de la pared celular, presencia y tipo de inclusiones celulares y productos de
almacenamiento, pigmentos, requerimientos nutricionales, productos de fermentacin,
requerimientos y tolerancia a la temperatura y al pH, sensibilidad a los antibiticos,
patogenicidad, caractersticas inmunolgicas y hbitat, etc.
Taxonoma numrica: Entre los aos 60 y 70 del siglo pasado los taxnomos comenzaron a
aprovechar la mayor capacidad de cmputo que ofrecan las computadoras de la poca para
desarrollar mtodos ms objetivos de clasificacin. Los agrupamientos de organismos en
categoras se construyeron a partir de la cuantificacin de las semejanzas y diferencias entre los
microorganismos. Se asume que, si a cada carcter estudiado se le asigna el mismo valor, es
posible expresar numricamente las distancias taxonmicas entre los organismos en funcin del
nmero de caracteres que comparten dentro del total de caracteres estudiados. Obviamente la
significacin de este tipo de clasificacin est directamente afectada por el nmero de
caracteres analizados y en consecuencia stos deberan ser tan numerosos y variados como sea
posible para que el resultado sea reflejo significativo del fenotipo. La recomendacin usual es
que el nmero de caracteres analizados debera ser al menos 60 y que en lo posible sean
independientes entre s. Los caracteres analizados pueden ser de cualquier tipo: morfolgicos,
bioqumicos, fisiolgicos o serolgicos (inmunolgicos).
Los datos se organizan en una tabla llamada matriz de datos (Fig. 2), cuyas filas
corresponden a las poblaciones, cepas, variedades, etc. -conocidas colectivamente como
Unidades Taxonmicas Operativas, OTUs en ingls- y las columnas de la matriz a los
caracteres. Existen diferentes coeficientes para comparar OTUs y obtener medidas de
semejanza entre ellas. Los resultados se organizan en una nueva matriz conocida como matriz
de distancia o similitud.
Esta matriz contiene toda la informacin para analizar las relaciones entre OTUs, pero
su uso no es prctico y la forma ms usual para representarlo es mediante dendrogramas (Fig.
3).
Taxonoma molecular: Las tcnicas utilizadas para la clasificacin de los microorganismos
utilizando metodologas moleculares son adaptaciones, las cuales se mencionaron anteriormente
en la seccin de sistemtica.

60




61

Microbiologa Agrcola y
Ambiental
MICROBIOLOGA AGRCOLA
Y AMBIENTAL
62

CAPTULO 6
ECOLOGA MICROBIANA
El suelo y el agua como ambiente para los microorganismos, factores que afectan su
distribucin. Los microorganismos y su microambiente, ecosistemas y nichos ecolgicos.
Interaccin de los microorganismos entre s y con su entorno (competencia, cooperacin).
Importancia de la ocupacin de diferentes nichos ecolgicos naturales por parte de los
microorganismos y la modificacin de los mismos. Microorganismos de la rizosfera y su
interaccin con la planta. Nichos ecolgicos de importancia agrcola; actividad microbiana y
fertilidad del suelo. Rol de los microorganismos en procesos de degradacin de sistemas
acuticos con relevancia ambiental y agronmica. Metodologa comnmente utilizada para el
estudio de los microorganismos en el suelo y en el agua.

I - INTRODUCCIN
Ya en el ao 1676 Antonius van Leeuwenhoek describi la presencia de pequeos animculos
en la materia orgnica en descomposicin. Sin embargo se considera como padre de la
microbiologa del suelo a Sergei Winogradsky (1856-1953) en reconocimiento a sus muchas
contribuciones a esta emergente ciencia. Entre otras cosas descubri las bacterias nitrificadoras,
y su papel en el fenmeno de la nitrificacin. En 1888 Beijerink aisl bacterias fijadoras de
nitrgeno del gnero Rhizobium.
En el comienzo del siglo XX, la microbiologa del suelo ya estaba firmemente establecida como
ciencia, dndose mayor nfasis a la fijacin simbitica del nitrgeno, la degradacin de la
materia orgnica y a las transformaciones del nitrgeno. Asimismo, en esa poca se llevaban a
cabo esfuerzos considerables haciendo censos y recuentos de los microorganismos del suelo,
para utilizarlos como ndices de la fertilidad del suelo. Estos esfuerzos fueron vanos, ya que no
se tena en cuenta que los propgulos capaces de formar colonias en cultivo representan solo
una pequea fraccin de los microorganismos del suelo, y que adems existen otros factores que
limitan la fertilidad del suelo.
Durante el desarrollo del siglo XX se lleg al entendimiento de gran parte de los procesos
microbiolgicos que ocurren en el suelo. Hacia finales del mismo una serie de nuevos
desarrollos y tecnologas han influenciado la microbiologa del suelo. Entre los avances ms
relevantes podemos citar, por un lado, la introduccin de la computacin para el procesamiento
de la informacin y, por otro lado, el reconocimiento de la participacin de los microorganismos
en una importante cantidad de procesos ambientales. Adems, de la necesidad de tcnicas de
manejo agropecuario ms eficientes surge la aplicacin de nuevos mtodos en la agricultura,
como la labranza cero.
El desarrollo de tcnicas de ingeniera gentica es el desafo ms grande de este momento para
producir y emplear organismos con sus genomas modificados artificialmente. La utilizacin de
estos organismos en el mejoramiento del ambiente requiere un profundo conocimiento de las
caractersticas bsicas de los microorganismos del suelo.
Los nuevos microorganismos podran ser capaces no solo de realizar ms eficientemente
diferentes procesos, como la fijacin biolgica de nitrgeno y la degradacin de la materia
orgnica, sino que adems podran producirse organismos capaces de llevar a cabo el control de
pestes, o de realizar procesos como la degradacin de restos de pesticidas o insecticidas txicos
(biorremediacin).

63

II - El SUELO COMO AMBIENTE PARA LOS MICROORGANISMOS
II.1 Introduccin: el suelo como ecosistema
La microbiologa del suelo pone nfasis en las actividades metablicas de los microorganismos,
as como en su papel en el flujo de energa y en la biotransformacin de nutrientes asociados
con la productividad primaria del ecosistema. Tambin se ocupa del impacto ambiental,
favorable o desfavorable, de los organismos del suelo y de los procesos que ellos llevan a cabo.
En gran parte, la microbiologa del suelo est ligada a la bioqumica del suelo (i.e., a las
reacciones de ndole biolgica que ocurren en ste), sin embargo, se ha enfatizado cada vez ms
la importancia del aspecto ecolgico, el cual estudia las interacciones de los microorganismos
entre s y con el medio edfico.
El suelo es un ecosistema donde conviven organismos muy dismiles en estrecha dependencia.
No es posible el desarrollo de un suelo sin la presencia de microorganismos, ya que los
nutrientes quedaran retenidos en la materia orgnica sin descomponer, sin que las plantas
pudieran utilizarlos. Tampoco puede haber desarrollo de microorganismos sin la presencia de
plantas que fijan la energa solar en forma de energa qumica, hacindola disponible para los
organismos hetertrofos.
El desarrollo de microorganismos en el suelo est determinado por las condiciones fsicas del
mismo, como porosidad, humedad, pH, disponibilidad de nutrientes y de O2. Asimismo, los
microorganismos interactan con el medio fsico, alterndolo mediante procesos como la
meteorizacin (degradacin de minerales), liberacin de sustancias al medio, agregacin de
partculas, y transformacin de la materia orgnica.
Las principales limitaciones que sufren los organismos del suelo son:
La dificultad para desplazarse en un medio tan compacto debido al pequeo tamao de los
poros.
La ocurrencia de condiciones microclimticas desfavorables, como estrs hdrico, anegamiento
y anaerobiosis.
La relativamente baja cantidad de nutrientes y sustratos orgnicos fcilmente digeribles.
La actividad de la biomasa microbiana en condiciones de campo es 1.000 a 10.000 veces menor
que en condiciones de laboratorio. Esto sugiere que en el suelo los microorganismos estn
activos solamente durante perodos cortos, en un nmero limitado de micrositios. La comunidad
microbiana es una poblacin mayoritariamente latente, con una enorme riqueza de especies, que
se desarrolla solamente en condiciones favorables.
Actualmente se conoce solo una pequea fraccin de los microorganismos del suelo, debido a
que an no se han desarrollado medios sintticos en los que la fraccin restante pueda ser
cultivada.

II.2 Microorganismos del suelo

El suelo es un medio extremadamente complejo, que contiene una enorme cantidad de
microorganismos. Un gramo de suelo seco contiene aproximadamente 10
7
bacterias, 10
6

actinomicetes, 10
5
hongos, 10
5
protozoos y 10
4
algas. Describimos los principales grupos
microbianos:
Bacterias: procariticos y unicelulares, las bacterias constituyen el grupo de organismos ms
numeroso del suelo. Pueden ser hetertrofas, quimioauttrofas o fotosintticas. Llevan a
64

cabo numerosas funciones en el suelo, tales como la degradacin de la materia orgnica,
fijacin de nitrgeno y desnitrificacin. Viven en forma libre o interactuando con los
vegetales u otros organismos, pudiendo incluso ser patgenos. Entre las bacterias cultivables,
el gnero Arthrobacter es el ms abundante en los suelos agrcolas, constituyendo hasta el
40% del contenido total de microorganismos en el suelo. Otros gneros abundantes son
Pseudomonas y Bacillus.
Actinomicetes: Son organismos procariontes, filamentosos, de vida libre (Streptomyces) o
simbiontes (Frankia). Participan en la degradacin de la materia orgnica y la fijacin de
nitrgeno atmosfrico.
Hongos: Son organismos eucariontes, saprfitos o simbiontes. Tienen una estructura en forma
de micelio filamentoso. Son importantes en la degradacin de la materia orgnica. Algunos
son patgenos de importancia y otros son benficos. Entre estos ltimos se encuentran
aquellos que se asocian simbiticamente con las races y forman las micorrizas.
Cianobacterias: Son organismos procariontes fotosintticos. Pueden ser de crecimiento libre o
en asociacin simbitica con hongos o helechos, formando lquenes. Son fijadoras de
nitrgeno atmosfrico.
Estos microorganismos conviven en el suelo con numerosas especies de insectos, caros,
vermes, entre otros.
II.3 - Distribucin de los microorganismos en el suelo
La distribucin de los microorganismos en el suelo es extremadamente heterognea. Est
determinada por diversos factores, pero el factor preponderante es la presencia de materia
orgnica, que acta como fuente de energa, carbono y nutrientes. Debido a esto, la cantidad de
microorganismos disminuye con la profundidad en el perfil del suelo igual que la disponibilidad
de la materia orgnica. Esto no significa que las zonas sin aportes orgnicos no presenten
microorganismos; en el suelo tambin existen microorganismos auttrofos, cuyo metabolismo
es independiente de fuentes de carbono orgnicas. Por ende, al alejarnos de zonas con alto
contenido de sustratos orgnicos, no slo disminuir el nmero de microorganismos sino que
tambin aumentar la proporcin de auttrofos.
Para el estudio de la distribucin de los microorganismos, el perfil de suelo puede dividirse
tericamente en dos sectores: aquel no influenciado directamente por las races vegetales y el
suelo rizosfrico, en el cual los microorganismos interactan con las races vegetales. Esta
ltima zona, en la proximidad de las races vegetales, es conocida como rizosfera. La rizosfera
alberga la mayor densidad microbiana del suelo debido a que acta como hot spot
1
, con un
aporte continuo de fuentes carbonadas y de nutrientes preponderantemente de origen vegetal
(ver apartado correspondiente). En el resto del suelo, los microorganismos no estn
uniformemente distribuidos, sino que se encuentran congregados junto a los restos de materia
orgnica en descomposicin, o en los poros del suelo. En la matriz del suelo, la mayor biomasa
de microorganismos corresponde a los hongos, que se encuentran ubicados preferentemente por
fuera de los agregados del suelo, y en los poros mayores entre los agregados estabilizando los
agregados de mayor tamao (figura 1).
Las bacterias son las dominantes en nmero. Tambin se encuentran en los poros entre los
agregados pero siempre adsorbidas a la superficie de las partculas minerales u orgnicas del
suelo, por lo cual no son fcilmente separadas del suelo. Los poros pueden tener una o varias

1
El trmino hotspot en ecologa microbiana de suelos se refiere a la zona de alta actividad microbiana, en
general debida a un alto input de fuentes de carbono, energa y nutrientes.
65

entradas, y pueden estar conectados por canales. Las bacterias se pueden encontrar como clulas
aisladas, pero lo ms frecuente es que se encuentren en pequeas colonias de un solo tipo de
clulas (especialmente, entre las cultivables, Bacillus y Arthrobacter sp.). Algunas veces las
bacterias pueden estar completamente recubiertas por polisacridos y por laminillas de arcilla,
formando microagregados menores de 20 m.

II.4 - Factores que determinan la distribucin de los microorganismos en el suelo
Adems de la vegetacin, son las caractersticas fsicas y qumicas del suelo las que determinan
la distribucin de los microorganismos en el perfil. Entre ellas podemos citar:
La atmsfera del suelo: La composicin de la atmsfera del suelo es un factor determinante
para la actividad de los microorganismos. Los gases ms abundantes en este ambiente son el N
2
,
O
2
y el CO
2
. Otros gases provenientes de la actividad microbiana, como los xidos de nitrgeno,
el H2, etc., pueden estar presentes, aunque desaparecen rpidamente por su reactividad con los
componentes del suelo. En suelos bien aireados, la concentracin de O
2
oscila entre 18-20%, y
la de CO
2
entre 1-2%. Sin embargo, en un suelo arcilloso con contenido alto de humedad la
concentracin de CO
2
puede alcanzar al 10%. La difusin de los gases en el suelo sigue la ley
de Fick:
q
i
= Dsa
i
.c
i
/z
i

Donde: q
i
es la velocidad de difusin (g cm
-2
seg
-1
) del gas, Dsa
i
es la constante de difusin en el
suelo (cm
-2
seg
-1
), c
i
la concentracin del gas en la atmsfera del suelo (g cm
-3
), y z
i
la
profundidad (cm).

Los parmetros que rigen la difusin de los gases en el suelo van a ser afectados por
condiciones edficas, como la textura, y la cantidad de macro y microporos, y especialmente por
el contenido de agua. Los macroporos mayores a 10 m en dimetro permiten la rpida difusin
del aire y la infiltracin y drenaje del agua. Se considera que para tener una buena aireacin el
suelo no debe tener menos del 10-15% de los macroporos ocupados por aire. Los microporos
(<10 m) son importantes para la retencin del agua disponible para las plantas y para la
provisin de un hbitat acuoso para los microorganismos. Los microporos menores a 5 m, en
Figura 1. Modelo de un agregado de suelo. Adaptado de Paul y Clark (1989).

66

general, no son hbitat para la mayora de los microorganismos y pueden ser muy pequeos
para sus exoenzimas.
El O2 en el aire o en el agua del suelo puede ser consumido en pocas horas por los
microorganismos pero al mismo tiempo, ser repuesto por difusin. Si la difusin del O2 en el
suelo se haya restringida debido a un anegamiento, a alta proporcin de arcilla o compactacin
del mismo, las condiciones sern anaerbicas. La actividad microbiana depender de la
disponibilidad de otros aceptores de electrones, diferentes al O2. Este cambio en los aceptores de
electrones promueve la reduccin de varios elementos importantes en el suelo, entre ellos el
nitrgeno, manganeso, hierro y azufre, en procesos conocidos como respiracin anaerbica y
metanognesis del CO2. El cambio de metabolismo aerobio a anaerobio se produce con
concentraciones de O
2
menores a 1%. La actividad de los organismos aerbicos y facultativos
es dominante en suelos bien drenados, mientras que al reducirse la concentracin de O2 aumenta
la actividad de los anaerobios obligados y fermentadores.
La aireacin total del suelo no es tan determinante como la aireacin de los agregados
individuales. La ocurrencia de procesos anaerobios como la desnitrificacin y la reduccin del
sulfato (respiracin anaerobia) en suelos bien aireados esta indicando que existen micrositios
con condiciones anaerbicas. Otra prueba de la existencia de micrositios anaerobios es la
presencia de bacterias anaerbicas como Clostridium en los estratos superiores del suelo.

Estructura del suelo: Es fundamental para la actividad de los microorganismos. La materia
orgnica no se degrada si no hay contacto fsico con los microorganismos. sta se acompleja
con la arcilla formando agregados de diferentes tamaos, dejando poros entre ellos. La mayora
de los organismos del suelo se encuentran sobre el lado externo de los agregados, slo unos
pocos residen dentro de los agregados y corresponden a aqullos que quedaron atrapados
adentro cuando el agregado se form. Fotografas de microscopia electrnica y clculos de
densidad microbiana indican que los microorganismos ocupan menos del 1% del espacio poroso
total. Los poros de unos pocos micrones estn llenos de agua y son colonizados por bacterias, ya
que en estos hbitats van a encontrar suficiente humedad y materia orgnica para su desarrollo.
Los hongos, por su tamao y debido a la formacin de micelios, invaden los poros mayores.
Estos juegan un rol muy importante en la formacin y mantenimiento de la estructura del suelo
cementando agregados (figura 1). Similarmente, las bacterias secretan muclagos y gomas
bacterianas, a las cuales se unen las arcillas, formando y estabilizando los agregados.
Caractersticas de las arcillas: La adhesin de los microorganismos a las arcillas modifica
varios aspectos de sus funciones biolgicas. Las arcillas al igual que las bacterias poseen cargas
negativas en sus bordes. Sin embargo, debido a la presencia de mucigel y extensiones de las
paredes celulares llamadas fibrillas ocurre la adsorcin de las bacterias a las arcillas del suelo.
Las cargas de las arcillas tambin pueden tener importancia en regular el pH en determinados
microclimas, ya que les confieren capacidad buffer. Por otro lado, la materia orgnica tambin
se cubre de laminillas de arcilla, hacindola entonces inaccesible a los microorganismos,
impidiendo su degradacin (estabilizacin).
Potencial agua: En general se encuentra una buena correlacin entre el potencial agua y el
nmero y actividad de los microorganismos. La actividad microbiana disminuye en forma lineal
con la reduccin del potencial agua, siendo extremadamente baja por debajo de -10 MPa y con
un valor lmite de -40 MPa. Sin embargo los valores de potencial agua de los suelos agrcolas se
encuentran entre la saturacin y los -4.5 MPa. Los niveles ms altos de respiracin microbiana,
nitrificacin y mineralizacin ocurren cuando el contenido de agua del suelo se mantiene en el
mximo posible sin que disminuya la aireacin. Esto ocurre cuando el suelo se encuentra
67

aproximadamente 60% de la capacidad de retencin de agua. En la mayora de los suelos este
valor oscila entre -0,01 a -0,03 MPa.
El efecto del potencial agua es diferente segn los diferentes tipos de microorganismos. Las
bacterias son ms sensibles a un potencial de agua bajo que los hongos y los actinomicetes. La
mayora de los hongos pueden crecer sin inconvenientes a tensiones mayores a -1.5 MPa. Por
otro lado, cada especie de microorganismo tiene un potencial agua mximo y mnimo para su
crecimiento.

pH: El pH afecta en forma importante el desarrollo de los microorganismos. Los hongos se
desarrollan preferentemente en hbitats de pH cidos, en tanto que las bacterias y los
actinomicetes se desarrollan mejor en pH alcalinos (figura 2). Sin embargo, esto no implica que
no se encuentren bacterias en suelos cidos, o que no se encuentren hongos en suelos alcalinos.
El pH del suelo incide en numerosos factores que afectan a la actividad microbiana, por
ejemplo, en la solubilidad e ionizacin de constituyentes orgnicos e inorgnicos presentes en la
solucin del suelo, afectando las actividades enzimticas. A modo de ejemplo se puede citar a la
nitrificacin como una de las biotransformaciones ms sensibles al pH. Sin embargo, en suelos
de bosque con valores de pH menores a 4 se ha detectado nitrificacin, a pesar de que in vitro
este proceso no ocurre a valores de pH por debajo de 6. Esto se explica, en parte, por la
existencia de micrositios, donde la descomposicin de la materia orgnica podra liberar NH3, el
cual al formar NH4
+
alcaliniza el medio, desarrollndose un pH adecuado para la nitrificacin.
Otra explicacin para la nitrificacin a pH cido, en ambientes acuticos y suelos, es el
descubrimiento de la presencia de arqueobacterias nitrificadoras con sistemas enzimticos
menos sensibles al pH (Lehninger, 1978).

Figura 2. Efecto del pH del suelo sobre la densidad de
microorganismos.
Adaptado de Frioni (1990).

Adaptado de Frioni, 1990.
68

Temperatura: El aumento de la temperatura, dentro de ciertos lmites, incrementa la
mineralizacin o descomposicin de la materia orgnica por acelerar las reacciones enzimticas
y la difusin de los sustratos solubles en el suelo. Sin embargo, mientras que la velocidad de
difusin molecular aumenta con el aumento de la temperatura, la solubilidad de los gases en la
solucin del suelo no, y an puede disminuir haciendo ms lenta la actividad microbiana. Una
temperatura baja reduce la velocidad de las reacciones enzimticas y hasta las detiene, en tanto
que una muy alta desnaturaliza las enzimas. Existen estudios que han demostrado que 10C de
aumento de la temperatura de 15 a 25C puede aumentar tres veces la tasa de mineralizacin de
C y N del suelo. El aumento en las actividades biolgicas a mayores temperaturas
probablemente se deba al cambio en la estructura de la comunidad microbiana
En general, la mayor actividad microbiana en los suelos se verifica entre 20 y 40C, aunque
existen microorganismos que toleran temperaturas extremadamente altas, entre 45 a 65C, y
algunos termfilos obligados son incapaces de crecer por debajo de 40C.
La actividad microbiana en los suelos es ms lenta a temperaturas por debajo de 5C. Sin
embargo, se ha registrado actividad microbiana incluso en suelos con temperaturas menores a
0C. Los organismos psicrfilos son capaces de crecer a bajas temperaturas porque ajustan la
concentracin osmtica de sus constituyentes citoplsmicos, manteniendo de este modo su
citoplasma sin congelar. Muy pocos suelos mantienen una temperatura uniforme en sus estratos
superficiales a lo largo del da y mucho menos del ao. Los suelos con mayor contenido de
humedad estn menos sujetos a variaciones diurnas de la temperatura que los suelos secos
debido al alto valor de calor especfico del agua. La orientacin de la pendiente (al sur versus al
norte), el sombreado, la cobertura vegetal determinan la radiacin solar efectiva que recibe el
suelo y, consecuentemente, su calentamiento.
Potencial redox: Los organismos vivos obtienen su energa de la oxidacin de materiales
reducidos. El material ms reducido de la biosfera es la materia orgnica presente en la biomasa
viva. Los microorganismos del suelo generan electrones durante las reacciones metablicas de
oxidacin de la materia orgnica, y esos electrones deben ser transferidos a un aceptor, siendo el
O2 atmosfrico el principal aceptor de electrones en suelos aerbicos, bien drenados.
El potencial redox (EH) provee una medida del estado de aireacin del suelo. Es una medida de
la disponibilidad de electrones como resultado de una transferencia de los mismos entre un
compuesto oxidado y uno reducido. Los valores de EH permiten predecir cul ser el producto
ms probable de una reaccin biolgica. Por ejemplo, el N2O puede producirse de la
nitrificacin bajo condiciones aerbicas y de la desnitrificacin bajo condiciones
moderadamente reductoras, donde la intensidad de la reduccin no es lo suficientemente fuerte
como para que el nitrato se reduzca completamente a N2.
A cada reaccin de oxidacin (remocin de uno o ms electrones) corresponde una reaccin de
reduccin (aceptacin de electrones). Las sustancias involucradas o los pares de cada reaccin
redox pueden ser orgnicos o inorgnicos y varan en sus tendencias a transformarse en
oxidadas o en reducidas. Los electrones se mueven a lo largo de una cadena de transportadores
hacia aceptores como el O
2
, que es el aceptor de electrones por excelencia. Sin embargo, otros
aceptores pueden ser reducidos si el organismo tiene el sistema enzimtico apropiado. El O2 y el
NO3
-
sirven como aceptores de electrones a valores de EH de 350 a 400 mV y mayores. Cuando
la concentracin de ambos en la solucin del suelo cae, a EH de 0 a 350 mV, el Mn
2+
y el Fe
3+

sirven como aceptores de electrones, comenzando a 350 mV el Mn y a 250 mV el Fe, hasta
aproximadamente 100 mV. La reduccin del sulfato puede ocurrir a valores de EH tan altos
como 350 a 100 mV. La produccin de metano comienza cuando el EH alcanza valores de 100
mV. Las reducciones de Mn, Fe y SO4
2-
ocurren en un rango ms amplio de potenciales redox
que las reducciones del O2 y NO3
-
y la produccin de metano.

69

De todas maneras los electrones de las sustancias reducidas son movidos a lo largo de la cadena
de transporte respiratorio en una sucesin de pasos o reacciones intermediarias. Cuanto mayor
sea la diferencia entre los potenciales de la sustancia donante y la aceptora, mayor ser el
potencial de produccin de energa por los sistemas biolgicos.
En la tabla 1 se muestran las principales reacciones redox que ocurren en los suelos y los
potenciales redox para esas transformaciones. Estas sern estimuladas o inhibidas de acuerdo
con el potencial redox del suelo. Frecuentemente en el suelo ocurren dos o ms reacciones redox
simultneamente, por lo tanto una medida del potencial redox reflejar una mezcla de
potenciales.
El monitoreo del potencial redox del suelo es una prctica comn en campos de arroz. Estos
campos constituyen un ambiente particular, el cual permite estudiar la relacin entre el EH de los
suelos y la emisin de gases con efecto invernadero, debido a las prcticas de riego y drenaje
controladas que se realizan. Los campos de arroz inundados son una fuente importante de
metano, durante el ciclo de inundacin, y de N2O cuando son drenados. Las prcticas de manejo
en producciones arroceras deben adecuarse para no producir cantidades importantes de esos dos
gases. Existe una ventana de valores de EH en esos campos, entre 200 a -100 mV en la cual se
verifica el potencial mnimo de contribucin al calentamiento global de los arrozales.

Tabla 1. Potenciales redox de algunos pares de oxido-reduccin con importancia en
los suelos (Paul, 2007)
Forma oxidada Forma reducida EH aproximado (mV)
Oxgeno O2 H2O +600 a +400
Nitrgeno NO3
-
N2O, N2, NH4
+
+250
Manganeso Mn
4+
Mn
2+
+225
Hierro Fe
3+
Fe
2+
+100 a -100
Azufre SO4
2-
S
2-
-100 a -200
Carbono CO2 CH4 < -200
Los pares redox estn ordenados del oxidante ms fuerte (potencial ms positivo) al
reductor ms fuerte (potencial ms negativo).
II.5 - La rizosfera
Como ya se explic, la rizosfera comprende la regin de la interfase raz-suelo. Es un ambiente
extremadamente particular debido a los efectos que la raz produce en el suelo adyacente.
Debido a que las races son la principal fuente de energa, carbono y de otros nutrientes para los
microorganismos, se dice que la regin del suelo que rodea las races es un verdadero oasis en
el desierto (Bertin et al. 2003). Las caractersticas qumicas y biolgicas de esa zona son muy
diferentes al resto del suelo. Por ejemplo, la acidez en la rizosfera puede ser hasta 10 veces
mayor que en el suelo no sujeto a la influencia de las races (Bertin et al. 2003).
En la literatura se suelen distinguir tres regiones: el rizoplano, que comprende la superficie de
la raz; la endorrizosfera o interior de la raz, y la rizosfera propiamente dicha. Este ltimo
trmino se usa para referirse a la zona de suelo prxima a la raz y que se ve directamente
afectada por ella. En general puede abarcar el suelo comprendido desde la superficie radical
hasta aproximadamente 3 mm. Sin embargo, esto depende primordialmente de las
caractersticas de la raz y del ambiente creado por ella debido al aporte de fuentes carbonadas.
70

En la prctica, una forma de separar el suelo rizosfrico del no rizosfrico es descalzar la planta
y sacudir a mano el sistema radical. La fina capa de suelo que queda adherida a la raz se define
como rizosfera.
Como ya se destac, la rizosfera se caracteriza por la abundancia de compuestos orgnicos
provenientes de los pelos radicales y las races primarias y secundarias en activo crecimiento.
Estos compuestos son parte de diferentes sustancias:
1. Exudados: Son compuestos de bajo peso molecular, como aminocidos, azcares, cidos
orgnicos, o iones como HCO3
-
y H
+
. Estos compuestos difunden al suelo a travs de la
membrana celular de las clulas radicales en forma pasiva.
2. Secreciones: Estn formadas por compuestos de alto y bajo peso molecular que resultan de
procesos metablicos especficos. Pueden ser enzimas de diferentes tipos, sustancias de accin
antibitica, nematicidas, fitohormonas, fitoalexinas, etc. A diferencia de los exudados, estos
compuestos son liberados a la rizosfera por transporte activo. La secrecin de sustancias
especficas permite a la raz tener un cierto control de la biota de la rizosfera, inhibiendo el
desarrollo de organismos patgenos, y estimulando el desarrollo de organismos benficos.
3. Muclagos: Son polisacridos secretados por la raz o por los microorganismos que habitan
la rizosfera. Pueden ser de varios tipos:
a) Secretados por la caliptra: Sirven de lubricantes en la zona de crecimiento, donde la
friccin entre el suelo y la raz es mxima. Contienen restos de clulas muertas de la
caliptra. En general, la vida media de estas clulas es de un da.
b) Secretados por la epidermis: Las clulas epidrmicas componen la capa delgada ubicada
por detrs de la caliptra. Estas secreciones contiene productos provenientes de hidrlisis de
la pared celular.
c) Lisados celulares.
Todos estos materiales, mezclados con arcillas y colonizados por microorganismos constituyen
el mucigel. Este tiene un rol relevante en el mantenimiento de la estructura del suelo pues su
abundancia favorece la formacin de los complejos entre la materia orgnica y las partculas
minerales del suelo.
Los muclagos son polisacridos muy hidratados, y poseen numerosos grupos carboxilos, con
cargas negativas, unindose a las arcillas a travs de cationes multivalentes (Ca
2+
, Mg
2+
). La
cantidad de compuestos carbonados secretados de esta manera por la raz es muy abundante,
pero es muy difcil de cuantificar, dado que se confunde rpidamente con el resto de los
compuestos carbonados del suelo. Una forma de medirlo es suministrar a la planta
14
CO2 para su
fotosntesis, y medir posteriormente la radioactividad en el suelo. Se estima que entre el 10-13%
del C fijado por fotosntesis pasa al suelo, incluyendo la respiracin radical y bacteriana. Esto
constituye aproximadamente un 2% de la materia orgnica del suelo.
Adems de secretar sustancias carbonadas, la raz altera el suelo adyacente de diferentes
maneras. La activa respiracin radical consume gran parte del O2 el suelo, produciendo un
microclima de condiciones microaeroflicas. Debido a la transpiracin de la planta, la raz
absorbe una gran cantidad de agua del suelo adyacente, por lo tanto en la rizosfera existe menor
disponibilidad de agua que en el suelo libre. La absorcin de nutrientes por la raz tambin
cambia la composicin del suelo rizosfrico con respecto al suelo libre. Asimismo, la excrecin
de H
+
u OH
-
modifica el pH. Todo esto hace que, como ya se mencion, la poblacin
microbiana de la rizosfera sea diferente a la del suelo libre.

71

II.5.1 - Microbiologa de la rizosfera
Las interacciones planta-microorganismos que se verifican en la rizosfera pueden afectar de
manera positiva el crecimiento vegetal a travs de mltiples mecanismos. Entre ellos, la fijacin
de nitrgeno atmosfrico, el aumento en la tolerancia a estrs bitico y abitico, y los efectos
directos o indirectos debidos a las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal. Las
bacterias tambin producen biofilms que sirve de proteccin y actan como controladores
biolgicos de potenciales patgenos, produciendo antibiticos. Adems pueden degradar
compuestos txicos producidos por plantas u otros microorganismos, los cuales de otro modo
perjudicaran al crecimiento vegetal. Sin embargo, existen tambin microorganismos que
pueden tener efectos perjudiciales sobre la salud y supervivencia de las plantas, tales como los
patgenos o parsitos.

La colonizacin de la raz es el primer paso para una asociacin benfica o patognica con los
microorganismos. El efecto rizosfrico descrito por primera vez por Hiltner en 1907
(Srensen 1997), asume que los microorganismos son atrados por los nutrientes exudados por
las races. Este autor observ que el nmero y la actividad de los microorganismos aumentan en
la vecindad de las races de las plantas. Adems de los compuestos carbonados, las races
inician una comunicacin con el entorno a travs de seales qumicas que son reconocidas por
los microorganismos (fenmeno de quorum sensing).
Si bien, la cantidad de bacterias cultivables sobre el rizoplano es muy elevada, solamente un 5 a
10% de la superficie de la raz est cubierta por microorganismos. A medida que aumenta la




Raz Suelo












20 mm
Clulas epiteliales y corticales lisadas e invadidas con microorganismos
Pelo Radical

Microorganismos con muclagos vegetales y microbianos
dispersos en el suelo
Compuestos de bajo peso molecular liberados de clulas
vegetales intactas en forma pasiva (Exudados) y activa
( Secreciones)
OO
O
000
0
Clulas de la caliptra liberadas al medio
Caliptra y pice radical

Figura 3. Esquema del origen de las distintas fuentes carbonadas (rizodeposicin)
encontradas en la rizosfera. Fuente: Maddonni et al., 2003.
72

distancia desde la superficie de la raz, el nmero de microorganismos disminuye. La tabla 2
muestra datos de la rizosfera de lupino donde se destacan los principales grupos microbianos
que podemos encontrar y su nmero en relacin con la distancia desde la raz.
Las bacterias que habitan la rizosfera son de mayor tamao que las del suelo libre y con un
mayor contenido de carbohidratos de reserva. Estas bacterias son predominantemente Gram
negativas, aunque tambin hay Gram positivas. Las colonias bacterianas estn separadas unas de
otras por sus propios polisacridos extracelulares, o por capas de arcillas compactadas.
La concentracin de microorganismos en la rizosfera, as como su tipo, depende de numerosos
factores. Es ms importante para la composicin de la rizosfera la especie vegetal de que se
trate, que el tipo de suelo. La tabla 3 muestra que el efecto rizosfrico es mucho mas marcado en
especies nativas que en las cultivadas.














II.5.2 - Coeficiente rizosfrico (R/S)
Es el cociente entre el nmero de microorganismos en la rizosfera y el nmero de
microorganismos en el suelo no rizosfrico. Un R/S igual a 1 indica que la cantidad de
microorganismos es igual en ambos ambientes. Si el R/S es mayor a 1, el nmero de
microorganismos es mayor en la rizosfera que en el ambiente no rizosfrico. Esta informacin
aplicada a un grupo taxonmico o funcional en particular puede indicar la preferencia de ste
grupo por el ambiente rizosfrico. Tambin se da el caso en el que el ambiente rizosfrico
resulta muy competitivo pese a sus condiciones ambientales propicias, por lo cual ciertos
microorganismos pueden presentar mayor crecimiento en el suelo no rizosfrico, generando un
coeficiente R/S inferior a 1.

Tabla 3. Efecto de la especie vegetal sobre la composicin de la rizosfera
(Elliot et al., 1984)
ESPECIE N colonias por gramo de suelo R/S*
Tabla 2. Composicin de la rizosfera de Lupinus sp. (Elliot et al., 1984)
Distancia desde
la raz (mm)
Nmero de microorganismos (10
3
g suelo seco
-1
)
Bacterias Actinomicetes Hongos
0 159.000 46.700 355
0-3 49.000 15.500 176
3-6 38.000 11.400 170
9-12 37.400 11.800 130
15-18 34.170 10.100 117
>80 27.300 9.100 91
73

Rizosfera Suelo
Trifolium pratense 3260 34 4
Avena sativa 1090 84 6
Linum usitatissimum 1015 185 5
Zea mays 614 184 3
Atriplex babingtonii 23,3 0,016 1455
Ammophila arenaria 3,58 0,016 223
Agropyron junceum 3,56 0,016 222
* Coeficiente rizosfrico

Las condiciones edficas tambin influyen sobre la composicin de la rizosfera, ya que la
presencia de nutrientes es un determinante importante. Una deficiencia de Ca
2+
o K
+

desestabiliza las membranas de las clulas radicales, incrementando la exudacin de azcares y
compuestos orgnicos y, en consecuencia, el nmero de microorganismos. Las condiciones de
anaerobiosis y de exceso hdrico tambin alteran la capacidad de regular la permeabilidad de las
membranas de las plantas, aumentando el flujo de sustancias carbonadas hacia la rizosfera. En
general, esas condiciones favorecen el desarrollo de microorganismos patgenos para las
plantas.
La aplicacin de fertilizantes nitrogenados tiene efectos poco predecibles sobre la exudacin
radical y su relacin con la actividad y el crecimiento microbiano en la rizosfera. Se ha
observado que el agregado de nitrgeno en plantas jvenes de cebada aument la exudacin
radical y ello result en una mayor abundancia de bacterias en las races seminales, mientras que
en cultivares de trigo no aument la produccin de exudados pero s se vio estimulado el
crecimiento bacteriano debido, sobre todo, a una mayor utilizacin de los exudados existentes
(Srensen, 1997). Por otra parte, en suelos no fertilizados, la baja disponibilidad de nutrientes
minerales (amonio, nitrato, fosfatos) puede limitar el uso que hagan los microorganismos de los
compuestos carbonados liberados por las races. En esos casos las plantas pueden ejercer dos
efectos contrapuestos sobre los microorganismos: la estimulacin, debida a la liberacin de
sustratos orgnicos y la inhibicin, debido a la utilizacin de los nutrientes minerales por las
plantas. En este ltimo caso, los nutrientes no podrn ser aprovechados para el crecimiento
microbiano (Srensen, 1997).

II.5.3 - Composicin de la rizosfera
En el pasado, el cultivo de los microorganismos del suelo en medios de laboratorio ha sido la
base para los estudios de las poblaciones microbianas de la rizosfera. Sin embargo, por esta
metodologa, solamente se pone en evidencia menos de un 10% de la poblacin bacteriana
presente. La flora hetertrofa cultivable de la rizosfera est representada principalmente por
bacterias Gram negativas de los gneros Pseudomonas y Achromobacter. Una menor
proporcin representan bacterias Gram positivas como Bacillus y Arthrobacter. Tambin
podemos encontrar microorganismos auttrofos, como las bacterias nitrificadoras, aunque stas
constituyen menos del 5% de los microorganismos del suelo.
Otros habitantes de la rizosfera y endorizosfera son bacterias fijadoras de nitrgeno, como
Rhizobium y Azospirillum. Adems, podemos encontrar hongos micorrticos asociados a las
races. Los microorganismos que colonizan la rizosfera pueden provenir de la poblacin que
colonizaba la semilla y que sobrevivi al almacenaje y germinacin de la misma y/o de la
74

poblacin presente en el suelo. En la tabla 4 se muestra la abundancia relativa de diferentes
grupos de rizobacterias cultivadas a partir de las races de cebada y trigo.
Varios estudios indican que la diversidad de especies de la poblacin indgena del suelo
determinar la composicin de la microflora de la rizosfera. Sin embargo, debe tenerse en
cuenta que los grupos dominantes que cultivamos dependern del medio de cultivo que usemos
para hacer los aislamientos. Tambin se observan variaciones estacionales, ya que la actividad
de los microorganismos del suelo vara con la temperatura, el contenido de agua y de nutrientes.


Tabla 4. Abundancia relativa (porcentaje del recuento total) de diferentes grupos de
rizobacterias en races de cebada (Hordeum vulgare) y trigo (Triticum aestivum)
(Srensen, 1997)

Cebada Trigo
No tratada
Esterilizada No tratada Esterilizada
Pseudomonas 34 53 46 52
Enterobacterias - 16 4 23
Otras Gram (-) - 18 - 8
Coreniformes 61 13 50 16
Formadoras de esporas 5 - - 2
La poblacin de las races no tratadas representa a las bacterias de la rizosfera y la de las
races esterilizadas superficialmente a las de la endorrizosfera. Los datos se obtuvieron a partir
de recuentos de UFC en placas con medio agarizado.

II.5.4 - Interacciones en la rizosfera
Los microorganismos interactan entre s, con su entorno y con las plantas. Las interacciones
entre las bacterias de la rizosfera y la planta pueden ser benficas, dainas o neutras para la
planta. Las bacterias que producen beneficios a las plantas son de dos tipos: aquellas que son
simbiticas, o aquellas que son de vida libre, aunque vivan sobre, o a veces dentro de la raz.
A las bacterias benficas de vida libre se las conoce comnmente como bacterias promotoras del
crecimiento de las plantas (PGPR, de su sigla en ingls Plant Growth Promoting
Rhizobacteria). Especies de varios gneros han sido includos en esta categora, tales como
Azotobacter, Azospirillum, Acetobacter, Bacillus, Burkholderia, Pseudomonas y tambin
rizobios, pero solamente cuando actan sobre plantas diferentes a su simbionte especfico.
Las PGPR pueden afectar el crecimiento de dos maneras, directa o indirectamente. Uno de los
mecanismos directos es el suministro de nutrientes a las plantas, como el nitrgeno fijado por
Azospirillum (Cassan y Garca de Salamone, 2008) o hierro, por bacterias productoras de
siderforos (Pseudomonas). Este ltimo mecanismo tambin involucra el secuestro del hierro
del medio, evitando su consumo por parte de los patgenos (mecanismo indirecto). Otra
manera, es estimular la absorcin de nutrientes por la planta, por ejemplo, la secrecin de cidos
por parte de las bacterias permite la solubilizacin de los fosfatos del suelo, hacindolos
disponible. Otra manera directa es secretando las hormonas reguladoras de crecimiento
(auxinas, giberelinas y citoquininas) estimulando as el incremento de biomasa radical de la
planta. Este mecanismo permite una mejor absorcin de nutrientes y del agua del suelo.
75

Entre los mecanismos indirectos de promocin de crecimiento el ms efectivo es la liberacin
de sustancias antibiticas por parte de los PGPR, lo cual evita la proliferacin de fitopatgenos.
Un buen ejemplo es Bacillus amyloliquefaciens, una bacteria capaz de controlar un amplio
espectro de patgenos secretando sustancias antifngicas, como iturina y surfactina (Souto et
al., 2004).
76

III - EL AGUA COMO AMBIENTE PARA LOS MICROORGANISMOS
III.1 - Introduccin
Un poco ms del 70% de nuestro planeta est cubierto por agua. De su volumen total una
enorme proporcin forma parte de los ocanos y slo menos del 3% corresponde a aguas dulces,
de mayor calidad y aptitud para el uso y consumo humano. El agua, adems de ser fundamental
en el funcionamiento vital de los organismos, posee propiedades qumicas y fsicas nicas:
estado lquido en un amplio rango de temperaturas, alta capacidad calorfica, capacidad de
humectacin y alta tensin superficial. Estas propiedades le otorgan un rol esencial en procesos
como regulacin trmica, accin capilar, disolucin y transporte de partculas, entre otros.
Adems, el agua acta como hbitat para una gran diversidad de especies y, de hecho, es
probable que haya sido el lugar de origen de las primeras formas de vida.
As como el hbitat terrestre se divide en biomas, que a su vez estn compuestos por distintos
ecosistemas, los ambientes acuticos se agrupan segn su contenido de sales disueltas en dos
grandes zonas de vida acutica: zonas de agua dulce y de agua salada o marinas. La salinidad
del agua es el determinante principal del tipo de organismos presentes y, dentro de cada zona, es
de fundamental importancia el movimiento del agua y la profundidad en la columna, la cual
determina en ltima instancia otras caractersticas del ambiente, tales como la temperatura, el
contenido de oxgeno disuelto, la cantidad y calidad de luz y la disponibilidad de nutrientes. Por
estas caractersticas diferenciales surgen, dentro de cada zona, los ecosistemas acuticos, los
cuales poseen un funcionamiento anlogo al de los terrestres, con productores primarios al
inicio de la cadena trfica y diversos hetertrofos que conforman los sucesivos eslabones. Los
microorganismos son componentes clave de las cadenas trficas acuticas.

III.2 Microorganismos acuticos
En los cuerpos de agua habitan diversos microorganismos principalmente del grupo de las
bacterias y algas, pero tambin protozoos, virus y hongos microscpicos. En un ambiente
acutico pueden encontrarse microorganismos indgenas, caractersticos del cuerpo de agua; u
otros provenientes del aire, suelo o efluentes, que habitan el agua en forma transitoria o
intermitente. Como ya se mencion y tal como ocurre en los hbitats terrestres, en los ambientes
acuticos los microorganismos son componentes clave. Por un lado, son los principales
productores primarios; es decir, en la mayora de los casos son los organismos fototrficos
predominantes. En las zonas oxigenadas estos microorganismos fototrficos estn representados
principalmente por cianobacterias y algas, mientras que en las zonas anxicas dominan las
bacterias fototrficas anoxignicas. Por otro lado, los microorganismos son los consumidores
ms importantes, lo cual los convierte, al igual que en el ecosistema edfico, en la base de las
cadenas trficas acuticas, actuando como recicladores de la materia orgnica y, en
consecuencia, liberando nutrientes para la utilizacin por parte de otros organismos.
En cuanto a los hongos, stos raramente son planctnicos aunque s pueden actuar como
parsitos de algunas algas planctnicas, ejerciendo un control sobre su crecimiento y, por ende,
regulando el nivel de turbidez que restringe la penetracin de la luz. Algunos hongos poseen un
estilo de vida simple, colonizando superficies y muchas veces formando cspedes fngicos;
otros, como Zoophagus insidians, habitan algas verdes filamentosas a la vez que ramifican y
extienden sus hifas en la columna de agua con el objetivo de alimentarse de rotferos
2
. Los

2
Las hifas de este hongo, de gran longitud, detectan el tacto de las cilias de los rotferos y responden secretando una
sustancia que les permite adherirse a ellos. Luego, la hifa crece rpidamente dentro de la boca del rotfero
formando un micelio que absorbe el contenido de su cuerpo.
77

virus, por su parte, pueden ser muy abundantes en aguas dulces, pudiendo utilizar como
hospedantes a bacterias, cianobacterias y microalgas. Tanto la dinmica poblacional como la
composicin del plancton estn sometidos a la influencia de los virus (20-50% de la mortalidad
del bacterioplancton se debe a lisis inducida por virus). La densidad de la poblacin viral tiende
a fluctuar con la poblacin de sus hospedantes, y su abundancia puede exceder la del
bacterioplancton. Los virus que afectan al bacterioplancton varan en su especificidad. Los
protozoos tambin son importantes predadores de microorganismos acuticos, principalmente
de bacterias y algas. En consecuencia, su densidad poblacional responde a los cambios en
abundancia de esos dos grupos microbianos. El nmero de protozoos es varias veces menor al
de bacterias pero, dado que cada protozoo consume cientos de algas y bacterias por da, son
capaces de afectar su densidad poblacional. Por lo antedicho, puede asumirse que tanto
protozoos como virus son importantes en la regulacin de la densidad de algas y bacterias,
favoreciendo un balance poblacional en los ecosistemas de agua dulce.

III.3 Distribucin de los microorganismos en el agua
Los microorganismos acuticos se presentan comnmente en suspensin, en sedimentos o
formando films o capas, siendo mayor su densidad en las capas superiores y los sedimentos del
fondo. Ocupan diferentes hbitats que se detallarn a continuacin: perifiton, bentos, neuston y
plancton. Los organismos del perifiton (del gr. peri: alrededor de, y fytn: vegetal) o aufwuchs
(del alemn: crecimiento en superficie o sobrecrecimiento) crecen arraigados a rocas,
vegetacin y detritus sumergido. Los microorganismos se presentan generalmente en biofilms
3

mixtos de algas, bacterias y hongos, aunque sus representantes ms comunes son diatomeas
pinnadas, algas verde-azuladas y algas verdes filamentosas. Con excepcin de las algas verdes
filamentosas, el perifiton puede desplazarse activamente por el sustrato, ya sea por reptacin o
por deslizamiento. Su ciclo de vida est sujeto a la vida del elemento sobre el cual viven,
pudiendo entonces ser estacional, como el perifiton que vive sobre las plantas, de rpido
crecimiento y poco adherido (principalmente diatomeas y otras algas), o estable, en caso de
habitar un sustrato como piedras o restos de madera. Conviven con protozoos y varios animales
pequeos, algunos de los cuales, como caracoles y larvas de insectos, regulan su produccin de
biomasa mediante la predacin.
En el bentos (del gr. vnthos: fondo del mar)
los organismos habitan el fondo del cuerpo de
agua, ya sea superficialmente (epibentos) o
penetrando en su interior (infauna). Esta zona
de transicin entre la columna de agua y la
zona sub-superficial est constituida por una
masa no consolidada de agua, materia
orgnica y minerales particulados, resultado
de la deposicin de sedimentos. La alta
concentracin de nutrientes y materia
orgnica deriva en una alta poblacin y
actividad microbiana heterotrfica, siempre
que otras condiciones (principalmente
temperatura y presin) lo permitan. Esto,
sumado al eventual efecto de la profundidad, lleva a que generalmente existan limitantes de

3
Biofilm: asociacin superficial de microorganismos fuertemente aferrados gracias a que producen una matriz
extracelular de polmeros. En la mayora de los casos los biofilms se forman en un entorno acutico o hmedo.
Figura 4. Algunas diatomeas bentnicas
Foto: Yoichi Kogure.
http://web.vims.edu/bio/shallowwater/benthic_com
munity/microbes.html
78

oxgeno y se alternen ambientes aerbicos y anaerbicos, sosteniendo una importante diversidad
metablica. En el bentos predominan las diatomeas (figura 4), e invertebrados filtradores como
esponjas y bivalvos. Tambin se encuentran presentes algunas cianofitas y algunas algas verdes
como las del orden Chroococcales.
Al igual que en el perifiton, en el
neuston conviven seres tanto
macro- como microscpicos, estos
ltimos son principalmente algas
unicelulares, bacterias y protozoos.
Estos organismos habitan la
superficie de cuerpos de agua dulce
o salada, movindose o
mantenindose a flote sobre ella
(epineuston) o inmediatamente por
debajo (hiponeuston). As, forman
una capa en los primeros
milmetros de la columna de agua
(figura 5), conformando un hbitat
muy variable que incluso ha sido
calificado como un ambiente
extremo. Esto se debe a que la
interfaz entre el agua y el aire est sujeta constantemente a fuerzas fsicas (e.g.,
microturbulencias
4
) que modifican su estabilidad y las reacciones qumicas que all ocurren. El
neuston absorbe una importante fraccin de la luz incidente, incluyendo gran parte del espectro
visible activo y UV, con efectos directos sobre la temperatura y la actividad metablica de sus
habitantes. Las superficies acuticas son asidero de muchos contaminantes de origen terrestre y
atmosfrico que podran conducir a situaciones problemticas, como una alta densidad de
neuston que altere el intercambio gaseoso del cuerpo de agua con la atmsfera, afectando su
concentracin de oxgeno.
Tambin puede encontrarse una importante presencia de microorganismos en el plancton (del
griego planktn: lo que va errante) de aguas dulces y marinas. Se trata de organismos que se
encuentran a la deriva, mantenidos en suspensin por la corriente del agua, flotando o nadando
dbilmente. Los microorganismos forman parte de lo que se conoce como fitoplancton, es
decir, algas (eucariotas, figuras 6 y 7) y cianobacterias (procariotas) fotoautotrficas, y tambin
del bacterioplancton, compuesto por bacterias heterotrficas. En el zooplancton pueden
encontrarse protozoos y pequeos animales que quedan fuera del foco de este captulo. En
trminos generales se dice que los organismos zooplanctvoros pastorean el fitoplancton pero
en realidad existe un complejo entramado dentro de la comunidad planctnica, donde el tamao
de los organismos resulta determinante.

4
Los propios organismos del neuston pueden alterar el hbitat, por ejemplo creando microturbulencias que enfran el
agua.
Figura 5. Representacin esquemtica del neuston.
Fuente: Sandrin et al., 2009
Fuente: Sandrin et al., 2009.

79

















El fitoplancton ha sido ampliamente estudiado por su importancia en el estado nutricional de
muchos cuerpos de agua. En climas tropicales se desarrolla de un modo continuo, mientras que
en regiones templadas crece en blooms o pulsos de crecimiento, que responden a las pocas de
mayor temperatura e incidencia lumnica. Los miembros del fitoplancton cuentan con variadas
estrategias que permiten su supervivencia ante condiciones desfavorables (formas de reposo,
capacidad de nadar o de cambiar su densidad) o ante la accin predatoria del zooplancton
(produccin de toxinas, cubiertas gelatinosas, formacin de colonias de gran tamao, alta tasa
de crecimiento). En aguas oligotrficas (escasa concentracin de nutrientes) de lagos o del
ocano abierto, las algas muy pequeas o picoplancton suelen ser dominantes.

Contenido de sales. La salinidad est dada por la presencia de elementos conservativos
5
,
principalmente sodio y cloro, que constituyen el 86% de la sal marina. El cloro es el
elemento ms abundante y, por ende, es el que se utiliza como indicador de la salinidad
ocenica. Procesos fsicos como evaporacin y precipitaciones, formacin de precipitados no
solubles, y movimientos y mezcla de las masas de agua, afectan la salinidad del agua. En el
mar abierto el contenido es mayor o igual al 24,7% y relativamente constante.


5
Elementos conservativos son aquellos poco o no involucrados en procesos biolgicos, siendo entonces los ms
afectados por procesos fsicos. Los no conservativos, como el nitrgeno y el fsforo, estn asociados a procesos
biolgicos y por eso son ms variables en el mar.

a
b
Figura 6. Ejemplares de fitoplancton
(a) Scenedesmus, un alga verde colonial;
(b) Cryptomonas, una Cryptophyta unicelular Fuente: Moss, 1998.
80




Tensin de oxgeno. Este gas, a pesar de ser abundante en la atmsfera, posee una solubilidad
en agua limitada. El ingreso de oxgeno al sistema se da por el intercambio con la atmsfera,
pero cuando se trata de grandes masas de agua la transferencia es muy baja en trminos
relativos. Otra va de ingreso es mediante la produccin fotosinttica pero sta se limita a las
zonas superficiales, bien iluminadas. Por todo esto, el contenido de oxgeno disuelto est
determinado principalmente por el movimiento del agua (remolinos y agitacin) que acelera el
ingreso de este gas desde la atmsfera. Las aguas de ambientes lticos, entonces, presentan en
general un mayor contenido de oxgeno. En aguas quietas, por el contrario, las profundidades
pueden llegar a volverse anxicas y, en ese caso, la actividad biolgica estar restringida a
bacterias anaerbicas y algunos animales microaeroflicos. En esta situacin el metabolismo
pasa de ser respiratorio a ser fermentativo, repercutiendo en el ciclo del carbono y otros
nutrientes y generndose compuestos odorferos (e.g., aminas, H2S, mercaptanos y cidos
grasos), algunos de los cuales pueden resultar txicos para los organismos superiores.
Figura 7. Otras algas tpicas del fitoplancton. Cianofceas (Cyanophycota): (a) Oscilatoria, (b)
Microcystis; Algas doradas (Chrysophyceae): (c) Dinobryon; Algas verdes (Chlorophycota): (d)
Pediastrum, (e) Staurastrum, (f) Chlamidomonas; Diatomeas (Bacillariophyceae): (g) Cyclotella, (h)
Asterionella; Euglenoides (Euglenophycota): (i) Phacus; Criptomonas (Cryptophyceae): (j)
Rhodomonas; Dinoflagelados (Dinophyceae): (k) Ceratium; Haptophyceae: (l) Prymesium. [Nota:
Microcystis (b) es un alga de gran tamao, cuya colonia no cabe en los lmites del diagrama.]. Fuente: Moss, 1998.

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
(j)
(k)
(l)
81

Temperatura. En general vara diaria- y estacionalmente, y depende del tamao del cuerpo de
agua y de la exposicin al sol. Dentro del cuerpo de agua, la temperatura tambin es
condicionada por la profundidad. Cuando se trata de ambientes lnticos las variaciones
trmicas, tanto estacionales como en profundidad, son ms acentuadas que en las aguas
corrientes.
Luz. Principal factor determinante de la productividad primaria del ecosistema acutico, la luz
es muy variable en profundidad, siendo menor la cantidad y mayores las longitudes de onda
a medida que se desciende en la columna de agua. Esto, a su vez, condiciona el tipo de
organismos que habita cada sector. Por ejemplo, muchos microorganismos fotosintticos
acuticos difieren en su espectro de absorcin de la luz; hay bacterias, como Chlorobium y
Rhodobacterium, capaces de absorber en la zona del infrarrojo, lo cual les permite vivir por
debajo de la capa donde habitan las algas, dado que stas no absorben esa regin del
espectro.
pH. Se relaciona con el contenido de carbonatos, bicarbonatos y sales, y, por ende, con la
cantidad de vida acutica (i.e.: mayor pH -> mayor contenido de carbonatos -> mayor vida
acutica).
Profundidad. La profundidad es determinante de muchas otras caractersticas ambientales (e.g.,
cantidad y calidad de luz, temperatura, presin, entre otros) que determinan el tipo de
organismo que puede habitar cada regin de la columna de agua. La figura 8 muestra el
efecto de la profundidad en la distribucin de los microorganismos del agua.




Adems, los ocanos poseen gran influencia de otros factores:
Presin. El espectro de valores en los ocanos es muy amplio, yendo desde 1 atm en la
superficie hasta valores de 1.000 atm en las grandes profundidades. La biota se adapta a los
Figura 8. Ejemplos de distribucin de microorganismos en profundidad segn metabolismo
(a) y grupo taxonmico (b). Fuentes: a) Mardigan et al., 1998, y b) Rheinheimer, 1991.
82

distintos niveles de presin y, por ende, hay organismos que slo se limitan a vivir a
determinada profundidad.
Olas y corrientes. Los ocanos presentan oleaje interno y superficial, a la vez que existen
corrientes internas y superficiales. El proceso de afloramiento puede generar zonas altamente
productivas, dado que la alta carga de nutrientes de sus aguas, pese a ser fras, estimula el
crecimiento del fitoplancton, atrayendo a su vez poblaciones de peces y aves.
Mareas. La atraccin gravitatoria del Sol y la Luna provoca ondas de gran longitud en los
ocanos, responsables de las mareas, es decir, del ascenso y descenso de las aguas del mar.
Cada uno de estos astros es responsable de dos ondas.





















Figura 9. Cadena trfica del plancton y microbial loop. Fuente: Sandrine et al., 2000

Estas caractersticas condicionan la productividad primaria del ambiente acutico, la
cual influir asimismo en la productividad total. Como se mencion anteriormente, los
microorganismos juegan un rol primordial como productores primarios y como
consumidores. En trminos generales, el fitoplancton se encarga del ingreso de energa
al sistema, ste es luego consumido por el zooplancton, el cual puede ser consumido a
su vez por otros organismos hetertrofos. Este esquema de cadena es conocido bajo el
nombre de grazing food chain y simplifica las transferencias de carbono y energa entre
niveles trficos del ecosistema acutico.


Figura 9. Cadena trfica del plancton y microbial loop
Fuente: Sandrin et al., 2009.

83

En realidad las interacciones son mucho ms complejas; ms de la mitad del carbono
fijado en la fotosntesis es liberado en la columna de agua como materia orgnica
disuelta, la cual es rpidamente utilizada por bacterias heterotrficas del
bacterioplancton, que incorporan parte de ese carbono y liberan otra parte como CO2
(figura 9). Este camino detrtico intermedio es llamado microbial loop y su produccin
de biomasa bacteriana se conoce como produccin secundaria, constituyendo una de las
principales vas de utilizacin del carbono proveniente de la produccin primaria.
Tambin puede existir un estadio protozoario intermedio entre el pastoreo del
fitoplancton y la alimentacin del zooplancton.
Los distintos niveles de la cadena trfica interactan modificndose el uno al otro: cada
cambio en la biomasa de un nivel tiene el efecto contrario en el siguiente. Por ejemplo,
el zooplancton se alimenta del fitoplancton y en esta herbivora existe una relacin de
tamaos, con lo cual el tamao del zooplancton dominante afectar la estructura del
fitoplancton.Todas las interacciones entre los distintos grupos de alimentacin alterarn
la productividad de cada nivel trfico pero en conjunto determinarn la productividad
del ecosistema lacustre. La produccin de toda la red ser mxima a niveles medios de
densidad en cada nivel trfico.
De acuerdo a su productividad, los ambientes acuticos se clasifican en diferentes
estados trficos. Existen ambientes oligotrficos, con un bajo contenido de nutrientes y
una consecuente baja productividad primaria, en general de gran profundidad y aguas
cristalinas. Los cuerpos eutrficos presentan una gran cantidad de nutrientes disponibles
(principalmente nitratos y fosfatos) y por ende una alta productividad primaria neta.
Estos ltimos suelen ser de menor profundidad y se caracterizan por sus aguas ms
turbias de color verde o marrn, resultado principalmente del crecimiento de plancton
microscpico. Los cuerpos de agua mesotrficos, como su nombre lo dice, poseen
caractersticas trficas intermedias. El estado trfico no es necesariamente congnito: un
cuerpo oligotrfico puede acumular sedimentos y restos de productores primarios en su
lecho, cuya descomposicin puede derivar progresivamente en una eutrofizacin. Este
proceso puede ocurrir naturalmente o merced algn tipo de induccin antrpica (ver
Eutrofizacin).
III.5 Ambientes acuticos
III.5.1 Ambientes de agua dulce: hbitats lticos
Los ambientes lticos son cursos de agua (arroyos y ros) que pueden surgir como descargas de
estanques o lagos como ser escurrimientos de las aguas de deshielo, drenaje de reas
montaosas o manantiales. Se caracterizan por sus aguas en movimiento, que mantienen la
concentracin de O2 en niveles altos, cercanos a la saturacin. Esta particularidad, sin embargo,
no se mantiene constante en un mismo curso: el oxgeno disuelto disminuye en zonas profundas,
donde la mezcla es menor, y tambin en zonas contaminadas, ya que stas presentan un alto
consumo de O2.
Entre sus habitantes dominan los organismos bentnicos y perifitnicos, presentes en forma de
sedimentos y biofilms, que estn ms adaptados a las veloces corrientes de agua veloces y
poseen requerimientos de luz vinculados a aguas poco profundas. La presencia de algas en
suspensin (fitoplancton) se encuentra sujeta a un equilibrio dinmico dado por la profundidad y
la tasa de movimiento de agua, que determinarn la posibilidad de su establecimiento espacial.
Por lo tanto, a medida que el curso de agua se hace ms lento y/o profundo aumenta la
84

proporcin de plancton sobre la de bentos, pudiendo incluso superarlo como ocurre en aguas
quietas.
III.5.2 Ambientes de agua dulce: hbitats lnticos
Los ambientes acuticos lnticos son depresiones del terreno, naturales o artificiales, que se
rellenan con agua dulce estancada proveniente de precipitacin, escorrenta o filtracin. Estn
tpicamente dominados por algas planctnicas, que pueden establecerse debido a que las
corrientes lentas no las arrastran y expulsan del sistema. Por esta razn, los lagos y lagunas en
general contienen abundantes productores primarios, que interactan dinmicamente con
productores secundarios.
La zonificacin de estos ambientes (figura 10) es determinante en la distribucin de los
organismos. El lecho constituye la zona bentnica; luego, segn la distancia a la orilla se
distinguen la zona litoral o costera y la limntica; y, finalmente, esta ltima se subdivide
verticalmente en las zonas ftica y aftica. Como su nombre lo dice, la zona ftica es la que
absorbe casi la totalidad de la luz que penetra al cuerpo de agua.
En la zona litoral la productividad primaria es alta como resultado de la actividad de algas del
fitoplancton, algas epfitas, y cianobacterias. El hbitat limntico tambin est dominado por el
fitoplancton, que forma un gradiente de comunidades en profundidad a medida que vara la
longitud de onda y cantidad de luz penetrada. Esa variacin en profundidad tambin se da con
otros organismos como las bacterias: las poblaciones fotosintticas (ciano- y clorobacteria) se
concentran en la zona superior. En un lago eutrfico, donde la luz penetra hasta menores
profundidades, esta concentracin es ms acentuada. A su vez, al existir mayor disponibilidad
de nutrientes, tanto la poblacin de fotosintticos como de hetertrofos es mayor en el lago
eutrfico.
La composicin de microorganismos en un lago o laguna no slo vara espacialmente, en sus
distintas zonas y profundidades, sino que existe una variacin estacional, la cual es mucho ms
marcada en climas templados. En estos casos, el crecimiento algal responder a pulsos o
blooms. Por lo tanto, en primavera suele ocurrir que se agotan nutrientes limitantes como
nitrgeno (N) y fsforo (P) como consecuencia de las altas tasas de crecimiento del
fitoplancton, y por el hundimiento de esa biomasa al morir, la precipitacin qumica y la
Figura 10. Esquema de las zonas de un lago. Adaptado de kentsimmons.uwinnipeg.ca.

85

sedimentacin. Pese a que la actividad descomponedora puede aportar P y N disuelto, parte de
ese N se pierde por desnitrificacin. Hacia el verano, la menor produccin del fitoplancton y su
menor tasa de sedimentacin hacen que aumente la disponibilidad de nutrientes.

III.5.3 Ambientes de agua salada
A diferencia de los ambientes de agua dulce, el medio marino es amplio y muy profundo,
haciendo que la fraccin del volumen total iluminada por el sol sea muy pequea. Este factor,
sumado a la escasa concentracin de nutrientes principalmente no conservativos, limita la
productividad primaria de estos sistemas.

En los ocanos, como en los lagos y lagunas, la zonificacin es determinante en la distribucin
de los microorganismos (figura 11). La regin pelgica, correspondiente a la columna de agua
en s, se divide horizontalmente en dos partes: la nertica, correspondiente a las aguas sobre la
plataforma continental, y la ocenica. Tambin se divide verticalmente, dando lugar a una zona
ftica en la superficie y una zona aftica, que se subdivide en meso- y batipelgica, esta ltima
de mayor oscuridad y presin, y menor temperatura. Finalmente, la zona abisal se refiere a las
fosas marinas, a partir de los 6.000 metros de profundidad.
En las costas, por la mayor proporcin de luz interceptada y la mayor concentracin de
nutrientes, provenientes de la tierra y de las corrientes marinas permiten la existencia de
ecosistemas altamente productivos en relacin con el mar abierto, albergando el 90% de las
especies marinas a pesar de ocupar slo el 10% de la superficie ocenica. Arrecifes de coral,
estuarios, marismas y manglares, son ejemplos de ecosistemas marinos costeros. En el mar
abierto la productividad primaria se encuentra limitada por la entrada de nutrientes y, en las
zonas ms profundas, por la escasa luz penetrada. La concentracin microbiana en esta regin es
relativamente muy alta en la fina capa del neuston y disminuye acentuadamente por debajo de
sta.
Las especies fitoplanctnicas se limitarn a poblar aguas superficiales pero su abundancia y
composicin variar temporal y espacialmente de acuerdo a otros factores, como temperatura,
concentracin de nutrientes y herbivora por parte del zooplancton. El picoplancton, que incluye
a las cianobacterias o algas azules, constituye la mayor proporcin de biomasa fitoplanctnica
en aguas templadas y tropicales. Los dinoflagelados son abundantes en zonas de circulacin
descendente y adquieren su mayor abundancia en aguas clidas, pudiendo concentrarse en la
superficie y dando lugar a las mareas rojas (ver ms adelante). Las diatomeas son dominantes en
zonas de afloramiento y relativamente abundantes en zonas rticas, dado que su cpsula de
slice las protege. Donde la circulacin de agua, ya sea vertical u horizontal, es rpida,
prosperarn las especies que puedan adaptarse al ambiente cambiante, con arreglo a las
condiciones locales.
El fondo de los ocanos tambin est habitado por algas, las cuales, junto con plantas y
animales, conforman el bentos. Asimismo, los sedimentos albergan bacterias de gran
importancia en la cadena alimentaria bentnica, ya que utilizan los nutrientes disueltos y se
convierten en una fuente de protenas y lpidos para los sedimentvoros. Bacterias y protistas
constituyen la mitad de la biomasa martima y algunos de ellos son iniciadores de una parte de
la cadena alimentaria en reemplazo del fitoplancton, siendo tambin responsables de gran parte
del flujo de energa en sistemas pelgicos.
III.6 Alteracin de los ambientes acuticos
El agua no se encuentra en estado puro en la naturaleza, sino que contiene otras sustancias
orgnicas e inorgnicas en solucin y suspensin. En muchos casos son depositados de forma
natural pero muchos otros tienen un origen antrpico (xenobiticos) y/o ingresan al sistema
acutico por accin del hombre. En este ltimo caso, el impacto que el agente que ingresa pueda
86

tener sobre el funcionamiento del sistema depender tanto de sus caractersticas y abundancia,
como de la capacidad de ste para procesarla. Sus efectos pueden ser, o bien efectos txicos
directos, o bien efectos indirectos mediante interrupciones en la red trfica (e.g.: si el
fitoplancton ve afectado su crecimiento, el microzooplancton filtrador no podr desarrollarse ni
crecer normalmente). Otro fenmeno de importancia no menor lo constituye la acumulacin de
esa sustancia a lo largo de la cadena trfica por el proceso de biomagnificacin
6
. Adems de los
problemas asociados al ingreso de sustancias, son comunes los casos de ingreso de agentes
patgenos, exceso de nutrientes, calor excesivo, istopos radiactivos solubles e introduccin de
especies alctonas.

III.6.1 - Eutrofizacin
El trmino proviene del griego eu (bien) y trophein (alimentar), y se refiere al fenmeno natural
o antrpico de enriquecimiento en nutrientes que ocurre en algunos cuerpos de agua. La primera
respuesta al enriquecimiento nutricional es un aumento de la productividad primaria y, cuando
ese aumento es exacerbado, derivan de l numerosos efectos, relacionados tanto con el
funcionamiento del ecosistema acutico como con la explotacin de sus recursos y servicios. El
impacto es, entonces, ambiental en un sentido amplio, abarcando desde lo ecolgico hasta lo
econmico y lo social (tabla 5).
Sea cual sea el cuerpo de agua en cuestin, un aumento en la concentracin de fsforo (P) y/o
nitrgeno (N), dos nutrientes altamente limitantes para el crecimiento de la flora acutica,
acarrea una serie de eventos que, en ltima instancia, modifican el ecosistema. A saber:
1. Aumenta el crecimiento de algas: el P excedente es destinado a reservas y reproduccin.

6
Biomagnificacin: traspaso de un contaminante entre niveles trficos, con tendencia a aumentar su concentracin a
medida que asciende de nivel.
Zona
mesopelgic
a


Zona
batipelgica
Figura 11. Zonificacin de los ocanos. Adaptado de kentsimmons.uwinnipeg.ca.

87

2. De crearse una limitante en el contenido de N, aumenta la poblacin de cianofceas,
fijadoras de N (ver Blooms de cianofceas).
3. El exceso de nutrientes, en primera instancia, promueve la produccin secundaria,
aumentando la actividad respiratoria.
4. A su vez, cuando la gran masa de algas producidas muere y cae al fondo, es
descompuesta por bacterias aerbicas, que tambin aumentan la respiracin total.
5. Los dos tems anteriores llevan a una limitante en el contenido de O2 que perjudica y
puede llegar incluso a matar peces y otros organismos acuticos aerbicos. El input por parte
de la fotosntesis que disminuye por la mayor turbidez del agua- y el intercambio gaseoso
con la atmsfera ya no son suficientes para reponer el oxgeno consumido
7
.
6. Si el flujo de nutrientes hacia el agua contina, las bacterias anaerbicas toman el relevo
y producen compuestos gaseosos de descomposicin, como el sulfuro de hidrgeno, muy
txico y maloliente, y el metano, inflamable.

Este enriquecimiento nutricional puede originarse por diversas causas. En condiciones naturales
pueden acontecer enriquecimientos estacionales, asociados a altas temperaturas estivales o
sequas. Fuera de esta singularidad, la eutrofizacin natural se debe principalmente a la
escorrenta, a la ocurrencia de procesos erosivos que arrastran partculas del suelo, y
eventualmente a un aporte atmosfrico. Sin embargo, las actividades humanas, principalmente
agrcolas e industriales, en muchos casos aceleran este proceso dando lugar a la eutrofizacin
cultural o antrpica. En el rea agrcola los mayores perjuicios se originan por escorrenta de
fertilizantes y desechos animales, y por una aceleracin de la erosin debida a prcticas de
manejo que no protegen el horizonte superficial. Muchas de las estrategias para combatir la
eutrofizacin se centran en la dinmica del fsforo, el principal nutriente limitante, aunque
tambin hay otras tantas basadas en el balance de N del sistema. La reduccin de la densidad de
algas ha sido un factor comn entre los esfuerzos por recuperar aguas eutrofizadas (Smith et al.,
1999).
La eutrofizacin es un fenmeno que suele vincularse exclusivamente a los ambientes lnticos,
pese a que puede ocurrir tambin en aguas corriente e incluso en ambientes salinos. Lo que las
hace frecuentes en los primeros es que son cuerpos con poco flujo de agua, lo cual dificulta la
oxigenacin y la dilucin de sustancias. El recambio de agua se demora entre uno y cien aos,
frente a los pocos das o semanas que puede durar en los cursos de agua. Esta caracterstica hace
que estos ambientes sean ms sensibles al ingreso de sustancias extraas y, por ende, a procesos
de contaminacin por sustancias txicas, cidos provenientes de escorrenta o lluvia cida y
exceso de nutrientes.
Durante mucho tiempo se crey que los ambientes lticos no eran sensibles a aumentos en la
concentracin de nutrientes. El efecto de las corrientes, los slidos orgnicos en suspensin, el
sombreado por la vegetacin lindante y la herbivora, segn el caso, podran actuar como
limitantes de la productividad primaria y permitiran una rpida recuperacin (mediante dilucin
y descomposicin bacteriana) ante un inusitado ingreso de nutrientes o residuos degradables. De
hecho, la produccin de algas por unidad de P total es frecuentemente menor en ambientes
lticos que en lagos o estanques. Sin embargo, cuando el sistema se sobrecarga o cuando la
velocidad del curso se reduce (por sequas, presas o desvo para su utilizacin agropecuaria o

7
La concentracin de O2 en el agua es de por s baja (alrededor del 5%), ya que es un componente de baja presin
parcial en la atmsfera y, a su vez, posee baja solubilidad en agua. La mayor solubilidad del CO2 hace que ste
sea ms abundante en ambientes acuticos. Factores como temperatura, aireacin, actividad biolgica
(fotosntesis neta), presencia de otros gases y posibles eventos de oxidacin qumica, modifican la concentracin
de estos gases.
88

industrial) este mecanismo de depuracin deja de ser funcional. Lo mismo ocurrir si se
introducen contaminantes poco o nada degradables.
La eutrofizacin de aguas saladas por mucho tiempo se ha considerado un fenmeno poco
probable debido a la alta capacidad de las aguas marinas para diluir, dispersar y degradar
contaminantes, en parte gracias a los organismos que las habitan. No obstante, la vida de las
profundidades ocenicas es todava muy poco conocida por el hombre como para elaborar tales
conjeturas. Por otro lado, es evidente que el ingreso de una elevada cantidad de sustancias
forneas tendr un impacto sobre los organismos que habitan las aguas marinas y, por lo tanto
sobre su funcionamiento. La concientizacin a este respecto aument con la creciente
ocurrencia de blooms de fitoplancton txico en costas marinas, fenmeno de peligro potencial
mayor dada la alta diversidad de especies txicas presente en aguas marinas. Otros fenmenos
de eutrofizacin de aguas marinas registrados son los blooms de macroalgas en estuarios poco
profundos, la aparicin de zonas anxicas con prdidas comerciales de peces y mariscos.
Por todo lo antedicho, los valores umbral para establecer el estado trfico son diferentes de
acuerdo al cuerpo de agua en cuestin (tabla 6). Un indicador y, por ende, herramienta de
monitoreo- utilizado en lagos y ros- es la concentracin de oxgeno: mientras que las aguas
oligotrficas se mantienen prcticamente saturadas, las eutrficas pueden ir desde una
supersaturacin en el epilimnion hasta una virtual anoxia en el hipolimnion (Boveri, 2005).

III.6.2 - Blooms de cianofceas
Los blooms o floraciones algales son eventos de multiplicacin y acumulacin de fitoplancton
que se dan en una o unas pocas especies y que pueden tomar perodos de horas a das. La
importancia del estudio de las floraciones de cianofceas, y no de otro tipo de fitoplancton,
surge en primer lugar porque muchas especies de este grupo producen toxinas (cianotoxinas)

Tabla 5. Principales efectos de la eutrofizacin en los diferentes cuerpos de agua
(adaptado de Smith et al., 1999).
Efectos
Ambiente
Lntico Ltico Marino
Aumento en biomasa de: - Fitoplancton
X X X
- Perifiton X X
- Algas epiftas y zooplancton X
Variacin en composicin especfica del fitoplancton,
que puede volverse txico (e.g. blooms de cianofceas)
X X
Alteracin en produccin, biomasa y composicin de:
- Plantas vasculares X X
- Macroalgas X
Mayor turbidez del agua X X X
Prdida del valor esttico/Restriccin del uso recreativo X X X
pH elevado y disminucin del O2 disuelto X X X
Mayor probabilidad de muerte de peces X X X
89


perjudiciales para el hombre y para un gran nmero de macroalgas, invertebrados y peces. stas
pueden desarrollarse tanto en aguas saladas como dulces, generando grandes perjuicios sobre el
consumo y la comercializacin de productos acucolas. Microcystis, Anabaena, Nodularia,
Cylindrospermopsis, Planktothrix y Aphanizomenon son gneros destacados por su gran
distribucin y toxicidad.
Altas temperaturas y luminosidad, as como baja turbulencia, son factores naturales
desencadenantes de estos blooms. El aumento en la cantidad de nutrientes tambin puede
cumplir este rol en forma natural pero los crecientes eventos de eutrofizacin cultural han
llevado a que la frecuencia y duracin de las floraciones sea mayor. El pastoreo excesivo
sobre otros grupos de algas tambin puede llegar a favorecer el desarrollo de cianobacterias,
mediante la reduccin de la competencia.

Las cianotoxinas son metabolitos secundarios de las cianofceas -bajo la forma qumica de
pptidos, alcaloides o lipopolisacridos- que varan en tipo y nivel de toxicidad, incluso dentro
de la misma especie y dentro de la misma floracin. Cada organismo puede generar una o ms
toxinas y los factores que desencadenan su sntesis no estn claros, aunque la temperatura, la
luz, la estabilidad de la columna de agua y el pH podran llegar a estar involucrados. La
intoxicacin puede darse mediante varias vas: contacto directo, inhalacin o ingestin de
Mayor proporcin de peces no deseables X X
Mayor produccin de peces y de cosecha X
Matas algales abundantes dificultan el desove de peces X
Perjuicios para el suministro de agua: sabor, olor,
filtrado
X X
Posibles riesgos de salud asociados al consumo del agua X
Muerte y prdida de comunidades de arrecifes de coral X
Tabla 6. Caracterizacin de lagos, cursos de agua y ambientes marinos de diferentes
estados trficos (adaptado de Smith et al., 1999).
Hbitat Estado trfico N total
1
P total
1
Clorofila a
1,3
Translucidez
2

Lagos Oligotrfico <350 <10 <3,5 >4
Mesotrfico 350-650 10-30 3,5-9 2-4
Eutrfico 650-1200 30-100 9-25 1-2
Hipertrfico >1200 >100 >25 <1
Cursos Oligotrfico <700 <25 <20
Mesotrfico 700-1500 25-75 20-70
Eutrfico >1500 >75 >70
Marinos Oligotrfico <260 <10 <1 >6
Mesotrfico 260-350 10-30 1-3 3-6
Eutrfico 350-400 30-40 3-5 1,5-3
Hipertrfico >400 >40 >5 <1,5

1
en mg m-
3
.
2
metros de profundidad alcanzados por el disco de Secchi.
3
Para cursos de agua, contenido de
clorofila a en el bentos.

90

cianobacterias o de animales que hayan estado expuestos a stas. Las toxinas pueden ser
neurotoxinas, hepatotoxinas o dermotoxinas, y por ende, ocasionar distintos tipos de perjuicios.
Lamentablemente, no existe tratamiento contra la intoxicacin, por lo cual los controles
preventivos deben estar bien planificados. La mala apariencia del agua favorece la distincin y
rechazo del agua por parte del hombre, pero no ocurre lo mismo con los animales, los cuales
terminan siendo las vctimas ms frecuentes. La microcistina, sintetizada por el gnero
microbiano del mismo nombre, es una hepatotoxina muy frecuente y de gran toxicidad, incluso
mayor que la del cianuro. Un dato no menor es que su efecto no es necesariamente inmediato
sino que puede ser acumulativo, acarreando malestares crnicos.
En Argentina se encontr que las cianobacterias dominaban ambientes chaco-pampeanos,
especialmente en ambientes someros (Quirs, 2004). El mismo autor enunciaba en 2004 que, a
pesar de ser conocida la existencia de cianobacterias en varios cuerpos de agua dulce de
Argentina, su distribucin y abundancia no era del todo clara.
III.6.3 - Marea roja
El fenmeno denominado marea roja es el resultado de los florecimientos masivos de ciertas
especies de microalgas planctnicas. Su nombre se debe a que la mayora de estas floraciones
colorean el agua, observndose franjas rojas sobre su superficie (Hernndez-Orozco y Grate-
Lizrraga, 2006). Actualmente, sin embargo, se sabe que su coloracin tambin puede ser
amarilla, naranja, marrn, verde o azul, dependiendo de los pigmentos presentes en las
microalgas, su profundidad y concentracin (Hernndez-Orozco y Grate-Lizrraga, 2006;
FAO, 2005; SENASA, 2010).
El particular inters en la formacin de mareas rojas se debe a la produccin de toxinas por
parte de algunas de esas microalgas, muchas de las cuales son potencialmente letales para
humanos. Muchos florecimientos o mareas rojas son causados por especies no txicas pero
alrededor de 75 especies de microalgas producen potentes toxinas (Hernndez-Orozco y Grate-
Lizrraga, 2006). La intoxicacin no ocurre por ingestin directa de microalgas, sino a travs
del consumo de otras especies marinas, en especial moluscos bivalvos, los cuales ingieren
microalgas txicas por filtracin y concentran las toxinas en su organismo, sin que tal
acumulacin los afecte (SENASA, 2010). Ello se debe a que los msculos y nervios de los
moluscos trabajan con canales de calcio, cuando las toxinas involucradas bloquean slo canales
de sodio (Hernndez-Orozco y Grate-Lizrraga, 2006). El problema es que, al no tener efecto
alguno sobre el molusco, no hay diferencias de aspecto o de color entre uno contaminado y uno
no contaminado, como tampoco las hay de sabor ni de olor. La nica forma de detectar la
presencia de las biotoxinas es mediante pruebas de laboratorio (SENASA, 2010). Por otro lado,
todas las toxinas son de naturaleza no proteica y extremadamente estables. As, el cocinado,
ahumado, secado o salado no las destruye. Por el momento no existe antdoto alguno para estas
toxinas (Hernndez-Orozco y Grate-Lizrraga, 2006). La saxitoxina (y sus ms de 26
anlogos) pertenece a la familia de neurotoxinas solubles en agua y es la principal toxina
paralizante, adems de ser la toxina ms potente conocida. Su dosis letal mnima es de 9
microgramos/kg, inferior incluso que la del cianuro de sodio (Hernndez-Orozco y Grate-
Lizrraga, 2006).
La floracin comienza como una pequea poblacin de clulas de dinoflagelados txicos en
fase latente o como quistes de resistencia depositados en el sedimento del fondo. Una vez
desencadenada la floracin, se ingresa en una fase de crecimiento exponencial de la poblacin.
El mayor porcentaje de clulas txicas se registra generalmente en la mitad de esta fase de
crecimiento exponencial. A medida que transcurre el tiempo, la floracin causa una marcada
disminucin de nutrientes y del contenido del dixido de carbono en el agua, limitando el
crecimiento de la poblacin. Ingresa, entonces, en una fase estacionaria, se estabiliza y el agua
91

adquiere un color rojizo fluorescente. En esta etapa, muchas especies de dinoflagelados forman
quistes de resistencia (hipnozigotes) que se hunden al fondo, a la espera de la prxima floracin
(FAO, 2005).
No se conocen con exactitud las condiciones ambientales que desencadenan los crecimientos
explosivos de las algas, en parte porque hay muchos organismos diferentes involucrados en el
fenmeno (Hernndez-Orozco y Grate-Lizrraga, 2006; FAO, 2005). Muchas veces los
crecimientos explosivos ocurren al cambiar las condiciones climticas, pero pueden haber otras
causas, como variaciones en las corrientes verticales, la temperatura, transparencia y la salinidad
de las aguas, la concentracin de nutrientes disueltos, los vientos o la iluminacin superficial
(FAO, 2005).
Durante las dos ltimas dcadas, ha aumentado la frecuencia, intensidad y distribucin
geogrfica de las floraciones de algas perjudiciales, as como la de los compuestos txicos
presentes en la cadena alimentaria marina. Se han ofrecido diferentes explicaciones para esta
tendencia: una mayor concientizacin e investigacin, crecimiento de la acuicultura en aguas
costeras, transferencia de mariscos de una zona a otra, eutrofizacin cultural, movilidad de
sustancias hmicas y metales traza desde el suelo por deforestacin y/o precipitaciones cidas
(lluvia cida), y condiciones climticas poco comunes. Otra posible explicacin de la creciente
tendencia de aparicin de floraciones de algas perjudiciales es el traslado de quistes en reposo
de dinoflagelados en las aguas de lastre de los barcos o por el movimiento de poblaciones de
mariscos de una zona a otra (FAO, 2005).
Hay suficientes evidencias de diferentes zonas (como el puerto de Hong Kong, el Mar Interior
de Seto en Japn y aguas costeras del norte de Europa) de que la eutrofizacin cultural en el mar
-proveniente de aguas domesticas, industriales y de desechos agrcolas- puede estimular
floraciones perjudiciales de algas. Es incluso posible que estos regmenes nutricionales atpicos
induzcan toxicidad en especies de algas habitualmente no txicas. Los cambios en los usos de la
tierra, como la deforestacin, pueden tambin causar cambios en la composicin de las especies
del fitoplancton, aumentando las concentraciones de sustancias hmicas en los desplazamientos
de tierras.















Microorganismos en aguas de consumo humano
A pesar de que es de comn conocimiento que el agua est habitada por microorganismos de diversa ndole, en
algunos casos su presencia puede resultar perjudicial para el hombre, ya sea a la hora del consumo, uso
recreativo o utilizacin con fines tecnolgicos.
En cuanto al aspecto sanitario, se sabe que el agua acta como hbitat y/o medio de transporte de una gran
cantidad de organismos perjudiciales para la salud del hombre. La mayora de los patgenos en el agua de
bebida son bacterias y virus, muchos de origen entrico o fecal. Esto hace que el control de la calidad
microbiolgica del agua sea tan importante como el de su calidad qumica y organolptica. Para evaluar la
calidad del agua, los gobiernos y las agencias reguladoras como la World Health Organization (WHO) crearon
estndares que proponen contenidos mnimos que no resultaran en perjuicios para la salud. En cuanto al agua
de red, se ha encontrado que la calidad microbiolgica del agua no ocurre slo en la fuente sino tambin en el
proceso de colecta-transporte-almacenamiento-extraccin. El agua embotellada, por su parte, raramente est
completamente libre de microorganismos y algunos de ellos pueden ser patgenos. A pesar de la existencia de
un proceso de desinfeccin previo al embotellado, el contenido de bacterias aumenta dentro del envase,
especialmente en aguas no gasificadas y en envases plsticos. Adems, entre las bacterias que se han
encontrado, muchas son resistentes a una variedad de agentes antibiticos.
Los microorganismos tambin pueden interferir indirectamente con la utilizacin del agua. Por ejemplo, las
bacterias oxidantes del azufre y el hierro pueden obstruir tuberas y conductos de agua al metabolizar
compuestos solubles (H2S, FeCO3) para dar como producto precipitados (e.g.: Leptothrix, Gallionella,
Beggiatoa). Otros microorganismos pueden aportar sabor y olor indeseable al agua, ya sea por su propia
presencia o su metabolismo, como las bacterias anaerobias que producen mercaptanos, sulfhdrico y otros
productos. Los actinomicetes tambin afectan el olor y el sabor del agua, promoviendo la descomposicin de
plantas acuticas y algas. Las actinobacterias del gnero Streptomyces por su parte, producen geosmina, un
compuesto voltil causante del conocido olor a tierra no slo en el suelo sino tambin en el agua.

92




En Argentina, anualmente y por lo general entre la primera mitad de la primavera y la ltima del
verano, la marisquera en el litoral atlntico es vedada total o parcialmente debido a la marea
roja (Ciocco, 1995). Nuestro pas cuenta con un programa de control de toxicidad en mejillones
en cada una de las provincias de la costa. Por reglamentacin, el lmite para la STX en los
moluscos es de 400 UR/ 100 g y el mtodo de anlisis es el bioensayo en ratn. (FAO, 2005).
Los niveles de toxicidad superan habitualmente dicho valor lmite entre septiembre y noviembre
y permanecen por sobre ese nivel hasta la segunda mitad del verano o principios de otoo
(Ciocco, 1995).
93


IV. MTODOS UTILIZADOS EN ESTUDIOS DE ECOLOGA MICROBIANA

1. De enriquecimiento y aislamiento
En un ambiente natural es muy difcil encontrar un solo tipo de microorganismo. Por ello es
ms acertado hablar de comunidad microbiana. De cualquier manera, las tcnicas de
enriquecimiento son las ms utilizadas y apropiadas para el aislamiento y cultivo de
microorganismos. Se debe poner nfasis en el empleo de un medio de cultivo y una serie de
condiciones de incubacin que favorezcan el crecimiento del microorganismo o grupo
taxonmico que se desea multiplicar. De alguna manera, se busca reproducir en el laboratorio
las condiciones que imperan en su nicho ecolgico. En todos los casos se requiere de una
fuente de inculo apropiada.
De todas maneras se debe tener en cuenta que la cantidad y tipos de microorganismos presentes
en un determinado nicho ecolgico es casi completamente imposible de determinar. Este tipo
de mtodos hacen posible estimar una proporcin de la comunidad total posible de ser cultivada
sobre un medio de cultivo y que en muy rara ocasin puede ser mas del 14%. La figura 12
representa un esquema de como los grupos de microorganismos no cultivables pueden pasar
mediante especficos cambios fisiolgicos a los tipos cultivables mientras la mayor proporcin
de microorganismos no cultivables permanecen como tales. La evaluacin de un subgrupo de la
comunidad debera ser suficiente para detectar cambios en la dinmica total de la comunidad,
siempre y cuando haya interacciones entre el subgrupo medido y los otros miembros que
integran la misma.

Figura 12. Tipos de microorganismos presentes en la comunidad microbiana del suelo
(Fuente: Garland, 2004)
La columna de Winogradsky (figura 13) se utiliza para reproducir las condiciones de un
ecosistema anaerbico en una escala muy pequea. Es un mtodo muy til para estudiar las
poblaciones de procariontes involucradas en los ciclos de los nutrientes. En el seno de la
columna se desarrollan diferentes microorganismos, por eso resulta apropiada para utilizarla
como un medio de enriquecimiento de poblaciones aerobias y anaerobias. Recuentos utilizando
medios selectivos permiten cuantificar los tipos presentes. En la columna de Winogradsky se
pueden enriquecer y estudiar las especies involucradas en el ciclado de los nutrientes (por ej.
ciclos del nitrgeno y azufre).
94

Los microorganismos generan sulfuro en la parte de abajo de la columna. La fermentacin de la
celulosa libera lentamente azcares que son usados por los organismos anaerbicos. El sulfato
sirve como un aceptor de electrones para los reductores de sulfato (por ej. Desulfovibrio),
generando sulfuro. El carbonato est disponible para el crecimiento autotrfico y tambin como
buffer de pH. Se usan sales de calcio insolubles de manera de no crear un medio ambiente muy
salino. Los sulfuros de metales (por ej. de hierro) le proporcionan el color negro al fondo de la
columna. Los sulfuros difunden hacia arriba en la columna y el oxgeno difunde hacia abajo
desde la superficie. Los organismos oxidadores de sulfuro consumen ambos componentes en su
metabolismo, resultando en un contrabalance estable de los gradientes de oxgeno y sulfuro.
Esto permite el crecimiento de microorganismos con diferentes requerimientos de oxgeno.

2. De los enriquecimientos a los cultivos puros
El objetivo de un cultivo de enriquecimiento es generalmente la obtencin de un cultivo puro.
Para los organismos que crecen bien sobre las placas con agar, la estra en placa es el mtodo
ms conveniente para su aislamiento. A travs de repetidos repiques y nuevas estras de una
colonia bien aislada, generalmente se obtiene un cultivo puro que se puede transferir a un medio
lquido.
Existen mtodos que permiten cultivar una determinada comunidad microbiana sobre varios
sustratos simultneamente. Estos mtodos brindan mayor informacin sobre su funcin,
diversidad y potencial de actividad que los mtodos tradicionales. Esta metodologa representa
una herramienta de gran potencial que permite comparar comunidades microbianas sin
necesidad de conocer exactamente su composicin en grupos taxonmicos y/o especies
presentes (Garland y Mills 1991).

3. De identificacin y cuantificacin.
En algunos de los casos los microorganismos de inters en un ecosistema pueden no ser
cultivables (figura 12). Si este es el caso, son necesarios mtodos que por lo menos detecten que
estn presentes. Varios mtodos bastante especficos se han desarrollado para la identificacin y
enumeracin, que incluyen los mtodos basados en la especificidad de los anticuerpos y las
secuencias de cidos nucleicos.

a) La tincin y los anticuerpos fluorescentes.
Los microorganismos pueden ser identificados y enumerados por el examen microscpico
directo del hbitat. Sin embargo, se hacen necesarios procedimientos especiales para hacer
visibles los microorganismos en hbitat opacos. En el suelo, por ejemplo, los organismos
pueden ser teidos por una variedad de compuestos fluorescentes especficos para clulas vivas.
Por ejemplo, el naranja de acridina se emplea para teir el ADN y el ARN. Es una tcnica de
tincin directa y es ampliamente usada para conteo del nmero microbiano total en suelo y
agua.
La tincin con anticuerpos fluorescentes es un mtodo para identificar una especie o incluso una
cepa de una especie dada en muestras de suelo. En ciertas aplicaciones la tcnica puede ser
utilizada tambin como un mtodo de cuantificacin. La gran especificidad de los anticuerpos
preparados contra los constituyentes de la superficie celular de un organismo particular, puede
ser explotada para identificar ese organismo en un hbitat complejo como el suelo.
95




b) Las sondas de cidos nucleicos.
Una aproximacin poderosa para la identificacin y cuantificacin de microorganismos en la
naturaleza es el uso de las sondas con cidos nucleicos. Una sonda con cidos nucleicos
constituye un fragmento corto de ADN o ARN complementario a una regin de un gen al cual
la sonda puede hibridizar. Algunas sondas que han sido utilizadas emplean secuencias de ARN
ribosomal 16S como herramientas para diferenciar microorganismos en ambientes naturales. Al
utilizar una coleccin de tales sondas para analizar muestras naturales, es posible identificar
diferentes especies en una muestra.
En pruebas filogenticas, se utilizan dos tipos de sistemas de marcado: radioistopos y tincin
fluorescente. El mtodo de los radioistopos emplea sondas marcadas con
35
S y
32
P que se
agregan a clulas fijadas con formaldehdo inmovilizadas con filtros de fibra de vidrio. Antes
del tratamiento con una sonda, las clulas secas se someten a tratamientos de permeabilizacin,
de manera que la sonda pueda penetrar y encontrar un ribosoma para unrsele. El marcado de
clulas individuales es luego visualizado por autorradiografas: la exposicin de una emulsin
fotosensible a la radioactividad en los ribosomas a los que la sonda se ha unido.
La tincin fluorescente es un sistema de deteccin alternativo. La tintura se adhiere
qumicamente a la sonda, y las clulas se visualizan a travs de microscopa fluorescente. Si se
Figura 13. Esquema de la Columna de Winogradsky con un detalle de las
zonas microbianas y las principales reacciones.
96

usan sondas marcadas con varios colorantes que fluorescen en diferentes longitudes de onda, es
posible tratar una muestra con diferentes sondas a la vez y luego identificar y cuantificar
diferentes tipos de clulas en las muestras empleando un filtro de fluorescencia apropiado.
El estudio de la biodiversidad de comunidades microbianas puede hacerse usando sondas de
ARN ribosomal. El resultado obtenido es un cuadro filogentico de las especies presentes en la
comunidad. En resumen, los mtodos involucran extraccin de ADN o ARN total de los
representantes de la comunidad microbiana entera y luego, usando sondas de cido nucleico
especficas, se obtiene una coleccin de clones de ARN ribosomal. Esto ltimo se genera por
tcnicas de amplificacin por PCR (del ingls Polimerase Chain Reaction) de genes de ARN
ribosomal o indirectamente por la produccin de cADN complementario al ARN ribosomal.
Siguiendo la secuenciacin del ARN ribosomal, se pueden construir los rboles filogenticos
que muestran la composicin de la comunidad microbiana. En casi todos los casos de anlisis
filogenticos de comunidades microbianas se ha demostrado que contienen organismos
filogenticamente diferentes que no han sido cultivados hasta el momento. Esto apoya la
hiptesis que la biodiversidad de las comunidades microbianas es mucho ms grande que la de
los organismos aislados hasta ahora. Esto significa que an queda mucho trabajo para los
microbilogos que realizan trabajos de cultivo y enriquecimiento.
Se puede utilizar la tecnologa de sondas para propsitos de monitoreo (por ejemplo, monitorear
el xito de la colonizacin de un nuevo hbitat por microorganismos genticamente modificados
o para identificar genes particulares (por ejemplo, genes que codifican protenas involucradas en
la biodegradacin de compuestos txicos) en organismos del ambiente. En cada caso, el
aumento o la disminucin de la "dosis" de un gen o genes especficos a los que una sonda
reacciona, puede ser utilizados para monitorear el xito del o los organismos que lo/s portan.
Adems, utilizando los mtodos que emplean sondas se pueden evaluar los efectos de
perturbaciones sobre el origen o la declinacin de poblaciones microbianas especficas (o dosis
gnicas especficas).
El futuro de las sondas con cidos nucleicos en ecologa microbiana es muy auspicioso,
especialmente para utilizarlas donde los mtodos de cultivo no han sido exitosos o donde los
organismos de inters estn presentes en nmero inferior a la sensibilidad de las mediciones de
actividad. De cualquier manera, la principal dificultad que presentan todos los mtodos que han
sido descriptos, es que la obtencin de datos se 1imita exclusivamente a la deteccin,
enumeracin y posicionamiento filogentico de los organismos. Sin embargo, en la mayora de
los estudios de ecologa microbiana, es muy importante conocer la actividad microbiana, a fin
de asignarle significancia ecolgica a la presencia de un organismo en un hbitat determinado.

c) PCR cuantitativa para el anlisis de comunidades microbianas.
La PCR cuantitativa (qPCR o PCR en tiempo real) es una herramienta de gran utilidad en
estudio de las comunidades microbianas, ya que permite la cuantificacin de los
misroorganismos presentes (Smith y Osborn, 2008). Consiste en una reaccin de PCR con un
marcador que se une a los fragmentos de DNA y emite seal fluorescente. Esta seal es leda
por el equipo, el cual genera una curva logartmica de amplificacin, que representa la cantidad
de copias de DNA en funcin del ciclo. Luego de un nmero de ciclos determinado, se obtiene
un valor de la cantidad de copias de DNA a partir del cual se estima la cantidad inicial de
copias, que es el nmero de copias que contena la muestra. Qu grupo de microorganismo se
estar cuantificando depender del cebador o primer utilizado en la reaccin de PCR. Existen
primers universales para bacterias, hongos y actinomicetes, que son seleccionados por el
investigador dependiendo del organismo a estudiar. Sin embargo el alcance de esta herramienta
no se limita solamente al nmero de miembros de cada grupo, sino tambin permite la
cuantificacin de microorganismos involucrados en los procesos microbianos especficos
97

utilizando primers para genes funcionales. Por ejemplo, el empleo de primers para el gen nifH
permitir la cuantificacin de microorganismos involucrados en la fijacin de nitrgeno. De este
modo, existen primers para cuantificar genes otros procesos que ocurren en el suelo, como la
desnitrificacin o degradacin de determinadas sustancias agroqumicas.

d) Perfiles de steres de fosfolpidos y cidos grasos (PLFA).
El anlisis de marcadores PLFA ha sido usado para evaluar la dinmica de la estructura de
comunidades microbianas en diversos ambientes. Es un anlisis bioqumico de componentes de
las membranas celulares que permite disponer de un biomarcador distintivo que ha sido definido
para una variedad de diferentes grupos microbianos (por ejemplo hongos, bacterias y
actinomicetes). El anlisis de PLFA es un mtodo til para evaluar biomasa viable total y la
proporcin relativa de los diferentes grupos microbianos. Pero no siempre puede relacionarse
directamente el perfil de PLFA con diversidad microbiana porque estos biomarcadores pueden
ser comunes para diferentes especies. Esta metodologa fue exitosamente empleada para el
estudio de las comunidades bacterianas de suelos de la regin de Las Yungas del noroeste
argentino, estableciendo relacin entre el uso de los suelos y la diversidad y biomasa viable de
dichas comunidades (Montecchia et al, 2011). Las comunidades bacterianas de los suelos
agrcolas resultaron menos diversas y abundantes que las de los suelos no cultivados, poniendo
en evidencia el alto impacto que tienen el desmonte y el cultivo sobre la biologa de estos
suelos.
e) Estimacin del carbono de la biomasa microbiana por el mtodo de fumigacin extraccin
El fundamento de esta tcnica consiste en la muerte de la biomasa viva de muestras de suelo,
previa remocin de races y restos de animales, a travs de una fumigacin con vapores de
cloroformo. Posteriormente, el carbono de la biomasa microbiana es extrado del suelo con
K2SO4 y se cuantifica por medio de una titulacin. La diferencia entre la cantidad de carbono de
las muestras fumigadas y las no fumigadas dividida por una constante (kc) dar como resultado
el carbono de la biomasa. El factor kc se utiliza para expresar la fraccin de carbono microbiano
que se recupera en un proceso de fumigacin y extraccin. En general se recomienda usar 0,33,
pero debera calcularse para cada tipo de suelo. A modo de resumen se presenta esta
metodologa en forma esquemtica en la figura 14

4. Mediciones de actividad microbiana
Las mediciones de actividad microbiana por lo general son estimaciones de los procesos
microbianos en conjunto, donde se evalan las actividades colectivas de varias poblaciones
relacionadas metablicamente a travs de mediciones de un solo tipo de transformacin. De ah
que la sensibilidad del mtodo guarda una importancia crucial.

a) La respiracin microbiana del suelo.
La respiracin del suelo (consumo de O2 o produccin de CO2) es un componente importante en
el balance de carbono de los ecosistemas terrestres y resulta indicadora de la actividad biolgica
del suelo, ya que ese flujo de CO2 es producido por la actividad metablica de los organismos
(meso, microfauna y microflora) y las races de las plantas. Se trata de una determinacin que
puede realizarse tanto a campo como en el laboratorio, donde se utilizan diferentes mtodos
para su medicin. Cuando la medicin se realiza a campo se instalan en el terreno cmaras de
respiracin como se muestra en la figura 15.
98




En el laboratorio el sistema ms comnmente utilizado consiste en frascos con tapas hermticas
donde se coloca la muestra de suelo en condiciones adecuadas de humedad (50-70 % CR), y un
recipiente menor con KOH o NaOH. Tambin se incluyen frascos sin suelo que sern utilizados
como controles de la concentracin de CO2 en la atmsfera del frasco. Luego de un perodo
variable de incubacin, en oscuridad y a temperatura ambiente o controlada, se procede a
Muestras de suelo
fumigadas
no fumigadas
(control)
CHCl
3
vaco
vapores de
CHCl
3
muestras
de suelo Incubar en oscuridad
Extraccin
24h
fumigadas no fumigadas
+ K
2
SO
4
0,5 M
extraccin
digestin del extracto con
dicromato de K y titulacin
por retorno con sal de Mohr
Clculo del Carbono de la biomasa microbiana
A - B
C-biomasa = g C-CO
2
g
-1
suelo =
k
c
A
B C-biomasa
A: carbono de las muestras fumigadas
B: carbono de las muestras sin fumigar
Figura 14. Esquema del mtodo de Fumigacin-Extraccin para la estimacin del
carbono de la biomasa microbiana.

99

precipitar el Na2CO3 producido con una solucin de BaCl2 y por titulacin, usando fenolftalena
como indicador, se determina la cantidad de NaOH que qued sin reaccionar. Cuanto mayor sea
la actividad respiratoria, menor ser la cantidad de NaOH que queda sin reaccionar. En la figura
16 se muestra un esquema de esta metodologa y el clculo de la produccin de CO2 o
respiracin.

Figura 15. Cmara de respiracin conectada a un equipo analizador de aire.



Figura 16. Esquema del mtodo de respiracin por titulacin, utilizando frascos hermticos
y trampas de un lcali fuerte.
100

b) Actividades enzimticas
Existe una gran variedad de tcnicas para estudiar la actividad de enzimas tanto in vitro como in
situ. Determinadas reacciones enzimticas, vinculadas a valores de recuento de distintos grupos
funcionales, permiten obtener informacin comparativa de la actividad microbiana en distintas
muestras ambientales. Uno de los principales problemas que enfrenta esta metodologa al
momento de interpretar los resultados es la interaccin que de las enzimas con los minerales
arcillosos del suelo. Dependiendo de la enzima y del contenido y tipo de arcilla, la actividad
enzimtica puede perderse por completo debido a la accin de proteasas o a cambios
conformacionales que ocurran como resultado de la interaccin, y tambin puede verse
protegida por las arcillas, conservando la actividad an despus de la muerte del
microorganismo que la produjo.

Deshidrogenasa y ureasa
Las enzimas comnmente ms usadas como indicadoras de actividad microbiana en suelos son
la deshidrogenasa y la ureasa. Si existe actividad deshidrogenasa en suelo el 2,3,5
triphenytetrazolium (TTC), que es incoloro, se reduce a triphenylformazan (TPF) observndose
el desarrollo de una coloracin rojiza.

2,3,5 triphenytetrazolium + 2H
+
-------------------- triphenylformazan + HCl

En el caso de actividad de ureasa, el amonio liberado como resultado de dicha actividad se
cuantifica por el mtodo de indofenol azul.
Para cada situacin y grupo de microorganismos de inters se recomienda recurrir a alguno de
los mtodos citados en la bibliografa. El libro editado por Alef y Nannipieri (1995) cuenta con
una recopilacin bastante completa de tcnicas y aplicaciones prcticas.

c) Perfiles fisiolgicos de las comunidades microbianas
Uno de los mtodos para estudiar la diversidad microbiana de un ambiente es a travs del
consumo diferencial de sustratos carbonados por parte de las comunidades microbianas
(Garland y Mills, 1997), que se pone de manifiesto por la reduccin de un colorante. Esta
tcnica consiste en la inoculacin de microplacas con una suspensin de microorganismos del
suelo. Las microplacas contienen una solucin buffer, colorante violeta tetrazolio y una variedad
de fuentes carbonadas (hidratos de carbono, aminocidos, cidos carboxlicos, etc.). A medida
que un sustrato est siendo respirado por los microorganismos, el colorante se reduce,
tornndose la celda de color violeta. A mayor consumo la intensidad del color, y por ende, la
absorbancia, son mayores. Las celdas con un sustrato no consumido permanecen incoloras. Las
placas luego son ledas con un espectrofotmetro, obtenindose de este modo los perfiles de
consumo diferencial. A partir de los datos obtenidos se pueden estimar ndices de diversidad,
tales como la riqueza y equitatividad de microorganismos presentes, entre otros.

d) Los microelectrodos.
El empleo de pequeos electrodos de vidrio, denominados microelectrodos, ha sido de gran
utilidad para estudiar la actividad de los microorganismos en su ambiente. Los ms difundidos
permiten medir pH, oxgeno, N2O y SH
-
.
101

Los microelectrodos se insertan cuidadosamente dentro del hbitat que se desea estudiar,
empleando un dispositivo que permite movimientos precisos del electrodo a travs de distancias
muy pequeas. Se emplean regularmente en los estudios de fotosntesis y transformaciones
qumicas donde participan cianobacterias, bacterias fotosintticas y quimioorgantrofas, entre
otras. Mediante el empleo de diferentes microelectrodos, se pueden realizar a la vez mediciones
de transformaciones microbianas para distintas especies qumicas.
e) Los istopos estables.
Los istopos estables pueden utilizarse en estudios de transformaciones microbianas, debido a
que la mayora de las reacciones bioqumicas que involucran elementos como el carbono y el
azufre, favorecen la incorporacin del istopo ms liviano (
12
C,
32
S). El fenmeno de
fraccionamiento isotpico puede observarse en la naturaleza al analizar el origen de los istopos
en los compuestos qumicos. La composicin isotpica de una muestra lleva consigo un registro
de su actividad biolgica anterior. Por ejemplo, en el caso del carbono, las bacterias
metanognicas discriminan entre las formas isotpicas del CO2, favoreciendo ampliamente a las
especies de
12
C frente a las de
13
C. Como consecuencia de las diferencias entre la proporcin de
12
C y
13
C, estrechamente relacionados con el origen biolgico y geolgico del carbono, se ha
utilizado la relacin isotpica
12
C/
13
C en varios estratos geolgicos con el objeto de determinar
los procesos que dieron origen al comienzo de la vida en rocas antiguas.
Se han utilizado los istopos de azufre para distinguir entre depsitos de azufre mineral (sulfuro
de hierro) y azufre elemental, de origen bitico y abitico. Por otra parte, los anlisis de
istopos estables se pueden utilizar en el monitoreo de las cadenas alimenticias de
microorganismos y organismos superiores. En la cadena trfica, la composicin isotpica de un
consumidor se aproximara a la de un productor, su principal fuente de alimento. Esto permite
delinear la corriente de carbono en un ecosistema dado.
En el captulo 8 del libro Brock Biologa de los Microorganismos se analizan las formas de
utilizacin del istopo de
15
N, para estimar fijacin biolgica de N2 y otros procesos biolgicos
del ciclo de este elemento.

f) Los radioistopos.
Los radioistopos constituyen otra til herramienta para la medicin de procesos microbianos
especficos con un alto grado de sensibilidad. Adems permiten obtener informacin acerca de
las velocidades de recambio entre las especies qumicas que se encuentran presentes en la
naturaleza.
Siempre existe la posibilidad de que alguna transformacin de un compuesto marcado se origine
estrictamente de un proceso qumico ms que de uno microbiano, por lo cual, resulta
sumamente importante emplear los controles adecuados cuando se utilizan los istopos. Se debe
demostrar que la transformacin que se est evaluando en la naturaleza, puede inhibirse por
agentes microbicidas o tratamientos con calor que bloqueen la actividad microbiana o maten a
los organismos.


102

CAPTULO 7
CICLO DEL CARBONO. DEGRADACIN DE COMPUESTOS CARBONADOS EN EN
DIFERENTES AMBIENTES. HUMIFICACIN Y DESHUMIFICACIN.
Ciclo del Carbono. Importancia de la fotosntesis en el ciclo del Carbono. Descomposicin de la
materia orgnica (Brock Biologa de los Microorganismos: Captulo 14, seccin 14.11).
Utilizacin de hexosas, pentosas y polisacridos (Brock Biologa de los Microorganismos:
Captulo 13, seccin 13.21). Formacin y degradacin de la materia orgnica del suelo:
humificacin y deshumificacin. Transformaciones de hidrocarburos (seccin 13.25).
Metanognesis y sintrofa. Hbitats metanognicos. Metanognesis en los ocanos (seccin
14.12).
El ecosistema microbiano del rumen. Las bacterias, protistas y hongos del rumen. Dinmica del
ecosistema del rumen. Otros animales herbvoros (sesin 14.13). Produccin de Biogs (esta
gua).
Repasar oxidaciones y reducciones (ver lectura sugerida en el captulo 4 de esta gua).

La degradacin de la materia orgnica y el rol de los microorganismos.
La principal fuente de energa para la microflora del suelo proviene de la materia
orgnica (MO) aportada por la cobertura vegetal, la cual est formada por un 50-60% de C, y un
0,3-5,0% de N. El N se encuentra principalmente formando parte de las protenas, las cuales son
rpidamente degradadas por la microflora del suelo, en tanto que el C forma parte de los
polmeros que constituyen la pared celular de las plantas, principalmente celulosa,
hemicelulosas, lignina y sustancias pcticas. La descomposicin microbiana de estos residuos
en condiciones aerobias produce una gran prdida de carbono a la atmsfera como CO2.
Durante el primer ao se pierde entre el 60 y 70 % del carbono de la MO recientemente
incorporada al suelo. Otro 20% se perder en los siguientes 6 a 9 aos. El resto permanece en el
suelo en forma ms estable.
La descomposicin de la MO comienza an antes de que los tejidos hayan sufrido
senescencia. Las hojas antes de expandirse se cubren de bacterias del filoplano, y al envejecer
son atacadas por diferentes patgenos parsitos y saprofitos-. Sin embargo, la velocidad de
descomposicin mayor ocurre cuando los tejidos caen al suelo. La fauna del suelo tiene un
importante papel en la descomposicin de la materia orgnica del suelo, fragmentando y
mezclando el material vegetal con el horizonte superficial del suelo. Cuando hay fauna presente
la descomposicin de la MO es entre 25 y 80 % ms rpida que en su ausencia. Los grupos ms
importantes de la fauna del suelo que participan activamente en la descomposicin de la MO
son lombrices, artrpodos, nematodes y protozoos.
La actividad enzimtica de hongos y bacterias transforman la MO, dando origen a
compuestos ms sencillos y humus. En casi todos los suelos la materia orgnica es inicialmente
atacada por hongos, que gracias a sus hifas y micelios pueden penetrar y proliferar en los restos
recin depositados. Gneros tpicos de hongos que degradan a los polisacridos de la pared
celular vegetal son Rhizopus, Fusarium, Trichoderma, Penicillium, Aspergillus, Alternaria y
Rhizoctonia.
Las bacterias generalmente se desarrollan secundariamente, principalmente sobre
detritos con una alta relacin superficie/volumen. Entre los gneros ms representativos,
encontramos a Flavobacterium, Clostridium y Cellulomonas. Los actinomicetes tambin forman
103

un grupo siempre presente en la microflora que ataca la materia orgnica, destacndose especies
del gnero Streptomyces.
Existen ciertas homologas en las etapas del proceso de descomposicin de la celulosa,
hemicelulosa y pectinas de la pared vegetal, y tambin del almidn, el cual no es un
constituyente de la pared sino que es un polmero de reserva. En general, actan complejos
enzimticos, unos son capaces de degradar los polmeros desde los extremos, otros que rompen
las cadenas de polmeros en su interior y otros actan sobre los puntos de ramificacin. Un
ejemplo de esto ltimo es la degradacin de la celulosa, la cual, dado su alto peso molecular y
estructura en microfibrillas, solo puede ser degradada por aquellos organismos que son capaces
de excretar enzimas extracelulares, rindiendo compuestos de menor peso molecular, solubles en
agua. Estos compuestos (mono- y disacridos) son transportados al interior de las clulas
microbianas, donde son degradados por enzimas citoplasmticas.
En general, la complejidad estructural de los compuestos carbonados y su solubilidad en
agua hacen que su facilidad de degradacin responda al siguiente orden (de mayor a menor):
Monosacridos < oligosacridos < almidn < pectinas < hemicelulosas< celulosa <
ligninas
La presencia y distribucin relativa de estos compuestos en los residuos vegetales ser
variable en diferentes ambientes y por lo tanto tambin lo ser la dinmica de su degradacin. A
modo de ejemplo, en un sistema forestal habr mayormente presencia de lignina y menor
cantidad de compuestos carbonados solubles, en contraposicin con un pastizal en donde habr
predominantemente compuestos carbonados solubles (Metting, 1993).
La tasa de descomposicin de la MO est dada por el cambio de la concentracin del
sustrato (S) en el tiempo (t), y puede expresarse como una funcin de todos y cada uno de los
sustratos que son degradados. El tipo de funcin que ms se ajusta para la caracterizacin de
este fenmeno es una ecuacin de primer orden, en la cual la tasa de transformacin del sustrato
S es proporcional a la concentracin del mismo.

Integrando tenemos que:

Cuando se descomponen sustratos complejos las tasas relativas de descomposicin van
disminuyendo con el tiempo, debido a que la composicin del residuo remanente va cambiando.
Los compuestos ms lbiles se descomponen primero, mientras que los ms resistentes y el
material humificado se van acumulando. El material vegetal fresco, por ejemplo, tiene una tasa
de descomposicin elevada, de aproximadamente un 50% por semana, en tanto que la tasa de
descomposicin del humus puede ser de un 3% por ao.
En la figura 1 se grafic una curva tpica de descomposicin de materia orgnica en la
naturaleza:
104


Figura 1. Evolucin de la descomposicin de a materia orgnica expresada como el
cambio en el porcentaje de sustrato remanente en funcin del tiempo.
Adems de la cantidad inicial de sustrato, la tasa de descomposicin depende tambin
del pH, contenido de sales, nutrientes, agua, oxgeno y temperatura. La descomposicin se
inhibe a valores de pH extremos (menores a 4,5 y mayores a 9), y del mismo modo la afectan la
salinidad elevada y la deficiencia de nutrientes, especialmente nitrgeno.

Degradacin de lignina
La lignina se origina a partir de la oxidacin enzimtica de tres precursores fenlicos:
cumaril, coniferil y sinanpil, que difieren en el grado de metilacin. Su formacin resulta de una
serie de uniones al azar y por lo tanto el tipo de uniones que tiene son muy variables (fig. 2).



Figura 2. Esquema de la estructura de la lignina de una confera del gnero Picea.
Fuente: Kluczek-Turpeinen (2007).

Unin aril-glicerol--
aril-ter
Estructura
Dibenzodioxocina
Grupos
Metoxilos
Grupos
Hidroxilos
Grupo
Hidroxi-fenlico
105


Debido a su estructura complicada, su asociacin con celulosa y hemicelulosa (fig. 3),
su insolubilidad en agua y la presencia de estructuras aromticas y uniones no hidrolizables, la
lignina es muy resistente a la degradacin microbiana. Para complicar an ms su
descomposicin, las enzimas necesarias para la degradacin completa solo se inducen en
ausencia de nutrientes fcilmente disponibles, de lo contrario, la degradacin se retarda o resulta
muy lenta.


Figura 3. Esquema de la estructura de lignocelulosa. Fuente: Kluczek-Turpeinen (2007)

La degradacin biolgica de la lignina representa una contribucin muy importante al
ciclo del carbono en la Tierra, y es tambin responsable de la destruccin de la madera y de la
accin de los patgenos vegetales. Adems, los microorganismos degradadores de lignina tienen
un papel relevante en procesos industriales como la industria de papel a partir de pulpa de
madera y el tratamiento de contaminantes orgnicos, tinturas y colorantes. En los estudios de
degradacin se utilizan preparaciones de lignina sinttica marcada con
14
C debido que la
purificacin de la nativa es muy complicada. Uno de esos compuestos es el polmero de
deshidrogenacin (DHP, es su sigla en ingls) que tiene propiedades parecidas a las de la
lignina nativa.

Microorganismos degradadores de lignina
A pesar de su riqueza en carbono, la mayora de los microorganismos no pueden utilizar
a la lignina como nica fuente de carbono y energa. Se considera que, en general, su
depolimerizacin tiene por objeto lograr el acceso a celulosa y hemicelulosa, sustratos de mayor
labilidad frente a la accin microbiana. Los degradadores de lignina ms eficientes son los
hongos basidiomicetes de la denominada pudricin blanca Degradan todos los componentes
de la madera a CO2 y H2O y la misma toma un color blancuzco. Algunos de los hongos que
realizan este proceso son Coriolus versicolor, Pleurotus ostreatus y Phanerochaete
chrysosporium.
Lignina
Celulosa
Regin
amorfa
Regin
cristalina
Hemicelulosa
106

Durante la utilizacin de los azcares de la pared celular se produce H2O2 por accin de
glucosa- y glioxil-oxidasas, inicindose as la oxidacin de la lignina. Es un proceso oxidativo
no especfico, donde se reduce el contenido de grupos metoxilos (grupo metilo unido al
oxgeno), fenlicos y alifticos de la lignina, abriendo los anillos aromticos y formando nuevos
grupos carbonilos (carbono unido al oxgeno por doble enlace), dando como resultado la
depolimerizacin de la molcula y la liberacin de CO2. Los hongos nombrados en el prrafo
anterior secretan enzimas extracelulares tales como lignina peroxidasas (LiP), manganeso
peroxidasas (MnP) y lacasas (fenol oxidasas), realizando la degradacin como parte de su
metabolismo primario y en condiciones de limitacin de nutrientes, sobre todo de nitrgeno. Es
as que el agregado de nitrgeno orgnico al medio de crecimiento reprime la actividad de
degradacin de la lignina por el hongo Phanerochaete chrysosporium. Por otra parte, se observ
que altos niveles de O2 (100%) aumentan la mineralizacin de la lignina cuando el hongo
Phlebia radiata crece en madera de lamo.
Los hongos de la pudricin parda que tambin son basidiomicetes alteran
mnimamente a la lignina por reacciones de hidroxilacin y demetilacin que resultan de la
prdida de estructura de la madera y de celulosa y hemicelulosa, pero no su destruccin total. Se
degradan los polisacridos asociados a la lignina y los grupos CH2 y R-O-R, pero quedan
intactos los grupos fenlicos, los cuales se oxidan tomando un color marrn. El hongo
comestible Agaricus bisporus degrada hasta el 35% de la lignina luego de 80 das de cultivo.
Algunos hongos que forman ectomicorrizas (Cenococcum, Amanita, Tricholoma y Rhizopogon)
mineralizan lentamente la lignina sinttica y la lignina de tallos de maz. Sin embargo, la
eficiencia de este proceso es mucho menor que la de los hongos de la pudricin blanca.
Tambin los hongos que habitan comnmente el suelo realizan una degradacin limitada de la
lignina, fundamentalmente produciendo una demetilacin. Penicillum chrysogenum, Fusarium
oxysporum, F. solani y Pestalotia oxyanthi mineralizan del 2 al 9% del
14
C de la lignina en 28
das. Lacasas, peroxidasas y la produccin de radicales superxido e hidroxilos participan en
esta actividad.
Las bacterias capaces de degradar lignina pertenecen a los actinomycetes filamentosos
del gnero Streptomyces. Esta bacteria Gram positiva puede solubilizar hasta el 45% de la
lignina presente en un precipitado soluble en agua, obtenido por tratamiento con cido, y es
capaz de mineralizar el 3% del
14
C luego de 21 das.
En ambientes acuticos tambin son los hongos los ms importantes degradadores de la
lignina. Se ha informado que varias especies de hongos marinos son capaces de mineralizar
entre el 4-5% de la lignina de especies de arce y abeto, luego de 30 das de cultivo. El
ascomicete marino Sordaria fimicola mineraliz hasta el 10% de la lignina sinttica cuando
creci en un medio con poco nitrgeno y suplementado con sales marinas.
Algunos de los compuestos simples producidos a partir de la descomposicin de la
lignina son la vainillina, el cido vainillnico y el cido ferlico (fig. 4). Estos compuestos
pueden ser utilizados como fuente de carbono por algunos hongos, transformndolos en cido
protocatquico. Los compuestos fenlicos derivados de la descomposicin de la lignina son los
precursores de la formacin del humus.
La descomposicin procede en aerobiosis, mientras que en ambientes anaerbicos
prcticamente no se detecta descomposicin de lignina. Tambin puede ocurrir la degradacin o
transformacin abitica bajo condiciones y ambientes especiales, por ejemplo bajo la accin de
la radiacin UV.

107


Figura 4. Descomposicin de la lignina

Formacin de las sustancias hmicas.
Las sustancias hmicas (SH) son los materiales orgnicos ms ubicuos y ampliamente
distribudos existentes en ambientes terrestres y acuticos. Cuando hablamos de SH nos
referimos a compuestos de alto peso molecular, de color marrn oscuro que son ricos en grupos
aromticos. Se originan de materia orgnica vegetal, animal y microbiana. Adems del suelo,
podemos encontrar SH en lagos, ros, compost, sedimentos y turberas. Los productos de la
descomposicin de la lignina y los polisacridos de las paredes celulares son dos de sus
principales precursores. En una primera etapa se rompen las uniones glicosdicas entre la lignina
y los polisacridos. Luego, la lignina pierde sus grupos metoxilos y fenlicos, aumentando su
proporcin de grupos carboxilos y carbonilos. A este proceso se lo denomina Humificacin, y
depende de la descomposicin de componentes de origen vegetal de alto y bajo peso molecular
y la sntesis de componentes celulares microbianos. Durante la descmposicin de los tejidos
vegetales el 70% del carbono orgnico se mineraliza, mientras que la lignina se une
covalentemente a las SH. De modo que una parte de la lignina se degrada mientras que otra, al
mismo tiempo, sufre una nueva polimerizacin.
Los residuos nuevos y antiguos se van combinando al azar, con restos de materia
orgnica fresca, formando un cuerpo muy complejo. Restos de pared celular o fracciones
citoplasmticas de diferentes organismos se unen a los polmeros fenlicos, y de esta manera se
estabilizan y quedan protegidos de la degradacin microbiana. Todos estos procesos son
extremadamente lentos, y la acumulacin de una cantidad considerable de humus puede
verificarse luego de 100 o 10.000 aos de acuerdo a las condiciones ambientales. El tiempo
medio de permanencia de estos compuestos en el suelo oscila entre 200 a 2.000 aos. El humus
del suelo representa la materia orgnica natural ms abundante en los ecosistemas terrestres,
108

constituyendo una de las mayores reservas de carbono orgnico del suelo (aproximadamente 3 x
10
12
toneladas) (Yanagi et al., 2008).
En un lapso relativamente corto, de 0 a 9 aos, se pierde a la atmsfera en forma de CO2
el 90% del C incorporado al suelo como materia orgnica (por ejemplo, restos de cosechas o
rastrojos). El 10% que permanece en el suelo luego de diez aos constituye el residuo que no es
ni fcil, ni rpidamente utilizable como fuente de energa por los microorganismos (humus), el
cual se acumula lentamente, y constituye la mayor parte de la MO del suelo, conteniendo ms
del 90% del C y del N del mismo.
El proceso de humificacin es una transformacin de la estructura de los compuestos
orgnicos, que supone una disminucin progresiva de los ms lbiles, junto con un aumento de
estructuras aromticas ms complejas, dando macromolculas con mayor resistencia a la
biodegradacin. La diversidad de los precursores orgnicos y la cantidad de factores y
condiciones que intervienen en el proceso dan lugar a que no exista una nica estructura
molecular, sino distintas estructuras macromoleculares, como ocurre con la lignina (Labrador
Moreno, 1996). Es por ello que la estructura del humus es extremadamente compleja y
heterognea.
La humificacin se considera un proceso anlogo a la sntesis de lignina, donde los
precursores son producidos o alterados enzimticamente y la sntesis resulta de la condensacin
en molculas ms grandes. Una de las teoras de la formacin del humus establece que lignina y
protenas de la materia orgnica se condensan para formar cidos hmicos (AH) (fig. 5). Esta
teora se ha denominado Teora de la lignina para explicar la formacin de la MO del suelo.
Sin embargo, no permite explicar la formacin de sustancias hmicas en los ocanos, donde no
existe lignina.

Figura 5. Formacin de sustancias hmicas por reaccin entre productos de la
descomposicin del fenol con aminocidos y compuestos alifticos. Fuente: Paul, 2007.

Actualmente se considera que la Teora de los Polifenoles es la ms aceptable para
explicar la formacin del humus. Los compuestos fenlicos se pueden polimerizar en forma
qumica, por condensacin o a travs de radicales libres, o pueden hacerlo enzimticamente. Las
mayores fuentes de fenoles durante la descomposicin de la materia orgnica son:
109

1. Polifenoles derivados de la degradacin de la lignina.
2. Polmeros fenlicos (melaninas) sintetizadas por muchos hongos, actinomicetes
y bacterias, a partir de compuestos alifticos diferentes de la lignina.
3. Polifenoles de origen vegetal diferentes a la lignina. Esta fuente puede ser
importante en bosques con mucho aporte de materia orgnica.
No todos estos polifenoles son estables, sino que pueden ser degradados por los
microorganismos del suelo. Alternativamente, pueden sufrir recombinacin, frecuentemente
convirtindose en quinonas. La oxidacin puede ser espontnea, o mediante peroxidasas o
fenoloxidasas sintetizadas por muchos microorganismos. Las quinonas sufren condensacin o se
combinan con compuestos aminados para formar polmeros conteniendo nitrgeno.
Estructura del humus segn la solubilidad o no de los productos luego del
tratamiento con lcali y cidos
En la estructura heterognea que es el humus se reconocen diferentes fracciones sobre la
base de la solubilidad en cidos y lcali:
1. cidos flvicos (AF): Constituyen molculas de peso molecular entre 1.000 y
30.000. Son solubles en NaOH, mantenindose solubles a pH 2,0. Estn formados
por series de anillos aromticos altamente oxidados, con numerosas cadenas
laterales. Se forma a partir de benceno y cidos fenlicos. Las molculas se unen
entre s a travs de uniones puente de hidrgeno.
2. cidos hmicos (AH): tambin se extraen en solucin alcalina, pero precipitan a
pH 2,0. Su peso molecular oscila entre 10.000 y 100.000. Contienen anillos
aromticos y compuestos nitrogenados cclicos. Se unen a cadenas de pptidos y su
estructura an no se conoce. Estos humatos se unen a arcillas a travs de cationes
polivalentes, como calcio y magnesio.
3. Humina: no es extrable con NaOH. Est formada por cidos flvicos y cidos
hmicos combinados con materia orgnica insoluble en diferentes estados de
descomposicin. Es una sustancia extremadamente compleja y heterognea, y
constituye la mayor parte de la materia orgnica del suelo.

Biodegradacin de las sustancias hmicas. La deshumificacin.
El humus es tambin muy resistente a la degradacin biolgica. Sin embargo, existen
muchos microorganismos que pueden descomponer lentamente los AH. Los ms activos son los
hongos basidiomicetes y los actinomicetes, quienes tambin descomponenen la lignina. Su
degradacin, al igual que la de la lignina, ocurre bajo condiciones de co-metabolismo, en
presencia de fuentes de carbono fcilmente asimilables, tales como glucosa y pentosas, aunque
existen excepciones. El primer estudio que demostr la degradacin microbiana de los AH fue
el de Hurst y col. (1962), que informaron que los hongos basidiomicetes que colonizan madera
Trametes versicolor y Hypholoma fasciculare fueron capaces de decolorar los AH del suelo.
Esto tambin se observ con Streptomyces y fue asociado a la actividad de peroxidasas (Dari et
al., 1995) siendo mayor la degradacin bajo condiciones de burbujeo con oxgeno y dependiente
de la adsorcin de los AH a la superficie de la clula microbiana.Tambin fue necesaria la
presencia de glucosa en el medio, ya que sin ella no hubo degradacin.
Por su parte Gramss et al. (1999) aislaron hongos y bacterias capaces de degradar una
fraccin hmica que se obtuvo por solubilizacin en lcali (cidos hmicos). Esos
microorganismos fueron identificados como hongos basidiomicetes degradadores de maderas,
110

hongos formadores de ectomicorrizas, microhongos, y eubacterias. La degradacin tambin se
asoci con la actividad de peroxidasas, -glucosidasas y la accin de oxidantes abiticos como
el perxido de hidrgeno.


A continuacin se presenta un estudio de caso de la degradacin de AH por un hongo
habitante del suelo.
Degradacin de cidos hmicos por el hongo basidiomicete Collybia dryophila.
Steffen y col. (2002) Degradation of humic acids by the litter-decomposing
basidiomycete Collybia dryophila. App. Environ. Microbiol. 68: 3442-3448.
El trabajo que analizaremos es muy interesante ya que, en general, los microorganismos
que degradan AH tienen su hbitat en maderas, troncos, etc., y por lo tanto dicha actividad se
halla muy relacionada con la lignolisis. Sin embargo, Steffen et al. (2002) estudiaron la
capacidad de degradar AH del hongo basidiomicete Collybia dryophila que es un habitante del
suelo, y que no sera considerado un hongo lignoltico en sentido estricto.
Este hongo es una especie muy comn en bosques de Europa y Norteamrica, creciendo
en diferentes estratos de la broza de conferas y otros rboles de hojas caducas. Fue aislado de
basidiocarpos y se creci en un sustrato compuestopor acculas, ramas, musgo y partculas de
suelo rico en humus. Los aislamientos obtenidos se crecieron en agar extracto de malta al 2%,
con el agregado de cloranfenicol y benomil para inhibir el crecimiento de bacterias y hongos,
respectivamente. Los AH que se utilizaron en esta investigacin se obtuvieron por extraccin
alcalina de la broza depositada en el suelo del bosque. Para estudiar la mineralizacin se
utilizaron AH marcados con
14
C, midindose la liberacin de
14
CO2 y tambin, midiendo la
decoloracin (A 450 nm) en medio lquido. La decoloracin se produce por la depolimerizacin
de los AH y su conversin en otros compuestos. Otro aspecto estudiado en este trabajo fue la
necesidad o no de la presencia de Mn
2+
para la mineralizacin de los AH.
En la figura 6 se muestran los resultados obtenidos con y sin agregado de Mn
2+
al medio
de cultivo. Sin Mn
2+
el hongo mineraliz cerca del 20 % de los AH, mientras que el 35 % lo
incorpor en su biomasa o qued estrechamente unido a la superficie celular. El agregado de
Mn
2+
al medio de cultivo indujo un aumento en la degradacin de aproximadamente un 50% y
adems, redujo la cantidad de AH asociados al micelio del hongo (dato no mostrado).
En estudios previos de otros autores, se observ que enzimas extracelulares del tipo de
lacasas y peroxidasas estaran involucradas en la mineralizacin de los AH, y que las mismas
necesitan de la presencia de Mn
2+
para exhibir su mayor actividad. Analizando los resultados de
la figura 6 podemos concluir que los mismos coinciden con los antecedentes previos que haba
en la literatura.

111



Figura 6. Mineralizacin de 14C-cidos hmicos por Collybia dryophila en cultivo lquido.
Crculos llenos: hongo en medio suplementado con Mn
2+
; crculos vacos: hongo en medio sin
suplemento de Mn
2+
, diamantes: control, sin hongo. Los datos son el promedio de tres repeticiones
y las barras el desvo estndar.

Los resultados del estudio enzimtico se muestran en la figura 7. El hongo C. dryophila
excret al medio una peroxidasa dependiente de la presencia de Mn
2+
(Mn-peroxidasa) y una
lacasa. La disponibilidad de manganeso result crtica para la actividad de la peroxidasa. Las
actividades de ambas enzimas fueron muy bajas sin el agregado de Mn
2+
, 30 U/l para la Mn-P y
9 U/l para la lacasa (fig. 7 A). Con el agregado de Mn
2+
la actividad de la peroxidasa aument
significativamente (de 30 U/l a 80 U/l), mientras que la actividad de la lacasa no se vio
modificada (fig. 7 B). La presencia de AH en el medio de cultivo tambin estimul la actividad
de ambas enzimas (figura 7 C), obtenendose los valores ms altos cuando el medio tena Mn
2+

y AH (fig. 7 D).
Los resultados obtenidos pusieron en evidencia la capacidad de este hongo para
mineralizar AH tanto naturales como los sintticos, siendo esto ltimos preparados a partir de
catechol. Los autores concluyen que este hongo podra jugar un rol importante en el reciclado
del carbono orgnico que forma parte del humus del suelo y que adems podra tener
promisorias aplicaciones biotecnolgicas.

Mineralizacin de las sustancias carbonadas y la fertilidad de los suelos
Los microorganismos que mineralizan las sustancias carbonadas de los materiales
vegetales en el suelo son comunes en reas de cultivo y en zonas forestales as como en tejidos
vegetales en descomposicin. La microflora responsable presenta una alta heterogeneidad
fisiolgica, lo cual permite que este tipo de transformaciones tenga lugar en hbitats muy
diversos: sitios con o sin O2, en medios de pH cido o alcalino, y temperaturas cercanas al punto
de congelacin y hasta los 65C. Por todo esto, entre las bacterias celulolticas hay especies
mesoflicas, aerobias y anaerobias, hongos filamentosos, bacterias termoflicas y actinomicetes.
En condiciones naturales ellos ejercen una accin comn, en diferentes momentos y
condiciones, siendo el resultado final el producto de estas complejas comunidades.
112

Los microorganismos aerobios convierten la celulosa en: CO2 + H2O + material celular (nuevas
clulas en crecimiento). Las sustancias carbonadas extracelulares producidas pueden
constituirse en elementos cementantes, tales como cpsulas, gomas y muclagos microbianos.
Los mismos favorecen a la estructuracin del suelo pues mantienen las distintas partcul
edficas unidas y/o cementadas formando los agregados.


En general, los hongos son los principales causantes de la degradacin de la celulosa en
suelos hmedos y en zonas forestales, mientras que las bacterias tienen mayor peso en los
suelos bajo cultivos agrcolas y en las zonas semiridas. Hemos discutido que muchos hongos
parecen ser capaces de descomponer los restos leosos y la madera de los bosques as como de
degradar totalmente la celulosa, lo que marca un contraste con las bacterias, porque en ellas, la
posesin de todas las enzimas necesarias para degradar la celulosa es bastante rara.
En anaerobiosis las bacterias celulolticas, mayormente miembros del gnero
Clostridium, descomponen la celulosa con produccin de cidos orgnicos: actico, frmico,
lctico y butrico, que resultan un buen sustrato para otros microorganismos del suelo, y que si
persisten las condiciones anaerobias, esos cidos grasos voltiles (AGV) pueden dar lugar a la
Figura 7. Actividad de Mn-peroxidasa (crculos llenos) y lacasa (diamantes llenos) del
cultivo de C. dryophila en medio lquido y decoloracin de los AH de la broza
(diamantes vacos). Los datos corresponden al promedio de tres repeticiones y las
barras al desvo estndar. A: medio sin Mn
2+
ni HA. B: medio con 200 M de Mn
2+

(MnCl2) sin AH. C: medio con 250 mg de AH pero sin Mn
2+
. D: medio con 200 M de
Mn
2+
(MnCl2) y 250 mg de AH. C y D: decoloracin de los AH por medicin de la
disminucin de la absorbancia a 450 nm. Cada dato corresponde al promedio de tres
repeticiones y las barras al desvo estndar.

Das de cultivo Das de cultivo
M
n
-
p
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o
x
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A
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n
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4
5
0

n
m


113

generacin de metano. Estos microorganismos se hallan en suelos anegados, micrositios
anaerobios de suelos aerobios, fango de ros y cinagas. Los microorganismos anaerobios tanto
mesfilos como termfilos, al liberar compuestos que sern sustrato para otros
microorganismos, contribuyen con fuentes de energa para el reciclado de los nutrientes.
En todos los procesos mencionados, no slo los factores ambientales, como rangos de
pH y temperatura, afectarn la velocidad de reaccin de las enzimas implicadas, sino que la
velocidad de desaparicin del sustrato o formacin de productos, estar regida tambin por el
tipo de suelo, estacin del ao, y tipos de vegetacin (Alexander, 1980). Las enzimas presentes
en el suelo pueden provenir de diversos orgenes (Meeting, 1993). Sin embargo, debido a que la
mayora y de las enzimas son de origen microbiano, otros factores que rigen el tamao de la
comunidad tendrn influencia en la actividad enzimtica (Alexander, 1980).

Degradacin de restos orgnicos en condiciones anaerobias. La produccin de
Biogs y su aprovechamiento.

La digestin anaerbica de la materia orgnica es un proceso que ocurre en forma
espontnea en la naturaleza y forma parte del ciclo biolgico del Carbono. Gracias a las enzimas
de los diferentes microorganismos, los residuos orgnicos sufren reacciones de hidrlisis,
fermentacin, acetognesis y metanognesis (Brock, Biologa de los Microorganismos, 2008)
(fig.1). La interaccin que se establece entre diferentes grupos metablicos de procariotas
permite la generacin de metano (biogs) a partir de sustancias de elevado peso molecular.
En la hidrlisis de los polmeros participa un consorcio complejo de microorganismos
cuyas enzimas extracelulares (celulasas, celobiasas, xilanasas, amilasas, lipasas y proteasas)
hidrolizan las molculas complejas. La molcula de celulosa es hidrolizada en celobiosa y
glucosa libre. Hasta cinco grupos metablicos de procariotas pueden participar de la
fermentacin de la celulosa. La mayor parte de estos microorganismos son bacterias anaerobias
estrictas tales como las pertenecientes a los gneros Acetovibrio, Clostridium y Ruminococcus.
Tambin actan algunas bacterias anaerobias facultativas como Pseudomonas (Doi 2008). A
este grupo de bacterias se las denomina celulolticas e hidrolticas.
Los monmeros resultantes de la hidrlisis de las molculas complejas, por accin de
las bacterias fermentadoras primarias, dan lugar a la aparicin de H2 y CO2, cido actico y
cidos grasos voltiles (AGV: propinico, butrico y succnico) (fig. 1). Posteriormente, por un
segundo proceso de fermentacin, enelque actan bacterias oxidantes de AGV y productoras de
H2, esos AGV son transformados en acetato, CO2 e H2, y finalmente, las arqueas metangenas
convierten esos productos en gas metano (fig. 1).
Otra alternativa es la produccin de metano directamente a partir de acetato. Esto se
debe a la accin de bacterias fermentativas sobre los monmeros y la consecuente produccin
de CO2 e H2. Luego, actan bacterias homoacetognicas que sintetizan acetato, el cual
finalmente es reducido a metano por las arqueas metanognicas (fig. 1).
El biogs, formado por una mezcla de metano (CH4), dixido de carbono (CO2) y
diversas impurezas, es un combustible renovable de alta calidad que se obtiene cuando los
microorganismos descomponen la materia orgnica en ausencia de oxgeno. La produccin de
metano la realizan los metangenos, microorganismos del dominio Archaea, los cuales son
anaerobios estrictos. La mayora de ellos usan al CO2 como aceptor final de electrones en la
respiracin anaerbica, reducindolo a CH4 y el donante de electrones es generalmente el H2. La
reaccin en esta va metablica es la siguiente:
114



Tambin otros sustratos pueden convertirse a metano, por ejemplo el metanol (CH3OH),
el formiato (HCOO

) y las metilaminas. La produccin de CH4 depende de la generacin de

esos sustratos por otros microorganismos que descomponen la materia orgnica compleja en
condiciones de anaerobiosis.
Todo el H2 que producen los procesos fermentativos primarios es consumido
inmediatamente por las arqueas metanognicas, las homoacetognicas o las reductoras de
sulfato (en ambientes con altas concentraciones de sulfato).

Los organismos que resultan clave en la conversin de la materia orgnica compleja en metano
son los fermentadores secundarios, especialmente las bacterias oxidadoras de los AGV
productoras de H2 (fig. 1). Las bacterias productoras de H2 ven favorecido su crecimiento
cuando se asocian con organismos consumidores de H2 (ej. metangenas, homoacetgenas y
reductoras de sulfato). Bacterias de los gneros Syntrophomonas y Syntorphobacter realizan
estas fermentaciones secundarias y su nombre se debe a la necesidad que tienen de establecer
relaciones sintrficas con otras bacterias, las cuales consumen el H2 que ellas producen. Estas
reacciones de transferencia interespecfica de hidrgeno son las que determinan la velocidad de
la conversin de los polmeros complejos en metano. Salvo la microbiota celuloltica, los
restantes grupos microbianos dependen unos de otros, transfirindose el H2 entre especies hasta
llegar a la formacin de CH4 (fig.1). En general, en la naturaleza, las comunidades sintrficas
forman sedimentos u otros agregados que contienen varios productores y consumidores de H2
asociados.
Hbitats de microorganismos metanognicos
Estos organismos tienen una amplia distribucin en la Tierra. Los eructos de los
rumiantes y el CH4 liberado en las zonas pantanosas y encharcadas son las fuentes principales
de metano. Sin embargo, existen otros hbitats considerados xicos donde la produccin de
metano se lleva a cabo en microambientes anxicos (por ej., en el interior de un agregado de
suelo).
La produccin de metano puede ser abiognica (minera del carbn, escapes
industriales, combustin de biomasa, volcanes, etc.) o biognica (rumiantes, termites, suelo
pantanosos, humedales, vertederos de basura, etc.). En ambientes acuticos tambin existe
metanognesis, sobre todo de aguas dulces. Los valores elevados de sulfato en aguas y
sedimentos marinos determinan que el acetato y el H2 sean utilizados por las bacterias
reductoras de sulfato, las cuales son mejores competidoras que las metanognicas por esos
sustratos.
Cultivo de microorganismos metanognicos
Se ha aislado una gran variedad de metanognicos pertenecientes a diferentes gneros,
los cuales morfolgicamente pueden presentarse como bacilos cortos o largos, cocos en varios
tipos de agrupaciones, filamentosos y algunos tienen forma de placa. El crecimiento de estos
microorganismos se ve estimulado cuando en el medio hay tambin acetato, mientras que
algunas especies requieren de la presencia de aminocidos. Bajo condiciones de laboratorio
115

algunos metanognicos necesitan de agregados complejos como el extracto de levadura
Polmeros complejos
Monmeros
H
2
+ CO
2
Acetato AGV= Propionato;
Butirato; Succinato y
Alcoholes
Acetato
CH
4
H
2
+ CO
2
Acetato
Celulosa, otros polisacridos,
protenas y lpidos
Bacterias celulolticas y
otras bacterias hidrolticas
Hidrlisis
Azcares, aminocidos
Bacterias fermentativas Fermentacin
Acetognesis
Fermentacin
Metanognesis
Metangenos
Metangenos
Bacterias oxidantes de
cidos grasos y productoras
de H
2
(sintrofos)
Metangenos
Homoacetgenos


o hidrolizados de casena. Por su parte los microorganismos metanognicos del rumen
necesitan para crecer una mezcla de cidos grasos de cadena ramificada. Como fuente de
nitrgeno utilizan el NH4
+
, y algunos fijan N2. Adems, muchos requieren de la presencia de Fe,
Co y Ni para un adecuado crecimiento.

Composicin del Biogs
La composicin del biogs depende del tipo de residuo orgnico utilizado para su
produccin y de las condiciones en que ese residuo se procesa. En el cuadro 1 se resume la
composicin promedio del biogs segn la fuente que lo origina. El valor calorfico vara entre
17 y 34 MJ/m3 segn el contenido de CH4. La mezcla de gases obtenida debe purificarse si va a
ser utilizada como combustible en motores de explosin. Para ello se eliminan el gas carbnico
haciendo burbujear el biogs a travs de agua y el cido sulfhdrico hacindolo burbujear a
travs de una solucin de soda custica en agua que contiene sulfato de cobre disuelto, o
pasndolo por una trampa de limadura de hierro (esponjilla de alambre), o con la introduccin
de pequeas cantidades de aire (3% a 5% del volumen del depsito para el biogs) reduciendo
as en un 95% el cido sulfhdrico producido. La humedad se elimina circulando el biogs entre
cloruro de calcio o silica gel.

Principales factores que afectan a la produccin de biogs en un digestor
Diversos factores afectan a la actividad metablica microbiana involucrada en el
proceso metanognico. Los ms importantes son: el tipo de sustrato o materia prima (nutrientes
disponibles), el nivel de acidez (pH), la temperatura del sustrato, la agitacin o el grado de
mezclado, el tiempo de retencin (TR), la presencia de compuestos inhibidores y la relacin
Figura 1. Descomposicin anaerbica de la materia orgnica y produccin de metano. Fuente: Brock,
Biologa de los Microorganismos, Cap. 14, Edicin 2008).

116

Carbono/Nitrgeno. A continuacin se detallan cmo influyen cada uno de estos factores en la
produccin de biogs.
Tipo de materia prima: La materia prima fermentable puede ser desechos agrcolas, lodos
cloacales, aguas residuales orgnicas de las industrias y basuras de diferentes tipos (cuadro 1).
El proceso microbiolgico requiere de fuentes de carbono y nitrgeno y tambin de sales
minerales (azufre, fsforo, potasio, calcio, magnesio, hierro, manganeso, molibdeno, zinc,
cobalto, selenio, tungsteno, nquel y otros). Normalmente las sustancias orgnicas como el
estircol y lodos cloacales presentan estos elementos en proporciones adecuadas. Sin embargo,
en la digestin de ciertos desechos industriales puede ser necesaria la adicin de los metales
enumerados.
Las sustancias con alto contenido de lignina deben someterse a tratamientos previos (cortado,
macerado, compostado) a fin de liberar los componentes que puedan ser transformados. En lo
atinente a estircol animal la degradacin depender fundamentalmente del tipo de animal y de
la alimentacin que haya recibido. A modo ilustrativo, el cuadro 2 muestra la cantidad de
estircol producido por distintos tipos de animales y el rendimiento en gas en litros (L) tomando
como referencia el kilogramo de slidos voltiles (Kg.S.V).
pH: El pH ptimo para la digestin est entre 7,0 y 7,2, aunque el rango satisfactorio va de 6,6 a
7,6. La digestin microbiana comienza a inhibirse a pH 6,5. Una vez que se ha estabilizado un
digestor, el lodo queda amortiguado, es decir la concentracin de protones no vara aun cuando
se aadan cantidades relativamente grandes de cido o lcali. Si esta capacidad de
amortiguacin se destruye y el pH disminuye cesa la metanognesis. Las bacterias
metanognicas solo podrn multiplicarse cuando haya avanzado la fermentacin de los
substratos primarios por accin de las bacterias fermentativas y se haya consumido todo el
oxgeno disuelto, de manera que el potencial redox haya alcanzado un valor menor a -200 mV.
El pH no debera bajar demasiado (por ejemplo debido a los cidos producidos por los
Clostridium) como para inhibir el crecimiento de las bacterias metanognicas. La concentracin
de cidos grasos voltiles no debera superar los 2 a 3 g/L, expresados como cido actico. Si el
valor es mayor, la digestin se interrumpir en dos o tres das debido a que los metanognicos
no pueden utilizar los cidos a la misma velocidad con que stos se producen.
Cuadro 1. Composicin del biogs en funcin del sustrato fermentado. Fuente: Adaptado de
Carrillo Leonor, Microbiologa Agrcola, Universidad Nacional de Salta.

Gases Desechos
agrcolas
Lodos
cloacales
Rellenos
sanitarios
Propiedades
Metano 50-80% 50-80% 45-65% combustible
CO2 30-50% 20-50% 34-55% cido, asfixiante
Vapor de agua saturacin saturacin saturacin corrosivo
Hidrgeno 0-2% 0-5% 0-1% combustible
H2S 100-7000ppm 0-1% 0,5-100ppm corrosivo, olor, txico
117

Amonaco trazas trazas trazas corrosivo
CO 0-1% 0-1% Trazas toxico
Nitrgeno 0-1% 0-3% 0-20% inerte
Oxgeno 0-1% 0-1% 0-5% corrosivo


Cuadro 2. Cantidad de estircol producido segn la especie animal y caractersticas del mismo.
Fuente: INTA.
Especie Peso Vivo Kg. Estircol/da L/Kg.S.V % CH4
Cerdos 50 4,5-6 340-550 65-70
Vacunos 400 25-40 90-310 65
Equinos 450 12-16 200-300 65
Ovinos 45 2,5 90-310 63
Aves 1,5 0,06 310-620 60
Caprinos 40 1,5 110-290 --

Temperatura: Las bacterias metanognicas son sumamente sensibles a los cambios
ambientales, especialmente a una disminucin repentina de solo unos pocos grados de
temperatura. La actividad biolgica y por lo tanto la produccin de gas aumenta con la
temperatura. Se debe tener en cuenta que a diferencia de la digestin aerbica, la cual produce
desprendimiento de calor, la fermentacin no lo produce. Por ello los digestores que trabajan a
temperaturas meso y termoflicas poseen generalmente sistemas de calefaccin, aislamiento y
control, los cuales podran ser obviados en digestores rurales econmicos logrndose una menor
eficiencia en la produccin de biogs.
La gama de temperatura para la digestin anaerbica tiene dos zonas ptimas una
mesfila (30-40C) y otra termfila (45-60C). Casi todos los digestores funcionan dentro de los
lmites de temperaturas mesfilas y la digestin ptima se obtiene a 35C. La velocidad de
digestin a temperaturas superiores a 45C es mayor que a temperaturas ms bajas. A
temperaturas superiores a 60C la produccin de CH4 decae rpidamente.
Agitacin mezclado: Los objetivos buscados con la agitacin son la remocin de los
metabolitos producidos por las bacterias metanognicas, el mezclado del sustrato fresco con la
poblacin bacteriana, evitar la formacin de costras que se forman dentro del digestor,
uniformar la densidad bacteriana, evitar la formacin de espacios muertos sin actividad
biolgica y aumentar la produccin de biogs. Existen varios mecanismos de agitacin
utilizados desde los ms simples que consisten en un agitado-mezclado manual o el provocado
por la entrada y salida de los lquidos, hasta el uso de equipos sofisticados que involucran
agitadores a hlice, recirculadores del sustrato e inyectores de gas.
118

Tiempo de retencin (TR): Es el tiempo medio de permanencia del sustrato en el reactor
o digestor, para ser degradado por la accin de los microorganismos. El TR est ntimamente
ligado con dos factores: el tipo de sustrato y la temperatura del mismo. Su valor puede ser
obtenido dividiendo el valor de la capacidad del biodigestor por la tasa a la cual la materia
orgnica es introducida en el digestor. La seleccin de una mayor temperatura implicar una
disminucin en los TR requeridos y consecuentemente sern menores los volmenes de reactor
necesarios para digerir una determinada cantidad de material. En un digestor donde los residuos
permanecen 12 das la produccin de gas por unidad de slidos voltiles totales aadidos
diariamente es 20% mayor a 45C que a 35C.
En los climas clidos los digestores pueden funcionar sin calefaccin pero hay que aumentar el
tiempo de retencin. La regulacin de la temperatura puede lograrse haciendo circular agua
caliente a travs del tanque por medio de termointercambiadores.
Inhibidores: Los microorganismos metanognicos son considerados ms sensibles a
inhibidores que los otros microorganismos participantes en el proceso de degradacin
anaerbica. La presencia de metales pesados, antibiticos y detergentes pueden inhibir e incluso
interrumpir el proceso fermentativo. Cuando es demasiado alta la concentracin de cidos
voltiles (ms de 2.000 ppm para la fermentacin mesoflica y de 3.600 ppm para la termoflica)
se inhibir la digestin. Tambin una elevada concentracin de nitrgeno y amonaco destruye a
las bacterias metanognicas. Los organismos metanognicos son sensibles a los antibiticos que
afectan la sntesis de protenas o lpidos y a los que interfieren con la funcin de la membrana
citoplasmtica. Los antibiticos empleados en las explotaciones agropecuarias llegan a los
excrementos animales pero, como ocurre tambin con los antihelmnticos, no suelen afectar
mayormente la digestin debido a la dilucin con materiales no txicos.
Relacin C/N: Una relacin C/N de 16/1 se considera ptima para una buena
produccin de gas y para una fermentacin estable de los excrementos animales, aunque puede
obtenerse biogs a valores mayores de relacin C/N sta no debera superar el valor 30/1. En el
cuadro 3 se muestra la relacin C/N de varios materiales residuales.
Cuadro 3. Relacin C/N de diversos materiales utilizados como sustratos en un biodigestor.
Fuente: Adaptado de Carrillo Leonor, Microbiologa Agrcola, Universidad Nacional de Salta.
Contenido de nitrgeno y relacin C/N en varios residuos
De origen animal C/N %N De origen vegetal C/N %N
Estircol equino 25 2,3 Heno 12 4
Estircol vacuno 18 1,7 Alfalfa 16-20 2,4-3
Estircol de corral 14 2,15 Algas marinas 19 1,9
Heces humanas 6-10 5,5-6,5 Restos de lino 58 1,0
De origen domstico Paja de trigo 128 0,3
Basura en general 25 2,2 Aserrn 511 0,1
Cscara de papas 25 1,5


119

Condiciones para la utilizacin del biogs
Cuando el CH4 se produce en contenedores cerrados, llamados biodigestores, ste puede
ser utilizado directamente como combustible en reemplazo del gas natural o bien
indirectamente, para generar energa elctrica. La construccin de biodigestores ha sido una
prctica antigua en varias zonas rurales del mundo, especialmente en Asia. En los ltimos aos
en Amrica Latina ha crecido el inters por esta tecnologa para generar combustible y tratar
ecolgicamente los residuos orgnicos.
El proceso en un biodigestor difiere de otros tipos de fermentaciones ya que no es
necesario utilizar cultivos puros de microorganismos. Las diversas bacterias capaces de
descomponer las sustancias orgnicas y producir biogs estn ampliamente distribuidas en la
naturaleza y son aportadas en los mismos residuos orgnicos en descomposicin. Pueden
emplearse diversos materiales orgnicos tales como residuos vegetales, estircol, basura
domstica, algas, efluentes de las industrias de alimentos, etc.
Durante la bioconversin de materiales orgnicos a CH4, las diferentes etapas tienen
distinta velocidad: la degradacin de la celulosa ocurre en semanas, la de las hemicelulosas y
protenas en das y la de las molculas pequeas, como azcares, cidos grasos y alcoholes, en
horas. En cambio la lignina no es degradada en la mayora de los sistemas de digestin
anaerbica.

Aplicaciones del Biogs
La aplicacin del biogs en el rea rural ha sido muy importante y dentro de ella se
pueden diferenciar dos campos claramente distintos. En el primero, el objetivo buscado es
producir energa, sanidad y fertilizantes orgnicos para los agricultores de zonas marginales o
para el productor medio de los pases con sectores rurales de muy bajos ingresos y difcil acceso
a las fuentes convencionales de energa. En este caso la tecnologa desarrollada ha buscado
lograr digestores de mnimo costo y mantenimiento, fciles de operar pero con eficiencias
pobres y bajos niveles de produccin de energa.
El segundo tipo de tecnologa est dirigido al sector agrcola y agroindustrial de
ingresos medios y altos. El objetivo buscado en este caso es brindar energa y solucionar graves
problemas de contaminacin. Los digestores de alta eficiencia desarrollados para esta aplicacin
tienen un mayor costo inicial y poseen sistemas que hacen ms complejo su manejo y
mantenimiento.

CAPTULO 8
LOS MICROORGANISMOS Y EL NITRGENO
Ciclo del Nitrgeno. Utilizacin del nitrgeno por los microorganismos: formas nitrogenadas
orgnicas e inorgnicas del suelo. Mineralizacin: aminizacin, amonificacin. Inmovilizacin.
Nitrificacin. Desnitrificacin. Fijacin biolgica simbitica de nitrgeno: mtodos de
medicin. Biologa de Rhizobium y Bradyrhizobium. Grupos de inoculacin cruzada.
Mecanismo de infeccin en la interaccin rizobio-leguminosa. Regulacin gnica de la
nodulacin. Regulacin de la fijacin de nitrgeno. Produccin de inoculantes para
leguminosas. Otras asociaciones microbianas de importancia agrcola. Fijacin simbitica de
nitrgeno: Frankia. Fijacin no simbitica de nitrgeno: Azospirillum, Azotobacter.
120

Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los
Microorganismos, 8
a
edicin. Prentice Hall.
Captulo 14 (14.14 y 14.23)

Introduccin
El nitrgeno (N) es un nutriente esencial para el crecimiento de todos los organismos
vivos ya que forma parte de las molculas de protenas, cidos nucleicos y muchas otras de
mediano y bajo peso molecular, indispensables para el normal desarrollo del metabolismo
celular. Constituye entre el 0,3% y el 5% del peso seco de los vegetales.
El 98% del N de la tierra se encuentra formando parte de rocas y minerales de la corteza
y por lo tanto no asequible para los organismos vivos. Solamente el 0,01% del N en la tierra se
encuentra en la biosfera, como componente de los organismos vivos. Por otra parte, a pesar de
que aproximadamente el 78% de la atmsfera terrestre est formada por N2, ste constituye
solamente el 1,9% de la masa total de N en la Tierra.
El N atmosfrico se encuentra mayoritariamente en forma de N2, con los dos tomos de
N unidos covalentemente por medio de una triple ligadura. Esta molcula slo puede ser
metabolizada por algunos microorganismos, por lo tanto esta forma de N no es inmediatamente
asequible a las plantas superiores. stas solamente pueden utilizar el N proveniente de formas
combinadas, como el NO3
-
, NO2
-
, NH4
+
o aminocidos y compuestos orgnicos de bajo peso
molecular. Estas formas nitrogenadas son metabolitos producto de la degradacin de la materia
orgnica, y se encuentran en bajas concentraciones en la solucin del suelo. Dado que el N es el
nutriente requerido en mayor cantidad por las plantas, en el suelo se produce una gran demanda
de compuestos nitrogenados, lo cual determina su rpido ciclado en el ecosistema.
El N asimilable disponible es absorbido por las races de los vegetales principalmente
en forma de nitrato. ste posteriormente es reducido y es incorporado a las estructuras de la
planta como N orgnico, la cual es luego ingerida por los animales herbvoros. La mayor parte
del N orgnico vuelve al suelo por medio de las deyecciones durante la vida del animal, los
restos vegetales y los exudados radicales. Luego de su muerte, los compuestos de N orgnico
acumulados por animales y plantas retornan al suelo por medio de la descomposicin. All es
liberado nuevamente bajo formas inorgnicas por la accin microbiana, que sern reabsorbidas
por otros organismos, liberadas a la atmsfera, o lavadas a los horizontes inferiores del suelo.
Todos estos procesos ocurren simultneamente, a velocidades variables, y el resultado es la
cantidad de N disponible para el crecimiento de las plantas.

FRACCIONES NITROGENADAS DEL SUELO
Nitrgeno inorgnico
Las formas de N ms fcilmente asimilables para las plantas y microorganismos son las
molculas solubles, de bajo peso molecular, como el nitrato (NO3
-
) y el amonio (NH4
+
). El NO3
-

es extremadamente soluble, y al ser un anin, es poco adsorbido por las cargas negativas de las
partculas de arcilla y por lo tanto es fcilmente lavable por las precipitaciones a los horizontes
inferiores del suelo. A este proceso se lo conoce como lixiviacin. Por su parte el NH4
+
, al ser
un catin, se adsorbe rpidamente sobre las partculas de algunas arcillas y por lo tanto es
mucho menos lavado por lixiviacin.
121

Tambin forma parte de esta fraccin el nitrito (NO2
-
), en concentraciones menores,
pero que pueden ser elevadas bajo condiciones de baja concentracin de oxgeno donde el
proceso de nitrificacin esta globalmente reducido. Adems, existen en el suelo concentraciones
bajas de xido nitroso (NO2)

y de xido ntrico (NO), que se pierden a la atmsfera a travs de
la desnitrificacin.
Nitrgeno orgnico libre
Esta fraccin la integran aminocidos y aminoazcares, compuestos nitrogenados de
bajo peso molecular, que pueden ser absorbidas por las races a partir de la solucin del suelo.
Otros compuestos orgnicos libres de alto peso molecular, tales como protenas, no pueden ser
absorbidos por las plantas.
Nitrgeno unido a la materia orgnica del suelo
La materia orgnica del suelo es un concepto mal definido que se utiliza para englobar
los materiales orgnicos en diferentes estados de descomposicin. Podemos distinguir dos
fracciones principales. La primera fraccin incluye aquellos materiales orgnicos de rpida
descomposicin, como residuos de cosechas, y donde podran incluirse hasta los cuerpos de los
organismos del suelo, que mientras viven retienen su N. La descomposicin bacteriana de estos
residuos produce una gran prdida de carbono, el cual es utilizado como sustrato respirable.
La segunda fraccin est formada por el humus, el cual est formado por un complejo
de molculas de diferente peso molecular. Es muy estable, de lenta descomposicin, compuesto
mayormente por derivados fenlicos de la lignina y/o otras sustancias que se polimerizan, y que
no es utilizado como fuente de carbono por la mayora de los microorganismos.
El N que se encuentra como N orgnico formando parte del humus, constituye la mayor
fraccin del N en el suelo. Aunque existen diferencias entre suelos, en general alcanza al 90%
del N total. Es el gran reservorio de N del suelo, y est en equilibrio con las otras fracciones
nitrogenadas. Sin embargo el N no es accesible para las races. La interconversin de las
distintas fracciones de N en el suelo las llevan a cabo los microorganismos del mismo. Su
relevancia agronmica y ambiental, as como los procesos involucrados, sern analizados a
continuacin.
MINERALIZACIN
El N almacenado en la materia orgnica del suelo se transforma en N inorgnico, que
queda libre y disponible para el crecimiento de las plantas y organismos. Este proceso, conocido
como mineralizacin, se produce por medio de dos reacciones principales: aminizacin y
amonificacin.
1) Aminizacin
Comprende la degradacin de las protenas de la materia orgnica a compuestos
orgnicos aminados de bajo peso molecular. Es llevada a cabo por numerosos organismos,
principalmente hongos y bacterias, que obtienen a cambio energa y productos necesarios para
su crecimiento.
La hidrlisis de las protenas es llevada a cabo enzimticamente por proteasas y
peptidasas. Esta hidrlisis ocurre por sustitucin nucleoflica, donde el sitio activo de la enzima
se une al tomo de C electroflico del grupo carbonilo (C=O) del pptido. Al mismo tiempo el
tomo de N es desplazado y recibe un protn donado por el agua o la enzima.
122



Si el producto de la reaccin es otro pptido, el proceso se repetir, hasta que todos los
aminocidos sean liberados.
Las proteinasas (o proteasas) y peptidasas tienen amplia distribucin en el suelo, y
pueden tener diversos orgenes. Si bien existen numerosos microorganismos en el suelo capaces
de hidrolizar protenas, las variaciones estacionales de la poblacin microbiana no coinciden
con los cambios en la actividad proteoltica del suelo. Gran parte de la actividad proteoltica
podra provenir de plantas o animales, aunque no se conoce hasta qu punto contribuira cada
una de las fuentes a la actividad total. Adems, estas enzimas pueden ser estabilizadas en el
suelo, y permanecer activas en forma libre mucho tiempo despus de que el organismo que las
origin haya sido totalmente descompuesto.
2) Amonificacin
Consiste en la liberacin del N de los compuestos aminados, principalmente
aminocidos. Es llevada a cabo por numerosos microorganismos hetertrofos que obtienen
energa de la oxidacin de estos compuestos.
La desaminacin oxidativa de los aminocidos est catalizada por deshidrogenasas y
oxidasas de aminocidos. Ambas reacciones involucran la oxidacin inicial del aminocido, la
formacin de un aminocido intermediario, y finalmente la liberacin de un cetocido y NH4
+
.
Sin embargo, mientras que la deshidrogenasa utiliza NAD
+
como aceptor de electrones y H
+
, la
oxidasa contiene flavoprotenas, donde el flavn nucletido (FAD) es inicialmente reducido, y
posteriormente reoxidado por el O2 con formacin de H2O2.
Reaccin de la deshidrogenasa:


Reaccin de la oxidasa:

Los aminoazcares, por otro lado, se encuentran en el suelo principalmente formando
parte de polmeros, como la quitina o los peptidoglicanos, y la liberacin de NH4
+
requiere su
previa hidrlisis a amino-monosacridos. Esta reaccin se lleva a cabo por medio de
aminoglican-hidrolasas. Los amino-monosacridos as formados son degradados por medio de
123

una serie de reacciones que liberan NH4
+
. El esqueleto carbonado contina luego la va
oxidativa de la gliclisis.
Hidrlisis de la urea. La urea del suelo proviene principalmente de las excretas de los
animales y de las prcticas de fertilizacin. Es hidrolizada a CO2 y NH4
+
por medio de las
enzimas ureasas. Estas son enzimas extracelulares producidas tanto por los microorganismos
(bacterias, hongos y actinomicetes) como por las races de los vegetales.





La unin de la enzima con compuestos orgnicos e inorgnicos del suelo le confiere a la
misma diferentes grados de estabilidad, pudiendo sta permanecer activa en el suelo por largo
tiempo.
Amonio en el suelo
El NH4
+
liberado por los procesos previos mencionados puede ser absorbido por las
races, oxidado a NO2
-
y NO3
-
, reasimilado por los microorganismos del suelo, o fijado sobre las
arcillas.
El NH3 es un compuesto voltil, que se evapora a la atmsfera. En el rango de pH observado
normalmente en el suelo (5-6,5), el NH3 en solucin se protona, transformndose en NH4
+
. Este
se encuentra en equilibrio con la fraccin de amonio adsorbido sobre las arcillas, y con la
fraccin gaseosa:


La mayor parte del NH
4
+
se encuentra adsorbida sobre las arcillas, por lo tanto es poco
susceptible de ser lixiviado por las precipitaciones a los horizontes inferiores del suelo. Sin
embargo las prdidas por volatilizacin pueden ser importantes. Estas van a depender de la
diferencia entre la presin parcial de NH3 en equilibrio con la solucin del suelo, y la presin
parcial de NH3

en la atmsfera. Estas presiones dependen, por un lado, de la temperatura del
suelo, y por otro de la concentracin de NH3 y pH de la solucin del suelo. Cuanto ms alcalino
sea el pH, y mayor la temperatura, mayores sern las prdidas. Las prdidas de amonaco por
volatilizacin pueden ser importantes en los campos de pastoreo, sobre todo porque este es un
importante componente de las excretas animales. Segn Freney y Black (1988) esta
volatilizacin puede alcanzar entre el 7 y el 27% del N de la orina, y entre el 9 al 86% en lotes
donde se aplican abonos orgnicos. En cultivos, las prdidas varan de acuerdo con el tipo de
fertilizante aplicado. Cuando se aplica NH4
+
, en maz se han medido prdidas del 1 al 7% por
hora del total del fertilizante aplicado. Cuando la aplicacin se hace como urea, las prdidas son
menores.

124

Inmovilizacin
La materia orgnica del suelo es degradada por los microorganismos, liberando NH4
+
.
Este in es el producto de excrecin de todos los organismos hetertrofos del suelo que utilizan
la materia orgnica como sustrato respiratorio. La cantidad de NH4
+
liberado al suelo va a
depender de las proporciones respectivas de carbono y nitrgeno presentes en el suelo. Cuando
se aade al mismo un sustrato de alto contenido proteico, tal como sangre desecada, el 80% del
nitrgeno agregado se libera como NH4
+
y solo el 20% queda retenido por la biomasa
bacteriana. Cuando se agrega adems un sustrato de alto contenido en carbohidratos, como la
celulosa, la poblacin bacteriana la usar para aumentar su biomasa, y la cantidad de NH4
+

liberado ser menor. Al agotarse ese sustrato respirable, los organismos morirn, y el nitrgeno
ser liberado. Que el nitrgeno del suelo en un determinado momento sea inmovilizado o
liberado va a depender de la relacin C/N del sustrato agregado al suelo (Fig. 1).
En general, en un suelo en equilibrio, la relacin C/N es aproximadamente 10/1. Cuando
se agrega materia orgnica con una relacin C/N mayor que 30 hay una inmovilizacin neta del
N del suelo, que es utilizado por los microorganismos para aumentar su biomasa incorporando
tambin los carbohidratos del material agregado. Posteriormente, al agotarse el sustrato
respirable y producirse la muerte de los microorganismos, el nitrgeno acumulado es devuelto
al suelo lentamente. Si la relacin C/N de la materia orgnica agregada es menor que 20, se
produce inicialmente una liberacin de NH4
+
durante el proceso de descomposicin. Cuando se
agrega (NH4)2SO4 o urea, la relacin C/N de la materia orgnica activa baja y es relativamente
poco el N que se inmoviliza del suelo.
Sin embargo, no puede establecerse con certeza una relacin C/N crtica que controle
las tasas de mineralizacin/inmovilizacin, ya que las mismas tambin dependen del tipo de
materia orgnica agregada (cantidad de lignina y polifenoles), de las caractersticas del suelo y
de los factores ambientales.
Nitrificacin
En el proceso de nitrificacin, el NH4
+
libre en el suelo es oxidado a NO2
-
en un primer
paso, y luego el NO2
-
resultante contina su oxidacin hasta NO3
-
. Este proceso es llevado a
cabo por bacterias auttrofas Gram negativas de la familia Nitrobacteriaceae. Todos los
miembros de esta familia son aerobios obligados, adquieren su energa de la oxidacin de NH4
+

o NO2
-
y obtienen su carbono del CO2 y carbonatos.
La capacidad de oxidar NH4
+
a NO2
-
en el suelo ha sido descrita en los gneros
Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus y Nitrosovibrio. Nitrosospira y Nitrosomonas son los
gneros de mayor distribucin en los suelos agrcolas. Sin embargo, la presencia de diferentes
microclimas con condiciones diferentes en volmenes limitados de suelo, permite la actividad
de todos los gneros.
125



Figura 1. Efecto de la relacin C/N sobre la inmovilizacin del nitrgeno.


Las bacterias nitrificadoras auttrofas son aerobias estrictas y dependen del transporte
de electrones a travs de la cadena de citocromos para producir ATP, siendo el O2 el aceptor
final de los electrones. La oxidacin de una molcula de NH4
+
a NO2
-
involucra el transporte de
seis electrones y la formacin transitoria de hidroxilamina y de nitroxilo:



Esta reaccin puede producir alternativamente xido nitroso (N2O), especialmente en
condiciones de baja oxigenacin.
















INMOVILIZACION NETA
MINERALIZACION NETA
RELACIN
C/N

80


60


40


20
TIEMPO
NO
3
-


CO
2


C
A
N
T
I
D
A
D

126

La oxidacin de NO2
-
a NO3
-
en el suelo es llevada a cabo por bacterias de los gneros
Nitrobacter, Nitrococcus y Nitrospira. Esta transformacin involucra el transporte de 2e
-
, y est
mediada por una oxidasa. Los electrones son transportados a travs de la cadena de citocromos,
generando ATP


Varias bacterias hetertrofas de los gneros Arthrobacter, Mycobacterium y
Pseudomonas, actinomicetes como Streptomyces griseus y hongos como Aspergillus flavus,
Penicillium spp. y Cephalosporium entre otros, tambin pueden oxidar el amonio y el nitrito
llevando a cabo un proceso conocido como nitrificacin hetertrofa. Estos microorganismos no
obtienen energa de esas oxidaciones ya que las reacciones no estn acopladas a la generacin
de ATP. Sin embargo, son capaces de producir NO3
-
tanto de fuentes inorgnicas como
orgnicas. Las fuentes inorgnicas se oxidan en la misma forma que en la nitrificacin
quimioauttrofa, en tanto que para las fuentes orgnicas el camino de oxidacin sera como
sigue:


La tasa de la nitrificacin depende de factores ambientales como el suministro de
amonio (su sustrato) y la presencia de oxgeno (proceso aerobio). El laboreo del suelo, el
quemado, el talado de la vegetacin, la disposicin de residuos orgnicos, la fertilizacin y la
deposicin atmosfrica de nitrgeno, tienen efectos bien documentados sobre la produccin de
nitratos en los suelos. La nitrificacin ocurre en un rango amplio de temperatura y an en suelos
bajo la nieve aunque el proceso es muy lento bajo esta condicin. Por muchas dcadas se pens
que la nitrificacin se inhiba en suelos cidos, probablemente debido a que el aumento del pH
por el encalado de los suelos con carbonato de calcio o magnesio al mismo tiempo estimula la
nitrificacin. Adems, las bacterias nitrificadoras cultivables tienen un pH ptimo de 7,5-8.
Actualmente se sabe que el proceso de nitrificacin ocurre tambin en suelos forestales con
valores de pH<4,5.
En los suelos forestales cidos, luego de una perturbacin del ambiente como el talado,
quemado, etc., las tasas de mineralizacin de N son mayores que las de inmovilizacin. Bajo
esas condiciones, la existencia de micrositios con pH adecuado y la nitrificacin hetertrofa
pueden explicar la generacin de nitrato. Adems, en los ltimos aos y gracias al avance del
empleo de tcnicas de biologa molecular, se ha observado que existe tanto en el agua como en
el suelo una presencia importante de Arquebacterias que tambin realizan la oxidacin del
amonio y, que segn los investigadores, seran ms abundantes en suelos que las bacterias
(Leininger et al. 2006). El elevado nmero de estos microorganismos en varios ecosistemas y su
presencia a mayores profundidades del suelo, indicara que estn adaptados a un rango ms
amplio de condiciones ambientales y que podran tener un metabolismo ms verstil que el de
las bacterias nitrificantes auttrofas. Este hallazgo tambin permitira explicar la existencia de la
nitrificacin en suelos de pH cido.
127

Desnitrificacin
Se conoce como desnitrificacin al conjunto de procesos que conducen a la prdida en
forma gaseosa del nitrato del suelo. El NO3
-
y el NO2
-
del suelo sirven de sustrato para un grupo
de microorganismos aerobios facultativos que utilizan estos compuestos como ltimo aceptor de
electrones durante la respiracin anaerobia, liberando N2 y N2O. La mayora de estos
organismos son hetertrofos, obteniendo sus fuentes de C y energa a partir de sustratos
orgnicos. En ausencia de O2, el NO3
-
o sus xidos derivados sirven como aceptores finales de
electrones transportados por la cadena respiratoria durante la oxidacin de esqueletos
carbonados. Este proceso se conoce como reduccin disimilatoria porque sus productos no son
asimilados sino liberados a la atmsfera.
La capacidad de utilizar xidos de N como aceptores de electrones ha sido descrita en
aproximadamente veinte gneros de bacterias. La mayora pertenece a las Proteobacterias.
Muchas bacterias desnitrificadoras reducen anaerbicamente tambin a otros aceptores de
electrones, tales como el Fe
3+
y ciertos aceptores orgnicos. Debido a que el NO3
-
es un aceptor
terminal de electrones menos eficiente que el O2, la desnitrificacin tiene lugar cuando el O2 no
est disponible. En la mayora de los suelos esto ocurre luego de una lluvia importante con el
suelo saturado de agua y una difusin del O2 drsticamente lenta a los micrositios. La
desnitrificacin comienza cuando la concentracin de poros llenos de agua supera el valor del
60% de la capacidad de retencin del suelo. Tambin adentro de los agregados, en la vecindad
de materia orgnica en rpida descomposicin y en la rizosfera, la demanda de oxgeno puede
ser superior a la difusin y darse condiciones para el desarrollo de la desnitrificacin. La
desnitrificacin es el nico evento del ciclo del N en el cual el nitrgeno fijado vuelve a la
atmsfera como N2, cerrndose el ciclo. La desnitrificacin es tambin una fuente importante de
N2O, un gas con efecto invernadero que consume el ozono.
La presencia de desnitrificadores en el suelo es universal y su densidad puede superar al
milln por gramo de suelo, con concentraciones an mayores en la rizosfera.
Las bacterias desnitrificadoras pertenecen a diferentes familias. Las ms estudiadas pertenecen a
los gneros Pseudomonas y Paracoccus, pero tambin se ha descrito esta capacidad en gneros
como Alcaligenes, Achromobacter y Bacillus. Tambin se conoce esta actividad en bacterias
fijadoras de N2 como Azospirillum y numerosas especies de Rhizobium. La reaccin se lleva a
cabo enzimticamente, en sucesivos pasos, que involucran la transferencia de cinco electrones al
tomo de N.


Estas reacciones estn catalizadas por una nitrato y una nitrito reductasas
disimilatorias. El cido hiponitroso puede ser luego deshidratado y oxidado a N gaseoso, que
se pierde a la atmsfera, o deshidratado a xido nitroso, que es voltil, y pasa a la atmsfera
donde es luego reducido a N2
.

La cantidad de NO3
-
perdida como N2O y N2 a la atmsfera puede ser
considerablemente bajo ciertas condiciones. La desnitrificacin en el suelo depende
principalmente de tres factores: concentracin de oxgeno, concentracin de nitrato y
2 NO3
-
2 HNO3
-
2 H2N2O2
4 H
+
4 H
+
nitrato

cido nitroso

cido hiponitroso

128

disponibilidad de carbono. Sin embargo, el contenido hdrico, el pH y la temperatura son
factores a tener en cuenta en un gran nmero de situaciones.


El oxgeno del suelo es consumido principalmente por las races de las plantas y los
organismos aerobios. Este consumo puede alcanzar hasta 70 mmol O2 cm
-2
h
-1
, y ser mayor que
la tasa de reposicin del mismo por difusin desde la atmsfera. En condiciones de
anegamiento, el dficit de oxgeno puede ser considerable, hasta encontrarse condiciones de
total anaerobiosis. Sin embargo, en suelos inundados la desnitrificacin se ve limitada por la
falta de NO3
-
, ya que la nitrificacin est inhibida a bajas concentraciones de O2. En
consecuencia, la desnitrificacin puede ocurrir en la rizosfera y en la interface agua-sedimento,
lugares donde hay suficiente O2 para que la nitrificacin genere el NO3
-
, el cual podr difundir
hacia los desnitrificadores en zonas cercanas ms anaerbicas. El dficit de oxgeno induce la
actividad disimilatoria de los organismos desnitrificadores (Tabla 1). Las condiciones de
anaerobiosis son muy frecuentes incluso en suelos muy aireados, donde se encuentran
micrositios de baja aireacin, donde las condiciones favorecen la desnitrificacin.
Dado que los organismos involucrados son mayoritariamente hetertrofos, estos
requieren C asimilable para obtener energa. En suelos no saturados el contenido de C es a
menudo el factor que limita a la desnitrificacin. El C acta a dos niveles, por un lado provee
dadores de electrones para los desnitrificadores y por otro, estimula el consumo de O2 por los
hetertrofos. Por lo tanto la presencia de materia orgnica es un factor importante en la
regulacin tanto de la velocidad como de la magnitud de la desnitrificacin. En general, se
encuentra una relacin lineal entre la cantidad de carbono extractable del suelo y la actividad
desnitrificadora. Sin embargo, en condiciones naturales, es difcil que la disponibilidad de C
resulte limitante para la desnitrificacin, aunque puede ocurrir que en las capas inferiores del
suelo, con escasa materia orgnica, donde la desnitrificacin se vea inhibida por falta de
sustratos respirables. Tambin, puede ocurrir que se inmovilice el N durante la descomposicin
de los sustratos carbonados y no haya NO3
-
para desnitrificar.
En la tabla 1 se observa el efecto del agregado de glucosa y la concentracin de oxgeno
sobre la prdida de NO3
-
del suelo por el proceso de desnitrificacin. A bajas tensiones de O2
(0,46%) el agregado de una fuente de carbono de rpida utilizacin como la glucosa induce un
aumento en la prdida de NO3
-
por desnitrificacin, desde el da 0 (comienzo del experimento)
al da 10, con respecto a la prdida del NO3
-
en el suelo sin el agregado de glucosa. Bajo
condiciones de alta concentracin de O2, si bien se observan diferencias entre los tratamientos
con y sin glucosa, la magnitud de la desnitrificacin es mucho menor que en el caso anterior.
Este experimento demuestra la relacin que existe entre los tres factores que regulan a este
2 H
+
2 H2N2O2
cido hiponitroso

N2
xido nitroso

N2O
-2 H2O
N2
- H2O - H2O
129

proceso microbiano: la baja tensin de O2, la disponibilidad de nitratos y la presencia de una
fuente de carbono fcilmente utilizable.
La cuantificacin de las prdidas de nitrgeno por desnitrificacin no es sencilla. La
utilizacin de una fuente con
15
N, espectrometra de masa y de emisin, cromatografa gaseosa y
bloqueo enzimtico con acetileno son las tcnicas ms utilizadas para estudiar este proceso.
Existen pocos datos de las prdidas por desnitrificacin de
15
N aplicado como fertilizante, y los
datos son muy variables. Se ha estimado que en un cultivo de trigo se pierden entre 7 y 13 kg de
N/ha/ao cuando se aplican 70 kg N/ha como fertilizante, y entre 18 a 38 kg/ha en pasturas que
recibieron 250 kg/ha. En base a numerosas observaciones se ha generalizado que las prdidas de
N
2
+ N
2
O de los suelos varan entre 0 y 20% del N aplicado como fertilizante en suelos arables,
y del 0 al 7% en pasturas. La presencia de cultivos provoca la desecacin del perfil y as reduce
las condiciones de anaerobiosis pero adems las races compiten activamente con los
microorganismos por el uso del NO
3
-
. Esto hace que en promedio las prdidas de N del sistema
por desnitrificacin sean menores al 10% del flujo total de N en el mismo.

Tabla 1. Efecto del O
2
y del contenido de C sobre la desnitrificacin
Sin glucosa Con 0,5% de glucosa
NO3
-

(mg/100 g suelo)

N Total
(mg/100 g suelo)
NO3
-
(mg/100 g suelo)

N Total
(mg/100 g suelo)
Da 0,46% O2
0 78,3 154,7 78,3 154,7
5 72,5 147,9 23,2 150,8
10 63,5 143,4 1,4 114,8
2,27 % O2
0 78,3 154,7 78,3 154,7
5 79,0 149,0 55,5 150,5
10 76,5 152,4 58,5 143,6


La desnitrificacin bajo ciertas condiciones puede representar una ventaja, por ejemplo
para remover el exceso de NO3
-
de los suelos, a fin de evitar su lixiviacin hacia las aguas
subterrneas o superficiales. Adems, el tratamiento de las aguas residuales tiene como uno de
sus objetivos remover el N favoreciendo primero a la nitrificacin y luego a la desnitrificacin.
Trataremos este tema con ms profundidad en el captulo de Biorremediacin.

FIJACIN BIOLGICA DEL NITRGENO
Si bien el 78% de la atmsfera est formado por N2, ste no se encuentra disponible
para la mayora de los organismos vivos, ya que stos no son capaces de romper el enlace NN,
y deben utilizar el N existente en alguna forma reducida. Solamente algunos organismos
130

procariontes son capaces de romper la unin NN a travs del proceso conocido como fijacin
biolgica del N2. Este proceso involucra la transferencia de 8 electrones a la molcula de N2
para formar dos molculas de NH3, y requiere la presencia de Mg
2+
. Paralelamente se produce
una molcula de H2 de acuerdo con las siguientes reacciones:

Mg
2+

N
2
+ 6 e
-
+ 12 ATP + 8 H
+
2 NH
4
+
+ 12 ADP + 12 Pi
Mg
2+
2 H
+
+ 2 e
-
+ 4 ATP H
2
+ 4 ADP + 4 Pi
___________________________________________________________
Mg
2+
N
2
+ 16 ATP + 8 e
-
+ 10 H
+
2 NH
4
+
+ H2 + 16 ADP + 16 Pi

Esta reaccin la cataliza un complejo enzimtico conocido con el nombre de
nitrogenasa, que se encuentra solamente en algunos organismos procariontes.
Este complejo enzimtico est formado por dos subunidades. Una de ellas es conocida
como ferro-sulfo protena. Esta subunidad tiene un peso molecular de 60.000 Da, y contiene
cuatro tomos de Fe y cuatro grupos sulfidrilo (-SH).
La otra subunidad se conoce como ferro-molibdo protena, y tiene un peso molecular
entre 200.000 y 300.000 Da. Contiene 28-32 tomos de Fe, 28 grupos -SH y dos tomos de
Mo
2+
.

Esta enzima rompe especficamente las uniones NN,
NN NH
3
+ H
2

pero tambin es capaz de romper la unin
CN
-
CH
4
+ NH
4
+
y la triple unin de la molcula de acetileno:
HCCH H
2
C=CH
2
Esta reaccin es especialmente til porque en base a ella se ha desarrollado una tcnica
para medir la actividad de la nitrogenasa.
La nitrogenasa es inhibida por la presencia de O
2
.
Esta enzima se encuentra presente en diferentes organismos procariontes. Estos pueden
ser de vida libre o vivir en simbiosis con otros organismos. Los encontramos entre las
bacterias, cianobacterias y actinomicetes (Tabla 2).

Mtodos para medir la fijacin biolgica de nitrgeno
Estimar la cantidad de N fijado mediante fijacin biolgica es generalmente
complicado, principalmente porque el N recientemente fijado no puede diferenciarse del
nitrgeno reducido preexistente, y porque la cantidad de N fijado suele ser muy pequea en
comparacin con la cantidad de N reducido presente en el sistema. Por lo tanto, se han
desarrollado una serie de tcnicas para poder medir la fijacin biolgica del N.

131

Tabla 2. Ejemplos de los gneros de microorganismos capaces de fijar nitrgeno
Gneros
Hetertrofos
Aerobios Azotobacter, Beijernkia, Derxia,
Xanthobacter
Aerobios
facultativos
Paenibacillus, Klebsiella
Microaeroflicos Azospirillum, Thiobacillus
Anaerobios Clostridium, Desulfovibrio
Simbiontes Rhizobium, Bradyrhizobium, Frankia,
Nostoc
Auttrofos Nostoc, Anabaena, Gloeothece,
Rhodospirillum, Rhodopseudomonas


Cambios en el balance de N: Este es el mtodo ms preciso, y consiste en estimar la cantidad
inicial de N reducido presente en el sistema, donde solo se suministra N molecular, y la cantidad
presente luego de un determinado tiempo. La diferencia entre las dos cantidades indica la
cantidad de N fijado. Este mtodo solo es aplicable en algunos sistemas muy simples y
controlados, tales como una planta cultivada en hidroponia o bacterias creciendo en un cultivo
de laboratorio, pero es inaplicable en sistemas ms complejos como un suelo o un cultivo en el
campo.
Reduccin de acetileno: Este mtodo se basa en la capacidad que tiene la nitrogenasa para
romper la triple ligadura de la molcula de acetileno y transformarla en etileno. Por lo tanto, se
puede estimar la actividad de la enzima nitrogenasa suministrando acetileno a la planta o
bacteria en un sistema cerrado, y medir el etileno formado al cabo de un determinado tiempo, en
un cromatgrafo gaseoso. Este mtodo es el ms usado para medir fijacin de N, y resulta muy
til siempre y cuando se consideren sus desventajas. El mtodo no mide fijacin de N sino que
solamente estima la actividad de la enzima, por lo tanto slo sirve para hacer comparaciones
entre organismos o sistemas en determinadas condiciones, pero de ninguna manera se pueden
extrapolar los resultados como medidas de la fijacin de N. Adems, despus de un tiempo el
etileno resulta txico para la planta y la actividad medida cae.
Utilizacin del istopo
15
N: Este es un istopo pesado del N, no radiactivo, que tiene una
abundancia en la naturaleza del 0,3663%. Por lo tanto, suministrando a la planta N enriquecido
con este istopo se puede diferenciar el N proveniente de diferentes fuentes. Se lo puede usar de
diferentes maneras para estimar la fijacin de N. El sistema ms directo es suministrar a la
planta N2 marcado con
15
N, medir el incremento de este istopo en la planta y estimar entonces
directamente la cantidad de N2 fijado. Sin embargo este mtodo es poco usado, entre otras cosas
por la dificultad para manipular N gaseoso, la necesidad de trabajar en sistemas cerrados y la
imposibilidad de aplicarlo en sistemas extensivos.
La otra alternativa es suministrar a la planta
15
N en forma de NO3
-
o NH4
+
. Lo que se
hace entonces es estimar la fijacin de N a travs de la dilucin del
15
N suministrado por el N2
no marcado proveniente de la fijacin. Esto se lleva a cabo cultivando la planta leguminosa y
una planta control no fijadora en un suelo marcado con la misma proporcin de
15
N. Luego de
132

un tiempo se cosechan ambas plantas, y se estima qu proporcin de todo el N presente en la
leguminosa proviene de la fijacin biolgica, segn la ecuacin:
% de N fijado= [1-
15
N planta prueba /
15
N planta control] x 100
Este mtodo es el ms usado actualmente, aunque tambin tiene inconvenientes, como
por ejemplo, todo el volumen de suelo donde absorben las races debe estar igualmente
marcado, dado que si parte de la raz de una de las plantas absorbe N con un enriquecimiento
ms bajo, se pueden cometer errores bastante groseros (Fig. 2 C y D).


Figura 2. Utilizacin de la tcnica de la dilucin de
15
N. A y B corresponden a una marcacin
correcta del suelo. Las races de las dos plantas absorben de suelo igualmente marcado. B y C
corresponden a una marcacin incorrecta. Las races absorben de suelos marcados en forma
diferente.Con las tcnicas aqu mencionadas se han podido hacer estimaciones bastante
confiables de las cantidades de N
2
fijado en diferentes sistemas (Tabla 3).

Tabla 3. Cantidad de N fijado por diferentes sistemas (Adaptado de Paul y Clark, 1989).
Cultivo Kg N/ha/ao
Leguminosas 140-300
Arroz 30
Pastura 15
Bosque 10
No Leguminosas 5

133


FIJACIN SIMBITICA DEL NITRGENO
Las plantas superiores no han conseguido desarrollar durante su evolucin la capacidad
de sintetizar el complejo enzimtico nitrogenasa y de fijar N2. Sin embargo, muchas plantas han
desarrollado la estrategia de asociarse simbiticamente con organismos procariontes capaces de
fijar N2. A continuacin describiremos algunas de las asociaciones simbiticas de mayor
importancia para la agricultura.
LA ASOCIACIN ENTRE LAS PLANTAS LEGUMINOSAS Y LOS RIZOBIOS.
NODULACIN.
Este grupo de bacterias est formado por organismos Gram- con forma de bastn. No
producen endosporas. Su tamao oscila entre 0,5-0,9 m x 1,2-3,0 m, y son mviles cuando
jvenes con 2-4 flagelos pertricos, polares o subpolares. Cuando las condiciones de crecimiento
son adversas acumulan sustancias de reserva en grnulos de poli--hidroxibutirato (PHB). Son
aerbicas a microaeroflicas, con un ptimo aproximadamente en 0,01 atmsferas de O2. Su
crecimiento es ptimo a pH neutro a alcalino, con escaso o nulo crecimiento a pH 5 o menor.
Poseen la enzima nitrogenasa, y pueden desarrollarse en vida libre o establecerse como
simbiontes en plantas de la familia Fabaceae (leguminosas). Se conoce una sola planta no
leguminosa nodulada por rizobios, el gnero Parasponia de la familia Ulmaceae.
Inicialmente, los rizobios se clasificaron en funcin de su velocidad de crecimiento y de
la especie de planta que podan infectar. Las especies de rizobios de crecimiento rpido tienen
un tiempo medio de duplicacin en medio de cultivo extracto de levadura-manitol de 2 a 4
horas, y en el mismo medio agarizado producen colonias en 3-5 das. Las especies de
crecimiento lento tienen un tiempo medio de duplicacin de cerca de 8 horas, y forman colonias
en cultivo en 6-8 das. Esta antigua designacin fenotpica, en rizobios de crecimiento rpido o
lento, es a veces an utilizada cuando no se conoce con exactitud el gnero al que pertenece el
rizobio. Luego se vio que esta clasificacin era artificial, ya que bacterias de caractersticas muy
distintas podan infectar a la misma especie vegetal. Actualmente, para su clasificacin se
utilizan caractersticas bioqumicas y genotpicas, como anlisis de secuencia del gen ribosomal
16S e hibridacin DNA-DNA.
Todas las bacterias conocidas que nodulan leguminosas se clasifican dentro de las
Proteobacterias (clases Alfaproteobacteria y Betaproteobacteria). Los rizobios clsicos
pertenecen a Alfaproteobacterias y se distribuyen entre muchos gneros, siendo Rhizobium y
Bradyrhizobium los ms comnmente conocidos. Una clasificacin taxonmica actual de los
rizobios puede consultarse en: Weir BS (2010). The current taxonomy of rhizobia. New Zealand
rhizobia website. http://www.rhizobia.co.nz/taxonomy/rhizobia.html.

134

Tabla 4. Ejemplos de especies de rizobios y sus respectivas plantas husped.
Especie bacteriana Planta husped
de crecimiento rpido
Rhizobium etli Phaseolus vulgaris
Rhizobium leguminosarum biovar trifolii Trifolium
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli Phaseolus
Rhizobium leguminosarum biovar viciae Pysum, LaThyrus, Lens, Vicia
Rhizobium tropici Phaseolus vulgaris, Leucaena
Rhizobium galegae Galega officinalis, G. orientalis
Mesorhizobium loti Lupinus, Lotus, Ornithopus
Mesorhizobium Astragalus sinicus
Ensifer meliloti (Sinorhizobium meliloti) Melilotus, Medicago, Trigonella
Ensifer fredii Glycine max
de crecimiento lento
Bradyrhizobium japonicum Glycine max
Bradyrhizobium elkanii Glycine max
Bradyrhizobium sp. Vigna
Bradyrhizobium sp. Lupinus
Bradyrhizobium sp. Arachis hypogaea

BIOLOGA DE LOS RIZOBIOS
Las bacterias de los gneros Rhizobium y Bradyrhizobium crecen en forma saproftica
libres en el suelo y la rizosfera. En el suelo no rizosfrico su crecimiento es lento, con un
tiempo medio de duplicacin entre 241-361 horas. En cambio en la rizsfera de las leguminosas
su tiempo medio de duplicacin es entre 9-12 horas. Esta diferencia se debe en parte a la
presencia de sustratos carbonados respirables, pero principalmente a la presencia de factores
especficos secretados por la raz, los cuales estimulan la divisin y crecimiento de los rizobios.
Este estmulo es inespecfico, por lo tanto en la rizsfera de una leguminosa pueden encontrarse
abundantes rizobios que no sean los especficos para esa especie.
Infeccin: Se conoce como infeccin una serie de procesos que conducen a la penetracin de la
bacteria en las clulas radicales de la planta husped. Estos involucran un complejo intercambio
de seales de reconocimiento entre la raz y la bacteria.
El primer evento de la infeccin es la adhesin entre la bacteria y la clula radical. Los
rizobios creciendo libres en el suelo poseen flagelos, los cuales les otorgan cierta capacidad de
135

movimiento aunque sta es muy limitada Sin embargo, se ha comprobado que mutantes de
Rhizobium deficientes en movilidad son menos eficientes para infectar que las bacterias con su
movilidad normal. Por lo tanto, la movilidad y el quimiotaxismo parecen ser importantes en la
infeccin.
La raz secreta compuestos que tienen efecto quimiotctico sobre las bacterias. Estos
compuestos pertenecen al grupo de los flavonoides, y se han identificado un nmero
considerable de falvonoides involucrados en estos procesos. Varios de ellos se representan en la
figura 3. Los flavonoides constituyen los primeros factores de reconocimiento entre la bacteria y
la raz, y determinan la especificidad entre la bacteria y su planta husped.

Figura 3. Flavona, Flavanona, Isoflavona y Chalcona. Flavonoides reconocidos por los
productos (protenas) de los genes nod de diferentes rizobios.

La fijacin de la bacteria sobre la clula radical es esencial para que se produzca la
infeccin. Esta unin se realiza normalmente sobre el extremo de un pelo radical,
probablemente debido a la atraccin ejercida por los compuestos secretados por la planta.
Recientemente se ha descubierto que en la unin de la bacteria al pelo radical
intervienen unas protenas llamadas ricadesinas. Estas son protenas de un peso molecular de
14.000 kDa, con cinco locus de unin para el Ca
2+
. Estas protenas producen un puente entre la
bacteria y el pelo radical, que fija a ambos entre s. Son secretadas por la bacteria, y reconocen
un locus especfico en la superficie del pelo. Por lo tanto tambin contribuyen al reconocimiento
bacteria-planta husped.
Posteriormente el pelo radical produce microfibrillas de celulosa que anclan y fijan la
bacteria. En esta unin tambin estn involucradas lectinas, que son protenas producidas por la
planta que ligan clulas, pero su papel en esta unin todava es controvertido.
Regulacin gnica de la nodulacin
Los siguientes eventos de la infeccin estn regulados por una serie de genes (genes
nod) que pueden estar ubicados en un plsmido de la bacteria, conocido como plsmido sym, o
en el cromosoma bacteriano, lo cual depende del gnero de rizobio. Ese plsmido tambin
contiene los genes nif, que codifican para la sntesis de la nitrogenasa, y los genes fix, que
regulan funciones especficas durante la fijacin de N
2
. Cepas de Rhizobium a las que se les
elimina el plsmido sym son incapaces de nodular. Si se introduce el plsmido sym especfico
136

para una especie vegetal a una cepa no especfica, entonces sta se torna infectiva para dicha
especie vegetal.
Entre estos genes existe uno llamado nodD, que cumple el papel de regulador de la
transcripcin del resto de los genes nod, conocidos como genes comunes de la nodulacin, que
estn mayoritariamente involucrados en la determinacin de la especificidad de la infeccin, y
se los denomina genes nod A, B, C, E, F,..., etc. Hasta ahora se han descrito ms de treinta
genes bacterianos involucrados en la nodulacin.
Mecanismo de induccin de la nodulacin
El producto de la transcripcin del gen nodD es una protena que se une con un flavonoide
especfico excretado por la planta husped. (Fig. 4). Cuando este reconocimiento se ha
realizado, el complejo flavonoide-protena se une al locus nod-box. Esta unin especfica
desencadena la transcripcin del resto de los genes nod. Los productos de transcripcin de los
genes nod son principalmente compuestos que inducen la produccin por parte de la raz de
fitohormonas que van a inducir la curvatura del pelo radical y la divisin de las clulas de la
corteza radical.
Iniciacin de la nodulacin
Una vez que la bacteria se fij sobre el pelo radical, ste se curva sobre la bacteria,
formando lo que se conoce como gancho de infeccin (Figura 5A).
La posterior penetracin de la bacteria dentro del pelo radical se produce por la
degradacin de la pared celular vegetal, la cual se lisa en el sitio de contacto con la bacteria, la
membrana plasmtica se invagina, y se deposita nueva pared celular formando el tubo de
infeccin (Figura 5B). Este tubo contina alargndose hacia la base del pelo radical.
Simultneamente, se comienzan a dividir las clulas del parnquima cortical como consecuencia
de los productos de los genes nod. Esta divisin ocurre antes de que el tubo de infeccin se
ponga en contacto con las clulas corticales. La bacteria, a medida que avanza, se divide
numerosas veces dentro del tubo de infeccin. Ese tubo de infeccin est formado por la
invaginacin de la membrana plasmtica, de la clula del pelo cortical del husped, de modo
que la bacteria permanece siempre en el espacio intercelular. Por afuera de esa membrana se
deposita pared celular de la planta.

Al llegar el tubo de infeccin a la base de la clula del pelo radical y tomar contacto con
la clula cortical, la pared celular esta clula se lisa, se forma un poro, y la membrana
plasmtica se invagina. Las bacterias se liberan del tubo de infeccin y la membrana de la clula
cortical se cierra alrededor de las bacterias producindose un proceso de endocitosis. Esa nueva
estructura que forman las bacterias rodeadas por la membrana celular se denomina simbiosoma.
El espacio interior del simbiosoma es un continuo del espacio extracelular, y la bacteria no se
pone nunca en contacto con el citoplasma de la clula radical, sino que siempre est en un
compartimiento externo.
Dentro de cada clula pueden originarse muchos simbiosomas (Fig. 5C). Durante un
tiempo, la bacteria puede dividirse dentro del simbiosoma. Finalmente deja de dividirse y se
producen notables cambios. Cambia la composicin de la pared celular bacteriana, aumenta el
tamao celular, se acumulan grnulos de polifosfatos, y se producen cambios en el
metabolismo.
Luego se sintetiza la nitrogenasa, y comienza la fijacin de N2. La bacteria as
transformada se conoce como bacteroide. La membrana que limita al simbiosoma ahora se
conoce como membrana peribacteroide (Fig. 5D). El bacteroide de los rizobios de ndulos de
137

crecimiento determinado conserva su capacidad de dividirse una vez que se ha diferenciado en
la forma fijadora de nitrgeno (Denison 2000).

Rizobios
Genesnod
nodBox
nodD nodABC nodSUIJ
ProtenasNod
Factores Nod
ProtenaNodD
Flavonoides
Seales de la planta
Seales del rizobio
Nodulinas
ENOD12, etc
Infeccin
Exopolisacridos
Otraseal enel proceso
denodulacin
PLANTA
Peloradical
ProtenaNodD
+Flavonoide
Generalidades del intercambio de seales en la interaccin rizobios-
leguminosa
Rizobios
Genesnod
nodBox
nodD nodABC nodSUIJ
ProtenasNod
Factores Nod
ProtenaNodD
Flavonoides
Seales de la planta
Seales del rizobio
Nodulinas
ENOD12, etc
Infeccin
Exopolisacridos
Otraseal enel proceso
denodulacin
PLANTA
Peloradical
ProtenaNodD
+Flavonoide
Generalidades del intercambio de seales en la interaccin rizobios-
leguminosa


Figura 4. Eventos tempranos en la interaccin rizobio-leguminosa
Simultneamente ocurren cambios en la clula radical. Se produce un aumento del
volumen celular. Este aumento se traduce como un ensanchamiento de la raz, que se conoce
como ndulo. Adems ya se han activado los genes symde la planta, que inducen la produccin
de protenas especficas para la nodulacin, conocidas como nodulinas. Una de estas nodulinas
es la leghemoglobina. Esta es una protena que contiene un grupo hemo similar al de la
hemoglobina, lo que le confiere color rojo. Este grupo es sintetizado por la bacteria, mientras
que la protena es sintetizada por la planta. La leghemoglobina se acumula en la clula vegetal
del ndulo, y regula la transferencia de O2 al bacteroide, para crear las condiciones de
microareofilia requeridas para la fijacin de N2.

Si bien el proceso descrito arriba es representativo para muchas especies, existen muchas
excepciones donde no se produce tubo de infeccin, sino que la bacteria penetra en la raz a
travs de la epidermis, se multiplica en el espacio intercelular y luego penetra en las clulas
corticales, como ocurre en man. En otras familias de plantas tales como las Ulmaceae, en
especies del gnero Parasponia sp., se ha comprobado que tanto Rhizobium como
Bradyrhizobium pueden infectar y producir ndulos de estructura diferente a los de las
leguminosas, pero stos la mayora de las veces no son efectivos aun cuando se ha detectado la
presencia de leghemoglobina en ellos. El producto de la reduccin de N2 es NH4
+
. Este es
exportado a travs de la membrana peribacteroide, y fijado a esqueletos carbonados en las
clulas del ndulo a travs de la enzima glutamina sintetasa. Este es posteriormente transferido
a otros esqueletos carbonados mediante transaminaciones, y exportado a los vasos del xilema.
La forma de exportacin de N depende de la especie de leguminosa. En soja se exporta en
138

forma de uredos, como la alantona. En otras especies, como la alfalfa y algunos trboles, el
N se exporta como asparagina y glutamina
Regulacin de la fijacin de N2
La fijacin de N2 por la simbiosis rizobio-leguminosa est bsicamente regulada por la
demanda de N de la planta, que suministra fotosintatos al bacteroide. En plantas de soja, a las
que se le eliminan los frutos durante el llenado, se puede detectar inmediatamente una
disminucin de la actividad fijadora de sus ndulos.
La planta adems puede regular el nmero de ndulos que se forman en sus races. Una
vez que la raz ha nodulado, la planta produce compuestos que inhiben la formacin de nuevos
ndulos. Si se acoda una planta de alfalfa nodulada con una no nodulada, y se inocula a esta
ltima con Rhizobium, no se producir nodulacin. Asimismo, se han obtenido mutantes en soja
y arveja, que no poseen este sistema de regulacin y producen races hipertrofiadas con una
enorme cantidad de ndulos.
Por otro lado, una vez formado el ndulo el bacteroide produce unos compuestos
conocidos como rizopinas, que inhiben la formacin de nuevos ndulos. Slo pueden infectar
exitosamente aquellas bacterias que pueden degradar estas rizopinas, y solamente son capaces
de hacer esto aquellas bacterias de la misma cepa que las producen. Por lo tanto, una vez que
una cepa se estableci en la raz, es muy difcil que sea reemplazada por otra.
En presencia de determinados niveles de nitrato en el suelo la fijacin de N2 puede verse
inhibida. An no se conoce completamente cul es el mecanismo de esta inhibicin, pero se
postulan como causas posibles la acumulacin de NO2 dentro del ndulo, que tendra efectos
txicos. Otra posibilidad, es que se produzca una competencia por fotosintatos entre la nitrato
reductasa y la nitrogenasa. Tambin se postula que podra existir un mecanismo de
retroalimentacin (feed back) producido por la acumulacin de aminocidos en el ndulo.

Tipos de nodulacin
De acuerdo con el grado de compatibilidad entre la cepa bacteriana y la leguminosa infectada se
pueden obtener diferentes tipos de nodulacin segn el siguiente esquema:

I. NO NODULADO: No hay ndulos. Plantas pequeas y clorticas.
II. NODULADO: Seales de iniciacin de ndulos.
1. Ineficientes: ndulos con interior verde o blanco.
2. Eficientes: ndulos con interior rosa o rojo.

Inoculantes microbianos
Un inoculante microbiano es un producto que contiene un cultivo artificial de
microorganismos. Generalmente es aplicado sobre la semilla y/o sobre el suelo para establecer
algn tipo de asociacin benfica entre una planta y el microorganismo en cuestin. Los
inoculantes microbianos pueden clasificarse en monovalentes, es decir que contienen un solo tipo
de microorganismo, y en polivalentes cuando dos o ms microorganismos estn incluidos en su
formulacin. El uso de inoculantes microbianos es una alternativa adecuada para mejorar la
productividad de sistemas agrcolas y ganaderos y resulta una tecnologa que puede asociarse con
los principios de sustentabilidad, siempre y cuando se la aplique en forma correcta. Para lograr un
139

resultado positivo para el cultivo y el ambiente es necesario contar con inoculantes de calidad
probada, es decir, que la cantidad del microorganismo deseado est dentro de los niveles
necesarios para garantizar su eficiencia y que no aporten microorganismos no deseados.


Inoculantes a base de rizobios
El rendimiento de los cultivos est estrechamente relacionado con la disponibilidad de N
durante su ciclo de crecimiento y desarrollo. Las leguminosas constituyen un caso particular, ya
que el N puede ser provisto mediante la asociacin simbitica con bacterias denominadas rizobios
en forma general. Por ello, el uso de inoculantes conteniendo este tipo de microorganismos es el
ms generalizado en los sistemas de cultivos tanto agrcolas (ej. soja) como forrajeros (ej. alfalfa).
Se asegura la asociacin simbitica entre el rizobio y la leguminosa mediante la aplicacin de un
inoculante de calidad adecuada para permitir que cepas del microsimbionte especficas y efectivas
se instalen en la raz de la planta y formen ndulos para activar en forma eficiente el proceso de
fijacin biolgica del nitrgeno (FBN). El propsito de la inoculacin es lograr establecer en la
rizosfera de la plntula una poblacin vigorosa de la cepa bacteriana aplicada. Esta debe haber sido
seleccionada por su competitividad y eficiencia con el fin de lograr una nodulacin rpida y
efectiva en las races las plantas huesped.
En este proceso de instalacin de la simbiosis rizobio-leguminosa es importante:
a) contar con la cantidad suficiente de bacterias sobre la semilla
b) que la bacteria est en ptimas condiciones para colonizar a la leguminosa. Por ello, la forma
que se use para aplicarla deber asegurar una buena posibilidad de supervivencia.
Reconocimiento y unin
Rizobio libre
Pelo radical
Unin polar
Pelo
radical
El pelo radical se curva
luego del contacto con
el rizobio y se detiene
el crecimiento celular
El cordn de infeccin
penetra la clulas corticales
estimulando su divisin
Pelo radical
Clula infectada
Clula en divisin
Clula sana
Vacuola
Bacteroides
membrana
peribacteroide
Ndulos
Rizobios no diferenciados
Bacterias dentro del
cordn de infeccin
A
B
C
D
Receptor
Unin
Figura 5. Infeccin y establecimiento de los ndulos radicales.

140

c) que las caractersticas del medio donde se implante el vegetal permitan una adecuada
colonizacin de la rizsfera por parte del rizobio para que se formen una cantidad suficiente de
ndulos con funcionamiento efectivo, es decir, una simbiosis exitosa en trminos productivos.
Los dos primeros aspectos estn regulados por la legislacin argentina. En nuestro pas, es
el SENASA el ente oficial que regula y acuerda con los fabricantes de inoculantes y organismos de
investigacin como el INTA, Universidades y organizaciones profesionales, cules son los valores
apropiados para cada tipo de producto. Las exigencias en cuanto al nmero de bacterias en el
inoculante y por semilla deben garantizarse y estar declaradas en el marbete comercial del
producto. Por otra parte, las caractersticas del modo y sitio de aplicacin pueden condicionar la
eficiencia de la simbiosis, an cuando los puntos a) y b) sean completamente satisfactorios.
Calidad de los inoculantes
Cualquiera sea el tipo de produccin que finalmente se prepare, se deber tener en cuenta
varios elementos para garantizar la calidad del inoculante. En general, se debe tener en claro que lo
ms importante es la calidad de la cepa bacteriana a utilizar. sta debe provenir de un cuidadoso
proceso de investigacin y desarrollo llevado a cabo previamente. La cepa a utilizar debe tener la
capacidad de competir con la microflora nativa y naturalizada para establecer la nodulacin lo ms
temprano posible. Adems, debe a su vez estar adaptada a las condiciones de manejo del cultivo
sobre el cual se va a aplicar, as como a la logstica de almacenamiento y transporte impuesta por la
comercializacin del inoculante.
Como ya se mencion, la concentracin adecuada de bacterias y la ausencia de
contaminantes durante toda la vida til del producto son caractersticas fundamentales para
garantizar la calidad de un inoculante. La realizacin de recuentos de bacterias viables en el
inoculante, con capacidad de nodular en condiciones controladas, durante el periodo entre la
fabricacin y el vencimiento del inoculante, permite establecer si la calidad de ste se mantiene
durante su vida til en los niveles requeridos para ejercer su funcin (REDCAI, 2006).
Evaluacin de inoculantes
Para establecer cul fue el resultado de la inoculacin de un cultivo pueden considerarse
determinaciones microbiolgicas y agronmicas. Entre las primeras, puede estimarse el
establecimiento de la cepa del inoculante a travs de la determinacin de su presencia en los
ndulos de las plantas, por ejemplo, utilizando tcnicas de biologa molecular que permitan la
identificacin de la cepa utilizada en el inoculante. Estas metodologas se aplican casi
exclusivamente con fines de investigacin. Entre las determinaciones agronmicas, se pueden
considerar tanto la nodulacin temprana como la mxima, la ubicacin de los ndulos en el sistema
radical, el aspecto del cultivo, su nivel nutricional y su rendimiento. Cuanto ms temprana sea la
nodulacin mayor ser el tiempo total durante cual la FBN estar ocurriendo, con la consiguiente
ventaja para el estado nutricional del cultivo. Un inoculante de calidad, puede garantizar que en los
primeros quince das de la emergencia el 100% de las plantas del cultivo de soja estn noduladas en
la corona de la plantas, siempre y cuando las condiciones ambientales para la germinacin sean
ptimas. El aspecto del cultivo, su estado nutricional y su rendimiento, pueden compararse entre
cultivos con y sin inoculacin, pero los resultados de estas observaciones estn siempre
influenciados por numerosas caractersticas del ambiente y del manejo aplicado a stos.
Inoculantes de Azospirillumy otras PGPR
Numerosas bacterias rizosfricas con capacidad para asociarse con plantas de cultivo se
utilizan como inoculantes en el mundo y su capacidad de promocin del crecimiento vegetal est
bien documentado. En el caso de Azospirillum se cuenta con informacin que demuestra que su
141

inoculacin puede promover el rendimiento de cultivos en diferentes tipos de suelos y reas
climticas de todo el mundo (Okon, Labandera 1994; Bashan et al., 2004; Bashan, de-Bashan
2010). En la produccin de inoculantes a base a Azospirillum es necesario tener en cuenta sus
particularidades para una formulacin apropiada que garantice la calidad del inoculante producido.
En nuestro pas se estn realizando esfuerzos continuados para mejorar tanto la tecnologa de
produccin como de aplicacin de los inoculantes a base de Azospirillum desde hace ms de dos
dcadas (Cassan, Garca de Salamone 2008). Desde hace ya varios aos existen inoculantes
comerciales de Azospirillum recomendados para cultivos de cereales, extendindose a otros cultivos
como el girasol, hortcolas y en la soja en coinoculacin con Bradyrhizobium japonicum.
En Argentina tambin se comercializan inoculantes conteniendo cepas de Pseudomonas
spp., tanto en formulaciones monovalentes como en mezcla con otros microorganismos, a fin de
mejorar la instalacin, nutricin y produccin de diversos cultivos con resultados variables. Naiman
et al. (2009) citan incrementos en la produccin de trigo respecto a los controles sin inocular y sin
fertilizar del 16 y 19% cuando la inoculacin se realiz con inoculantes de Azospirillum y
Pseudomonas, respectivamente, mientras que el incremento debido al aporte de 45 kg N/ha fue del
13%.
Los procedimientos microbiolgicos para la evaluacin de inoculantes en Argentina est
siendo estandarizado (Albanesi et al., 2013).

Elaboracin de un inoculante commercial.

La produccin en gran escala de un inoculante se realiza en general en varias etapas:
1) Preparacin del inculo inicial a partir de cultivos conservados de la cepa a multiplicar.
2) Desarrollo de la bacteria en un medio lquido hasta alcanzar una alta densidad de clulas,
compatible con la utilizacin y/o comercializacin del inoculante.
3) Formulacin del inoculante.
4) Envasado y almacenamiento del producto.

El primer proceso es una operacin de laboratorio usando un medio de cultivo lquido
(caldo) adecuado para la bacteria en cuestin. Diversas modificaciones suelen aplicarse cuando los
motivos econmicos as lo indican, o debido a la mayor o menor disponibilidad de ciertos sustratos
y nutrientes. Se inocula el caldo (aprox. 250-500 ml) partiendo de un cultivo bacteriano puro
conservado en freezer (-20C a -80C). Se crece bajo condiciones adecuadas de aireacin y
temperatura y se usa este cultivo para inocular un volumen mayor (aprox. 10 litros) de caldo fresco,
a fin de realizar un aumento de escala. Este ser el inculo utilizado en la segunda etapa.
En la segunda etapa, tambin se utilizan medios de cultivo lquidos, en tanques de
produccin llamados fermentadores (aproximadamente 100 litros), aunque ms precisamente son
llamados bio-reactores dado que el proceso de cultivo es aerbico. Se inocula con el cultivo
obtenido en la primera etapa y se crece bajo condiciones controladas de temperatura, pH,
concentracin de nutrientes y aireacin, entre otros factores. Los niveles que se alcanzan dependen
de los factores y condiciones del proceso y en general se consideran buenos rindes bacterianos
cuando se llega a niveles que varan entre 10
9
y 10
10
bacterias por mililitro. La concentracin
bacteriana alcanzada vara con la bacteria que est siendo producida. Puede haber o no una
siguiente etapa de aumento de escala, en la cual el contenido del reactor de 100 litros se transfiere a
otro de 1.000 litros, y nuevamente se deja multiplicar el cultivo por el tiempo adecuado segn la
velocidad de crecimiento de la bacteria que se est produciendo.
142

La tercera etapa es crucial para la calidad del producto final. La formulacin del
inoculante consiste en el mezclado del caldo bacteriano con sustancias o medios de
acondicionamiento que favorezcan la estabilidad y conservacin del producto. Cuando se utiliza
turba acondicionada convenientemente u otro sustrato slido, el inoculante final es un producto
slido. En el caso de la impregnacin de la turba, ste ltimo puede o no ser estril. La
impregnacin del sustrato se realiza en varios pasos. A continuacin se ejemplifican para el caso en
que el sustrato sea turba:
a.- Preparacin de la turba: Se la seca hasta un 10% de humedad, preferiblemente por secado al
aire, se la muele para que pase por un tamiz de malla de 120. Se lleva el pH hasta un valor de
6,5-7,2, usando carbonato de calcio o carbonato de magnesio finamente pulverizados. En
Argentina se usan comnmente las turbas de musgos: Sphagnum spp., procedentes de turberas
de Ro Grande, provincia de Tierra del Fuego, y de ciperaceas: Carex spp. de turberas de El
Hoyo, provincia del Chubut.
b.- Impregnacin propiamente dicha: Es el mezclado del caldo bacteriano con la turba ya
acondicionada. Generalmente la proporcin del caldo agregado es la cantidad suficiente para
llevar la humedad del producto al 60-70% del peso seco. Se realiza en equipos adecuados para
asegurar una impregnacin homognea o en su defecto se realiza una homogenizacin
posterior.
c.- Maduracin: Este proceso dura de 4 a 7 das, a una temperatura de 25C-28C, se logra la
ms perfecta humectacin de las partculas de turba y tambin la disipacin del calor. Adems,
en esta etapa se produce un aumento de 2 a 5 veces en el nmero de bacterias viables, siempre
que no existan sustancias antagonistas o txicas en la turba.
En el caso de los inoculantes lquidos, se procede al mezclado del caldo de cultivo junto
con el soporte, cuyos componentes se mezclan y se esterilizan previamente en otro fermentador.
Luego, se transfiere el cultivo, el cual lleg al ttulo requerido, al tanque donde est el soporte
previamente enfriado, se mezcla en proporciones que fija el fabricante y se procede al envasado en
condiciones aspticas. Los soportes para inoculantes lquido contienen en general un adherente
(goma guar, alginato, etc.), el cual puede actuar tambin como protector de la desecacin,
micronutrientes, etc. Los componentes del soporte son secretos y cada empresa formula el propio.
En la ltima etapa, envasado y almacenamiento del inoculante, tanto para los inoculantes
slidos como para los lquidos, se utilizan bolsas de polietileno que por sus caractersticas retienen
satisfactoriamente la humedad y aseguran un conveniente intercambio gaseoso. En el caso de
inoculantes lquidos, esta etapa es fundamental para la calidad del producto y debe realizarse
manteniendo las condiciones de asepsia necesarias, para evitar el ingreso de contaminantes al
producto formulado. El almacenamiento, en general, se realiza en cmaras a temperatura controlada
(4C-10C), durante el mismo se pueden producir cambios en la cantidad de microorganismos
viables, que dependern del lapso y de las condiciones de humedad y temperatura de conservacin.
En trminos generales, cuando la temperatura est entre 0C y 5
o
C, la reduccin decimal del
recuento de viables en inoculantes de B. japonicum es menor que cuando la temperatura es de 25C.
Sin embargo, esto no puede generalizarse para todos los tipos de inoculantes.
Existen en el mercado de inoculantes productos elaborados sobre soporte lquido acuoso
u oleoso. Estos tienen amplia difusin tanto a nivel nacional como internacional, especialmente
los acuosos. Sin embargo, las bondades de estos productos dependen en gran medida de las
condiciones de produccin y almacenamiento y requieren mayor tecnologa de produccin, lo
cual determina que todava se sigan produciendo inoculantes con soportes slidos.

143

LA ASOCIACIN ENTRE ACTINOMICETES Y LAS RACES DE RBOLES Y
ARBUSTOS
Frankia es un actinomicete que forma ndulos en especies no leguminosas de rboles,
arbustos y algunas herbceas (Tabla 5).Estos ndulos poseen actividad fijadora de N2 y se
denominan actinorrcicos. La mayor parte de los hospedantes de Frankia son importantes
colonizadores de suelos pobres en N y como su hbitat son regiones templadas y fras, cumplen el
rol de las leguminosas en zonas tropicales (excepto Casuarina spp. que son representantes
actinorrcicos de reas subtropicales).
La naturaleza de esta asociacin simbitica ha sido objeto de muchas especulaciones desde que en
1866 Woronin detect por primera vez la presencia de un microorganismo en los ndulos radicales
de Alnus glutinosa al que llam Schinzia alni y lo consider un hongo filamentoso.
Numerosos intentos para aislar el endosimbionte desde 1910 fracasaron, hasta que
Callaham et al. (1978) lograron aislar y cultivar un microorganismo de desarrollo miceliar y de
crecimiento lento con todas las caractersticas de un actinomicete. Posteriormente fue clasificado
dentro de la familia Frankiaceae en el gnero Frankia.
En ndulos maduros, el actinomicete puede estar presente en tres estados diferentes: a)
hifal, b) vesicular y c) con formacin de esporangios con esporos.
a) En la etapa inicial de la infeccin las hifas invaden las clulas del hospedante y
forman grupos o masas en su interior causando perforaciones en las paredes celulares y pasando
de una clula cortical a otra. Estas hifas son muy delgadas, poseen un dimetro de 0,3 a 1 m,
son septadas y se ramifican poco. Durante todo el proceso de infeccin las hifas se encuentran
rodeadas por una cpsula de polisacridos producida por la clula hospedante. En el citoplasma
de la clula radical se manifiesta una intensa actividad de las organelas relacionadas con el
proceso de encapsulacin.
b) El estado vesicular se caracteriza por la formacin de vesculas de distintas formas
segn las especies y se localizan en el extremo de hifas formando en conjunto el aspecto de un
racimo de uvas.
c) El tercer estado corresponde a la formacin de esporangios con sus esporos. Los
primeros son hinchamientos fusiformes de las hifas ms gruesas y presentan divisiones tanto en
sentido longitudinal como transversal. Estos esporangios normalmente se observan en el interior
de las clulas del hospedante y ocasionalmente tambin en los espacios intercelulares entre
clulas infectadas. Al madurar se desintegran liberando a los esporos que se destacan por su
gruesa pared celular. Estos esporos de forma irregular, de 0.5 a 1.5 m de dimetro, se forman
por septacin del esporangio
Contrariamente a las hifas y vesculas que siempre estn presentes en los ndulos actinorrcicos
(excepto en especies de Casuarina y Allocasuarina que no forman vesculas), los esporangios y
esporos a veces estn ausentes. En especies de Alnus, Camptonia y Myrica se observaron
ndulos libres de esporos (Sp-) y ndulos con esporos (Sp+). Evidencias experimentales
corroboran que la esporulacin dentro de los ndulos es un carcter gentico del microsimbionte.
La organizacin del tejido de un ndulo Sp+ es igual al del ndulo Sp-.
La morfologa del ndulo puede ser de dos tipos: tipo Myrica y tipo Alnus. En los
primeros, el pice de cada rama nodular o lbulo da origen a una raicilla apogeotrpica. Los
segundos carecen de races nodulares y presentan ramificacin pseudodicotmica (Fig. 6). Los
ndulos tipo Myrica se llaman rizotammios y los tipo Alnus se denominan coraloides.
Dentro de cada lbulo nodular hay un gradiente de edad. Las clulas del hospedante
cerca del pice del ndulo son ms jvenes que las que estn prximas a la base. Las clulas
infectadas del ndulo senescen despus de la diferenciacin de los esporangios y mueren
144

cuando el esporangio est maduro. En este estado tambin las vesculas son senescentes y los
esporangios persisten dentro de las clulas en las regiones ms bajas del lbulo nodular. En la
Figura 7 se esquematiza ese gradiente de edad. La zona A contiene clulas no infectadas y clulas
pos-meristemticas. La zona B est formada por clulas pos-meristemticas, algunas de las cuales
comienzan a estar infectadas por los filamentos de Frankia pero an no hay fijacin de N2. La zona
C es la de mayor actividad, donde se producen hemoglobina y una serie de enzimas relacionadas
con la produccin de energa y compuestos nitrogenados reducidos. La zona D es la zona de
senescencia, donde se observara la sntesis de una serie de proteasas.


Tabla 5. Plantas actinorrcicas

















Figura 6. Esquema de las fases del desarrollo de los dos tipos de ndulos
actinorrcicas
Familia Gnero
Casuarinaceae Casuarina
Coriariaceae Coriaria
Betulacea Alnus
Datiscaceae Datisca
Myricaceae Myrica
Rosaceae Comptonia
Rubis
Dryas
Cercocarpus
Rhamnaceae Ceanothus
Discaria
Colletia
Trevoa
Kenthrothamus
Eleagnaceae Eleagnus
Hippophae
145







Figura 7. Localizacin de los diferentes estados del microsimbinte en una rama nodular.
Vas de infeccin
Algunos hospedantes son infectados por medio de los pelos radiculares mientras que en otros la
entrada del microsimbionte se produce por los espacios intercelulares del tejido de la raz. Algunas
especies admiten ambos mecanismos de entrada.
Infeccin del pelo radicular
En el comienzo del proceso se produce una deformacin de la pared del pelo radicular y un
encurvamiento como consecuencia de la presencia de Frankia. Si bien todos los pelos pueden
curvarse slo unos pocos pueden infectarse. Hay una gran actividad metablica en el citoplasma del
hospedante para formar el material que encapsula a las hifas.
Los pelos no infectados degeneran y los infectados presentan sus organelas con gran
actividad.
Con el ingreso del microsimbionte hay un aumento de la actividad mittica en el cortex
radicular en las proximidades de las infecciones del pelo radicular y esto lleva a la formacin de
una zona llamada pre-ndulo, el cual con el avance del proceso se transforma en ndulo.
Colonizacin intercelular
Los pelos radicales no se deforman, las hifas penetran entre las clulas epidrmicas
atravesando la lmina media. No se encapsulan, pero las clulas epidrmicas y corticales de la
planta secretan material dentro del espacio intercelular. Este tipo de infeccin se produce en tejidos
corticales de races maduras y al mismo tiempo un primordio del lbulo nodular se inicia en el
periciclo.
La presencia simultnea de ndulos activos y senescentes, de distintos tamaos y edades en
el sistema radicular, sugiere la continua formacin y desintegracin de ndulos durante la vida del
hospedante. Ocasionalmente los ndulos pueden alcanzar una edad de 10 aos.
Proteccin del oxgeno y fijacin del N2
Uno de los resultados ms sorprendentes del aislamiento de Frankia en l978 fue el
descubrimiento de que la fijacin de N2 es mxima cerca de los niveles de O2 de la atmsfera. Esto
contrasta con lo observado en los rizobios, que slo es capaz de expresar actividad nitrogenasa
cuando los niveles de O2 son extremadamente bajos.
Varias evidencias de naturaleza fisiolgica, citolgica y gentica indican que la funcin de
la vescula es proteger a la nitrogenasa del O2. Especialmente su pared, formada por varias capas de
naturaleza lipdica rica en hopanoides, bacterihopanotetrol y un fenilacetilester que slo se
encuentran en Frankia. Estos lpidos actuaran como una barrera para la difusin de O2. Sin
146

embargo, el desarrollo de una envoltura con apropiado espesor y composicin lipdica necesita
varios das. Por ello, se considera que otros mecanismos estn involucrados para completar la
proteccin de la nitrogenasa, como las actividades de las enzimas superxido dismutasa y catalasa
que se encuentran en mayor cantidad en las vesculas que en las hifas.
En Casuarina y Allocasuarina no se forman vesculas y se asume que la proteccin del O2
est determinada por un espesamiento y lignificacin de las paredes de la clula donde tiene su
asiento la nitrogenasa, una disposicin anatmica del tejido nodular que evita una gran aireacin y
un aumento de la hemoglobina.
El hecho que la diferenciacin de las hifas intracelulares se correlaciona con la
lignificacin de las paredes de las clulas infectadas del hospedante, lleva a suponer que estas hifas
intracelulares (y no las invasoras) seran en Casuarinaceae la contraparte de las vesculas de otras
simbiosis actinorrcicas.
Gentica
Los estudios con respecto a la nitrogenasa han demostrado que esta enzima es similar a la
de otros fijadores de N2, con los genes estructurales DHK. Los genes nifH y nifD de Frankia tienen
un alto grado de homologa con los correspondientes genes de Azotobacter y cianobacterias, no as
el gen nifK.
Si bien ha resultado bastante sencilla la identificacin de estos genes, no ha ocurrido lo
mismo con los genes nod, donde los intentos han tenido xito limitado. Se hace necesaria la
realizacin de ms estudios sobre la fisiologa, bioqumica y estructura fina de los ndulos en
desarrollo que aporten datos acerca de qu genes estn involucrados en la nodulacin. Se ha
avanzado en el estudio de las auxinas y citoquininas de Frankia y se especula que pueden tener
importancia en el proceso de nodulacin.
Factores ambientales que influyen sobre la nodulacin y la fijacin
pH: Contrariamente a la mayor parte de las leguminosas muchas plantas actinorrcicas pueden
desarrollar en suelos cidos (ej. Myrica gale), pero en general el pH ptimo para la fijacin est
comprendido entre 4,2 y 7.
Temperatura: La temperatura ptima para la actividad de la nitrogenasa vara segn las especies,
para algunas oscila entre 20 y 25
o
C y para otras entre 30 y 35
o
C.
Aireacin y humedad: La formacin de ndulos requiere un cierto grado de humedad en el suelo y
suficiente O2. Las races noduladas se hallan presentes sobre todo en las capas ms superficiales del
suelo y es difcil hallarlos en suelos inundados, excepto en Myrica gale.
Nutrientes: Para una adecuada nodulacin y fijacin de N2 se necesita un buen nivel de P y Ca y
adems cubrir los requerimientos de ciertos microelementos tales como Co, Cu y Mo.
Relaciones con otros microorganismos rizosfricos
Se destaca la accin sinrgica de Frankia con otros microorganismos de la rizosfera como
Pseudomonas, Azospirillum y micorrizas tanto ecttrofas como vesculo-arbusculares. Las
micorrizas son asociaciones simbiticas entre plantas y hongos que favorecen la provisin de P y
aumentan la exploracin del perfil de suelo.
147

Fijacin de N2 a campo y aplicaciones del sistema actinorrcico
Datos de fijacin evaluados en bosques de Alnus oscilaron entre 60 y 85 Kg de N ha
-1
ao
-
1
.Varias experiencias con Alnus glutinosa indicaron que pueden llegar a sobrepasar la eficiencia de
la fijacin de muchas leguminosas.
Como la gran mayora de las especies actinorrcicas son leosas, no son apetecidas por
el ganado por lo tanto pueden utilizarse como recuperadoras de la fertilidad de suelos agotados
o erosionados, sin correr el riesgo que sean devoradas.
Las plantas actinorrcicas ofrecen un interesante campo para su estudio desde el punto de
vista bsico y aplicado, dado el avance de las tcnicas moleculares que permiten conocer mejor la
diversidad gentica de las especies involucradas en esta simbiosis. La optimizacin de esta
simbiosis puede mejorar el nivel y disponibilidad de N del suelo en cultivos consociados de plantas
actinorrcicas con plantas de inters econmico. Por ejemplo, en muchos lugares del mundo se
emplean especies rboreas actinorrcicas consociadas con plantas de importancia comercial como la
asociacin de Populus spp. con Alnus spp..
Los programas de reforestacin necesarios para mitigar el impacto ambiental y cubrir las
exigencias de la industria papelera que requiere ejemplares de rpido desarrollo, han despertado el
inters por el establecimiento de la fijacin biolgica de N2 en especies forestales y representa un
gran desafo tecnolgico para nuestro pas.

FIJACIN NO SIMBITICA DE NITRGENO. FIJADORES LIBRES Y
ASOCIATIVOS.
La medida de la actividad nitrogenasa por medio del mtodo de la reduccin del
acetileno permiti examinar diversos ecosistemas en donde podra existir la fijacin potencial de
N2. Esta metodologa permiti confirmar que exista fijacin de N2 asociada con sistemas no
simbiticos en particular en la rizosfera de gramneas tales como sorgo, arroz y maz. Se ha
podido identificar y clasificar numerosas bacterias fijadoras de N2 de la rizosfera, en distintos
gneros de esta familia de plantas. Estas bacterias han sido aisladas de la rizosfera, superficie de
la raz, y en algunos casos del interior de la raz. Muchas bacterias que desarrollan en el suelo
son capaces de fijar N2 en cantidades importantes. Algunas crecen en el suelo libre pero la
mayora ocupan la rizosfera, con diversos grados de asociacin con las races. Los gneros de
mayor distribucin en los suelos son Azotobacter, Azospirillum, Beijerinckia y Derxia. Tambin
se ha descripto esta capacidad en especies del gnero Paenibacillus.

Azotobacter spp.: Son bastones aerobios de 2-3 m de ancho por 3-10 m de largo,
pleomrficos, formadores de quistes, con flagelos pertricos. Las especies A. chroococcum y A.
vinelandii estn limitadas a suelos neutros y slo espordicamente se encuentran en suelos
tropicales hmedos. Generalmente no prosperan en la rizosfera de las plantas, atribuyndose a la
acumulacin de sustratos bacteriostticos, excepto la especie A. paspali que es abundante en la
rizosfera de Paspalum notatum, siendo remarcable en este caso la alta especificidad planta-
bacteria que llega hasta ecotipo.
Azotobacter puede acumular en su protoplasma grandes concentraciones de polihidroxibutirato
(PHB), sustancia que actualmente se ensaya para la elaboracin de plsticos biodegradables. La
importancia de Azotobacter en el suelo est ms relacionada a su capacidad de degradar
sustancias recalcitrantes y a sus exopolisacridos capsulares que contribuyen a la agregacin del
suelo que a su eficiencia como fijador de N
2
.
148

Beijerinckia spp.: Contrariamente a Azotobacter, las especies de Beijerinckia son
representantes de zonas tropicales. Fueron aisladas de suelos cultivados con arroz y tambin de
la superficie de races de caa de azcar. Son muy tolerantes a la acidez, desarrollan en medios
con valores de pH de 3 a 9. Se encuentran en gran nmero en suelos tropicales del tipo Latosol.
Al microscopio, generalmente se distinguen fcilmente las clulas en forma de bastn porque en
cada extremo lleva un glbulo de PHB. La eficiencia de la fijacin es de 13-30 mg N g
-1
de
sacarosa consumida.
Derxia spp.: son bastones ms delgados que Beijerinckia, desarrollan colonias con mayor
cantidad de mucus que las de Azotobacter y Beijerinckia. La especie ms repartida en suelos
tropicales es D. gummosa. La eficiencia de la fijacin alcanza a 25 mg N g
-1
de glucosa
asimilado.
Azospirillum spp.: Son bastones ligeramente curvos de 0,8 a 1,0 m de dimetro por 2 a 4 m
de longitud y muchas veces son puntiagudos. Acumulan grnulos de PHB en condicin de
fijacin de N2, llegando a acumular el 50% del peso seco de su masa celular, mientras que las
clulas cultivadas con NH4
+
acumulan slo el 1%.
Los azospirilos son Gram
_
, muy mviles en medios semislido. Esos movimientos son
del tipo vibracional y son propulsados por un flagelo polar. Cuando crecen en un medio con
agar blando pueden observarse numerosos flagelos pertricos. Son aerobias cuando el medio
contiene una fuente combinada de N y posee principalmente un metabolismo respiratorio con el
O2 o NO3
-
como aceptores finales de electrones.
Han sido caracterizadas numerosas especies de Azospirillum. Algunas de ellas como A.
brasilense y A. lipoferum han sido ampliamente estudiadas. La mayora de ellas se han
encontrado en forma libre en el suelo o en asociacin con races vegetales en muchas partes del
mundo y frecuentemente en gran nmero (hasta 10
7
bacterias g
-1
de raz). Las plantas
hospedantes ms citadas son gramneas de zonas tropicales como maz, sorgo, caa de azcar y
arroz, pero tambin se han encontrado en zonas templadas y fras. Su inoculacin generalmente
produce incrementos de rendimientos en cultivos de grano que en promedio pueden oscilar entre
un 10 y 30%. Adems, hay numerosas evidencias que muestran que esta rizobacteria tiene
capacidad de producir asociaciones benficas con cultivos hortcolas, forrajeros, frutales y no
tradicionales.
Micrografas electrnicas de barrido han revelado que la colonizacin se efecta
preferencialmente en la zona de elongacin de la raz y en la base de los pelos radiculares. La
quimiotaxis de Azospirillum se ve favorecida por los exudados radiculares.
Los mecanismos por los cuales Azospirillum favorece el crecimiento vegetal son varios.
Ciertas combinaciones Azospirillum-planta permitieron demostrar utilizando la tcnica de
dilucin isotpica de
15
N que pueden lograse niveles de N provenientes de fijacin biolgica
que se equiparan a un aporte de 100 kg N ha
-1
. Por otra parte, Azospirillum produce factores de
crecimiento tales como cido indol actico, cido indol lctico, cido indol butrico, indol 3-
etanol, indol 3-metanol, varias giberelinas, citoquininas y cido abcsico. Algunas de estos
fitoreguladores se han purificado y se han agregado a plntulas reproducindose los efectos de
Azospirillum sobre el desarrollo y morfologa de la raz, es decir, alargamiento y mayor
produccin de pelos radiculares. Este proceso favorecera una mayor absorcin de agua y
nutrientes que mejorara el estado nutricional de las plantas inoculadas con esta rizobacteria.
En la literatura referida este tema se considera que dependiendo de la combinacin
azospirilo-planta pueden intervenir uno o ms de estos procesos en la promocin del
crecimiento y rendimiento en cultivos de importancia agronmica en diferentes suelos y reas
climticas del mundo. Por ejemplo, en ensayos con dos variedades de tomate se estableci que
149

la promocin del crecimiento y la sanidad del cultivo dependen en gran medida de la
combinacin entre el genotipo vegetal y la cepa de A. brasilense con la cual se haya inoculado
las semillas de tomate (Romero y col. 2003, Correa y col. 2007).
Existen en el mercado, tanto en el mbito nacional como internacional, formulaciones
comerciales de Azospirillum que no difieren en alternativas a las mencionadas para rizobios. De
todas maneras es necesario invertir en investigacin y desarrollo a fin de optimizar la eficiencia
de las asociaciones azospirilo-planta.

LA ASOCIACIN DE LA CAA DE AZCAR CON BACTERIAS ENDOFITAS.
Hace algunos aos se ha demostrado que la caa de azcar se asocia con bacterias de las
especies Gluconacetobacter diazotropicus (antes conocida como Acetobacter diazotropicus)
Herbaspirillum seropedicae y H. rubrisubalbicans. Estas bacterias se desarrollan dentro de las
plantas como endofitos. Se considera un endofito un hongo o bacteria que durante todo o parte
de su ciclo de vida invade el tejido de plantas vivas, sin causarles sntomas o enfermedad. Se
ha observado que en muchos casos la presencia de endofitos mejora el crecimiento de las plantas y
los protege de ataques de patgenos.
Se ha determinado que las bacterias antes mencionadas, cuando estn presentes, pueden
fijar por lo menos hasta el 60% del N requerido por la caa de azcar. La asociacin entre estas
bacterias y la caa de azcar constituye un campo de intensas investigaciones tanto en el mbito
nacional como en el internacional. No se conoce claramente como se produce la infeccin, y se
postula que hay en el suelo esporas que penetran las races y luego migran a la parte area. Otra
posibilidad es que la bacteria permanezca viable en el rastrojo hasta la cosecha del ao siguiente
e infecte a las nuevas plantas.

CAPTULO 9
MICORRIZAS
Clasificacin de las micorrizas. Su biologa. Aspectos nutricionales. Efectos benficos.
Preparacin de inoculantes. Su relacin con el ciclo del P.
Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los
Microorganismos, 8
a
edicin. Prentice Hall.
Captulo 14 (14.21)


Introduccin
Las plantas han desarrollado numerosas estrategias para poder sobrevivir en distintos
ambientes. Una de las estrategias ms exitosas es la capacidad de las races para asociarse con
microorganismos estableciendo simbiosis mutualistas.
Una micorriza es una asociacin simbitica mutualista entre un hongo no patgeno y
clulas vivas de la raz. Esta relacin produce beneficios tanto para la planta, debido a que
mejora la absorcin de agua y minerales, como para el hongo, que recibe nutrientes orgnicos
de la planta.
150

Los hongos micorrcicos son simbiontes obligados, lo cual implica que no pueden
multiplicarse sin estar asociados a una planta husped. En cuanto a las plantas, casi todas las
especies viven con este tipo de simbiosis, salvo ciertas especies de las familias de las
Ciperceas, Juncceas, Urticceas, Quenopodiceas, Cariofilceas y Crucferas, que son menos
infectadas que otras. Casualmente, muchas de estas especies no formadoras de micorrizas
constituyen malezas persistentes de cultivos agrcolas.
El origen de esta asociacin es muy antiguo. Los registros fsiles evidencian la
presencia de individuos de la divisin Glomeromycota hace 600 millones de aos, alrededor de
100 millones de aos antes que el surgimiento de las plantas en la superficie terrestre. Nicolson
(1975) estim que estos hongos pudieron haber evolucionado como una adaptacin para la
eficiente absorcin de fsforo y muchos investigadores postulan que pudieron haber participado
en la colonizacin de ambientes terrestres por parte de las plantas (Berbara et al, 2006).
Histricamente, las micorrizas se han dividido en dos grandes grupos: las
endomicorrizas (MA) y las ectomicorrizas (ECM). Las primeras estn presentes en plantas
herbceas y arbustivas de ecosistemas naturales y de inters agronmico mientras que las
ectomicorrizas se encuentran en plantas arbreas, muchas de uso forestal (Pinceas, Fagceas,
Quercinceas, entre otras). Las ectendomicorrizas, por su parte, constituyen un grupo con
caractersticas intermedias entre las ECM y las MA.
La clasificacin y caractersticas resumidas en la Tabla 1 incluyen los grupos de las endo- y
ectomicorrizas, as como las subdivisiones surgidas recientemente. En este captulo se
analizarn con mayor detalle a las MA y las ECM pues stas representan, junto al selecto
subgrupo de las micorrizas ericoides, el 90% de todas las asociaciones.

ENDOMICORRIZAS

Este grupo incluye las micorrizas arbusculares, las arbutoides y ericoides, y las
micorrizas de orqudeas. Las MA poseen particular consideracin porque se asocian
simbiticamente con la mayora de las plantas silvestres y cultivadas formadoras de
endomicorrizas. Todos estos hongos comparten el mismo modo de infeccin: las hifas penetran
en el tejido cortical de la raz de la planta e infectan progresivamente las clulas de la corteza.
Sin embargo, las estructuras visibles son significativamente diferentes entre los distintos tipos
(Tabla 1).
An existiendo un amplio grado de susceptibilidad del hospedante y de adaptabilidad
del hongo a determinadas condiciones, las endomicorrizas estn presentes en casi todos los
suelos, en asociacin con una gran variedad de plantas de distintos grupos taxonmicos. La gran
diversidad de hospedantes de las MA hace que stas sean sumamente importantes para el
crecimiento de las plantas en un amplio espectro ecolgico y geogrfico. La principal
contribucin del hongo est en la absorcin y traslocacin de agua y nutrientes. Los beneficios
se manifiestan especialmente en aquellos lugares donde los factores del crecimiento se
encuentran por debajo de los valores ptimos para el desarrollo de las plantas, como en zonas
desrticas de suelos pobres con alta cantidad de arena. Asimismo, existen beneficios indirectos
para las plantas y el ecosistema, principalmente a travs de su interaccin con el ambiente
edfico al participar en la dinmica del carbono y en la agregacin del suelo.

151

Tabla 1. Clasificacin de las micorrizas y sus caractersticas.
Clasificacin
clsica
Clasificacin actual Caractersticas
Planta
hospedera
Hongo
Endotrficas o
endomicorrizas
Arbusculares Desarrollo
mayoritario del hongo
dentro de la raz.
Hifas externas no
formadoras de manto.
Micelio no septado,
salvo en hifas viejas.
Hifas intercelulares
que no forman red de
Hartig, e hifas
intracelulares que
forman arbsculos y
en ciertos casos
vesculas.
Se han
encontrado en la
mayora de las
plantas de la
corteza terrestre
Glomeromycota
4 rdenes
11 Familias
17 Gneros

Ericceas Ericoides Rudimento de manto.
Hifas septadas inter e
intracelulares, las
intracelulares forman
masas compactas que
pueden ser lisadas o
digeridas.
No se forman
vesculas ni
arbsculos.
Ericaceae
Epacridaceae
Empetraceae
Ascomycota
Arbutoides Forman manto.
Hifas septadas intra e
intercelulares, las
intercelulares no
forman red de Hartig.
Ericaceae
Pyrolaceae
Monotropaceae
Basidiomycota
Orquidceas La planta husped
tiene un perodo de su
ciclo de vida
hetertrofo durante el
cual, para sobrevivir,
necesita ser infectada
por un hongo
micorrcico que forma
micelio septado.
Hifas pueden
evolucionar como
micorriza o parsitas.
Orchidaceae Basidiomycota
Ectotrficas o
ectomicorrizas
Formadoras de manto
(sheathing)
Manto que cubre la
raz.
Hifas slo
intercelulares que
forman la red de
Hartig. Micelio
septado.
Betulaceae
Fagaceae
Pinaceae
Eucaliptus
Basidiomycota

152

La aplicacin prctica de las endomicorrizas es solo factible en reas como fruticultura,
horticultura, floricultura y revegetacin de espacios degradados, donde es comn o factible la
existencia de una etapa de trasplante. Esto se debe a que hasta el momento no se ha podido
cultivar las MA en medios artificiales debido a que se trata de un hongo bitrofo obligado, o sea
que necesita de un hospedante para completar su ciclo de vida. Esto constituye una diferencia
tecnolgica con respecto a los hongos involucrados en las asociaciones ectomicorrcicas (ver
ECM).
Colonizacin de la raz por el hongo: proceso y estructuras involucradas
La infeccin se desarrolla a partir de la activacin del micelio del hongo, mediante la
germinacin de esporas o de micelio infectivo procedente de fragmentos de races micorrizadas.
En primer lugar, el hongo forma un apresorio sobre la superficie de un pelo radicular o
epidermis de la raz y luego las hifas penetran la pared celular por medio de acciones mecnicas
y/o enzimticas. Cuando se establece la simbiosis micorrcica, ocurren en la raz cambios
anatmicos y citolgicos: en el rea invadida se genera una hipertrofia de los tejidos celulares,
aumenta el plasmalema y el citoplasma del hospedante, as como tambin el ncleo de las
clulas infectadas modifica su forma y se vuelve ms voluminoso.
A partir de la formacin del apresorio comienza el desarrollo de micelio interno, el cual
ocurre intra e intercelularmente. En el interior de algunas clulas del hospedante el hongo forma
enrollamientos que permiten extender la infeccin longitudinalmente en la raz para penetrar las
clulas ms internas de la corteza. Una vez en la corteza, se forman ramificaciones a partir de
hifas intercelulares y el plasmalema del husped se invagina, rodeando totalmente la estructura
fngica hasta que sta se encuentra en el interior de la clula. Seguidamente, esta estructura del
hongo se ramifica repetidamente, dando lugar a una estructura arborescente llamada arbsculo.
En la zona de contacto husped-arbsculo se forma una fase donde se ha comprobado que
ocurre la mayor transferencia de nutrientes entre ambos simbiontes.
Por otra parte, el micelio interno puede formar vesculas que actan como rganos de
reserva. stas son formadas solamente por algunos gneros de MA y consisten en
ensanchamientos terminales o intermedios de hifas, que se disponen inter o intracelularmente.
Las vesculas se desarrollan ms tardamente que los arbsculos, en las regiones ms antiguas
de la infeccin, y contienen material lipdico. El hecho de encontrarlas asociadas con races
viejas o muertas sugiere que tambin desempean un papel como rganos de reposo y/o de
propagacin del hongo.
Al mismo tiempo las hifas crecen en el exterior, establecindose posteriormente puntos
de entrada. Se observa entonces la presencia de un sistema micelial integrado por dos fases: un
micelio interno, ubicado dentro de la corteza de las races micorrizadas, y un micelio externo
de extensin variable, el cual coloniza el suelo pudiendo llegar a extenderse varios centmetros
desde la raz. Se presentan dos tipos de hifas extramatriciales: aquellas que avanzan a travs de
amplias superficies del suelo y las hifas absorbentes (Figura 1).
La presencia del micelio externo constituye uno de los principales pilares de la
asociacin, ya que estas hifas se desarrollan ms all del suelo que circunda la raz, trascienden
la rizsfera y transportan nutrientes directamente hacia la planta, lo cual resulta de especial
importancia para la absorcin de nutrientes poco mviles. Adems de asistir en la absorcin de
nutrientes, esta red externa de hifas participa en la agregacin de las partculas del suelo. A
partir del micelio externo del hongo, y excepcionalmente dentro de la raz, se pueden formar
grandes cantidades de esporas de resistencia de paredes gruesas, las cuales pueden sobrevivir
por varios aos. Las esporas pueden ser de tipo clamidosprico (con pedicelo) o azigosprico
(sin pedicelo).
153


Taxonoma de hongos micorrcicos arbusculares
La taxonoma de los hongos formadores de MA (HFMA) ha sufrido numerosos cambios. Segn
la clasificacin de Schler et al. (2001), basada en el anlisis de las secuencias de ARN
ribosomal, es probable que estos hongos provengan de un ancestro comn con los phyla
Ascomycota y Basidiomycota. Estos autores ubicaron a los HFMA dentro del phylum
Glomeromycota, compuesto por hongos simbiontes obligados que forman endomicorrizas
arbusculares (MA) o endocitobiosis con organismos fotosintticos (Tabla 2).

La familia Geosiphonaceae incluye al hongo Geosiphon pyrifomis que establece endosimbiosis
con cianobacterias. Si bien esta asociacin puede no ser considerada micorrcica, indica la
posibilidad de tipos ancestrales de simbiosis entre hongos y organismos fotoauttrofos,
reflejando un posible estadio evolutivo primitivo de la asociacin micorrcica arbuscular cuando
las plantas todava no colonizaban la tierra y las cianobacterias eran organismos preponderantes
en el planeta (Schubler et al, 2001).




Figura 1. Diagrama de una endomicorriza. AD, azigosporo en desarrollo, AP apresorio, AZ
azigosoporo con hifas infectivas, CA clulas auxiliares, CL clamidospora, EV esporo vegetativo
de Glomus, ME micelio extraradicular, PR pelo radicular, TG tubo germinativo.


154

Tabla 2. Clasificacin de hongos micorrcicos arbusculares (HMA) (Schler & Walker,
2010)
Phylum Glomeromycota
Clase Glomeromycetes
rdenes (4) Familias (11) Gneros (17)
Glomerales Glomeraceae Glomus
Funneliformis
Rhizophagus
Sclerocystis
Claroideoglomeraceae Claroideoglomus
Diversisporales




Gigasporaceae Gigaspora
Scutellospora
Racocetra
Acaulosporaceae Acaulospora
Entrophosporaceae Entrophospora
Pacisporaceae Pacispora
Diversisporaceae Diversispora
Otospora
Paraglomerales Paraglomeraceae Paraglomus
Archaeosporales


Geosiphonaceae Geosiphon
Ambisporaceae Ambispora
Archaeosporaceae Archaeospora (incluye a Intraspora)

Papel nutricional de las MA
El papel de las MA en la nutricin vegetal en suelos con baja fertilidad o en ambientes
degradados o con niveles considerables de algn tipo de estrs es una de las reas ms
interesantes de investigacin, con un alto potencial para su aplicacin prctica en agricultura
sustentable y recuperacin de suelos degradados.
Los beneficios nutricionales de las MA resultan de interacciones dinmicas y complejas
entre las races y el micelio fngico moduladas por el ambiente. El papel primario de las MA en
el aumento de la absorcin de nutrientes se debe a que el micelio externo contribuye con el
aumento tanto de la superficie de contacto con el suelo como del volumen explorado. Es sabido
que las especies vegetales con un sistema radicular extremadamente ramificado dependen
menos de MA para la absorcin de nutrientes que otras plantas con sistemas radiculares
pivotantes con pocas ramificaciones.
Por otra parte, la disponibilidad de nutrientes en el suelo puede afectar el
establecimiento y funcionamiento de esta simbiosis. De acuerdo al aumento del nivel de
fertilidad, la dependencia de la condicin micorrcica para un buen desarrollo decrece hasta un
punto en que la planta se vuelve inmune a la colonizacin. La disponibilidad de fsforo ejerce
una influencia muy marcada en la micorrizacin y ser analizada luego con mayor detalle. En
cuanto al N, se sabe que altos niveles reducen la colonizacin.

Otros factores que afectan a las MA
Adems de la disponibilidad de nutrientes, el ambiente puede regular la formacin de MA a
travs de otros factores tales como:
155

- pH
Existe gran variabilidad entre las especies e incluso entre ecotipos. Generalmente, las especies
de Gigaspora y Acaulospora se encuentran en suelos de pH bajos mientras que el gnero
Glomus comnmente aparece en suelos prximos a la neutralidad o alcalinos y difcilmente
forma asociaciones micorrcicas en suelos con elevada acidez.
- Humedad
La colonizacin es aparentemente ms rpida cuando la humedad del suelo es menor a la
capacidad mxima de retencin. Suelos anegados presentan menor colonizacin debido a la
falta de oxgeno.
- Luz y temperatura
Ambos tienen efecto sobre el desarrollo del hospedante y, por ende, sobre la disponibilidad de
nutrientes para el hongo. La temperatura del suelo parece influir en la actividad fisiolgica de la
micorriza ms que afectar su desarrollo.
- Biolgicos
La presencia de otros organismos del suelo puede afectar la funcionalidad de las MA. Los
nematodes, por ejemplo, pueden alimentarse del micelio reduciendo su eficiencia en el
transporte de nutrientes.
- Agroqumicos
Adems de los efectos ya mencionados de los fertilizantes va nutricin, se ha encontrado que
muchos fungicidas e insecticidas inhiben la micorrizacin.

Medios artificiales y prcticas de inoculacin de MA
Como las esporas recogidas del suelo no desarrollan en medios artificiales, se inoculan
en plantas susceptibles (Rye grass, cebolla, trbol, Panicum, Bracchiaria, etc.) para obtener
raicillas infectadas que junto con las esporas sirven de inculo para los ensayos de investigacin
o para las actividades comerciales en viveros (plantas forestales, frutales y ornamentales).

ECTOMICORRIZAS (ECM)
En este caso los hongos micorrcicos forman un denso manto que envuelve la raz (Fig.
2). Desde este manto las hifas individuales crecen hacia fuera introducindose en el suelo, y
hacia dentro intercalndose entre las clulas del crtex de la raz, a travs de la lmina media,
formndose un entramado denominado red de Hartig. Esta red puede ser ms evidente en
algunas asociaciones que en otras as como el manto que envuelve la raz puede variar en
grosor. En algunos rboles la micorriza presente puede evidenciar un manto muy reducido o
estar totalmente ausente, formando las llamadas ectendomicorrizas.
Esta simbiosis produce grandes cambios en la morfologa radical. Se estimula la
formacin de races laterales, se elongan radialmente las clulas corticales y se suprime la
formacin de pelos radicales. Si bien esto ltimo reducira la superficie de absorcin, el efecto
queda contrarrestado por las hifas micorrcicas, que incrementan el volumen de suelo explorado.
Las races infectadas suelen hallarse en la capa del mantillo del suelo y el micelio se
extiende a travs de las hojas cadas y produce grandes cuerpos fructferos por encima del nivel
del suelo (hongos sombrero), que liberan una gran cantidad de esporas que sern dispersadas
por el viento. A diferencia de las endomicorrizas, los hongos ectomicorrcicos pueden crecer sin
influencia de la planta husped en un medio que contenga azcares simples y vitaminas.
La planta hospedante se beneficia con esta relacin ya que las hifas externas facilitan la
156

entrada a la raz de los compuestos orgnicos y minerales del suelo. El hongo, adems de
utilizar los fotoasimilados de la planta, est protegido de la competencia con otros
microorganismos, lo cual compensa su escasa habilidad competitiva saproftica.
Los hongos ectomicorrcicos son de gran importancia para la forestacin. Pertenecen en
su mayora al grupo Basidomycota. Son organismos aerobios, que crecen preferentemente en
suelos permeables y aireados con bajo o mediano grado de fertilidad. Los gneros ms comunes
son Boletus, Amanita, Russula, Suillus, Scleroderma, Agaricus y Pisolithus. Son simbiontes
caractersticos en forestales de las familias Fagaceae, Betulaceae y en particular de Pinaceae.





















Preparacin de inoculantes ectomicorrcicos (hongos sombrero)
Para obtener los inculos iniciales de estos hongos se puede proceder de dos formas:
- Obtener las esporas y sembrarlas en un medio slido adecuado, ya sea agar malta o agar
extracto de levadura glucosado a pH~5, e incubar a 25C.
- Si se trata de un basidiomicete, sembrar un trocito del sombrero en el medio slido
adecuado, e incubar a 25C.
Figura 2. Representacin esquemtica de las estructuras externas e internas
de las microrrizas ecttrofas.
157

Con cualquiera de las dos tcnicas al cabo de un tiempo se obtiene micelio, que luego se
inocula medio de cultivo lquido y se incuba con agitacin. ste es el inculo que se emplea
para impregnar la turba que se usar como inoculante.

BENEFICIOS DE LA MICORRIZACIN
Entre los posibles beneficios directos para las plantas se han observado:
- Asistencia en la absorcin de agua y nutrientes, fundamentalmente de aquellos poco mviles
como los fosfatos, amonio y elementos catinicos de K, Zn y Cu, favoreciendo un mejor
estado nutricional en la parte area de la planta.
- Mayor tolerancia frente a diversos factores de estrs abitico: sequa, valores desfavorables
de pH, alto contenido de sales, exceso de erosin elica, etc.
Las glomalinas
8
que sintetiza y exuda el hongo de MA poseen cargas negativas que
inmovilizan ciertos cationes fitotxicos, impidiendo que sean absorbidos. Esto aumenta la
tolerancia de algunas plantas a suelos con alto contenido de metales pesados.
- Mayor tolerancia frente al ataque de organismos patgenos, como se ha observado ante
nematodes y hongos como Fusarium, Pythium y Rhizoctonia. sta podra estar inducida
indirectamente a partir de los beneficios fisiolgicos sobre la planta, pero tambin
directamente mediante la competencia con el patgeno o la activacin de sistemas de
defensa en la planta.
- Aumento en eficiencia fotosinttica, que compensara las prdidas de C por transferencia al
hongo.

A nivel productivo estas ventajas de la micorrizacin permiten por ejemplo:
Mejorar la aclimatacin de plantas micropropagadas (manzano, duraznero, entre otros).
Reducir la mortalidad de plantas ornamentales y frutales que se desarrollen en sustratos
con bajo contenido de fsforo y buena aireacin, as como incrementar el peso seco de
hojas y races y lograr una floracin significativamente ms precoz mediante la
utilizacin de micorrizas del gnero Glomus (G. mosseae, G. intraradices y G.
viscosum).
Aumentar rendimientos cuanti y cualitativamente, permitiendo una disminucin en la
cantidad de fertilizantes empleados. Las micorrizas permiten una aplicacin exitosa
mediante el recubrimiento de las semillas, lo cual mejora su calidad (Read, 1999).
Mejorar en sitios degradados y/o contaminados la implantacin de las plantas destinadas
a la recuperacin y/o revegetacin.
Utilizar conjuntamente con micorrizas otros microorganismos de control biolgico o
promotores de crecimiento, desarrollando sistemas micorrizosfricos beneficiosos para
la nutricin y la proteccin vegetal (Barea, 2004).

Los principales beneficios indirectos de la micorrizacin conocidos hasta el momento son:
- Participacin en la formacin de agregados estables en el suelo a travs de la produccin
de hifas y exudados. Entre estos ltimos, las glomalinas favoreceran adicionalmente la
agregacin qumica (floculacin) de las partculas del suelo. Esto resulta de gran
importancia en suelos con baja actividad qumica, como aquellos arenosos, limosos o
tropicales.

8
* Glomalinas: glicoprotenas de estructura similar a los cidos hmicos cuya sntesis por parte de los
hongos micorrcicos arbusculares est siendo recientemente estudiada.
158

- Interaccin de los HFMA con la diversidad y abundancia de las comunidades vegetales:
e.g., mayor diversidad fngica ha resultado en una mayor diversidad de plantas (Berbara et
al., 2006).
- Mayor eficiencia del ciclaje de nutrientes mviles, reduciendo procesos de lixiviacin: por
ejemplo, la red de hifas captura parte del N no absorbido por las plantas.
- Drenaje de carbono atmosfrico a partir de su asimilacin por parte del hongo y su
acumulacin en estructuras estables, como la quitina de sus paredes.
- Posible transferencia de N entre plantas a travs de la red de hifas de EM de clima
templado y de MA, la cual se comprob entre individuos de distinta familia (Berbara et al.,
2006).

Los beneficios enunciados no se observan en todas las asociaciones micorrcicas, sino que su
ocurrencia depender del genotipo vegetal y fngico, de su interaccin y de las caractersticas
ambientales imperantes.
159


EL FSFORO: IMPORTANCIA BIOLGICA, CICLO E INTERACCIN CON
MICORRIZAS
El siguiente anlisis es principalmente para las MA y en alguna medida para las ECM,
ya que las asociaciones fngicas con orqudeas y ericceas actan de un modo bastante diferente
al de las dems micorrizas. Por otra parte, dado que la contribucin principal del hongo en la
asociacin micorrcica es la absorcin y translocacin de nutrientes, con particular relevancia
en el caso del P, a continuacin se analiza el rol de este elemento en la fisiologa de la planta y
desde la perspectiva del rol de la simbiosis micorrcica.

Importancia del fsforo en la planta
Junto con el nitrgeno y el potasio, el P constituye uno de los principales
macronutrientes para las plantas. Forma parte de los cidos nucleicos, fosfolpidos y vitaminas,
y es indispensable en procesos de transporte, almacenamiento y transformacin de energa.
Adems, acta en los caminos metablicos de la fotosntesis, respiracin y divisin y
elongacin celular. Tambin estimula la formacin temprana y el crecimiento de las races,
interviene en la formacin de los rganos de reproduccin de las plantas, es vital para la
formacin de semillas y acelera la maduracin de los frutos en los cuales generalmente se
almacena en altas concentraciones. Deficiencias severas de P provocan una atrofia en la planta.
Se pueden producir reas necrticas en las hojas, frutos y tallos. Los sntomas generales que se
observan en una deficiencia de P son: ralentizacin de la germinacin y el crecimiento,
reduccin drstica del crecimiento areo y radicular, tallos ms cortos y delgados, y prdida del
color verde del follaje, que luego puede secarse y finalmente morir.

Absorcin de P y rol de las micorrizas
El fsforo es absorbido casi enteramente en forma inorgnica, como fosfatos solubles,
pero muchas veces se encuentra en el suelo en forma no disponible. Entonces, el P que se
encuentra en formas insolubles o constituyendo la materia orgnica debe necesariamente
solubilizarse, tarea en la cual participa activamente la microbiota del suelo. Cuando el proceso
se realiza sobre el P mineral es llamado solubilizacin y si el sustrato fosforado es orgnico, la
liberacin de P se conoce como mineralizacin. En el primer proceso actan cidos minerales y
orgnicos, productos del metabolismo microbiano y tambin de origen vegetal; y en el segundo
la actividad de las enzimas fosfatasas juega un rol principal. La figura 3 describe el ciclo del P y
el rol de la microflora del suelo. Sin embargo, a pesar de que existen mecanismos para liberar el
P a formas asimilables, existe el inconveniente de que es un nutriente que rpidamente vuelve a
insolubilizarse. Aqu es donde juegan un papel muy importante las micorrizas, debido a que sus
redes de hifas actan como grandes bombas que retiran los fosfatos del pool soluble a una
velocidad 1000 veces superior a la de la raz. A su vez, este proceso obliga a una mayor
solubilizacin de la fraccin lbil para restablecerse el equilibrio.
Una vez absorbido por las hifas, el P es acumulado como grnulos de polifosfato en las
vacuolas de los arbsculos. Estos grnulos son luego transportados por la corriente
citoplasmtica hasta los extremos ms finos de las hifas, donde las fosfatasas alcalinas los
convierten a formas inicas. Finalmente, el P pasa al hospedante en forma de fosfatos

a travs
de los plasmalemas de ambos simbiontes, lo que se pudo comprobar por el aumento de la
actividad ATPasa en el plasmalema de la clula hospedante que envuelve las ramas del
arbsculo. Tambin a travs del arbsculo es que el hospedante provee al hongo de fotosintatos
160

en forma de azcares solubles para que ste los almacene como lpidos. Por esa razn, en
vesculas y micelio se puede observar la formacin de glbulos lipdicos. Sostener esta
simbiosis representa para la planta un costo energtico de alrededor del 10-12% ms de carbono
que una planta no micorrizada, de todos modos, el hongo lo compensa mejorando el estado
hdrico del hospedante e incrementando su tasa de fotosntesis. Esto se logra a travs de una
mayor fijacin de CO2, niveles de clorofila, grosor de las hojas y apertura de estomas,
favoreciendo as la entrada de CO2. Este balance energtico es fundamental para que los
organismos asociados obtengan un beneficio real durante la interaccin.

Figura 3. Ciclo del fsforo (P) y rol de la microflora del suelo.

CAPTULO 10

TRANSFORMACIONES MICROBIANAS DEL HIERRO Y EL AZUFRE
Transformaciones microbianas del azufre. Ciclo biolgico del S. Mineralizacin.
Inmovilizacin. Oxidacin del S mineral. Reduccin del S orgnico. Transformaciones
microbianas del hierro. Procesos de reduccin-oxidacin. Transformaciones directas del hierro
de la forma orgnica a la forma inorgnica y viceversa. Procesos de reduccin, solubilizacin y
precipitacin del Fe mediados por microorganismos en algunos tipos de suelo.
161

Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los
Microorganismos, 8
a
edicin. Prentice Hall.
Captulo 13 (13.11)
Captulo 14 (14.15)
TRANFORMACIONES MICROBIANAS DEL AZUFRE
El azufre es un elemento que se encuentra en la naturaleza, en rocas gneas y
sedimentarias bajo la forma de pirita (FeS2), yeso (CaSO4.2H2O), azufre (S) y formando parte
del humus del suelo y del mar. Es un constituyente de todos los organismos encontrndose en
molculas de pptidos, protenas, vitaminas, enzimas y cidos lpidicos. En los suelos, la mayor
parte del azufre se halla localizada en la fraccin orgnica proveniente de los restos de animales
y vegetales, pudiendo llegar a constituir cerca del 80% del azufre total. La intensificacin de la
agricultura en los ltimos aos, provoc una disminucin en los porcentajes de materia orgnica
y una baja reposicin de los nutrientes, lo cual ha generado deficiencia de azufre en algunos
suelos de nuestro pas. Como consecuencia de esto, se han determinado respuestas a la
aplicacin de S en trigo en el centro-norte de la Regin Pampeana (Martnez et al., 2001;
Salvagiotti et al., 2004), en donde la actividad agrcola se desarrolla hace ms de un siglo sin el
aporte de fertilizantes azufrados.
El azufre es un elemento reactivo, que se encuentra en distintos estados de oxidacin en
el suelo: desde +6 en S04
2-
y sus derivados hasta -2 en H2S y sus derivados, como se observa en
la Tabla 1.

Forma Frmula Estado/s de oxidacin
Sulfato SO4
2-
6
Sulfito SO3
2 -
4
Tiosulfato S2O3
2
-1 y +5
Tetrationato S4O6
2-
-2 y +6
Elemental S8 0
Polisulfuro Sn
2-
-2 y 0
Sulfuro S
2-
-2



En condiciones de reduccin, el azufre se presenta en las formas de FeS, FeS2 (piritas) y
H2S. En la pedognesis y formacin del suelo, la pirita se oxida hasta SO4
2-
, y en esta forma de
in soluble es asimilado por las plantas y los microorganismos e incorporado a sus biomasas,
siguiendo el proceso de inmovilizacin.
Tabla 1. Estado de oxidacin de formas microbiolgicamente
importantes de azufre en los suelos.
162

Las plantas absorben el azufre principalmente como sulfatos aunque se han citado casos
de crecimiento de plantas con aminocidos azufrados como la metionina, y existen en la
actualidad evidencias que demuestran que los vegetales pueden usar SO2 atmosfrico. El
contenido de S vara desde 0.002 % hasta 5% en suelos calcreos y salinos de zonas ridas y
semiridas. En suelos agrcolas de zonas hmedas y semihmedas, el porcentaje normal es de
0,01 a 0,05 % de S, pero muchas veces no est en forma aprovechable porque se encuentra
formando parte de la materia orgnica. Otra fuente de provisin de S al suelo es por medio de
las lluvias que arrastran el SO2 de la atmsfera que es un producto de las emanaciones
industriales. El SO2 al combinarse con el agua forma cido sulfuroso (H2SO3) que se oxida
rpidamente a sulfrico (H2SO4), responsable de la lluvia cida.
Tambin algunos fertilizantes y pesticidas pueden tener S en su formulacin, como el
caso de los superfosfatos, donde este elemento se encuentra bajo forma de CaSO4. Las prdidas
de S en los suelos presentan los ritmos de prdida de la materia orgnica. La magnitud de las
prdidas dependen de las lluvias, la capacidad de retencin del suelo, las caractersticas del
drenaje, la inmovilizacin por los microorganismos durante la descomposicin de los restos
vegetales. Debido a la lixiviacin, los sulfatos raramente se acumulan en zonas hmedas y
semihmedas. Adems puede perderse S como H2S y otros compuestos gaseosos producidos
por la actividad microbiana, prdidas que pueden llegar a ser importantes en suelos anegados.
El S orgnico se encuentra formando molculas de glutation, cistena, metionina,
coenzima A, biotina y tiamina. En algunos compuestos, el S est unido directamente al C. En
otras molculas el S est unido a los esqueletos carbonados por medio de puentes de -O-
(steres sulfato) o puentes de -N-. Los puentes disulfuros (-S-S-) sirven de unin entre pptidos
en las molculas proteicas, el grupo sulfidrilo (-SH) proporciona sitios para los cationes
metlicos y para la unin de los grupos prostticos a las enzimas.
Ciclo biolgico del S
Si bien este ciclo es muy complejo, se podra simplificar en las siguientes reacciones
(Figura 1):
A) MINERALIZACIN o descomposicin de complejas molculas orgnicas que
contienen azufre a molculas inorgnicas ms simples.
B) INMOVILIZACIN o asimilacin de estos compuestos en clulas microbianas por
procesos de reduccin asimilatoria de SO4
2-
a S orgnico.
C) OXIDACIN de compuestos inorgnicos del azufre como tiosulfatos, sulfuros, sulfitos
y azufre elemental.
D) REDUCCIN de las formas inorgnicas por reduccin desasimilatoria de SO4
2-
.
A) MINERALIZACIN
Los compuestos orgnicos en el suelo pueden ser sustratos adecuados para una gran
variedad de microorganismos hetertrofos y presentan procesos similares a la amonificacin.
En condiciones anaerbicas los productos resultantes de la mineralizacin son sulfatos, sulfuros
y compuestos voltiles como metil mercaptanos, mientras que en condiciones aerbicas los
sulfatos representan el metabolito final ms importante y abundante.
Este proceso de liberacin es realizado por la microflora hetertrofa del suelo,
constituida por una gran diversidad de microorganismos. Los estudios se han concentrado
fundamentalmente en los microorganismos que mineralizan los aminocidos cistina, cistena y
163

metionina. Entre estos microorganismos encontramos a Aspergillus niger, Pseudomonas sp. y
especies de Microsporium, entre otros.


Figura 1. Ciclo del Azufre.

Factores ecolgicos que influyen en la mineralizacin de S orgnico.
Humedad: La mayor produccin de SO4
2-
a partir de S orgnico se produce cuando la tasa de
humedad est prxima a la capacidad de campo. En suelos anegados, adems de la formacin de
sulfuros, el S orgnico da origen a mercaptanos, que son muy txicos para los vegetales,
especialmente el arroz.
Temperatura: La mineralizacin se detiene por debajo de 10C pero se incrementa con el
aumento de la temperatura de 20 a 40C y decrece despus.
Relacin C/S: Los valores de esta relacin variarn con la naturaleza de la sustancia carbonada.
Cuando en los residuos el cociente se encuentra por debajo de 200 habr una ganancia neta de
SO4
2-
inorgnico y si es mayor de 400 habr una prdida neta.
Efecto de la vegetacin: Las plantas ejercen una accin positiva sobre la mineralizacin de S
orgnico a travs de su efecto rizosfrico, al excretar sustancias carbonadas que contribuyen a la
proliferacin microbiana o enzimas que catalizan la descomposicin de MO. Por otra parte,
pueden actuar inhibiendo la mineralizacin, como el caso de algunas plantas perennes que
producen sustancias txicas para la microflora.
B) INMOVILIZACIN
Los sulfatos producidos en la descomposicin son absorbidos por los vegetales e
inmovilizados en protenas microbianas. Este ltimo proceso, que se manifiesta con mayor
intensidad en otoo e invierno, impide las prdidas por lixiviacin. Durante la degradacin de la
MO, la microflora del suelo puede consumir parte del azufre mineral o el azufre que forma parte
de protenas y aminocidos, provocando la desaparicin transitoria de este elemento en sus
formas asimilables por las plantas. Esto no suele presentarse en condiciones de campo de forma
164

tan crtica como para el nitrgeno, puesto que la relacin C/S necesaria para que se presente
inmovilizacin debe ser 200.
Los hongos retienen el S como steres de este elemento. En forma de S
o
se encuentra en
los esporocarpos de ectomicorrizas y en algunos grupos de bacterias que utilizan H2S como
agente reductor en la fotosntesis anoxignica.
C) OXIDACIN de S mineral
Este proceso puede realizarse por va qumica o biolgica, pero cuando las condiciones
ecolgicas son favorables, la segunda va es ms eficaz. Los microorganismos que intervienen
pueden clasificarse en cuatro grupos:
1) Bacterias quimiolitotrofas, familia Thiobacillaceae.
2) Microorganismos hetertrofos, familias Bacillaceae y Achromobacteraceae entre otras.
3) Bacterias quimiolitotrofas, familia Beggiatoaceae
4) Bacterias fotolitotrofas, familias Chlorobacteriaceae y Thiorodaceae.

Los dos primeros grupos son representantes del suelo y los dos ltimos de ambientes acuticos.
1) Las bacterias de la familia Thiobacillaceaese conocen comnmente como tiobacilos. Son
pequeos bastoncitos no esporulados que oxidan H2S, S, tiosulfatos y politionatos. La
especie tpica es Thiobacillus thiooxidans que desarrolla a pH 2-5 y es estrictamente
aerobia.
Otras especies: Th. denitrificans crece a pH entre 5-8. Puede sustituir al O2 por NO3
-
como
aceptor de electrones, Th. ferrooxidans: desarrolla a pH entre 1-1,5, tambin oxida Fe.
2) Microorganismos hetertrofos: Existen bacterias aerobias (Bacillus, Achromobacter,
Pseudomonas, Microccocus), actinomicetes, hongos y levaduras que oxidan S inorgnico.
Si bien esta accin es ms lenta que la de los tiobacilos, pueden ser los primeros oxidadores
en suelos neutros y alcalinos hasta que el pH baje lo suficiente para que acten los
tiobacilos.
3) Beggiatoaceas: Son bacterias aerobias quimiolitotrofas cuyo hbitat son las aguas
sulfurosas de temperatura elevada o de ciertos suelos hidromorfos. La especie tipo es
Beggiatoa, que obtiene la energa para vivir de la oxidacin de H2S con formacin de S que
se acumula en el interior de las clulas. Cuando en el medio falta S, estas bacterias oxidan
el stock intracelular de S
0
hasta H2SO4.
4) Bacterias fotosintticas sulfurosas: Estas bacterias son anaerbicas que obtienen su
energa de la luz y utilizan como fuente de electrones al H2S. Estas condiciones las
encuentran en barros y aguas estancadas ricas en MO conteniendo H2S y expuestas a la luz.
Tambin en lagos donde se presentan como una capa coloreada sobre los depsitos de sal.
Consecuencias agronmicas de la oxidacin de S mineral
En general, la oxidacin del S en el suelo no modifica sensiblemente el pH pues los
sulfatos formados son asimilados por las plantas. Cuando los aportes de S elemental son
importantes en suelos bsicos, pueden generar los siguientes resultados:
1) Estimulacin de la actividad de Thiobacillus con produccin de H2SO4 que neutraliza la
alcalinidad del suelo y mejora su estructura por floculacin de coloides.
2) El H2SO4 solubiliza fosfatos triclcicos y los transforman en fosfatos diclcicos y
monoclcicos asimilables por los vegetales.
165

3) La acidificacin promovida por la sulfooxidacin solubiliza otros elementos importantes
como el Mn, que pasa de tetravalente insoluble a divalente soluble y aprovechable por las
plantas.
En otros casos el aporte de S es muy perjudicial. Por ejemplo, el tratamiento de
enfermedades causadas por hongos y oomycetes, como el mildiu y los oidios, ha llevado a la
ruina a muchos viateros por el exceso de acidez.
D) REDUCCIN DE S INORGNICO:
La reduccin desasimilatoria de SO4
2-
es realizada por un grupo de bacterias llamadas
sulfatoreductoras. Son microorganismos hetertrofos, anaerobios estrictos que utilizan los SO4
-2
,
y otras formas de S inorgnicos como aceptores de electrones para llevar a cabo la respiracin.
La energa la obtienen de sustratos orgnicos y en ciertos casos pueden utilizar el H2 como
fuente de energa y electrones. Los representantes ms conocidos son las bacterias Desulfovibrio
y Desulfotomaculum. Las primeras son unos bastoncitos en forma de vibrin no esporulados
con una cilia polar, mesfilos. El segundo gnero est representado por bastones rectos o
curvos, esporulados, con cilias peritrcas, termotolerantes o termfilas estrictas.
El hbitat de estas bacterias son los suelos anegados ricos en MO por la vegetacin
halfila o presencia de algas, as como tambin lagos salados y sedimentos marinos.
Factores ecolgicos que facilitan la sulfatoreduccin
a) Presencia de SO4
2-

b) Anaerobiosis estricta
c) Cantidad suficiente de sustancias donadoras de electrones.
Estas condiciones ecolgicas se parecen a las que favorecen a la desnitrificacin, pero
existen dos diferencias, el pH y la anaerobiosis. Los sulfatoreductores se desarrollan a un pH
muy inferior a los desnitrificadores y necesitan anaerobiosis estricta, en cambio estos ltimos
son anaerobios facultativos.
Consecuencias agronmicas de la sulfatoreduccin
Este proceso puede alcalinizar el suelo porque los sulfuros hidrolizables que se forman
pueden dar origen a bases
Na2S + 2 H2O -> H2S + 2 NaOH
CaS + 2 H2O -> H2S + Ca(OH)2
El CO2 producto de la actividad microbiana o vegetal puede reaccionar con el NaOH o
Ca(OH)2 provenientes de la reduccin del S y formar carbonatos y bicarbonatos.
NaOH + H2CO3 ---> NaHCO3 + H2O
Ca (OH)2 + 2 H2CO3 -> Ca(HCO3)2 + 2H2O
Por otra parte, el H2S es muy txico para las races de las plantas, en arroz producen la
podredumbre o evitan la absorcin de elementos nutritivos. Generalmente esto puede suceder en
suelos irrigados ricos en sulfatos, pero si hay Fe activo en la rizosfera se forma FeS que no es
daino.
Corrosin anaerobia de metales en el suelo
La corrosin de metales especialmente de hierro y acero es frecuente en suelos
arcillosos, neutros y mal aireados as como tambin en las aguas poludas. La corrosin no se
produce en ambientes cidos. Las bacterias que intervienen son las del gnero Desulfovibrio.
166


TRANSFORMACIONES MICROBIANAS DEL HIERRO

Introduccin
Prcticamente todos los organismos, con excepcin de un pequeo grupo de bacterias
fermentadoras homolcticas, necesitan hierro en pequeas cantidades (ver Captulo 3). Este
micronutriente es utilizado como cofactor para muchas enzimas metablicas y protenas
reguladoras debido a su capacidad de existir en dos estados de oxidacin estable, hierro ferroso
(Fe
2+
) e hierro frrico (Fe
3+
). Sin embargo, el hierro no solo tiene una funcin nutritiva, el Fe
2+

puede funcionar como fuente de electrones para microorganismos que oxidan hierro bajo
condiciones oxignicas y anoxignicas, mientras que el Fe
3+
puede funcionar como un aceptor
terminal de electrones bajo condiciones anoxignicas para los microorganismos reductores del
hierro. En este captulo abarcaremos todas las transformaciones microbianas de este elemento.
Aunque el hierro es uno de los elementos ms abundantes en la corteza terrestre, solamente una
pequea porcin de este elemento se encuentra en forma soluble (Fe
2+
o Fe-quelado), y por
tanto, asimilable para las plantas y microorganismos. En condiciones alcalinas o neutras y en
presencia de oxgeno, el hierro ferroso es inestable y se oxida espontneamente a hierro frrico.
Los microorganismos influyen en la solubilizacin del Fe, ya que cambian el estado de
oxidacin de este elemento traza a travs de su metabolismo energtico, sintetizan y secretan
siderforos, y cambian el potencial redox y el pH del suelo. En consecuencia, la disponibilidad
para las plantas de este metal es altamente dependiente de la actividad de los microorganismos.

Transformaciones microbianas
Oxidacin y Reduccin.
Las reacciones de oxido-reduccin biolgicas estn asociadas a la produccin de energa por los
microorganismos. Los compuestos inorgnicos reducidos (Fe
2+
) son oxidados por
microorganismos quimioauttrofos para generar electrones usados en la produccin de ATP,
mientras que compuestos oxidados (Fe
3+
) son reducidos durante la produccin de energa bajo
condiciones anaerbicas cuando el elemento en cuestin acta como un aceptor de electrones
terminal alternativo (ver Captulo 3).
Oxidacin del Fe.
Los microorganismos estn involucrados en la oxidacin de hierro, pero no todas las
oxidaciones del hierro son mediadas por microorganismos. El ion ferroso Fe
2+
es rpidamente
oxidado al estado frrico Fe
3+
en condiciones aerbicas a pH>5. Por eso, es difcil probar la
oxidacin microbiolgica en medios neutros o alcalinos. Esto explica por qu la mayora de las
bacterias oxidantes de hierro son acidfilas estrictas. Estos microorganismos extraen la energa
necesaria para el crecimiento segn la siguiente ecuacin:
Fe
2+
+ H
+
+ O2 Fe
3+
+ H2O

Los electrones generados en esta reaccin son usados en la produccin de ATP. Esta oxidacin
solo produce una pequea cantidad de energa disponible y por esta razn las bacterias del
hierro deben oxidar grandes cantidades de hierro para crecer. Por lo tanto, una poblacin
pequea de estas bacterias puede causar la precipitacin de gran cantidad de hierro.
167

La bacteria oxidante de hierro ms conocida es Acidithiobacillus ferrooxidans (antiguamente
conocido como Thiobacillus ferrooxidans) que puede crecer autotrficamente usando hierro
ferroso y compuestos reducidos de azufre como donadores de electrones. Esta bacteria vive en
ambientes donde el cido predominante es el sulfrico y donde, adems, hay mucho sulfato. En
estas condiciones, el hierro frrico no precipita como hidrxido, sino formando parte de un
compuesto mineral llamado jarosita [Fe3H (SO4)2 (OH)6]. La jarosita es un precipitado
amarillento o marrn, que le da el color amarillo tpico al drenaje cido de las minas.
Otros acidfilos oxidantes del hierro incluyen Leptospirillum ferroxidans, Sulfolobus spp. y
Acidianus spp. Estos organismos son comunes en ambientes contaminados con cidos como
vertederos de minas de carbn, mientras que la arquea Sulfolobus vive en aguas termales cidas
a temperaturas cercanas al punto de ebullicin del agua.
Los microorganismos tambin pueden oxidar el hierro en forma indirecta actuando sobre el
medio. Por ejemplo, las algas, con su fotosntesis oxignica, enriquecen el medio creando las
condiciones para que se produzcan oxidaciones de naturaleza qumica. Por la accin microbiana
se forman cidos, H2CO3, HNO3, H2SO4 o cidos orgnicos que facilitan los procesos
oxidativos.
Por otra parte, a pH neutro, en medios anxicos a los que llega la luz, las bacterias fototrpicas
anoxignicas pueden oxidar Fe
2+
a Fe
3+
, en un proceso que ya se ha estudiado en el captulo 3.
La fuente principal de electrones para los fottrofos anoxignicos, a diferencia de los fottrofos
oxignicos, no es el agua sino alguna sustancia del medio. Unas pocas bacterias rojas pueden
usar el hierro ferroso como donador de electrones produciendo hierro frrico.
Reduccin del Fe.
Algunos microorganismos utilizan el Fe
3+
como aceptor terminal de electrones para generar
energa durante la respiracin anaerbica. La reduccin bacteriana del hierro frrico a ferroso es
el principal medio de solubilizacin de este elemento en la naturaleza, teniendo un rol
importante en la mineralizacin de la materia orgnica en ambientes con bajas concentraciones
de O2 (como ser suelos saturados con agua o en el interior de los agregados), donde adems el
sulfato y nitrato estn en cantidad insuficiente para realizar la oxidacin de estos elementos. El
Fe
3+
acta como un aceptor terminal de electrones alternativo (ver Captulo 3) en el
metabolismo energtico de algunos hongos y gran variedad de bacterias quimioorganotrofas y
quimiolitotrofas. Los electrones que viajan por cadenas transportadoras de electrones terminan
en un sistema de reductasa del hierro frrico. Ese flujo establece un gradiente de protones que
puede ser usado para generar ATP. Un amplio rango de arqueas y bacterias son capaces de
conservar energa a travs de la reduccin de Fe
3+
a Fe
2+
. Ejemplos: Geobacter, Desulfovibrio,
Pseudomonas y Acidithiobacillus.
El Fe
3+
tambin puede acompaar la fermentacin, en la cual las formas oxidadas del metal
sirven como aceptor de electrones suplementarios. Ambos procesos estn referidos como
reduccin desasimilatoria de hierro. Este trmino se utiliza para diferenciar este proceso de la
reduccin del hierro para su incorporacin dentro de los componentes celulares, la cual se
denomina reduccin de hierro asimilatoria. La reduccin del Fe en forma indirecta se origina
por la acumulacin de sustancias orgnicas reductoras sintetizadas por los microorganismos,
como el cido oxlico, aldehdos, etc.
Transformaciones directas del hierro de la forma orgnica (quelatado) a formas
inorgnicas y viceversa.
Aunque es uno de los elementos ms abundantes en el ambiente, el hierro suele ser un factor
limitante para el crecimiento bacteriano ya que, como se mencion anteriormente, en
condiciones aerbicas y a pH alcalino o neutro forma complejos de hidrxido de hierro
168

insolubles. Consecuentemente, las bacterias y hongos han desarrollado sistemas de transporte
especializados y de alta afinidad con la finalidad de adquirir la cantidad suficiente de este
elemento.
La mayora de las bacterias tienen la capacidad de producir y secretar unas molculas
denominadas siderforos para obtener el hierro que necesitan. Los siderforos son agentes
quelantes del hierro especiales que facilitan la solubilizacin y captacin de este metal. Son
molculas de bajo peso molecular (de 500 a 1500 Da), solubles en agua y que muestran una
gran afinidad por iones frricos. Muchas bacterias han desarrollado tambin la capacidad de
explotar el hierro que forma complejos con siderforos producidos por otras especies
bacterianas o fngicas.
La capacidad de utilizar siderforos se asocia a la presencia de sistemas de transporte que
puedan reconocer y mediar la absorcin de los complejos de siderforos frricos hacia el
interior de la clula. Existen diferentes estrategias para incorporar el Fe quelado. En el primer
mecanismo (Figura 2A), el hierro luego de ser transportado es clivado del siderforo por una
reductasa citoplasmtica que reduce el Fe
3+
a Fe
2+
, disocindolo del complejo. El siderforo sin
el hierro puede ser destruido (no se recicla) o puede ser secretado al ambiente (se recicla). En el
segundo mecanismo (Figura 2B) el complejo Fe-siderforo se une a un receptor en la superficie
celular donde el hierro es simultneamente clivado y transportado sin el pasaje concomitante del
siderforo. En el tercer mecanismo (Figura 2C) la remocin reductiva del hierro ocurre en un
sitio a cierta distancia de la protena transportadora teniendo la posibilidad de re-oxidarse y
precipitar en la superficie celular. Este es quizs el mecanismo menos eficiente ya que el Fe
2+
no
est directamente acoplado con el transporte del hierro.
La excrecin de siderforos es inducida por la falta de hierro. La expresin de los sistemas de
adquisicin de hierro se regula como respuesta a la concentracin intracelular de hierro,
aumentando cuando hay una limitacin de dicho elemento. Dado que la escasez de hierro reduce
el crecimiento bacteriano, mientras que concentraciones elevadas de dicho metal pueden ser
txicas, la concentracin intracelular de hierro es controlada cuidadosamente.
En los ltimos 20 aos, los siderforos se han investigado en relacin a la nutricin vegetal ya
que tambin sirven como fuente de hierro para las mismas, pero no todos los siderforos pueden
ser utilizados por las plantas y distintas especies y variedades de plantas tienen diferentes
habilidades para utilizar tipos especficos de siderforos.










Figura 2. Mecanismos generalizados del transporte Fe-siderforo en los microorganismos.
Adaptado de Crowley et al. (1991).
MEDIO EXTERNO o
PERIPLASMA
CITOPLASMA
MEMBRANA
PLASMTICA
2A 2B
2C
Con reciclado Sin reciclado
MEDIO EXTERNO o
PERIPLASMA
CITOPLASMA
MEMBRANA
PLASMTICA
2A 2B
2C
Con reciclado Sin reciclado
169


RELEVANCIA AMBIENTAL DE LAS TRANSFORMACIONES MICROBIANAS DEL
HIERRO.

Oxidacin de la pirita.
Una de las formas ms comunes de hierro y azufre en la naturaleza es la pirita (FeS2), que
proviene de la reaccin entre el azufre y el sulfuro ferroso (FeS). La pirita forma una estructura
cristalina muy insoluble, muy frecuente en carbones bituminosos y otros depsitos minerales.
Su oxidacin por parte de las bacterias Su oxidacin por parte de las bacterias tiene mucha
importancia para el desarrollo de las condiciones de acidez en las minas y drenajes mineros. En
este proceso los aceptores de electrones pueden ser el oxgeno y el in frrico, el cual solamente
est presente cuando el pH es menor a 2,5. A mayores valores de pH el hierro frrico precipita
como hidrxido.
La primera vez que la pirita entra en contacto con el aire, como ocurre en excavaciones mineras,
se produce una reaccin qumica con el oxgeno:
FeS2 + 3 O2 + H2O Fe
2+
+ 2 SO4
2-
+ 2 H
+

Esta reaccin lleva al desarrollo de condiciones cidas bajo las cuales el hierro ferroso que se
forma es bastante estable en presencia de oxgeno. Sin embargo, A. ferrooxidans oxida el hierro
ferroso a frrico y ste ltimo puede reaccionar con ms pirita para oxidarla, producindose ms
iones ferrosos y sulfato:

Fe
2+
+ H
+
+ 1/4O2 Fe
3+
+ H2O

FeS2 + 14 Fe
3+
+ 8 H2O 15 Fe
2+
+ 2SO4
2-
+ 16 H
+


El aumento en la tasa de oxidacin de la pirita hace que algunos iones ferrosos se escapen y
sean transportados por las aguas subterrneas hasta cursos de agua cercanos. Al salir a drenajes
aireados, las bacterias oxidan el in ferroso y se forma un precipitado de hierro frrico,
responsable del color anaranjado de las aguas.
Esta oxidacin bacteriana de los minerales de azufre es el factor principal que determina el
drenaje cido de las minas, un problema ambiental que es muy frecuente en zonas donde hay
minas de carbn. Debido a que no todo mineral de carbn posee sulfuro de hierro, el drenaje
cido no se produce en todas las cuencas mineras de carbn. La mezcla de las aguas cidas de
las minas con las aguas naturales de ros y lagos causa una degradacin importante en la calidad
del agua natural, ya que la acidez y el contenido de metales disueltos resultan txicos para la
vida acutica. Estas aguas tampoco son aptas para el consumo humano, ni la actividad
industrial. La oxidacin de la pirita tambin puede ocurrir qumicamente, pero el paso que
determina la tasa de oxidacin de esta reaccin es la oxidacin del in ferroso a frrico, la cual
ocurre a pH bajo si la bacteria est presente. El cido que se forma ataca a otros minerales de la
roca, por ejemplo al aluminio que es soluble a pH bajo. El Al
3+
a concentraciones de unos pocos
gramos por litro de agua es txico para los organismos acuticos.

170

Lixiviacin microbiana de metales
Consideraremos aqu una situacin en la cual la acidez y la solubilidad del metal que producen
las bacterias acidfilas desempean una funcin beneficiosa para la minera. El sulfuro, al
combinarse con muchos metales, forma minerales muy insolubles, y muchas menas (minerales
de los cuales se puede extraer un elemento) de donde se extraen dichos metales son sulfuros. Si
la concentracin del metal en la mena es baja, es posible que no sea econmicamente rentable
concentrar el mineral por medios qumicos convencionales. En esas condiciones se suele
aprovechar la lixiviacin microbiana (concentracin de metales valiosos de un mineral por
accin microbiana) que, a su vez, daan menos el medioambiente ya que no tiene los altos
requerimientos energticos de la fundicin y no produce emisiones gaseosas nocivas.
Bacterias como A. ferrooxidans pueden actuar como catalizadores y acelerar la tasa de
oxidacin de minerales que contienen sulfuros, ayudando a solubilizar el metal. Esta reaccin es
til, sobre todo, para la recuperacin de cobre, ya que el sulfuro de cobre que se obtiene es muy
soluble en agua. La mayora de los sulfuros metlicos se oxidan espontneamente, pero en
presencia de esta bacteria la velocidad es mucho mayor. En el proceso de lixiviacin microbiana
la mena de baja ley (baja concentracin del elemento) se amontona en una pila de lixiviacin, a
travs de la cual se hace pasar una solucin de cido sulfrico diluido (pH 2). Se recoge el
lquido que sale del fondo de la pila, rico en mineral y se transporta a una planta donde se
precipita y purifica. El lquido sobrante, al cual se agrega cido para mantener el pH bajo, se
vuelve a verter sobre la pila y el ciclo se repite.
Otro mecanismo, tal vez el ms importante en minera, se produce por oxidacin indirecta de la
mena de cobre, con iones frricos formados a partir de la oxidacin de iones ferrosos. La pirita
est presente en casi todas las menas y su oxidacin determina la formacin de hierro frrico.
ste resulta un buen oxidante de los minerales que tienen sulfuros y la reaccin del CuS con el
frrico determina la solubilizacin del cobre y la formacin de hierro ferroso. Con O2 y a pH
cido A. ferrooxidans vuelve a oxidar al hierro ferroso a frrico, el cual puede oxidar ms
sulfuro de cobre. Otro aspecto interesante del metabolismo de esta bacteria es que a pesar de
que la mayora de las reacciones discutidas arriba requieren oxgeno molecular, las reacciones
de oxidacin pueden realizarse de forma anaerbica debido a que A. ferrooxidans puede utilizar
el hierro frrico como aceptor terminal de electrones en ausencia de oxgeno.

171

CAPTULO 11
NICHOS ECOLGICOS ESPECIALES DE UTILIDAD AGRCOLA.
Nichos ecolgicos especiales de utilidad agrcola. La fermentacin lctica como mtodo de
conservacin de forrajes en el ensilado. Biologa y microorganismos del compost.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los Microorganismos, 8
a

edicin. Prentice Hall.
Captulo 14 (14.13)
LA FERMENTACION LCTICA COMO MTODO DE CONSERVACIN DE
FORRAJES: ENSILADO
1. Definicin
El ensilado es un sistema de conservacin biolgica basado en la fermentacin lctica.
Debido a este fenmeno el forraje sufre transformaciones fsicas, qumicas y biolgicas que
imposibilitan cualquier otra actividad microbiana conservndose durante aos sin alteraciones.
Se debe considerar que el material ensilado no es de mejor calidad nutricional que el material
del cual se origina, debido a que se utiliza como una tcnica para conservar y no para mejorar el
material vegetativo empleado (Stefanie et al., 2001)
La conservacin de los forrajes, mediante la tcnica del ensilado, surge como una
opcin viable por su utilidad y facilidad de implementar por parte de los productores. Esta
alternativa asegura la disponibilidad del recurso forrajero durante todo el ao en sistemas de
produccin de rumiantes (Titterton & Bareeba, 2001).
Cultivos para ensilar
Una gran variedad de plantas pueden ser ensiladas fcilmente, no obstante es
conveniente sealar sus diferencias en cuanto a su disponibilidad en azcares (Tabla 1).





Longitud de corte
El picado del forraje debe ser fino para minimizar el espacio de aire entre las partculas
de forraje y permitir que las bacterias cido lcticas entren en contacto directo con los azcares
solubles, el largo del picado deber ser de aproximadamente 2 cm, dependiendo el cultivo
(Nicklas, 1997).
2. Proceso fsico-qumico y microbiolgico del ensilado
A partir de la cosecha y de la ubicacin del forraje en el sitio de ensilado se puede
dividir este proceso en cuatro fases principales: respiracin, fermentacin, estabilizacin y
deterioro aerbico.
Tabla 1. Diferencias de disponibilidad de azcares
de distintos forrajes (Frioni, 1999).

172

2.1. Respiracin
Inicialmente, cuando el forraje se comienza a colocar dentro del ensilado, se observa
una oxidacin (aerbica) de los constituyentes de la planta a travs de la accin conjunta de las
enzimas de los microorganismos presentes (mohos, levaduras, bacterias aerbicas y anaerobias
facultativas) y de las mismas plantas, lo cual lleva a un incremento de la temperatura y el
consiguiente calentamiento de la masa de forraje.
Durante esta fase, los carbohidratos hidrosolubles (CHS, azcares primarios de las
plantas) son convertidos a CO2, calor y agua por la clula vegetal y microorganismos aerbicos
especficos. Este proceso continuar hasta que se disminuya el oxgeno o los CHS se consuman
totalmente (Herrera et al., 2007).
Esa respiracin de los HCS significa una prdida de valor nutritivo y por lo tanto habr
que tratar de llevar al mnimo la duracin de esta fase, eliminando el oxgeno lo ms rpido
posible. Las condiciones de compactacin del forraje como las condiciones de cierre hermtico
del ensilado modifican la cantidad de oxgeno disponible y por lo tanto el perodo de
respiracin.
Las desventajas de una extensa fase aerbica son: 1) excesiva prdida de materia seca
que podra estar disponible para las bacterias productoras de cido lctico o para el ganado al
consumir el ensilado y 2) produccin de calor excesivo contribuyendo al incremento potencial
de la desnaturalizacin de las protenas del forraje por calor (Herrera et al., 2007)
2.2. Fermentacin
A medida que desaparece el oxgeno del medio, se desarrolla otro tipo de microflora
que produce cido actico en pequeas cantidades (Escherichia coli, Enterobacter aerogenes,
Klebsiella sp.). La accin de estas bacterias se manifiesta hasta que el pH desciende a 4,5.
El forraje sin cortar tiene un nmero bajo de bacterias lcticas localizadas en la zona de
magulladuras o partes muertas de las plantas. Tambin estn presentes endosporas de clostridios
(Clostridium spp.). Luego de la cosecha y si las condiciones son anaerbicas, el nmero de
bacterias lcticas (Lactobacillus plantarum, L. casei, L. brevis, L. bulgaricus, Streptococcus
lactis, Pediococcus cerevisiae y Leuconostoc mesenteroides) proliferan rpidamente si las
condiciones de ensilado son anaerobias, produciendo exclusivamente cido lctico (bacterias
homofermentativas) o cido lctico junto con otros productos como cido actico y etanol
(bacterias heterofermentativas). Estos productos de fermentacin de azcares solubles reducen
el pH en el ensilado hasta un valor de aproximadamente 4 (3,8-4,2). Debido a ese descenso del
pH, cesa toda actividad biolgica y se obtiene un material estable y preservado en su calidad
(esto ocurre generalmente en la primer semana).
Las mejores condiciones para la preservacin del ensilado son aquellas que favorecen
una rpida fermentacin homolctica. En trminos generales es posible afirmar que esto ocurrir
cuando exista un adecuado suministro de azcares solubles para producir la fermentacin cido-
lctica y se logre una rpida cada del pH de manera de evitar la accin de bacterias del gnero
Clostridium. Bajas presiones osmticas debido a excesiva humedad en el forraje, alto contenido
de protenas y valores de pH superiores a 5,4 favorecen la proliferacin de los clostridios
afectando negativamente el proceso de ensilado. Los clostridios metabolizan los azcares y el
cido lctico para producir butirato y una serie de productos menores (acetato, propionato,
etanol, etc.). Tambin degradan protenas y aminocidos produciendo acetato, butirato,
cadaverina, putrescina, amonaco, etc. Dado que el cido butrico es ms dbil que el cido
lctico, y que muchos de los productos nitrogenados que derivan de la degradacin de
aminocidos son bases, la actividad de los clostridios en un ensilado revierte o hace ms lenta la
reduccin de pH que se necesita para la estabilizacin del ensilado. En estas condiciones el
173

perodo de fermentacin se prolonga a expensas de los nutrientes del forraje, resultando un
ensilado de bajo valor nutritivo y, adems, de pobre aceptacin por parte de los animales,
debido al olor fuerte y desagradable del cido butrico.
Los clostridios, adems de causar prdidas del valor nutritivo del forraje, pueden
contaminar la leche con sus esporas (cuando se suministra forraje ensilado en la sala de ordee)
provocando problemas durante la maduracin de quesos, sobre todo los de pasta dura. A esto
debe sumarse el riesgo para la salud de los animales cuando C. botulinum, agente del botulismo,
est presente en el material ensilado. Esto puede deberse a la incorporacin de tierra cuando se
levanta el material vegetal para el ensilado.
2.3. Estabilizacin
Como ya se indic, de producirse adecuadamente la fermentacin lctica el pH del
ensilado desciende hasta 3,5-4,0. En estas condiciones cesa la actividad de las bacterias lcticas
y por tanto la produccin de cido lctico. El ensilado se estabiliza al detenerse toda actividad
biolgica en la masa de forraje. Si se evita la entrada de aire o agua, el forraje ensilado se
mantiene por aos sin que se altere su calidad.
En la Figura 1 se observa la evolucin de la temperatura, pH y concentracin de cido
actico y lctico durante los primeros das de ensilado.
3. Requisitos para la fermentacin lctica
Para que se lleve a cabo la fermentacin lctica se deben cumplir una serie de
requisitos:
- Presencia de bacterias lcticas.
- Cantidad suficiente de HCS, necesarios para el desarrollo de las bacterias lcticas.
- Condiciones de anaerobiosis para evitar el desarrollo de microorganismos aerobios
indeseables.
- Humedad y temperatura adecuadas.
Estos factores sern analizados a continuacin con cierto grado de detalle.
Con respecto a las bacterias lcticas, ya se ha indicado que se encuentran sobre la superficie de las
hojas de las plantas a ensilar, por lo cual solo hay que crear las condiciones favorables para la
proliferacin de las mismas.

Tabla 2. Especies de bacterias lcticas comnmente encontradas en forraje
verde y en ensilados

Homofermentativas Heterofermentativas
Lactobacillus plantarum Lactobacillus brevis
Pediococcus acidolactici Lactobacillus buchneri
Streptococcus durans Lactobacillus fermentum
Enterococcus faecalis Lactobacillus viridescens
Enterococcus faecium Leuconostoc mesenteroides
Streptococcus lactis

174





En la Tabla 2 se indican las especies de bacterias homo y heterofermentativas ms
comunes que pueden encontrarse en el forraje tanto antes y como despus de ensilar.
En la Tabla 3 se puede observar que de un total de nueve establecimientos examinados,
en solo cinco se contaron bacterias lcticas sobre los cultivos en crecimiento al momento de la
cosecha y otros dos contenan nmeros muy bajos de microorganismos. El nmero de bacterias
lcticas estimadas sobre el forraje puede depender de la metodologa empleada tanto en el
muestreo como en el recuento y de sus posibilidades para detectar y cuantificar todos los tipos
de bacterias lcticas que existen. De todas maneras, es bastante sorprendente que en la mayora
de los ensilados las bacterias lcticas dominan la fermentacin alcanzando nmeros mximos
del orden de 10
9
UFC/ml en 2 4 das, seguidos por un perodo ms lento y de constante
declinacin de la actividad biolgica. En la Tabla 3 tambin resulta interesante observar como el
nmero de bacterias lcticas aumenta significativamente cuando la muestra se toma en el
momento de construccin del ensilado. Este incremento puede lograrse por el agregado de
aditivos al forraje que se va a ensilar, por ejemplo, el agregado de azcares solubles (melaza,
triturado de remolacha, etc.). El contenido ptimo de HCS est determinado principalmente por
la especie, el momento de corte y el tipo de cosecha. En esta tabla cada establecimiento puede
corresponder a una combinacin particular de todas estas variables.
Un contenido bajo de HCS en el forraje determina que el pH no baje lo suficiente como
para alcanzar el estado de estabilizacin. Normalmente se requieren un mnimo de 6 a 12% de
HCS para una apropiada fermentacin en el ensilado. El forraje de maz, cosechado en estado
de grano lechoso, contiene suficientes HCS como para asegurar un proceso completo de
ensilado. Por su parte las leguminosas (por ejemplo alfalfa) contienen baja cantidad de HCS, es
por ello que su ensilado resulta ms dificultoso (Herrera et al., 2007). En este ltimo caso cobra
relevancia el agregado de aditivos e inoculantes microbianos con bacterias lcticas.
Figura 1. Evolucin de la temperatura, pH, cido
lctico y actico en los primeros das del ensilado.

175

La anaerobiosis se logra por el correcto compactado del material y los factores que
inciden en la eficiencia de la eliminacin del aire son el tipo de picado, el estado de madurez del
forraje, el contenido de humedad y el tipo de ensilado.
El rango de temperaturas para el crecimiento de bacterias lcticas es de 5 a 45
o
C, con un
ptimo de 30
o
C. La mayora de las especies crecen a 15
o
C, pero no lo hacen a 45
o
C. Sin
embargo, hay excepciones como L. fermentum que puede crecer a 45
o
C pero no a 15
o
C. Las dos
especies de Enterococcus crecen en un rango de temperaturas entre 10 y 45
o
C. Por su parte,
diversas especies de Pediococcus tales como P. damnosus, P. pentosaceus y P. acidilactici
tienen ptimos de temperatura de crecimiento de 25, 30 y 40
o
C, respectivamente. Diversos
trabajos confirman que un nmero ms elevado de bacterias lcticas se obtiene en menor tiempo
en ensilados mantenidos a temperaturas de 30
o
C que en aquellos a temperaturas entre 15 y 20
o
C.
Tabla 3. Cantidad de bacterias lcticas presentes sobre el follaje de
cultivos para ensilado de varios establecimientos.


Establecimiento Cantidad de bacterias lcticas sobre el follaje
(UFC ml
-1
)
[1]
Del cultivo en crecimiento
previo a la cosecha
Previo al ingreso para la
construccin del ensilado
A 0 10
B 0 670
C 50 860
D 0 280
[2]
E 0 20.000
[2]
F 4 170
[2]
G 240 900.000
[2]
H 126 2600
[2]
I 5 5200
[3]
[1]
unidades formadoras de colonias por mililitro de material vegetal macerado en medio
agar acetato.
[2]
con agregado de azcar.
[3]
con agregado de forraje de remolacha triturado.
Adaptado de McDonald et al. (1991).

4. Caractersticas de un buen ensilado
Debe tener un valor de pH entre 3,5-4,0, un contenido de cido lctico entre 4,0-8,0 %,
de cido actico no mayor al 0,5-3,0% y el cido butrico debe estar ausente o presente en muy
pequeas cantidades. La cantidad de amonaco presente debe ser menor al 10-15% del nitrgeno
total. El color ser amarillo verdoso o marrn verdoso, y el olor agradable y avinagrado (cido
lctico). La textura del material ser firme, y las hojas no sern fcilmente separables del tallo.
5. Deterioro aerbico
Esta fase comienza con la apertura del silo y la exposicin del ensilado al aire. Esto es
inevitable cuando se requiere extraer y distribuir el ensilado, pero puede ocurrir por dao de la
cobertura del ensilado (ej. roedores o pjaros), antes de iniciarse la explotacin del mismo. El
perodo de deterioro puede dividirse en dos etapas. La primera se debe al inicio de la
176

degradacin de los cidos orgnicos que lo conservan, por accin de hongos y levaduras, y
ocasionalmente por bacterias que producen cido actico. Esto induce un aumento en el valor
del pH, lo cual permite el inicio de la segunda etapa de deterioro. En la segunda etapa se
produce un aumento de la temperatura y la actividad de otros microorganismos que tambin
deterioran el ensilado, como algunos bacilos. La ltima etapa tambin incluye la actividad de
otros microorganismos aerbicos (hongos) y facultativos (enterobacterias). El deterioro aerbico
ocurre en casi todos los ensilados al ser abiertos y expuestos al aire. Sin embargo, la tasa de
deterioro depende de la concentracin y la actividad de los organismos que causan este proceso
en el ensilado (Stefanie et al., 2001).
6. Rol del ensilado en el sistema de produccin
Debido a la oferta forrajera estacional discontinua, la cual se da en la mayor parte de los
sistemas de produccin, se produce un desfasaje entre los requerimientos de los animales y la
oferta de forraje cuando se trabaja con cargas medias a altas. Para mitigar el desequilibrio entre
la oferta de forraje y los requerimientos animales el productor cuenta con recursos tales como
verdeos de invierno, granos, henos, forrajes diferidos, ensilados, etc. Por lo tanto el ensilado
puede usarse no solo como seguro para condiciones climticas adversas, sino tambin como un
recurso ms de la cadena forrajera.

7. Ventajas del ensilado
- Permite balancear la composicin de la racin frente a pastoreos deficitarios.
- Permite mediante el encierre de la hacienda, esperar a que haya piso en una pradera con
exceso de humedad.
- Es el mtodo que mejor se adapta para la conservacin de cultivos enmalezados.
- Puede ser conservado durante ms tiempo que el heno.
- No tiene riesgos de incendio.
8. Desventajas del ensilado
- Tiene mayor costo que el heno.
- Se debe transportar ms material al ensilar que al henificar.
- Debe compactarse adecuadamente para permitir una fermentacin lctica.
- Su distribucin y racionamiento son ms complicados, salvo que se confeccionen silos
tipo bala.

BIOLOGA Y MICROORGANISMOS DEL COMPOST
Introduccin
La descomposicin de las plantas ocurre en cualquier lugar donde las plantas crezcan.
Cuando una planta muere es atacada por los invertebrados y microorganismos del suelo y se
convierte en minerales, CO2, agua y humus. Esta es la forma en que los nutrientes se reciclan en
el ecosistema. Esta descomposicin natural puede favorecerse creando condiciones ideales, en
esto consiste el procedimiento llamado compost (Figura 1).
El arte del compost ha sido parte de nuestra cultura desde la antigedad. En la
actualidad existen varias razones por las cuales sigue siendo una prctica de incalculable valor
porque a) permite convertir los restos de cosecha y la basura municipal en un recurso natural
177

til, b) soluciona parte de los problemas ambientales que surgen de otros manejos de la basura y
c) genera al mismo tiempo un mejorador del suelo barato y de alta calidad.
Los residuos orgnicos ocupan en el mundo un lugar prioritario ya que constituyen entre
el 30 y el 65% de los residuos domiciliarios y ms del 85% de los residuos considerados
agrcolas (Sztern y Pravia, 1999). Es por esta razn que la tendencia actual es la reduccin
sustancial del volumen de los residuos cuya fraccin orgnica ser la materia prima de los
procesos de compostaje.
Cmo se construye una pila de compost?
Para obtener un buen compost es necesario generar las condiciones ambientales
adecuadas para el desarrollo de microorganismos. El compost es el resultado de la accin
microbiana sobre los residuos orgnicos. Restos de cosecha y residuos urbanos orgnicos son un
sustrato apropiado para el desarrollo de las bacterias y hongos que participan en el proceso.
Algunos invertebrados tales como gusanos e insectos tambin contribuyen en la formacin del
compost favoreciendo la actividad microbiana.
Para construir una pila de compost es necesario tener en cuenta tres aspectos claves:
1. Una adecuada relacin C/N para sostener el crecimiento de la flora del compost. Esto se
logra seleccionando apropiadamente los materiales que forman la pila.
2. Una aireacin adecuada obtenida en general mezclando la pila.
3. El control de la humedad.
Estos tres elementos favorecen el aumento de la temperatura y aseguran una rpida
descomposicin de los residuos y la obtencin de un producto aprovechable para el suelo.



Materia orgnica
En trminos generales existen dos tipos de sustratos orgnicos que sirven de alimento o
sustrato para los microorganismos del compost:
Figura 1. Proceso de compostaje. Sustratos y productos principales.
178

a) ricos en carbono: mayormente material vegetal seco o muerto como paja, hojas secas,
astillas de madera o aserrn, menos usualmente papel, principalmente cartn. Estos
materiales funcionan como fuente de carbono y energa para los organismos. Como se
trata de material seco conviene humedecerlo antes de agregarlo a la pila.
b) ricos en nitrgeno: material vegetal fresco a menudo verde como restos de pasto, frutas,
verduras, hojas verdes, caf, t, bosta fresca, etc. Funcionan como una fuente de
nitrgeno para los organismos.
La combinacin de estos dos materiales proporciona el mejor balance nutricional para
los microorganismos del compost. Adems, proporciona una mejor aireacin y humedad de la
pila. Lo ricos en carbono suelen ser voluminosos y promueven una buena aireacin mientras
que los ricos en nitrgeno contienen ms agua y mantienen hmeda la pila.
Aire
Los microorganismos del compost son aerbicos y no pueden crecer a menos que
tengan aire. Adems de la eleccin de los componentes de la pila, conviene mezclar los
ingredientes de la pila con un rastrillo o pala de jardn, para que entre aire y armar la pila de
nuevo de manera ms floja. Para la produccin en gran escala existen mezcladores mecnicos y
en algunos casos se usan tambores rotatorios.
Agua
Idealmente la pila debe tener un nivel de humedad tal que una delgada capa de agua
cubra cada partcula para facilitar el desarrollo y dispersin de los microorganismos en todos los
estratos. Si la humedad est por debajo de este nivel el desarrollo microbiano ser pobre y se
har ms lenta la descomposicin, si el nivel de humedad es mayor, se genera una condicin
anaerbica desfavorable para la maduracin completa del compost. En climas secos puede ser
necesario mojar la pila ocasionalmente y en caso de tiempo lluvioso conviene cubrirla.
Temperatura
Otro aspecto a considerar es la temperatura. En climas fros la pila se mantiene
durmiente en invierno pero en primavera el proceso recomienza. Las pilas ms calientes se
descomponen ms rpido. En climas fros para que se mantenga el calor y permitir que los
microorganismos mantengan un metabolismo ms rpido y activo, la pila no debe tener ms de
1 metro cbico.
En climas templados generalmente se construyen pilas de forma piramidal con una base
de 2m x 2m, con una altura aproximada de 1,5m y una superficie superior de 1,5m x 1,5m. La
pila puede estar encajonada o no. Se alternan capas de 20 cm de residuos carbonados con capas
de 10cm de material verde rico en nitrgeno. Si el material est picado, la maduracin del
compost se acelera. Cada capa es humedecida de manera que no alcance a estar saturada. La pila
puede cubrirse con suelo, heno o plstico para retener el calor.
El compost terminado es oscuro y tiene olor a tierra. Usualmente es difcil reconocer los
ingredientes originales aunque a veces pueden verse trozos de materiales de difcil
descomposicin (por ejemplo, paja).
De qu manera el compost mejora el suelo?
El compost produce mayores beneficios en el suelo que los fertilizantes sintticos.
179

En primer lugar agrega materia orgnica, lo que mejora su estado de agregacin y
mejora la interaccin del agua con las particulas del suelo. En suelos arenosos el compost ayuda
a la retencin de agua, evitando el drenaje y protegiendo a las plantas de la desecacin. En
suelos arcillosos, el compost aumenta la porosidad permitiendo que el agua drene ms
rpidamente y no permanezca inundado o se torne quebradizo.
El compost adems inocula el suelo con un vasto nmero de microorganismos benficos
que extraen nutrientes de la porcin mineral del suelo y los dejan a disposicin de las plantas.
Tambin tiene valor como fertilizante ya que posee pequeas cantidades de N, P y S.
Biologa del compost
Hay una compleja red alimentaria en una pila de compost que se puede representar
como una pirmide con consumidores primarios, secundarios y terciarios. La base de la
pirmide es la fuente de energa proveniente de la materia orgnica de los residuos vegetales y
animales.
Como se puede ver en esta pirmide de la Figura 2 los residuos orgnicos como las
hojas u otros materiales vegetales son consumidos por algunos tipos de invertebrados como
milpies, caracoles y babosas, estos invertebrados trituran el material vegetal creando una mayor
superficie de accin para las bacterias, hongos y actinomicetes, y estos microorganismos son a
su vez consumidos por otros invertebrados. Muchas clases de gusanos, como las lombrices de
tierra y los nematodes comen plantas en descomposicin y microorganismos y excretan
compuestos orgnicos que enriquecen el compost. Adems ellos construyen tneles que
favorecen la aireacin de la pila. En esta pirmide, cada descomponedor que muere excreta o
agrega ms alimento a la red de los otros descomponedores.
Fases del compost
Durante el proceso de compost, los microorganismos descomponen la materia orgnica y
producen CO2, agua, humus y calor. Bajo condiciones ptimas, existen cuatro fases (Trautmann
y Olynciw, 2000; Coyne, 2000) (Fig. 3).
- La fase mesoflica o de temperatura moderada, que dura un par de das.
- La fase termoflica o de alta temperatura, que puede durar desde unos pocos das hasta
meses.
- La fase de enfriamiento que dura varios meses.
- La fase de maduracin.
180






Microorganismos del compost
Diferentes comunidades de microorganismos predominan durante las distintas fases. La
descomposicin inicial es llevada a cabo por microorganismos mesoflicos que consumen
rpidamente los compuestos solubles, fcilmente degradables. El calor que producen causa un
aumento rpido de la temperatura del compost. Cuando se alcanza una temperatura de 40C, los
microorganismos mesoflicos se vuelven menos competitivos y son reemplazados por los
termoflicos.
En la fase termfila la microflora mesfila es sustituida por la termfila, las altas
temperaturas (60-70C) favorecen el desarrollo de organismos capaces de degradar molculas
ms complejas tales como las protenas, los cidos grasos y los polisacridos como la celulosa y
la hemicelulosa, las principales molculas estructurales de las plantas. Estos microorganismos
transforman el nitrgeno en amonaco y el pH del medio se hace alcalino, a los 60 los hongos
termfilos cesan su actividad y aparecen bacterias esporgenas y actinomicetes (Nakamura et al,
2004). Por otro lado, se produce una disminucin del carbono presente en el material, lo que
conlleva un descenso de la relacin C/N ya que se degradan sustancias como celulosa y lignina
(Forgarty & Tuovinen, 1991), tambin en esta fase la mayora de los microorganismos
patgenos, parsitos, fitotoxinas y semillas de malezas son destruidos (Avendao, 2003).
Figura 2. Red alimentaria de una pila de compost.

181

En la etapa de enfriamiento, a medida que estos compuestos altamente energticos son
agotados, la temperatura baja gradualmente y los microorganismos mesoflicos vuelven a
colonizar y se encargan de la fase final de maduracin de la materia orgnica remanente.
La etapa de maduracin, se encuentra marcada por una baja tasa de actividad
microbiana, al agotarse los sustratos, se produce una cada gradual de la temperatura, la cual
ser igual a la del medio ambiente, lo que indica el trmino de la elaboracin del compost.
Durante esta etapa los productos resultantes de la etapa termoflica del compostaje se
estabilizan, lo que involucra una descomposicin ms avanzada de cidos orgnicos, una
disminucin de los compuestos resistentes y la formacin de compuestos hmicos. Se debe
continuar con un manejo apropiado de la humedad y oxgeno para mantener la actividad
microbiana (Bonilla & Mosquera, 2007).






Actualmente, el uso de inoculantes termoflicos es una alternativa viable en el
tratamiento de residuos de origen orgnico ya que presentan enzimas muy estables frente a
temperaturas extremas, garantizando, de esta manera, una capacidad de degradacin mayor que
la obtenida por gneros microbianos mesfilos. La inoculacin permite obtener un rendimiento
ptimo en la tasa de degradacin de cada tipo de residuo a tratar, sin alterar la calidad del
producto final, por el contrario, se logra la produccin de un compost con altos niveles de
nitrgeno, fsforo y potasio, que ayudan a incrementar la viavilidad de los suelos (Moreno et
al., 2001).
Figura 3. Evolucin de la temperatura e interaccin con microorganismos
frecuentemente reportados en cada estado de evolucin hasta maduracin del
proceso de compostaje (Bonilla & Mosquera, 2007).
182

Bacterias
Representan el 80-90% del billn de microorganismos tpicamente presentes en el
compost. Son responsables de la mayor parte de la descomposicin y de la generacin de calor.
Son de categoras nutricionales diversas y usan un amplio rango de enzimas para romper
qumicamente una gran variedad de sustancias orgnicas.
Al comenzar el proceso, predominan las bacterias mesoflicas que en general
corresponden a las especies que se encuentran en la superficie del suelo, Pseudomonas, un
grupo caracterizado por su diversidad metablica, Bacillus, iobacillus y Enterobacter son
algunos de los gneros encontrados. Bacterias celulolticas del gnero Cellulomonas tambin
estn presentes. A medida que el compost se calienta la poblacin inicial es desplazada por
miembros del gnero Bacillus, un grupo con capacidad de degradar protenas y por
actinomicetes (Nocardia, Streptomyces, etc.). La cantidad de Bacillus es regularmente alta entre
los 50 y 55C, pero decrece dramticamente por arriba de 60C. Cuando las condiciones se
vuelven desfavorables estas bacterias sobreviven formando endosporas y vuelven a estar activas
cuando las condiciones se vuelven favorables. En las mayores temperaturas del compost se han
aislado termfilas extremas como las bacterias del gnero Thermus.
En la fase termoflica (40 a 60C) desarrollan fundamentalmente los actinomicetes. En
el compost este grupo cumple un rol fundamental en la degradacin de compuestos orgnicos
complejos como la celulosa, las hemicelulosas, la quitina y la lignina. Poseen enzimas capaces
de degradar materiales resistentes como corteza de rbol, trozos de madera y papel. Algunas
especies aparecen en la fase termoflica y otras se vuelven importantes en la etapa de
enfriamiento o maduracin cuando solo quedan los materiales ms resistentes y participan en las
ltimas etapas de formacin de humus. Los actinomicetes son los responsables del olor a tierra
en la fase final del compost. Forman filamentos ramificados en forma de telaraa que suelen
verse en la parte superior de la pila, en las etapas finales.
Hongos
Incluye a los hongos filamentosos y las levaduras. Tpicamente saprofticos (obtienen
energa de la materia orgnica de las plantas y animales muertos) y aerbicos que encuentran un
hbitat ideal en el compost. Las especies fngicas son numerosas tanto en las fase mesoflica
como en la termoflica. Crecen como filamentos casi invisibles o como colonias blancas o grises
vellosas en la superficie de la pila. Los hongos son responsables junto con los actinomicetes de
la descomposicin de polmeros complejos (celulosa, hemicelulosa, pectinas, lignina). La
presencia de los hongos en el compost es importante porque degradan los restos vegetales y
animales permitiendo que las bacterias continen con la descomposicin una vez que la celulosa
se ha agotado. Pueden atacar material demasiado seco, cido o con bajo contenido de nitrgeno
de difcil descomposicin por las bacterias.
Protozoos y rotferos
Estos animales microscpicos unicelulares (protozoos) o multicelulares (rotferos) se
encuentran en la pelcula de agua en el compost. Se alimentan de materia orgnica, bacterias y
hongos.
Fsica del compost
La velocidad a la que madura el compost depende de factores fsicos y qumicos. La
temperatura es uno de los parmetros claves, as como algunas caractersticas fsicas de los
ingredientes del compost como el tamao de las partculas y el contenido de humedad. Otras
consideraciones fsicas incluyen el tamao y la forma del sistema que afectan la aireacin y la
tendencia a retener o disipar el calor.
183

Temperatura
El calor del compost es un subproducto de la degradacin de la materia orgnica. El
calor depende del tamao de la pila, la humedad, la aireacin y la relacin C/N. Adems la
temperatura ambiente tambin afecta la temperatura del compost. Una curva tpica de la
evolucin de la temperatura en la pila de compost se describe en la Figura 4.
Figura 4. Curva de temperatura tpica de una pila no mezclada.

El compost en gran escala de uso comercial o para reciclado de residuos urbanos
alcanza temperaturas entre 60 y 70C en 3 4 das. Por arriba de 65C se hace necesario
remover o airear la pila para evitar la muerte de los organismos beneficiosos. La fase termoflica
(40 a 60C) dura desde varias semanas a varios meses dependiendo del tamao de la pila y de la
composicin de los ingredientes. En esta fase la descomposicin ocurre ms rpidamente y es
tambin importante para destruir patgenos termosensibles. Los invertebrados del compost
sobreviven a esta etapa movindose a la parte externa de la pila o permaneciendo en estado de
dormicin. Para asegurar una reduccin significativa de los patgenos el compost debera
mantenerse al menos 5 das a una temperatura mnima de 40C con temperaturas que excedan
los 55C por lo menos 4 horas durante este perodo.
Cuando el compost empieza a enfriarse, si se remueve la pila se produce un nuevo pico
de temperatura por el aumento del contenido de oxgeno y la exposicin de materia orgnica
que no fue descompuesta. Existe un momento en que la temperatura cae y no puede ser
restablecida mezclando o removiendo la pila. Esto indica el fin de la fase termoflica y en este
punto los microorganismos inician un largo proceso de curacin o maduracin. En esta etapa
continan ocurriendo reacciones que hacen que la materia orgnica remanente se vuelva ms
estable y apta para usar como mejorador del suelo.
Tamao de las partculas
Los microorganismos se desarrollan sobre la superficie de las partculas orgnicas. Por lo tanto,
cuanto menor es el tamao de las partculas aumenta la relacin superficie/volumen y esto
conduce a un aumento de la actividad microbiana, el sustrato carbonado est ms disponible y
por consiguiente la velocidad de descomposicin aumenta. Por otra parte cuando las partculas
son demasiado pequeas y compactas la circulacin de aire en el interior de la pila empeora, lo
que disminuye la disponibilidad de oxgeno y el ritmo de descomposicin.
Aireacin
El oxgeno es esencial para mantener el metabolismo respiratorio que conduce a la
oxidacin del material de la pila. Al comienzo de la actividad oxidativa la concentracin de
oxgeno en los poros es cercana a 15-20% (semejante a la concentracin de la atmsfera) y la de
CO2 oscila entre 0,5 y 5%. A medida que la actividad biolgica progresa el oxgeno cae y el
CO2 aumenta. Si la concentracin de oxgeno cae por debajo del 5% se crean condiciones de
80


60


40


20
tiempo
Temp.
C
184

anaerobiosis. Mientras la actividad anaerbica se mantiene baja la pila de compost acta como
un biofiltro que atrapa y degrada los compuestos olorosos que resultan de la descomposicin
anaerobia. Cuando la actividad anaerobia aumenta por encima de cierto lmite se producen
olores desagradables y el compost no alcanza su estado maduro.
Existen varios factores que conducen a condiciones anaerbicas: 1) humedad excesiva
2) baja porosidad 3) sustratos que se degraden muy rpidamente 4) un tamao excesivo de la
pila.
Para mantener la condicin aerbica se pueden usar recipientes con agujeros de aire,
armar agujeros de aire en la pila y en el compost de gran escala el mezclado o rotacin
mecnica, el uso de caeras de ventilacin y el flujo forzado de aire son algunas de las
opciones.
Humedad
Un contenido de humedad de 50 a 60 % es considerado ptimo, la descomposicin
microbiana ocurre ms rpidamente en la pelcula delgada de agua que rodea las partculas
orgnicas. Mientras que muy bajos contenidos de humedad (<30%) inhiben la actividad
bacteriana, contenidos muy altos (>65%) genera condiciones anaerbicas y el consecuente
enlentecimiento de la descomposicin y la produccin de olores desagradables. El contenido de
humedad del material compostable vara mucho como se muestra en la Tabla 1. A menudo los
materiales ricos en nitrgeno son muy hmedos y los ricos en carbono son secos. Combinando
los distintos tipos de material se puede obtener una humedad adecuada.
Tamao de la pila
En sistemas aireados pasivamente la prdida de calor es proporcional a la superficie
expuesta y el calor producido es funcin del volumen. Las pilas ms grandes por lo tanto
tienden a sobrecalentarse y las ms pequeas tienden a ser demasiado fras. Usualmente la altura
ideal de la pila es de 1 a 3 m y el ancho cercano al doble. Las pilas que lleven sustratos que se
degradan rpidamente (estircol, restos de pasto verde, restos de alimento) deben estar en el
rango inferior y los ms porosos y de descomposicin ms lenta deben tener tamaos cercanos
al rango superior. Los sistemas de aireacin forzada con reciclado del flujo de aire o el uso de
aire precalentado permiten aumentar el tamao de la pila.

Tabla 1. Contenido de humedad de diversos materiales.
Material Humedad relativa (%)
Duraznos 80
Lechuga 87
Alimento seco (pellets) 10
Diario 5

Qumica del compost
Relacin C/N
El carbono y el nitrgeno son los elementos ms importantes para el crecimiento
bacteriano. Para proveer cantidades apropiadas de estos elementos, la relacin C/N debe ser
aproximadamente de 30/1. A relaciones mayores la provisin de nitrgeno es insuficiente para
185

un crecimiento ptimo de las poblaciones microbianas, el compost se mantiene fro y la
descomposicin ocurre lentamente. A relaciones menores, el exceso de nitrgeno es eliminado
en forma de gas amonaco causando un olor desagradable. En general, los materiales verdes y
frescos son ricos en nitrgeno y los oscuros y secos ricos en carbono.
Se pueden estimar las condiciones ptimas simplemente usando una combinacin de
estos materiales. Las relaciones C/N deben ser ajustadas teniendo en cuenta la biodisponibilidad
de estos componentes. Comnmente, los materiales ricos en carbono son derivados de la madera
o material lignificado, lo que reduce su biodegradabilidad. Las relaciones C/N de materiales
usados para el compost se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Relaciones C/N de diversos materiales
usados para fabricar compost Adaptado de Dickson et
al. (1991).
Materiales ricos en carbono C/N
Hojas en otoo 30-80:1
Paja 40-100:1
Astillas de madera o aserrn 100-500:1
Papel 150-200:1
Diario o cartn corrugado 560:1
Materiales ricos en nitrgeno C/N
Restos vegetales 15-20:1
Caf 20:1
Pasto cortado 15-25:1
Estircol 5-25:1
Los fertilizantes nitrogenados, a diferencia de las fuentes de nitrgeno naturales que
tienen un tiempo de liberacin compatible con el ritmo de crecimiento de la poblacin, quedan
disponibles tan rpidamente que exceden la capacidad de asimilacin de la comunidad del
compost y se pierden en forma de amonio. Para imitar un tiempo de liberacin natural los
fertilizantes sintticos deben ser usados de manera limitada y en aplicaciones seriadas.

Capacidad de Intercambio Catinico (CIC)
Los residuos orgnicos tienen una CIC variable cercana a 40 meq/100 g. Durante el
proceso de compostaje este parmetro tiende a llegar a niveles de 70-80 meq/100g, debido a la
desaparicin de la materia orgnica fcilmente degradable y al aumento de la materia orgnica
humificada (Larco Reyes, 2004).
Balance nutritivo
Cantidades adecuadas de P, K y elementos traza (Ca, Fe, B, Cu, etc) son esenciales para
el crecimiento microbiano. En general estos elementos no son limitantes porque estn presentes
en las concentraciones necesarias en los materiales del compost.
186

pH
Un rango de pH entre 5,5 y 8,5 resulta ptimo para los microorganismos del compost. A
medida que las bacterias y hongos digieren la materia orgnica se liberan cidos orgnicos.
Consecuentemente, en las primeras fases del compost se produce una cada del pH que favorece
el crecimiento de los hongos (generalmente acidfilos) y la ruptura de la celulosa y la lignina.
En general, los cidos orgnicos son posteriormente consumidos en fases posteriores. Sin
embargo, si el ambiente se vuelve anaerbico la acumulacin de cidos como resultado de la
fermentacin puede bajar el pH por debajo de 4,5 y limitar seriamente la actividad microbiana.
Presencia de microorganismos patgenos
La gran mayora de los microorganismos potencialmente patgenos para humanos
presentes en los residuos orgnicos son destruidos durante el proceso de compostaje en la fase
termoflica, por lo que se considera un proceso sanitario (Tabla 3).
La destruccin de patgenos durante la fase termfilica permite la obtencin de un
abono orgnico no contaminante. Por otro lado, el crecimiento de los patgenos puede verse
inhibido por la competencia por los nutrientes con otros microorganismos y por la aparicin de
otros organismos que actan como biocontroladores (Bonilla & Mosquera, 2007).

Tabla 3. Temperatura y tiempo requerido para la eliminacin de
microorganismos patgenos para la salud humana.
Microorganismo Temp (C) Tiempo de exposicin Fuente
Escherichia coli O157:H7 60 60 minutos Soldier y Strauch 1991
Escherichia coli O157:H7 60 3 semanas Juneta et al. 1997
Salmonella 65 24 horas Coger et al. 2001
Salmonella typhosa 60 20 minutos Tim 1980
Salmonella 55 60 minutos Tim 1980
Salmonella sp. 60 15-20 minutos Tim 1980
Shigella sp. 55 60 minutos Tim 1980
Escherichia coli 57 72 horas Paul 2000
Coliformes 70 60 minutos Tim 1980



187

CAPTULO 12
BIORREMEDIACIN
Material de estudio: Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biologa de los
Microorganismos, 8
a
edicin. Prentice Hall.
Captulo 14 (14.19 y 14.20)
Biorremediacin
Se entiende por remediacin a todo proceso que restablece, en un sistema contaminado,
las funciones biolgicas, de sustento y de soporte, mediante la reduccin o eliminacin de los
contaminantes que produjeron su alteracin. La atenuacin natural es el comienzo de la
biorremediacin, y se podra definir como un conjunto de procesos fsicos, qumicos y
biolgicos que se dan de forma espontnea luego de la aparicin del contaminante. La
contaminacin puede ser antrpica, como por ejemplo derrames de petrleo, o natural como son
las erupciones volcnicas (Orozco et al., 2003). Cuando la remediacin es realizada por
organismos vivos, como plantas y microorganismos, se denomina biorremediacin. (Adriano et
al., 1999). Diversos autores utilizan este trmino para hacer referencia a la remediacin
realizada por microorganismos (bacterias y hongos) mientras que emplean el trmino
fitorremediacin para hacer referencia a la accin de las plantas en el proceso remediador. La
remediacin llevada a cabo por los hongos se denomina micorremediacin (Singh, 2006).
Para llevar a cabo la biorremediacin, debe analizarse si la sustancia contaminante es
biodegradable y si el proceso no deja efectos adversos o secundarios en el sistema (Atlas &
Bartha, 2002). La degradacin de los contaminantes debe dar como producto sustancias menos
nocivas o inocuas (Martn Moreno et al., 2004). Si la contaminacin es pequea y las
condiciones del sistema son favorables, por medio de la atenuacin natural la biorremediacin
puede llevarse a cabo in situ y sin la intervencin antrpica (Martn Moreno et al., 2004). Sin
embargo en la mayora de los casos el tiempo de degradacin del contaminante suele ser muy
largo y es as que se requiere la aplicacin de tcnicas de biorremediacin dirigida.
La biorremediacin dirigida tiene como ventajas frente a otras metodologas de
remediacin que puede realizarse tanto in situ como ex situ, y suele ser ms econmica si la
comparamos, por ejemplo, con mtodos fsicos. La biorremediacin intrnseca o in situ es una
tecnologa en pleno desarrollo que requiere de seguimiento para asegurar una efectiva limpieza
del sistema. En la Figura 1 (Atlas & Bartha, 2002) puede verse un ejemplo de un acufero
contaminado por hidrocarburo, sometido a biorremediacin in situ. En el mismo se detallan las
distintas zonas de influencia de nutrientes y oxgeno, as como tambin la zona contaminada.
Los procesos de landfarming o remediacin de suelos poseen la ventaja de ser ms
sencillos de realizar que la remediacin de aguas, ya que en estas ltimas influyen las corrientes.
En los primeros tratamientos de remediacin de suelos, se requiere que el rea sea confinada
para la correcta aplicacin de los mismos. Una forma consiste en cubrir el suelo a tratar con un
plstico con una salida de gases, los cuales se recolectan para evitar as la contaminacin
atmosfrica (Atlas & Bartha, 2002). Como se ver ms adelante otra forma de confinamiento se
da en los vertederos donde se arrojan los desechos domiciliarios e industriales. La funcin del
mismo es evitar la dispersin de lquidos, gases y material particulado contaminante (Martn
Moreno et al., 2004).
El tiempo que tarde el proceso de biorremediacin en llevarse a cabo depende del
compuesto a degradar, la cantidad a degradar, las condiciones del lugar (pH, temperatura,
humedad, entre otros) y fundamentalmente de la composicin de la comunidad microbiana
188

autctona (Atlas & Bartha, 2002; Adriano et al., 1999). Esta ltima caracterstica es importante
debido a que cada microorganismo degrada diferentes compuestos y se desarrollan bajo distintas
condiciones (Martn Moreno et al., 2004).
Se denominan microorganismos endgenos a aquellos que estn presentes en el
ecosistema a remediar. Por contraposicin, los microorganismos exgenos son los que se
introducen para llevar a cabo el proceso biorremediador debido a que los microorganismos
autctonos no degradan la sustancia contaminante o es baja su actividad por las condiciones del
ecosistema. . Es fundamental que la eficacia de los microorganismos exgenos sea probada
anteriormente para evitar alterar el ecosistema por el agregado de microorganismos sin la
eficacia requerida (Martn Moreno et al., 2004). Por otra parte, para acelerar el proceso de
biorremediacin, hay tcnicas que mejoran el ambiente como por ejemplo la adicin de
nutrientes o la oxigenacin, (Atlas & Bartha, 2002). Para evaluar cul es el factor que debe
adicionarse para acelerar la biorremediacin, se realizan ensayos de laboratorio con las
comunidades autctonas degradadoras de xenobiticos, a las cuales se las somete a distintas
condiciones de humedad, temperatura, oxigenacin, etc., llevndose a cabo antes y despus del
ensayo el recuento de microorganismos y la evolucin de la concentracin del material
contaminante a fin de comparar con los controles sin tratar. La velocidad de desaparicin del
contaminante (su degradacin) es una medida de la eficacia de la biorremediacin. La siembra
de degradadores de xenobiticos solo es necesaria cuando los microorganismos autctonos no
son buenos degradadores de la sustancia contaminante y hasta incluso les resulta txico (Atlas
& Bartha, 2002). Sin embargo, en diversas ocasiones no hay tiempo de realizar ensayos de
laboratorio debido a que el contaminante puede lixiviarse o fotodegradarse. Esto trae efectos
secundarios, en el agua o en el aire en el primer y segundo caso respectivamente, si la
biorremediacin no se desarrolla en forma correcta (Atlas & Bartha, 2002). A su vez, no realizar
ensayos de laboratorio puede aumentar los efectos colaterales. A modo de ejemplo, aumentar el
oxgeno para acelerar la biorremediacin puede aumentar la toxicidad del contaminante
provocando la mortandad de la fauna del ecosistema (Ghosal et al., 1985). En caso de que el
contaminante no permita la proliferacin de los microorganismos autctonos, deben inocularse
repetidamente o agregar un sustrato que permita un crecimiento adecuado. A continuacin, se
describirn en forma ms detallada algunas de las tcnicas de biorremediacin de suelos y de
aguas.
Biorremediacin in situ y ex situ de suelos
La remediacin de suelos en el sitio de contaminacin, es ms rpida desde el punto de
vista operativo debido a que no requiere la remocin y el traslado del suelo contaminado como
sucede con las tcnicas ex situ. Sumado a esto, la cantidad de suelo a remediar puede ser mayor
debido a que no hay limitacin del transporte y capacidad de los reactores. En este sentido,
Martn Moreno et al (2004) describen a las tcnicas in situ como aquellos casos en que es el
propio suelo el que funciona como un reactor biolgico. Sin embargo, desde el punto de vista
biolgico, el proceso es ms lento debido a que las condiciones del sistema no son las ptimas
para que se lleve a cabo una remediacin rpida, y si se adicionan componentes stos deben ser
monitoreados. Otra desventaja es que la aplicacin de componentes en ciertos casos puede
distribuirse de forma heterognea quedando sitios sin ser tratados (Martn Moreno et al., 2004).

189

Zona de
influencia
del H
2
O
2
Zona de
influencia
del O
2
Flujo de agua
subterrnea
Pozo de
inyeccin
Zona de
influencia
de los
nutrientes






En contraposicin, las tcnicas ex situ son ms rpidas y efectivas desde el punto de
vista biolgico, pero suelen ser ms costosas y ms lentas desde lo operativo. Dependiendo de la
cantidad de suelo a remediar y del tipo de reactor, la biorremediacin puede ser lejos del lugar a
biorremediar, o si el reactor puede transportarse puede realizarse en el lugar de la
contaminacin. De todas formas, esta ltima se considera una tcnica ex situ porque el suelo
debe sacarse de su lugar y pasar por el reactor. El compostaje, por ejemplo, es una tcnica ex
situ aplicable para distintas situaciones de contaminacin de suelos. El suelo contaminado se
mezcla en proporciones adecuadas con diversos sustratos, tales como paja de cereales y/o guano
de producciones animales, de tal manera que se favorezca al sistema con la difusin de oxgeno
y humedad, optimizando as el metabolismo microbiano del sistema (Atlas & Bartha, 2002;
Martn Moreno et al., 2004; Medaura et al., 2007).
Biorremediacin de aguas
Las aguas profundas pueden ser remediadas por distintas metodologas. La eleccin
depender de cuales sean las condiciones geolgicas e hidrolgicas locales. En los sistemas in
situ se realizan pozos de extraccin del agua contaminada y ya en la superficie se agregan
nutrientes y oxgeno. El agua es reintroducida por otro pozo cercano para que los
microorganismos lleven a cabo la biorremediacin. Otra tcnica es la difusin directa de aire en
las aguas profundas, o columnas de oxigenacin. La primera metodologa tiene como desventaja
que el aire puede no llegar a todos los sitios contaminados y la segunda, es ms costosa por el
armado de las columnas (Martn Moreno et al., 2004)
Los residuos lquidos generados por actividades humanas son dirigidos por
alcantarillados y sistemas cloacales a distintos sitios. El sistema de alcantarillado pluvial
desagua en ros y arroyos recolectando el agua de lluvia, la cual no pasa por ningn sistema de
Figura 1. Zonas de contaminacin de un acufero y de influencias de inyeccin de
perxido de hidrgeno, nitrato y fosfato. La zona de influencia de los nutrientes es
mayor que la zona aerbica de influencia del oxgeno. (Fuente: Cookson 1995, citado en
Atlas y Bartha, 2002).
190

remediacin. La misma en ocasiones sufre desviaciones para ser utilizada por productores
hortcolas y piscicultores. En cambio, el sistema cloacal transporta agua con elevada carga de
materia orgnica, por lo cual no puede ser vertida directamente a cursos de agua y debe ser
dirigida a plantas de tratamiento, donde se la somete a remediacin fsica, qumica y biolgica.
Posteriormente, es derivada a cursos de agua o a redes de consumo domstico. Esto es un
ejemplo de remediacin de aguas ex situ, debido a que las mismas son remediadas en plantas de
tratamiento fuera del punto de contaminacin (Atlas & Bartha, 2002). Por medio de dicho
tratamiento se busca eliminar bacterias patgenas como Salmonella y parsitos como Giardia.
En primera instancia los lquidos son filtrados con el fin de extraer desechos grandes como
plsticos, metales, etc. A continuacin se deja sedimentar, eliminando as un tercio de la materia
orgnica. Finalmente, se aplica, en una cmara de aireacin, un conjunto de microorganismos
denominado barro activado.
A pesar de que las aguas naturales poseen una capacidad natural de autopurificacin, es
importante no arrojar xenobiticos a la red pluvial. En tal caso, los microorganismos
hetertrofos mineralizan los nutrientes orgnicos, y las algas y plantas acuticas superiores
utilizan e inmovilizan el amonio y el nitrato previamente nitrificado. Las poblaciones alctonas
de bacterias comunes y patgenos compiten con las poblaciones autctonas vindose estas
ltimas favorecidas por su adaptacin al medio (Atlas y Bartha, 2002). Los ros que reciben
aportes importantes de materia orgnica debido al vertido de aguas residuales y contaminacin
agrcola o industrial pueden ver reducido los niveles de O2 del agua debido a la respiracin
bacteriana que libera nutrientes inorgnicos a partir de la mineralizacin de la materia orgnica
(Figura 2). Esa disminucin de los niveles de O2 en ecosistemas de aguas frescas es indeseable
debido a que provoca la muerte de animales acuticos. Si las condiciones de anoxia se
mantienen proliferarn las bacterias anaerobias, las cuales son responsables de los malos olores,
debido a sustancias tales como aminas, sulfuro de hidrgeno, mercaptanos y cidos grasos,
algunos de los cuales resultan txicos para organismos superiores. A medida que el agua se
aleja del punto de vertido aumenta el nmero de algas y cianobacterias, debido a la presencia de
los nutrientes inorgnicos, principalmente PO4
3-
, NH4
+
y NO3
-
. El consumo de esos nutrientes
inorgnicos por algas y cianofceas y la reduccin en el contenido de MO determina que, aguas
abajo del sitio de vertido, los niveles de O2 del ro se recuperen (Figura 2).

Figura 2. Efecto de la incorporacin de aguas residuales y otras aguas de desecho ricas
en materia orgnica en un ro. Inmediatamente se produce un aumento en el nmero de
bacterias heterotrficas y un descenso en los niveles de O2. Si el aporte en las aguas
residuales tiene, por ejemplo, amonio, ste es oxidado a nitrato por las bacterias
nitrificantes. El aumento en el nmero de algas y cianobacterias es principalmente una
repuesta a los nutrientes inorgnicos, especialmente fosfatos.
191

Demanda biolgica de oxgeno
La demanda biolgica de oxgeno (DBO) es una medida del consumo de oxgeno
requerido para la oxidacin microbiana de materia orgnica y amonio, fcilmente degradables,
en las aguas residuales. Estas pueden ser de cuatro fuentes: aguas domsticas o urbanas,
industriales, escorrentias de usos agrcolas y pluviales. En el tratamiento de residuos lquidos, el
objetivo de las operaciones es la reduccin de la DBO asociada a la materia orgnica en
suspensin y disuelta, seguida ocasionalmente de la eliminacin de nutrientes inorgnicos y de
compuestos orgnicos recalcitrantes antes de la descarga del efluente. El nivel de DBO se
determina comparando el nivel de oxgeno disuelto (OD) de una muestra de agua tomada
inmediatamente, con el nivel de OD de una muestra de agua que ha sido incubada en un lugar
oscuro durante 5 das. La diferencia entre los dos niveles de OD representa la cantidad de
oxgeno requerido para la descomposicin de cualquier material orgnico en la muestra y es una
buena aproximacin del nivel de la DBO. La muestra de aguas residuales se diluye en agua
saturada de oxigeno y se encierra en una botella sin espacio de aire. La cantidad de OD se mide
normalmente con un electrodo de oxgeno. Como algunos compuestos orgnicos no se oxidan
fcilmente, y como se forma tambin biomasa microbiana, la DBO es menor que la demanda
qumica de oxgeno (DQO), que se mide utilizando oxidantes qumicos fuertes.
Como su solubilidad es baja, el oxgeno disuelto en aguas naturales rara vez excede los
8 mg/L y con frecuencia es mucho menor debido a la actividad microbiana hetertrofa. Se
considera que un agua potable tiene adecuado o bueno nivel de DBO cuando este es menor que
8 y 5 mg/L, respectivamente. Generalmente en las aguas de origen domstico este valor flucta
entre los 200 a 300 mg/L. El reaprovisionamiento del OD de la atmsfera (reaireacin) y/o por
produccin fotosinttica de oxgeno, puede ser considerablemente ms lento que el consumo de
oxgeno por parte de los microorganismos hetertrofos en presencia de sustratos orgnicos
abundantes. En consecuencia, el impacto principal de la sobrecarga de aguas residuales
naturales es la reduccin o el agotamiento de su contenido de OD. Una vez agotado ste, los
procesos de autopurificacin se hacen drsticamente ms lentos. Los productos de fermentacin
y la reduccin de los sumideros de electrones secundarios, como el nitrato y sulfato, producen
olores, sabores y colores nocivos o desagradables, el agua se convierte en anxica o sptica. La
falta de oxgeno mata forzosamente los organismos aerobios. La descomposicin de estos
organismos muertos constituye una demanda adicional de oxgeno. La turbidez y los productos
metablicos txicos, como H2S, tambin interfieren con la regeneracin fotosinttica de
oxgeno, retardando an ms el proceso de recuperacin.
La entrada de una nica dosis de aguas residuales en un ambiente lntico (aguas
estancadas, remansos), produce un periodo sptico de agotamiento de oxgeno al que se asocia
una reduccin de la diversidad biolgica. Despus de un periodo sptico prolongado, la difusin
de oxgeno finalmente reairea el sistema y permite la mineralizacin de los productos de
fermentacin acumulados. Los nutrientes minerales liberados de la materia orgnica degradada
pueden entonces producir una floracin (bloom) de algas. Si no hay ms alteraciones, la
sucesin secundaria finalmente restituir la comunidad acutica a su estado anterior. Cuando un
habitat ltico (un ro que fluye) recibe una entrada continua de aguas residuales sin tratar, los
acontecimientos previamente descritos pueden observarse en estado estacionario a diversas
distancias ro abajo del vertido de las aguas residuales. Dependiendo de las tasa de emisin de
aguas residuales, de flujo, de la temperatura del agua y de otros factores ambientales, la calidad
del agua puede revertir a un estado prximo al original, a distancias que van de unos pocos hasta
varias docenas de kilmetros ro abajo desde el punto de vertido de las aguas residuales.
Las condiciones spticas en aguas naturales, tanto si ocurren temporalmente como de
manera constante, nunca son recomendables. Para evitarlas, el tratamiento de las aguas
192

residuales tiene como objetivo reducir la DBO antes del vertido, algo que se consigue en tres
etapas. Estas se denominan tratamientos primario, secundario y terciario de aguas residuales,
respectivamente. Las dos primeras causan una mayor reduccin de la DBO original. La tercera
etapa normalmente esta dirigida a eliminar nutrientes minerales y/o compuestos orgnicos
recalcitrantes.
Las aguas entran en la planta depuradora a travs de pantallas, sifones y mecanismos de
espumacin que eliminan los objetos ms grandes, arenilla, espuma flotante y grasa. El
tratamiento primario elimina solamente los slidos en suspensin. Esta extraccin se consigue
en tanques de sedimentacin o piletas, donde los slidos se sacan del fondo. Pueden someterse a
digestin anaerbica y/o compostaje antes de la distribucin final en terraplenes o como
acondicionadores de suelo. Slo un bajo porcentaje de la materia orgnica suspendida o disuelta
se mineraliza durante la depuracin de residuos lquidos. La mayor parte de la materia orgnica
se elimina por sedimentacin, en cierto modo, el problema de eliminacin simplemente se
desplaza al rea de residuos slidos. Sin embargo, este desplazamiento resulta esencial dada la
fragilidad de los ecosistemas acuticos debido a su bajo contenido en OD. La parte lquida de
las aguas residuales que contiene materia orgnica disuelta se somete a tratamiento adicional o
se vierte despus del tratamiento primario. Los residuos lquidos varan en composicin, y si
contienen principalmente slidos y poca materia orgnica disuelta, el tratamiento primario
puede eliminar un 70-80% de la DBO y considerarse adecuado. No obstante, en las aguas
residuales domsticas tpicas, el tratamiento primario elimina slo 30-40 % de la DBO y es
necesario el tratamiento secundario para una reduccin aceptable de la DBO. En el tratamiento
secundario se mineraliza una menor porcin de la materia orgnica disuelta y una parte mayor
en estado disuelto de transforma en slidos que pueden eliminarse. La combinacin de
tratamientos primario y secundario reduce la DBO original de las aguas residuales en un 80-
90%. La fase de tratamiento secundario depende de la actividad microbiana. El tratamiento
puede ser aerbico o anaerbico, y se dispone de gran cantidad de mecanismos para llevarlo a
cabo.
A continuacin se desarrollarn brevemente algunos casos de contaminantes que pueden
ser tratados por medio de biorremediacin.
Hidrocarburos
La contaminacin del suelo y del agua por derrame o prdidas de hidrocarburos es un
hecho frecuente. Esto lleva a que sea uno de los compuestos ms estudiados en lo que respecta a
su biodegradacin por medio de bacterias (Pseudomonas y Sphingomonas wittichii) y hongos
(Cladophialophora sp.). Las cianobacterias han sido menos estudiadas, pero tambin
contribuyen a la degradacin de estos compuestos. Sin embargo, en aguas se estudia la
degradacin por medio principalmente de cianobacterias y algas. Los microorganismos utilizan
los derivados de petrleo como fuente de carbono y algunos de ellos producen surfactantes,
siendo estos ltimos inocuos y biodegradables. Las fracciones de hidrocarburos BTEX
(benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos) y algunos PAH (hidrocarburos policclicos
aromticos) son fcilmente degradables, mientras que otros PAH y algunos componentes de los
hidrocarburos del petrleo son muy recalcitrantes y persisten en el sistema por mucho tiempo.
Luego de que las primeras fracciones mencionadas son degradadas, las que permanecen estables
pueden producir en ciertas circunstancias mayores riesgos.
En la Figura 3 (Cookson, 1995, citado por Atlas & Bartha, 2002) puede observarse la
aplicacin de conceptos vistos anteriormente. La degradacin vara en funcin del tipo de
hidrocarburo y la textura del suelo, demostrndose que el petrleo tarda ms en biorremediarse
que la gasolina y gasoil, independientemente del tipo de suelo, mientras que el tipo de suelo
193

afecta el tiempo de biorremediacin de los hidrocarburos (ver recuadro Biorremediacin del
vertido de petrleo del Exxon Valdez extrado de Atlas & Bartha, 2002).
Residuos slidos: su disposicin en vertederos controlados
La generacin de residuos nos compete a todos, debido a que todos producimos,
consumimos y finalmente generamos un desecho, ya sea desde un envoltorio de papel de
caramelo hasta la viruta de metal que se genera en las industrias metalrgicas. En la actualidad,
en la Ciudad Autnoma de Buenos Aires se generan 5.000 tn diarias de residuos slidos urbanos
y sumado al Gran Buenos Aires, 15.000 tn de residuos llegan diariamente al Complejo
Ambiental Norte III del CEAMSE (Coordinacin Ecolgica rea Metropolitana Sociedad del
Estado) (FIUBA-CEAMSE, 2008).
Estudios realizados por el CEAMSE determinaron que cerca del 60% de los desechos
que llegan diariamente al relleno son compuestos de lenta degradacin, como metal, plstico,
vidrio, etc., llegando a tardar, como en el caso del vidrio, ms de 4 mil aos en descomponerse
(FIUBA-CEAMSE, 2008). El 40% restante son productos orgnicos que se descomponen a
mayor velocidad que los anteriores, incluyendo a restos de poda y jardinera, desechos
alimenticios y papel no plastificado. stos son atacados por microorganismos anaerobios y
facultativos originando, principalmente, gas metano, el cual es 24 veces ms contaminante en la
atmsfera que el dixido de carbono (Atlas & Bartha, 2002). Es por tal motivo que un relleno
sanitario, vertedero controlado o relleno de bioseguridad debe controlar el metano generado por
los microorganismos y debe ser tratado.

Figura 3. Tasa de biodegradacin en funcin de la fuente de hidrocarburos
y del tipo de suelo. Los hidrocarburos tardan ms en degradarse en los suelos
de textura fina, mientras que la tasa de biodegradacin es menor para el petrleo
que para la nafta y gasoil, independientemente del tipo de suelo (Fuente: Cookson
1995, citado en Atlas & Bartha, 2002).
194


En la Figura 4 se pueden apreciar las partes de un relleno sanitario, entre las cuales se encuentra
un pozo de recuperacin de metano para la generacin de electricidad (Miller, 2002). En el
Complejo Ambiental NORTE III del CEAMSE el metano es quemado con el fin de eliminar
dixido de carbono a la atmsfera y as obtener bonos de carbono. Adems se generan
lixiviados, los cuales son recolectados por tuberas ubicadas en la zona ms profunda del
vertedero y son conducidas a pozos o piletas de tratamiento. Estos lixiviados no deben llegar a
las aguas subterrneas para evitar la contaminacin de las mismas. En las piletas, los lixiviados
son tratados en distintas fases, pasando por lagunas anaerbicas, lagunas aerbicas y finalmente
lagunas de barros residuales. En cada una de ellas la remediacin puede ser biolgica y/o fsico-
qumica dependiendo de los parmetros de los contaminantes (FIUBA-CEAMSE, 2008).





Pesticidas o xenobiticos
Los herbicidas, insecticidas y funguicidas son pesticidas, los cuales varan en su
naturaleza qumica, encontrndose productos fosforados, clorados, nitrofenoles, etc. Algunos de
Figura 4. Corte transversal de un relleno sanitario. Se muestran los sistemas de
recuperacin de gas y de lixiviados, as como tambin la forma de disposicin de las
capas de sustratos. (Fuente: CEAMSE-Infografa Relleno Sanitario)
195


ellos son utilizados por los microorganismos como fuente de carbono y dadores de electrones,
pero hay otras sustancias que son ms persistentes. En la tabla 1 se muestra la persistencia de
distintos pesticidas en el suelo. Como se mencion anteriormente, los componentes del sistema
(temperatura, humedad, pH, etc.) afectan al tiempo de degradacin. Una prctica comn para
biorremediar ambientes contaminados con altas concentraciones de pesticidas consiste en arar el
suelo para airear y aumentar la superficie especfica de contacto entre el plaguicida y los
microorganismos del suelo. Adems, pueden adicionarse fertilizantes para facilitar y aumentar
la disponibilidad de los mismos para los microorganismos, acelerando aun ms la
biorremediacin (Atlas & Bartha, 2002). Tanto bacterias como hongos intervienen en dicho
proceso, pero la desaparicin de los pesticidas en el suelo no se debe exclusivamente a su
remediacin, sino que puede deberse a lixiviacin, descomposicin qumica espontnea o
volatilizacin.

Tabla 1. Persistencia de herbicidas e insecticidas en el suelo. Fuente:
Madigan et al., 1997.
Sustancia
Tiempo requerido para la
desaparicin del 75-100%
Insecticidas Clorados
DDT 4 aos
Aldrin 3 aos
Clordano 5 aos
Heptacloro 2 aos
Lindano 3 aos
Insecticidas Organofosforados
Diazinon 12 semanas
Malation 1 semana
Paration 1 semana
Herbicidas
2-4, D 4 semanas
2,4,5 T 20 semanas
Dalapina 8 semanas
Atrazina 40 semanas
Simazina 48 semanas
Propazina 1,5 aos

196





Biorremediacin del vertido de petrleo del Exxon Valdez (Fuente: Atlas & Bartha, 2002)

En marzo de 1989, el superpetrolero Exxon Valdez encall en el estrecho Prince
William de Alaska, vertiendo al mar ms de 40 millones de litros de petrleo crudo. La marea
negra alcanz una extensin de ms de 1.500km de costa. Fue el peor accidente de esta clase en
territorio estadounidense que, adems de afectar a peces, aves y mamferos marinos, arruin la
calidad del medio ambiente prstino de Alaska. La respuesta inicial de la empresa Exxon fue
eliminar el petrleo de las rocas del estrecho mediante tratamientos fsicos, con un xito parcial
y un gasto de ms de 1 milln de dlares diarios.
Dada la limitada eficacia del lavado fsico de la costa, se pens en recurrir a la
biorremediacin para aumentar la eficacia de otros procedimientos de limpieza. La EPA y
Exxon acordaron estudiar conjuntamente la factibilidad de la propuesta. El proyecto se centraba
en determinar si el suministro de nutrientes poda acelerar la biodegradacin por parte de las
poblaciones microbianas indgenas (Pritchard y Costa 1991; Bragg et al., 1992). Se incluyeron
en el proyecto numerosos ensayos de laboratorio, pero lo esencial era hacer pruebas sobre el
terreno para establecer la eficacia de la biorremediacin en condiciones reales.
Una de las primeras pruebas consisti en aplicar a distintas parcelas de playa
contaminada diferentes abonos, entre los cuales haba frmulas solubles en agua, de difusin
lenta y olefilas. La aplicacin del abono olefilo tuvo un resultado espectacular: despus de
diez das de tratamiento la superficie de las rocas cubiertas de petrleo estaba limpia (Pritchard
y Costa 1991) (Figura A). Este resultado pareca confirmar la idea de que la biodegradacin del
petrleo en aquella zona estaba limitada por la disponibilidad de nutrientes, y que la aplicacin
de abonos era una buena estrategia de biorremediacin. Los espectaculares resultados positivos
desplazaron el inters hacia el uso preferente de la biorremediacin para tratar el vertido del
Exxon Valdez (Beardsley, 1989). Los estudios de toxicidad e impacto ecolgico mostraron que
los abonos olefilos y de difusin lenta podan aplicarse sin miedo, a concentraciones que como
mnimo doblaban la tasa de biodegradacin natural. En 1989 se aprob el uso de Inipol y de
otro abono de difusin lenta para el tratamiento de las costas, y este sistema acapar gran parte
del trabajo de descontaminacin.
A pesar de los espectaculares resultados visibles de la aplicacin de abonos y de la
decisin de su empleo extensivo, an quedaban dudas sobre la eficacia del abono olefilo y
sobre las pruebas cientficas de la eficacia de la biorremediacin. Aunque las observaciones
demostraban que el abono permita mantener poblaciones mayores de microorganismo
degradadores en las costas contaminadas, y que la tasa de biodegradacin potencial aumentaba
en muestras procedentes de los enclaves tratados con abono, los anlisis de hidrocarburos
residuales no mostraban diferencias significativas entre las muestras tratadas y las no tratadas
(Prince et al., 1990; Chianelli et a,. 1991). El problema era la alta variabilidad generada por la
distribucin muy fraccionada del petrleo, tanto en las parcelas experimentales como en las de
control. Una costa rocosa contaminada por petrleo es extraordinariamente heterognea, hasta el
197


punto de que hubo estadsticos que sugirieron el vertido de ms petrleo para aumentar la
uniformidad de la contaminacin, una posibilidad que se rechaz de inmediato.
Durante el ao siguiente se llev a cabo otra serie de ensayos sobre el terreno en un
intento de establecer la credibilidad cientfica de la biodegradacin de hidrocarburos reforzada
por los abonos y de ganar autoridad para continuar la biorremediacin de la contaminacin
petrolfera remanente (Bragg et al., 1992, 1994). Estas pruebas comprendan el muestreo de
pozos para registrar las concentraciones de oxgeno y nutrientes en el agua intersticial, adems
de anlisis qumicos ms detallados del petrleo residual, como la determinacin de la
concentracin de hopanos mediante cromatografa de gases y espectrometra de masas. Los
hopanos son hidrocarburos (C27) alicclicos que no parecen ser biodegradables. Dado que
permanecen en los sedimentos que contienen petrleo, los hopanos pueden servir como patrones
internos para normalizar las concentraciones de otros hidrocarburos residuales. Esto reduce la
variabilidad entre muestras debida a la distribucin fragmentada del petrleo y permite anlisis
estadsticos ms significativos. La normalizacin de los datos qumicos, junto con el uso de
tcnicas complejas de regresin estadstica, permiti establecer definitivamente que la
biorremediacin era un tratamiento eficaz para reducir la concentracin de hidrocarburos en las
costas contaminadas. La tasa de biodegradacin dependa de la cantidad de nitrgeno contenido
en el abono que era retenido en el sedimento (Figura B). La tasa de biodegradacin de
hidrocarburos aumentaba de tres a cinco veces cuando se aplicaba el abono a razn de 4-8 kg
por cada 10 m
2
de costa contaminada. Estos estudios demos-traron que el abono estimulaba la
bio-degradacin en el subsuelo, adems de la eliminacin del petrleo superficial. Aunque
podran haberse conseguido tasas de bio-degradacin ms altas, la dosis de abono se eligi de
manera que permaneciera bastante por debajo de niveles que habran supuesto efectos
ecolgicos adversos, y tambin por debajo del nivel de toxicidad amoniacal para el salmn.
Debido a su eficacia, la biorreme-diacin se convirti en el principal trata-miento para
eliminar la marea negra de las costas del estrecho Prince William. La aplicacin de abonos
redujo el tiempo de eliminacin de los hidrocarburos txicos biodegradables de los 10-20 aos
previstos a 2-3 aos en los lugares ms deteriorados. El xito de la biorremediacin para el
tratamiento de la marea negra del Exxon Valdez sirvi tambin para que se conociera mejor esta
tcnica y para estimular la investigacin y el desarrollo de tcnicas de biorremediacin para
otras aplicaciones.

198



Figura B
Aumento relativo de la tasa de biode-
gradacin de hidrocarburos totales en
sedimentos oleosos predicho por el modelo
de regresin derivado de los estudios de
campo. La eficacia relativa de la biorre-
mediacin es una funcin de la cantidad de
nitrgeno retenida en el sedimento en
relacin a la concentracin de petrleo en el
sedimento. De acuerdo con este resultado,
la biorremediacin podra haberse aumen-
tado hasta diez veces. En la prctica, se
aplicaron dosis de 0,03-0,05 M N por mg
de petrleo por kg de sedimento, lo que
aseguraba una tasa de biodegradacin entre
tres y cinco veces mayor en las zonas
tratadas que en las no tratadas. (Fuente:
Bragg et al. 1992.)

Figura A
Resultado de la aplicacin del Inipol en la costa del
estrecho Prince William (Alaska). El rea tratada
con este abono olefilo (el recuadro blanco de la
fotografa) apareca relativamente limpia al cabo de
10 das. En cambio, la zona cincundante permaneca
negra y cubierta de petrleo. Se comprob que este
hecho no era solo atribuible a la eliminacin fsica,
sino que se estaba produciendo una degradacin
biolgica del petrleo. (Fuente: Russ Chianelli,
EXXON Corporate Research, Anandale, NJ.)









199



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