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UNIVERSIDADE DE SO PAULO
FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS
Programa de Ps-Graduao em Cincia dos Alimentos
rea de Bromatologia
Deteco de Salmonella em alimentos crus de origem animal empregando
os imunoensaios rpidos TECRATM Salmonella VIA, TECRATM Salmonella
UNIQUE e o mtodo convencional de cultura.
ANA MARIA RAMALHO DE PAULA
Dissertao para obteno
de grau de Mestre
Orientador:
Proto Oro Bernadette Do G. M. Franco
So Paulo
2002
J'.f.lftJC
ANA MARIA RAMALHO DE PAULA
Deteco de Salmonella em alimentos crus de origem animal
empregando os imunoensaios rpidos TECRA Salmonella VIA,
TECRA Salmonella UNIQUE e o mtodo convencional de cultura.
Comisso julgadora
Dissertao para obteno de grau de mestre
~
- - - - - ~ ~ ~ __........ o:;
Praf. Or. Bem ette O. G. M. Franco
Orientad ra IPresidente
Praf. Or. Suzana Marta Issay Saad
1
0
examinador
Praf. Or. Mariza Landgraf
2
0
examinador
So Paulo, 22 de Maro de 2002.
PARA
Antnio de Paula e Maria da Anunciao de Paula,
meus pais pelo carinho, apoio, dedicao, e incentivos
ao longo de todos estes anos, que tanto contriburam
para a minhaformao pessoal quanto profissional.
Joo e Paulo, meus irmos, que sempre compartilharam
de todos os momentos e me apoiaram com entusiasmo.
AGRADEO E DEDICO
AGRADECIMENTOS
pror . ~ Bernadette Dora Gombossy de Melo Franco, pela orientao,
amizade, pacincia, confiana e estmulo na realizao deste trabalho.
Dr
a
. Dilma Scala Gelli, pelo apoio, orientao, estmulo, e esforo
dedicado para o meu aprimoramento profissional.
Ao Dr. Odair Zenebon, pela oportunidade e estmulo.
~ . Elza S. Gastaldo Badolato, pela confiana e oportunidade.
Dr
a
. Miyoko Jakabi, pelo apoio, compreenso e incentivos.
Aos colegas, funcionrios e estagirios da Seo de Microbiologia Alimentar
do Instituto Adolfo Lutz, pelo apoio e amizade.
Madasa, representante no Brasil da Tecra Diagnostics, na pessoa do Sr.
Mareei Lincoln L. Duarte, pela cesso dos "kits" TECRA Salmonella VIA e
TECRA Salmonella UNIQUE.
Alexandra S. Papasidero, estagiria da FUNDAP, pela ajuda na obteno
das amostras para anlise, pelo incentivo e tima convivncia diria
todos os funcionrios da Seo de Meios de cultura do Instituto Adolfo
Lutz, em especial a Julia Taeko U. Yoshida, pelo fornecimento de meios de
cultura.
funcionria Ana 1. Tavechio do Setor de Enterobactrias da Seo de
Bacteriologia Mdica do Instituto Adolfo Lutz pela sorotipagem das cepas de
Salmonella.
Aos Profs. Drs. Mariza Landgraf, Suzana Marta Issay Saad e Jos Paes de
Almeida Nogueira Pinto, pelas anlises crticas e sugestes feitas no exame
de qualificao.
s Bibliotecrias Leila e Adriana, pelo auxlio na reviso das referncias
bibliogrficas
Aos funcionrios da Biblioteca do Instituto de Qumica da Universidade de
So Paulo e do Instituto Adolfo Lutz.
s secretrias Angela, Mnica e Izabel pelos servios prestados.
Bene, Elaine e Jorge da secretaria de Ps-graduao pela ateno
prestada.
Ao Marcos pelo auxlio na formatao final da dissertao.
A todos que mesmo indiretamente colaboraram com este trabalho.
SUMRIO
pgina
1. Introduo 1
2. Objetivo 13
3. Materiais e Mtodos 14
3.1. Amostra para anlise 14
3.2. Anlises microbiolgicas 14
3.2.1. Metodologia convencional de cultura 15
3.2.2. TECRA Salmonella ViA 17
3.2.3. TECRA Salmonella UNIQUE. 22
3.3. Avaliao dos Resultados 27
4. Resultados e Discusso 28
5. Concluses 41
6. Referncias Bibliogrficas 42
7. Resumo 48
8. Abstract. 49
FIGURAS
pgina
Figura 1. Foto do "kit" TECRA Salmonella VIA. 17
Figura 2. Foto do carto comparativo de cores do "kit" TECRA Salmonella
ViA 21
Figura 3. Foto do "kit" TECRA Salmonella UNIQUE. 22
Figura 4. Foto do basto do "kir TECRA Salmonella UNIQUE. 25
Figura 5. Fluxograma descritivo das etapas empregadas nos trs mtodos
de deteco de Salmonella 26
Figura 6. Quadro comparativo do tempo necessrio para desenvolvimento
dos trs mtodos para deteco de Salmonella em alimentos.... .40
TABELAS
pgina
Tabela 1. Sorotipos de Salmonella detectados nas amostras de
alimentos 28
Tabela 2. Desempenho dos procedimentos de cultura convencional, TECRA
Salmonella VIA e TECRA Salmonella UNI QUE na deteco de
Salmonella em 45 amostras positivas de alimentos 29
Tabela 3. Nmero de amostras positivas confirmadas e negativas para
Salmonella pelo mtodo convencional e pelo sistema TECRA
Salmonella ViA 30
Tabela 4. Nmero de amostras positivas confirmadas e negativas para
Salmonella pelo mtodo convencional e pelo sistema TECRA
Salmonella UNIQUE. 31
Tabela 5. Nmero de amostras positivas e negativas para Salmonella pelo
sistema TECRA Salmonella UNI QUE e pelo sistema TECRA
Salmonella ViA 32
Tabela 6. Positividade para Salmonella em alimentos de acordo com o
mtodo analtico 34
1
1- INTRODUO
Caractersticas gerais de Salmonella
o gnero Salmonella pertence famlia Enterobacteriaceae e
consiste de bacilos Gram-negativos, anaerbios facultativos, no formadores
de endosporos. Quando mveis possuem flagelos peritrquios. As colnias
tm geralmente 2 a 4 mm de dimetro, so oxidase negativa, crescem em
meios de cultura artificiais, e fermentam a glicose com formao de cido e
gs. As bactrias do gnero Salmonella so capazes de produzir gs
sulfdrico detectvel em gar Trplice Acar Ferro Usina, utilizam citrato,
reduzem nitrato a nitrito e a maioria descarboxila Iisina e ornitina. No
produzem urease e indol, e no desaminam os aminocidos fenilalanina e
triptofano (Le MINOR, 1984).
O gnero Salmonella consiste de apenas duas espcies: S. enterica,
dividida em seis subespcies: (enterica, salamae, arizonae, diarizonae,
houtenae, e indica) e S. bongori. Essas duas espcies contm atualmente
2501 sorotipos. Para fins de designao desses sorotipos, costuma-se
escrever o genero Salmonella em itlico acrescido apenas do sorotipo em
letras romanas, iniciando com letra maiscula. Por exemplo: Salmonella
enterica subsp. enterica sorotipo Enteritidis costuma ser escrito apenas
como Salmonella Enteritidis (ou S. Enteritidis).
Esta nomenclatura reflete a taxonomia atual de Salmonella (POPOFF et
aI. ,2001 ).2
Para propsitos epidemiolgicos, as salmonelas podem ser
classificadas em 3 grupos:
Sorotipos adaptados ao homem, como S. Typhi, S. Paratyphi A, S.
Paratyphi B. e S. Paratyphi C. Este grupo inclui os agentes das febres
tifide e paratifide, que so as doenas mais severas causadas por
Salmonella. A febre tifide caracteriza-se por um perodo de
incubao longo, desenvolvimento de altas temperaturas corporais e
alta taxa de mortalidade se no houver tratamento. S. Typhi pode ser
isolada do sangue e algumas vezes da urina de pacientes. A
sindrome paratifide mais branda que a tifide. Estes sorotipos
usualmente no so patognicos para os animais.
Sorotipos altamente adaptados a animais, como S. Gallinarum (aves),
S. Dublin (gado bovino), S. Abortus-equi (cavalos), S. Abortus-ovis
(ovelha) e S. Choleraesuis (suinos).
Sorotipos ubquos, como S. Typhimurium, que afetam tanto o homem
quanto os animais, causando infeces gastrointestinais de
severidade varivel, mas menos severas que a febre entrica.
Incluem a maioria dos sorotipos transmitidos por alimentos (VARNAM
E EVANS, 1991).
Salmonella pode colonizar ou infectar uma grande variedade de
animais domsticos e de criao para abate. Roedores, pragas e rpteis
podem atuar como reservatrios e vetores de Salmonella.
As salmoneloses em animais e humanos podem ser uma doena de
prognstico leve com sintomas somente gastrointestinais, como tambm
uma doena severa e comprometedora. Cada espcie animal responde
diferentemente aos sorotipos especficos, e tambm a sintomatologia da
salmonelose varia de acordo com a espcie infectada, o sorotipo infectante,
e as condies gerais do animal infectado (ex: idade e fatores de sade)
(PROST e RIEMANN, 1967, JAY, 2000).
3
Segundo D' Aoust et ai, 2002, as salmoneloses humanas podem
ocorrer como uma de trs sndromes:
1 - Bacteremia ou septicemia por Salmonella no tifide, que pode
resultar da infeco com alguns sorotipos de Salmonella. Estas infeces
srias esto associadas com somente poucos sorotipos (ex: S. Enteritidis, S.
Dublin, S. Choleraesuis, e S. Paratyphi). As salmoneloses sistmicas podem
tornar-se doenas severas com sequei as e morte e os sobreviventes podem
tornar-se portadores crnicos assintomticos da bactria.
2 - Febre tifide verdadeira (febre entrica) que causada por
infeco com Salmonella Typhi. A taxa de mortalidade pode exceder 10%
em pacientes sem tratamento, mas so inferiores a 1% em pacientes
tratados.
Os sobreviventes podem tornar-se portadores crnicos assintomticos.
3 - Gastroenterite (ou enterocolite) por Salmonella, que pode ser
causada por alguns dos vrios sorotipos de Salmonella exceto S. Typhi. A
doena geralmente auto-limitante com diarria prolongada mas de
severidade moderada.
Alm disso, tm importncia os portadores assintomticos, uma vez
que a veiculao de Salmonella pelo homem aps uma infeco com
sorotipos adaptados a humanos um fenmeno comum. A excreo
assintomtica pode continuar por semanas, meses ou anos, usualmente
pelas fezes, mas tambm pela via urinria.
Entre os 2501 sorotipos de Salmonella j descritos somente uma
frao deles est relacionada com doenas em humanos. Em determinados
perodos de tempo, considerando-se algumas dcadas, observou-se que
havia prevalncia de apenas 2 a 3 sorotipos nas infeces humanas
(VARNAM e EVANS, 1991, POPOFF e LE MINOR, 1997).
4
Levantamentos realizados nos Estados Unidos, onde os surtos so
notificados de forma mais sistematizada, revelam que, no periodo de 1988 a
1992,ocorreram 549 surtos por Salmonella, correspondendo a 69% do total
de surtos de etiologia conhecida. Destes, 60% foram causados por S.
Enteritidis, o que demonstra a importncia deste sorotipo no perodo
considerado (BEAN et al.,1997).
Outro dado importante a capacidade de S. Enteritidis causar
infeces extra-intestinais, inclusive com casos fatais. Nos pases da
Europa, os dados existentes revelam situao semelhante descrita nos
Estados Unidos (VARNAM e EVANS, 1991; FANTASIA e FILETICI, 1994).
Apesar da existncia de sistemas de notificao de doenas alimentares nos
pases citados, alm de Japo e Canad, sabe-se que os dados existentes
no retratam a totalidade de surtos com esta etiologia (NOTERMANS e
BORGDORFF, 1997). No Brasil, especificamente em So Paulo, segundo
dados do Centro de Vigilncia Epidemiolgica da Secretaria de Estado da
Sade - So Paulo (CVE/SES-SP), foram notificados 27 surtos de
Salmonella com 602 casos, correspondendo a 13,7% e 12,2%,
respectivamente, do total de surtos e casos notificados de Doenas
Transmitidas por Alimentos no ano de 2000 (Brasil 2002).
O problema das salmoneloses preocupa a Sade Pblica em nvel
internacional, pois Salmonella uma bactria com ampla distribuio
geogrfica, afetando tambm a importao e exportao de alimentos.
Apesar de Salmonella no possuir esporos e, portanto, apresentar
termosensibilidade de clulas bacterianas vegetativas, alm de outras
caractersticas como incapacidade de sobreviver por longo tempo em pH
cidos, a ocorrncia de surtos por Salmonella freqente. As causas so
vrias, em especial sua capacidade de disseminao, relacionada com
possibilidades de contaminao cruzada em ambiente de preparo de
alimentos, com conseqente multiplicao, dependendo da temperatura e
tempo decorrido entre preparo e consumo de alimentos (VARNAM e
EVANS, 1991).
5
Mtodos para o isolamento laboratorial de Salmonella
Enquanto amostras clnicas, como por exemplo, fezes,
frequentemente contm concentraes elevadas de Salmonella e podem ser
semeadas diretamente em meios altamente seletivos e diferenciais, isto no
ocorre com amostras de alimentos, sendo necessrio seguir-se esquemas
de pr-enriquecimento e enriquecimento seletivo da amostra (ZIPRIN, 1994).
Pr-enriquecimento corresponde a um perodo de crescimento em um
caldo no seletivo como gua peptonada tamponada ou caldo tripticase
soja. O objetivo favorecer a recuperao e multiplicao das bactrias
viveis presentes no alimento. Essa etapa recomendada para alimentos
que passaram por tratamentos que possam ter causado danos mas no a
morte das clulas de Salmonella. Nesta situao, esta etapa permite que as
clulas se recuperem e se multipliquem. Algumas vezes, o pr-
enriquecimento permite diluir os inibidores de crescimento, como os aditivos
ou outros componentes antimicrobianos presentes nos alimentos.
Enriquecimento seletivo um processo no qual uma amostra
contendo vrias espcies bacterianas diferentes cultivada em condies
que favorecem o crescimento de um tipo particular de bactria. Os caldos
tetrationato, Rappaport-Vassiliadis e selenito-cistina so meios de
enriquecimento seletivo para Salmonella (FLOWERS et aI., 1992)
LE MINOR (1984) recomenda especificamente 3 meios de
enriquecimento seletivo: o meio tetrationato de Muller, o caldo tetrationato de
Muller modificado por Kauffmann, o qual contm bile e verde brilhante, e o
caldo selenito-cistina de Leifson. Uma outra formulao de caldo de
enriquecimento seletivo utilizada o caldo Rappaport-Vassiliadis
(VASSILlADIS et al,1983, Van SCHOTHORST & RENAUD 1983), que usa
verde malaquita e cloreto de magnsio como agentes seletivos, com maior
sensibilidade que o tetrationato verde brilhante de Muller-Kauffmann.
6
Na etapa seguinte da pesquisa de Salmonella em alimentos os caldos
de enriquecimento seletivo so estriados em placas contendo gar seletivo-
diferencial.
Caso colnias tpicas de Salmonella sejam observadas aps uma
incubao de 18 a 24 h, necessrio examinar as suas caractersticas
bioqumicas e sorolgicas.
Os meios seletivos diferenciais utilizados para o isolamento de
Salmonella so numerosos e incluem: gar Xilose Lisina Deoxicolato (XLD),
gar Salmonella-Shigella (SS), gar Verde Brilhante (BGA), gar Bismuto-
Sulfito (BSA), gar Hektoen-enterico (HE), gar MacConkey, gar Levine
Eosina Azul de metileno (EMB), entre outros.
A confirmao bioqumica das colnias suspeitas de Salmonella nos
meios seletivos diferenciais feita pela inoculao de colnias selecionadas
em gar Trplice Acar Ferro, gar Usina Ferro e caldo uria. Testes
adicionais incluem fermentao de arabinose, utilizao de citrato,
fermentao de ramnose e de trealose, e outros.
A sorologia realizada aps a confirmao bioqumica, utilizando-se
os anti soros polivalentes somtico (O) e flagelar (H) para Salmonella. A
reao de aglutinao frente aos antisoros feita em lmina ou placa de
vidro.
Estes mtodos tm sensibilidade para detectar uma clula vivel de
Salmonella por amostra analisada, mas a presena de outros
microrganismos que podem competir com a Salmonella durante a etapa de
enriquecimento podem impedir a sua deteco (BECKERS et ai ,1987).
O aumento no nmero de casos de infeco por Salmonella tem
consequncias sociais e econmicas e evidenciam a necessidade de
medidas preventivas (HUMPHREY, 1988; SOCKETI, 1991). Embora o
controle da salmonelose requeira aes em todos os nveis da cadeia de
produo de alimentos pela aplicao do sistema HACCP e do uso de Boas
Prticas de Fabricao, a anlise microbiolgica de produtos envolvendo
testes seguros com amostragens estatsticamente significantes e mtodos
analticos sensveis so tambm importantes (D' AOUST, 2001).
7
isolamento de Salmonella por mtodos convencionais necessita um
perodo de pelo menos 5 dias para a obteno de resultados positivos, e o
trabalho laboratorial exigido pelas tcnicas que envolvem as etapas de pr
enriquecimento, enriquecimento seletivo, semeadura em placas,
caracterizao bioqumica e sorologia grande (FLOWERS et al.,1992,
ANDREWS et al.,1995).
Existe a necessidade da utilizao de testes para deteco de
Salmonella que propiciem resultados mais rpidos, com uma sensibilidade
similar ou maior que a dos mtodos convencionais.
Segundo FRANCO, 1999 os procedimentos alternativos para detectar
elou isolar Salmonella de alimentos podem ser agrupados em 3 grandes
grupos: I - Tcnicas Imunolgicas, 11 - Tcnicas baseadas na quantificao
do metabolismo e 111 - Tcnicas moleculares
I - Tcnicas Imunolgicas:
I - a Tcnicas imunoenzimticas
Entre os vrios tipos de testes imunoenzimticos existentes, o tipo
no competitivo (tipo sanduche) o mais empregado nos sistemas de
triagem de microrganismos patognicos em alimentos. Neste tipo de
mtodo, os patgenos investigados, se presentes no produto em teste, so
capturados por anticorpos especficos adsorvidos superfcie de uma matriz
slida, que dependendo do sistema, podem ser esferas de poliestireno,
placas de microtitulao, partculas metlicas, papel e outras. Na etapa
seguinte, o complexo antgeno-anticorpo formado reage com o conjugado,
preparado atravs da ligao do anticorpo especfico para o microrganismo
a ser detectado e uma enzima cromognica. As enzimas mais utilizadas
nesses testes so a fosfatase alcalina e peroxidase. Em seguida o
sanduche formado reage com o substrato da enzima cromognica,
resultando em desenvolvimento de cor. Substratos f1uorognicos tambm
podem ser empregados.
8
Os testes imunoenzimticos para deteco rpida de Salmonella so
muito empregados por apresentarem diversas vantagens: simplicidade,
rapidez, sensibilidade, especificidade e convenincia como mtodo de
triagem. Em princpio, possvel produzir anticorpos especficos para
qualquer sorotipo de Salmonella.
Atualmente, existe no mercado mundial um nmero bastante grande
de sistemas comerciais baseados em tcnicas imunoenzimticas, grande
parte deles disponvel tambm no mercado brasileiro.
I - b Tcnicas de imunocaptura
Nessas tcnicas, as clulas de Salmonella so removidas da
suspenso em teste atravs da captura por anticorpos especficos presentes
na superfcie de uma fase slida. A fase slida mais utilizada composta por
partculas metlicas, razo pela qual essas tcnicas so tambm conhecidas
pela denominao de tcnicas de imunoseparao magntica. Uma vez
obtida a ligao entre antgenos bacterianos e anticorpos, o sistema ento
colocado em um suporte que contm um im que atrai as partculas
metlicas. O material no ligado removido usando uma pipeta, restando
um concentrado de Salmonella. Esse material concentrado pode ento ser
utilizado para novo enriquecimento ou para semeadura em placas, que ficam
muito mais eficientes pois a microbiota acompanhante de interferncia foi,
em grande parte, removida. Esta tcnica, quando aplicada diretamente nos
alimentos, pode reduzir ou mesmo substituir a etapa de pr-enriquecimento
sempre necessria quando se pretende investigar a presena de Salmonella
em alimentos pelos mtodos convencionais.
9
I - c Tcnicas de imunoimobilizao
Nessa tcnica, as salmonelas mveis cultivadas em meio semi-slido
tem sua mobilidade bloqueada pela adio de anticorpos flagelares
especficos.
H formao de uma banda de precipitao visvel na interface
anticorpolbactria. Essa tcnica constitue a base de um sistema comercial
bastante utilizado em diversos pases para pesquisa de Salmonella. Esse
sistema constitui-se em um conjunto de duas pequenas cmaras plsticas
interligadas formando um L. A cmara horizontal contm um caldo de
enriquecimento seletivo para Salmonella e a cmara vertical contm um
meio semi-slido, na superfcie do qual se adiciona anti soro flagelar
polivalente.
Se o alimento estiver contaminado com Salmonella, haver em 24
horas a formao de uma banda de imunoprecipitao em forma de U no
alto da cmara vertical. Esse teste tambm um mtodo de triagem,
devendo toda a amostra positiva ser submetida aos testes convencionais
para pesquisa de Salmonella em alimentos.
1- d Tcnicas de aglutinao de ltex
Essas tcnicas so baseadas na aglutinao de partculas de ltex
sensibilizadas com anticorpos especficos para Salmonella.
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11 - Quantificao do Metabolismo
II - a Condutncia
As tcnicas de Impedncia-condutncia so baseadas na propriedade
que os microrganismos tem de alterar a transmisso da corrente eltrica
atravs de um meio de cultura. Essas alteraes ocorrem como
consequncia da mudana da composio qumica desse meio devido
atividade metablica dos microrganismos presentes. Durante a multiplicao
microbiana, molculas grandes (protenas, lipdeos, carboidratos) so
transformadas em molculas menores (aminocidos, cidos graxos, cidos
orgnicos), qumicamente mais ativas. A formao e acmulo desses
metablitos finais resultam em alteraes mensurveis na condutncia e na
impedncia eltrica do meio. Existem no mercado vrios aparelhos que
fazem essas determinaes, inclusive de Salmonella, empregando meios de
cultura especficos e seletivos para esses microrganismos.
II - b Radiometria
baseado na produo do 14C02 a partir de um substrato marcado
com 14C, como resultado do metabolismo bacteriano. STEWART et aI.,
1980, usaram esta metodologia para verificar a inibio especfica da
fermentao de 14C dulcitol na presena de antisoro polivalente H. Aps um
enriquecimento seletivo, as culturas foram inoculadas em duplicata no meio
de dulcitol, um contendo soro anti-salmonela. Uma grande reduo da
liberao de 14C02 devido a presena do antisoro era indicativa da presena
de salmonela. Em 58 amostras de alimentos testadas houve uma
concordncia geral de 91 % entre os resultados de positividade obtidos pela
radiometria e o mtodo convencional de cultura. Os autores verificaram que
esse mtodo era de simples realizao e o custo por amostra era
comparvel com o mtodo convencional de cultura. Quando culturas puras
eram usadas para determinar a especificidade da tcnica, verificou-se que
50% das enterobactrias davam resultados falso positivos enquanto cepas
de S. arizonae deram resultados falso negativo (KONING et aI., 1982;
STEWART et al.,1980).
11
li - Tcnicas Moleculares
Entre as tcnicas baseadas em biologia molecular, as mais
conhecidas so aquelas fundamentadas em reaes de hibridizao
DNAlDNA ou DNAlRNA, e de peR (reao de polimerase em cadeia).
111 - a Hibridizao
Para usar as tcnicas de hibridizao, necessrio submeter o
microrganismo a um tratamento em que seu material gentico liberado da
clula e separado em duas fitas simples. Em seguida adiciona-se as
"sondas", que so fragmentos especficos de DNA ou RNA para o patgeno
investigado. Essas sondas so marcadas com enzimas, normalmente
cromognicas. Quando h hibridizao com a sonda, h desenvolvimento de
cor, e portanto, a presena do microrganismo investigado detectada.
Em estudos de validao para alimentos, o mtodo DNA hibridizao
tem demonstrado ser to efetivo quanto o mtodo de cultura convencional
(CURIALE et al.,1990
a
; MOZOLA et al.,1991) e ser mais sensvel do que o
mesmo para produtos cmeos e aves (ROSE et aI., 1991).
lU - b PCR
A tcnica de PCR muito utilizada em microbiologia para
amplificao do material gentico de microrganismos.
Com o surgimento de vrios "kits" comerciais, que tomaram essa
tcnica mais acessvel, ela deixou de ser empregada somente em
laboratrios de pesquisa para ser utilizada atualmente em laboratrios de
controle de qualidade.
Os "kits" contm todos os reagentes necessrios. A reao de
amplificao feita em tubos, e posteriormente realiza-se uma eletroforese
para verificao da identidade das bandas de DNA obtidas, utilizando-se os
padres adequados (FRANCO, 1999).
12
Aplicao dos mtodos rpidos de deteco de Salmonella
De todos os mtodos rpidos anteriormente citados, os baseados em
reaes antgeno-anticorpo so os mais utilizados como mtodos de triagem
de amostras de alimentos positivas ou negativas para Salmonella. Isso se
deve sua maior simplicidade de utilizao e ao seu menor custo, quando
comparados aos demais mtodos rpidos disponveis (FRANCO, 1999).
Dos testes imunoenzimticos comercializados no Brasil, os "kits"
TECRA Salmonella VIA e TECRA Salmonella UNIQUE, fabricados pela
TECRA Diagnostics, Rosewille, NSW, Austrlia, e comercializados no pas
pela Madasa do Brasil Ltda., so os mais conhecidos.
O "kit" TECRA Salmonella VIA um teste imunoenzimtico com
enzima ligada, na configurao sanduche. Anticorpos especficos, com alta
afinidade para Salmone/la, revestem a superfcie das placas "Removawell"
que acompanham o "kit". Os antgenos de Salmone/la quando presentes na
amostra so capturados por esses anticorpos. Na etapa seguinte de
lavagem, todos os materiais da amostra no capturados so retirados. Em
seguida, adiciona-se um conjugado (anticorpos especficos para Salmone/la
marcados com enzima cromognica) formando-se um sanduche. A
presena de Salmone/la indicada pelo desenvolvimento de cor verde,
decorrente da ao da enzima do sanduche sobre o substrato. A ausncia
de cor verde indica reao negativa para Salmonella.
O "kit" TECRA Salmonella UNIQUE combina, em um nico mdulo
plstico, imunoenriquecimento com imunoensaio, utilizando como base fixa
um basto recoberto com anticorpos policlonais especficos para Salmonella
mveis e imveis. Todos os reagentes do teste vem previamente distribudos
nos tubos que formam o "kit".
Apesar da utilizao desses "kits" comerciais ser aprovada pela
Association of Official Analytical Chemists (AOAC), o mercado brasileiro
necessita de dados locais sobre a sua eficincia e convenincia de uso,
necessrios para embasar sua utilizao de forma rotineira no pas.
13
2 -OBJETIVO
o presente trabalho teve como objetivo avaliar o desempenho dos
imunoensaios rpidos TECRA Salmonella VIA e TECRA Salmonella
UNIQUE na deteco de Salmonella em 200 amostras de alimentos de
origem animal, comparando os resultados com aqueles obtidos atravs do
mtodo convencional de cultura empregado na seo de Microbiologia de
Alimentos do Instituto Adolfo Lutz de So Paulo, da Secretaria de Estado da
Sade.
14
3 - MATERIAIS E MTODOS
3.1. Amostras para anlise
Foram analisadas duzentas amostras de alimentos crus de origem
animal, parte das quais enviadas ao Instituto Adolfo Lutz para anlise
microbiolgica e parte adquirida em feiras livres da cidade de So Paulo
Capital. As amostras foram as seguintes:
Carne bovina: 23, carne suna: 1, linguia crua: 18, tripa bovina: 12, ostra:
4, kibe cru: 1, hamburguer cru: 3, carcaa de frango: 10, peixe: 7,
salsicha: 3, peito de frango: 10, moela de frango: 10, asa de peru: 1, asa
de frango: 4, ps de galinha: 1, figado de frango: 9, corao de frango:
11, coxa e ante coxa de frango: 4, estmago bovino e suno (dobradinha):
11, cabea e pescoo de frango: 4, vsceras bovina (rim, pulmo, fgado,
bao): 26, vsceras suna (figado, rim): 4, lngua de boi: 3, lngua de
suno: 2, corao de suno: 5, corao de boi: 4, sangue de suno: 2, rabo
de boi: 2, costela de cabrito: 1, toucinho: 2, banha de carneiro: 1,
presunto cru: 1.
As amostras foram transportadas e mantidas sob refrigerao at
serem analisadas (aproximadamente uma a duas horas aps a chegada ao
laboratrio).
3.2. Anlises microbiolgicas:
As anlises foram realizadas utilizando-se simultaneamente o mtodo
convencional de cultura, e os sistemas rpidos TECRA Salmonella VIA e
TECRA Salmonella UNIQUE, ambos da TECRA Diagnostics, Roseville
NSW, Australia. Os "kits" TECRA foram empregados de acordo com as
recomendaes do fabricante, descritas em 3.2.2 e 3.2.3.
O mtodo convencional de cultura empregado foi aquele utilizado no
Laboratrio de Microbiologia de Alimentos do Instituto Adolfo Lutz, So
Paulo, SP, Brasil, descrito em 3.2.1.
15
3.2.1 Metodologia convencional de cultura
A metodologia utilizada no Laboratrio de Microbiologia de Alimentos
do Instituto Adolfo Lutz para a deteco de Salmonella em alimentos
compreende as seguintes etapas:
Pr-enriquecimento: 25 9 de amostra foram homogeneizadas com 225 mL
de APT (gua peptonada tamponada a 1%) empregando-se um
homogeneizador de pisto (stomacher 400 "Seward", Londres). A mistura foi
incubada a 35e por 18 a 24 horas.
Para as carcaas de frango, foi utilizado enxgue das aves com 225 ml de
gua peptonada tamponada a 1%, incubada a 35e por 18 a 24 horas.
Enriquecimento seletivo: 1,5 ml do caldo de pr-enriquecimento foi
transferido para tubo contendo 20 ml de caldo selenito-cistina (Se),
formulado, com incubao a 35e por 48 h. 0,1 ml do caldo de pr-
enriquecimento foi transferido tambm para 9,9 ml de caldo Rappaport-
Vassiliadis (RV) (Oxoid eM 669), distribudo em tubos de ensaio de 16x160
mm com incubao a 42e por 48 horas.
A formulao do meio selenito-cistina a seguinte: 5g de triptona, 4g
de lactose, 10g de Na
2
HP04, 4g de selenito de sdio, 1000 ml de gua
destilada, 100 ml de soluo de cistina 1% estril. Soluo de cistina a 1%
(1 9 de cistina, 80 ml de gua destilada, 20 ml de NaOH 1N filtrados em
membrana esterilizada de 0,22 J.l de dimetro).
Semeadura em meios seletivos: os caldos de enriquecimento seletivo se
e RV foram estriados na superfcie de placas contendo gar sulfito de
bismuto segundo Wilson-Blair (BSA) (Merck 105418), gar Salmonella-
Shigella (SS) (Diagnostics Pasteur 64514) e gar verde brilhante (BG)
(Merck 107232). As placas de agar SS e BG foram incubadas a 35C por 18-
24h e as de gar BSA a 35e por 48h.
16
Caracterizao presuntiva das colnias suspeitas de Salmonella:
Foram consideradas colnias suspeitas de Salmonella aquelas que
apresentaram as seguintes caractersticas:
gar B5A: colnias pretas ou marrons, com ou sem brilho metlico, com
halo escuro ao redor;
gar 55: colnias pequenas, incolores, transparentes e com ou sem centro
negro;
gar BG: colnias rosa plido, transparentes, com halo vermelho;
Colnias com essas caractersticas foram transferidas com agulha de nquel
cromo para tubos contendo o meio de IAL (PESSOA e SILVA, 1972 e 1974)
e incubadas a 35C por 18 a 24h. Foram consideradas colnias presuntivas
de Salmonella as que apresentaram as seguintes caractersticas
bioqumicas nesse meio: reao positiva de descarboxilao de lisina,
produo de H2S, reao negativa de indol, fermentao de glicose, com ou
sem produo de gs e sacarose negativa.
50roaglutinao e testes bioqumicos :
As colnias que apresentaram reaes caractersticas de Salmonella
no meio de IAL foram testadas frente aos anti soros polivalentes "O" e "H",
atravs do teste de soroaglutinao em lmina, empregando-se anti soros
polivalentes flagelar (H) e somtico (O) produzidos na Seo de
Bacteriologia do Instituto Adolfo Lutz , So Paulo, SP.
Caracterizadas como Salmonella, as cepas foram enviadas para o Setor de
Enterobactrias da Seo de Bacteriologia Mdica do Instituto Adolfo Lutz,
So Paulo, SP. onde foram sorotipadas segundo metodologia descrita por
POPOFF e LE MINOR, 1997.
Interpretao de Resultados
Somente as amostras nas quais a presena de Salmonella foi
confirmada pela sorotipagem completa foram consideradas positivas.
17
3.2.2 TECRA Salmonella VIA
a) Materiais e reagentes:
o "kit" TECRA Salmonella VIA composto pelos seguintes reagentes:
dispositivos plsticos (Removawell) contendo poos cujo fundo revestido
com os anticorpos anti-Salmonella, soluo concentrada de lavagem,
controle positivo, diluente do controle, conjugado, diluente do conjugado,
substrato, diluente do substrato, soluo "stop", suporte para os dispositivos
plsticos, manual de instrues e carto de cor, conforme indicado na Fig. 1.
Figura 1: Foto do "kit" TEGRA Salmonella VIA18
b) Preparao dos materiais e reagentes:
A preparao dos reagentes foi feita de acordo com a orientao do
fabricante.
Soluo de Lavagem: A soluo concentrada de lavagem foi diluda
em 2 litros de gua destilada ou deionizada e estocada a 4C. Para a
sua utilizao empregou-se uma garrafa plstica com bico
dispensador (pisseta).
Controle Positivo: O controle positivo foi diluido com 3 ml do diluente
do controle que acompanha o "kit".
Controle Negativo: O diluente restante da reconstituio do controle
positivo foi usado como controle negativo.
Conjugado: Cada "kit" contm dois frascos de conjugado e dois de
diluente para o conjugado. O contedo de um dos frascos de diluente
foi adicionado ao frasco do conjugado, mantendo a mistura em
repouso em temperatura ambiente at completa dissoluo (o
contedo do frasco no deve ser agitado). A data de reconstituio foi
registrada no rtulo, sendo 1 ms o prazo de utilizao aps a
reconstituio.
Substrato: O substrato foi reconstituido com o diluente
correspondente, assegurando-se que o contedo tenha se dissolvido
completamente. O substrato reconstitudo deve apresentar colorao
verde clara.
A Soluo Stop j vem pronta pronta para o uso.
Para o uso, todos os componentes do "Kit" estavam em temperatura
ambiente (20 a 25C).19
c) Realizao do teste
o imunoensaio foi realizado seguindo-se o protocolo de
procedimentos descrito no manual de mtodos, indicado para alimentos crus
com alta carga de microrganismos (protocolo MS 2296 1/99 do TECRA
Salmonella VIA). Foram realizadas as seguintes etapas:
Pr-enriquecimento: 25g da amostra foram homogeneizadas com
225ml de gua peptonada tamponada a 1%, utilizando-se um
homogeneizador de pisto. A mistura foi incubada a 35-37C por 18 a
22 horas.
Enriquecimento seletivo: 0,1 ml do caldo de pr enriquecimento foi
transferido para um tubo contendo 9,9ml de caldo Rappaport-
Vassiliadis (RV) e incubado a 42C por 16 a 20 horas.
Ps-enriquecimento: 1ml do caldo Rappaport-Vassiliadis foi
transferido para tubo contendo 10ml de caldo M e incubado a 35-37C
por 6 a 8 horas.
Aqueceu-se 1ml da cultura do caldo M por 15 minutos em um banho
de gua fervente, esfriando-se em seguida temperatura ambiente. O
restante do caldo M (no aquecido), bem como as culturas de
enriquecimento seletivo, foram refrigeradas para serem usadas
posteriormente para a confirmao dos resultados positivos obtidos no "kit",
atravs dos procedimentos da metodologia convencional de cultura.
Os dispositivos plsticos contendo os poos revestidos de anticorpos
foram removidos do envelope lacrado, tomando-se um poo para cada
amostra, um para o controle positivo e um para o controle negativo. Os
dispositivos foram pressionados firmemente no suporte que acompanha o
"kit".
Utilizando-se uma pipeta automtica, pipetou-se alquotas de 200
dos controles positivo e negativo e das amostras no Caldo-M em poos
individuais, anotando-se a posio de cada amostra em uma folha de
registro. A placa foi coberta com um filme plstico e incubada por 30 minutos
a 35-37C.
20
Em seguida os poos foram esvaziados e submetidos a trs lavagens
consecutivas, com a soluo de lavagem.
O lquido residual foi removido por inverso da placa, com absoro
do lquido em papel toalha.
Em seguida adicionou-se a cada poo 200 do conjugado, e cobriu-
se a placa com filme plstico, que foi incubada por 30 minutos a 35-37C.
Os poos foram esvaziados e lavados 4 vezes, usando a sequncia j
descrita.
A cada poo foram adicionados 200 111 de Substrato, incubando-se a
20-25C (temperatura ambiente) por 10 minutos.
Os poos foram levemente agitados antes de se proceder a. leitura
dos resultados.
A soluo Stop no foi utilizada pois ela s necessria quando a
placa no pode ser lida imediatamente.
21
d) Leitura e Interpretao dos resultados:
o desenvolvimento de cor verde foi observada visualmente,
comparando-se com o carto de cor de referncia, onde os painis
1(branco) e 2 (verde clarssimo) indicam resultado negativo e os painis 3, 4
e 5, com intensidades crescentes da cor verde, indicam resultados
presuntivos positivos (Figura 2).
Card 1 : Color comparator for TECRA
SarmoneHa Visual tmmunoassays.
Negative Positi"e
. . .
Color equivalent
to Positive Control
00
Figura 2: Foto do carto comparativo de cores do "kit" TECRA
Salmonella VIA
Seguindo as instrues do fabricante, todos os resultados presuntivos
positivos foram confirmados por estriamento do Caldo M no aquecido na
superfcie de placas com gar seletivos SS, BG e BSA. Aps a incubao,
as colnias suspeitas de Salmonella foram confirmadas atravs de testes
bioqumicas, sorolgicos e sorotipagem, conforme descrito em 3.2.1.
22
3.2.3 - TECRA Salmonella UNIQUE
a) Materiais e reagentes:
o "kit" TECRA Salmonella UNIQUE consiste de mdulos plsticos
formados por 6 tubos numerados e um basto plstico. Os tubos de 1 a 6
contm soluo tampo, soluo de lavagem, caldo de enriquecimento,
conjugado, soluo de lavagem e substrato, respectivamente. Os bastes
recobertos com os anticorpos vem acondicionados em envelope lacrado. O
"kit" contm ainda um manual de instrues, o carto de cor de referncia e
tampas plsticas para fechar os tubos. A Fig. 3 mostra os componentes do
"kit".
Figura 3: Foto do "kit" TECRA Salmonella UNIQUE
23
b) Preparao dos materiais e reagentes:
Esse "kif vem pronto para uso. O pr enriquecimento das amostras
na anlise foi feito em gua peptonada tamponada modificada, preparada
atravs da adio de 0,74g de Na
2
HP0
4
(anidro), 0,32g de KH2P0
4
. e 12,5
ml de TECRATM Supplement-MBPWSP250 212,5 ml de APT. Aps a
homogeneizao, a soluo foi autoclavada por 15 minutos a 120C. Aps o
esfriamento do meio, adicionou-se 2,25 ml de soluo de Imbentin AGS/35
(fornecido pela Madasa no Brasil Ltda.), autoclavada separadamente a
100C por 15 minutos e armazenada abaixo de 10C. No momento de uso, a
soluo foi levada temperatura ambiente (20 a 25C).
c) Realizao do teste:
Os testes foram realizados conforme recomendao do fabricante
para alimentos crus com alta carga microbiana seguindo o protocolo TECRA
MS 2327 9/98. Antes do inicio do uso do "kit", efetuou-se o pr
enriquecimento, de 25 g da amostra em 225 ml de APT modificada. A
homogeneizao foi feita empregando-se um stomacher. A mistura foi
incubada a 42C por 16 a 20 horas.
Iniciou-se o teste transferindo-se 4ml dessa cultura ao tubo 1 do mdulo. Um
basto foi inserido neste tubo, e o conjunto foi incubado a 35C por 20
minutos. Nessa etapa, os anticorpos purificados de alta especificidade que
revestem a superfcie do basto capturam seletivamente qualquer
Salmonella presente no meio de enriquecimento.
O basto foi ento transferido para o tubo 2, fechando-se o tubo 1
com uma tampa plstica.
O mdulo foi invertido para garantir um bom contato do contedo do
tubo 2 com o basto, evitando-se a formao de bolhas de ar.
O basto foi ento transferido para o tubo 3, que contm o caldo M,
incubando-se o mdulo a 35-37C por 5 horas, correspondente ao perodo
de replicao da Salmonella capturada no basto.
24
Em seguida o basto foi transferido para o tubo 4, que contm o
conjugado, formado por uma enzima cromognica ligada a um anticorpo
especfico para Salmonella. O mdulo foi incubado a 35-37 C por 30
minutos.
No passo seguinte, o basto foi transferido para o tubo 5, que contm
a soluo de lavagem. Foram feitas 2 inverses do mdulo para remover o
excesso de conjugado.
Finalmente, o basto foi transferido para o tubo 6, que contm o
substrato da enzima do conjugado. O mdulo foi incubado a 20-25C ou
temperatura ambiente por 10 minutos.
25
d) Interpretao dos resultados:
o desenvolvimento de cor prpura/cinza na metade inferior do basto,
aps ser removido do tubo 6, foi considerado um resultado presuntivo
positivo. A metade superior do basto correspondente ao controle negativo
do teste, deve permanecer branca.
Na extremidade do basto deve apresentar colorao roxa, pois trata-
se do controle positivo (Figura 4).
NEGATIVO POSITIVO
.. o"
Figura 4: Foto do basto do "kit" TECRA Salmonella UNIQUE
Os resultados presuntivos positivos foram confirmados por
estriamento do caldo do tubo 3 (Caldo M) na superfcie de placas de agar
SS, BG e BSA. As etapas subsequentes seguiram a metodologia
convencional de cultura, descrita em 3.2.1.
O fluxograma na figura 5 indica, de modo esquemtico, cada uma das
etapas de cada um dos trs mtodos empregados no trabalho.
" IJ.
f cuidada dtl ~ n c ~ ... f rmacutlcal
!nivpr<;irl::ldA de So Paulo
Alimento (25g)
Homogeneizao com APT 1% (1: 1O)
I 42C/16-20h
35C /18-24h
Selenito-Cistina
I 35C/48h
gar SS,BG,BSA
42C/48h
35C /18-24h
I
Rappaport-Vassiliadis
HomoQeneizao. cI APT modificada (1: 10) 42C/18-20h
I
Basto
Tecra Unique tubo 1
35C/20 mino
Tecra Unique tubo 2
35C/24h(SS e BG) e 48h (BSA)
Ir- ~ I _ I
Testes bioqumicos meio de IAL
i
Teste de soroaglutinao
Caldo M
35CI6-8h
Aquecimento
100C/15 mino
Tecra Unique tubo 3
I 35C/5 horas
Tecra Unique tubo 4
35C/30 mino
Tecra Unique tubo 5
Desenvolvimento de cor
TECRA Salmonella UNIQUE
I 25C/10 mino
Tecra Unique tubo 6
I
I 350C130min
I 25C/10 min
I 35C130min
Tecra Via (placa)
Sorotipagem
Mtodo convencional de cultura
Desenvolvimento de cor
IV
0\
TECRA Salmonella VIA
Figura 5: Fluxograma descritivo das etapas empregadas nos trs mtodos de deteco de Salmonella.27
3.3 Avaliao dos resultados
Somente as amostras de alimentos nas quais a presena de
Salmonella foi confirmada atravs da sorotipagem completa foram
consideradas positivas. Aquelas amostras em que Salmonella no pode ser
detectada por nenhum dos trs mtodos foram consideradas negativas.
Um resultado falso negativo correspondeu amostra que apresentou
um resultado negativo por um dos mtodos, mas foi confirmado positivo por
pelo menos um dos outros dois mtodos utilizados.
Denominou-se como resultado "presuntivo" aquele obtido antes da
etapa de confirmao.
O teste de .. i de Mc Nemar com 5% de nvel de significncia, foi
utilizado para determinar se havia diferena estatisticamente significativa
entre as propores de resultados positivos confirmados e negativos obtidos
por cada um dos mtodos utilizados com o mtodo convencional de cultura.
28
4 - RESULTADOS E DISCUSSO
Das 200 amostras analisadas, 45 (22,5%) foram positivas para
Salmonella por algum dos trs mtodos utilizados. Os sorotipos encontrados
nessas amostras esto apresentados na Tabela 1. Verifica-se que houve
predominncia de S. Enteritidis, isolada de 13 (28,8%) amostras, seguida
por S. Typhimurium, S. Agona e S. Infantis, isoladas de seis (13,3%)
amostras cada uma. Uma das cepas de Salmonella no pde ser sorotipada,
por estar na forma rugosa.
Tabela 1: Sorotipos de Salmonel/a detectados nas amostras de alimentos
sorotipos
S. Enteritidis
S. Typhimurium
S.Agona
S. Infantis
S. Hadar
S. Minnesota
S. Give
S. Saintpaul
S. Brandenburg
S. Cerro
S. London
S.IV 43:Z4,Z24:-
no tipvel (rugosa)
TOTAL
nmero de
amostras
13
6
6
6
3
2
2
2
1
1
1
1
1
45
Das 45 amostras confirmadamente positivas para Salmonel/a, 34
(75,6%) foram detectadas pelo mtodo convencional, 29 (64,4%) pelo
sistema TECRA Salmonella VIA e 27 (60%) pelo sistema TECRA Salmonella
UNIQUE.29
o nmero total de amostras com resultado presuntivo positivo para
Salmonella empregando o sistema TECRA Salmonella VIA foi 43. Entre
essas amostras, 29 (67,4%) foram confirmadas como Salmonella positivas e
os demais resultados (32,6%) foram considerados resultados falso-positivos
pois no puderam ser confirmados atravs da metodologia empregada
(Tabela 2).
Tabela 2: Desempenho dos procedimentos de cultura convencional,
TECRA Salmonella VIA e TECRA Salmonella UNIQUE na deteco de
Salmonella em 45 amostras positivas de alimentos
Resultados Cultura
convencional
TECRA Salmonella VIA TECRA
Salmonella
UNIQUE
n n % n
Positivo presuntivo
Positivo confirmado
Positivo presuntivo no
confirmado
Falso negativo
d
34
n.a.
11
n.a.
75,6
n.a.
24,4
43
29
14
16
95,5
64,4
b
67,4
c
32,6
35,6
47
27
20
18
104,4
42,6
40
n= nmero de amostras analisadas
a
= no aplicvel
b
= em relao ao nmero total de amostras positivas
c
= em relao ao nmero de amostras presuntivas
positivas pelo mtodo em questo
d
= nmero de amostras positivas no detectadas pelo
mtodo em questo
30
A Tabela 3 mostra a relao existente entre os resultados positivos
confirmados e resultados negativos obtidos pelo sistema TECRA Salmonella
VIA e pelo mtodo convencional de cultura. Conforme apresentado, entre as
amostras confirmadamente positivas para Salmonella pelo sistema TECRA
Salmonella VIA, 4 foram positivas somente por esse sistema, no sendo
detectadas pelo mtodo convencional de cultura. Dessa forma, as quatro
amostras no detectadas pelo mtodo convencional correspondem 13,8%
das amostras confirmadamente positivas pelo sistema TECRA Salmonella
VIA.
Por outro lado, o sistema TECRA Salmonella VIA no deu resultado
positivo em 9 amostras positivas pelo mtodo convencional de cultura.
Assim, a porcentagem de resultados falso-negativos para esse sistema foi
de 26,5% em relao ao sistema convencional e 35,6% em relao ao
nmero total de amostras positivas para Salmonella.
Tabela 3: Nmero de amostras positivas confirmadas e negativas para
Salmonella pelo mtodo convencional e pelo sistema TECRA Salmonella
VIA.

TECRA VIA con
Total
+
Total
25
9
34
4
162
166
29
171
200
Considerando resultados positivos confirmados e resultados negativos
em conjunto, verificou-se pelo teste de McNemar que as diferenas entre os
resultados obtidos pelo sistema TECRA Salmonella VIA, quando
comparados aos obtidos pelo mtodo convencional de cultura, no foram
significativas, ao nvel de 5% (p =0,267).
31
o nmero total de amostras com resultado presuntivo positivo para
Salmonella empregando o sistema TECRA Salmonella UNIQUE foi 47. Entre
essas amostras, 27 (57,4%) foram confirmadas como Salmonella positivas e
os demais resultados (42,5%) foram considerados resultados falso-positivos
pois no puderam ser confirmados atravs da metodologia empregada
(Tabela 2).
A Tabela 4 mostra a relao existente entre os resultados positivos
confirmados e resultados negativos obtidos pelo sistema TECRA Salmonella
UNIQUE e pelo mtodo convencional de cultura. Conforme apresentado,
entre as amostras confirmadamente positivas para Salmonella pelo sistema
TECRA Salmonella UNIQUE, 10 foram positivas somente por esse sistema,
no sendo detectadas pelo mtodo convencional de cultura. Dessa forma, o
mtodo convencional deixou de detectar 37,0% das amostras
confirmadamente positivas pelo sistema TECRA Salmonella UNIQUE.
Por outro lado, o sistema TECRA Salmonella UNI QUE no foi
eficiente na deteco de 17 amostras positivas pelo mtodo convencional de
cultura. Dessa forma, a porcentagem de resultados falso-negativos para
esse sistema foi 50% em relao aos resultados do sistema convencional e
40% em relao ao total de amostras positivas para Salmonella.
Tabela 4: Nmero de amostras positivas confirmadas e negativas
para Salmonella pelo mtodo convencional e pelo sistema TECRA
Salmonella UNI QUE

+ Total
TECRA UNI QUE con
+ 17 10 27
17 156 173
Total 34 166 200
32
Considerando resultados positivos confirmados e resultados negativos
em conjunto, verificou-se pelo teste de McNemar que as diferenas entre os
resultados obtidos pelo sistema TECRA Salmonella UNIQUE, quando
comparados aos obtidos pelo mtodo convencional de cultura no foram
significativas, ao nvel de 5% (p =0,248).
Uma avaliao comparando um sistema rpido com o outro (Tabela
5) permite verificar que das 45 amostras positivas para Salmonella 17
(37! 7%) deram resultado positivo confirmado pelos dois sistemas rpidos
simultaneamente. Doze amostras positivas pelo sistema TECRA Salmonella
VIA foram negativas pelo sistema TECRA Salmonella UNIQUE, ao passo
que 10 amostras positivas pelo sistema TECRA Salmonella UNIQUE foram
negativas pelo sistema TECRA Salmonella VIA.
Tabela 5: Nmero de amostras positivas e negativas para Salmonella
pelo sistema TECRA Salmonella UNIQUE e pelo sistema TECRA
Salmonella VIA
TECRA VIA (conf)
+
Total
+
17
10
27
12
161
173
Total
29
171
200
33
A Tabela 6 mostra a concordncia entre os resultados confirmados
positivos e resultados negativos obtidos para as 200 amostras de alimentos
analisados, quando os trs mtodos de anlise so considerados em
conjunto. Conforme possvel verificar, quatro (8,8%) das amostras
analisadas apresentaram resultado positivo para Salmonella exclusivamente
pelo mtodo convencional. Nenhum dos outros dois mtodos foi capaz de
detectar o patgeno nessas amostras.
Os alimentos e os respectivos sorotipos de Salmonella isolados pelo
mtodo convencional foram:
- pulmo de boi e lngua de suino: ( S. Infantis);
- midos de porco: (S.IV 43:
- moela de frango: (S. Enteritidis)
Por outro lado, o sistema TECRA Salmonella UNI QUE detectou sete
(15,5%) amostras positivas que no haviam sido detectadas por nenhum dos
outros dois mtodos. Os alimentos implicados e os sorotipos foram:
- tripas de boi: (S. Cerro);
- figado de boi: (S. Saintpaul);
- 2 carcaas de frango: (S. Enteritidis);
- pulmo de boi: ( S. Typhimurium);
- fgado de frango: (S. Enteritidis);
- moela de frango: (S. Enteritidis).
O sistema TECRA Salmonella VIA. detectou apenas uma (2,2%)
amostra positiva que no foi positiva por nenhum dos outros mtodos. Essa
amostra foi corao de frango e o sorotipo isolado foi S. Give.
Tabela 6: Positividade para SalmonelJa em alimentos crus de origem animal, de acordo com o mtodo analtico.
RESULTADOS
Positivos para Sa/monella em pelo menos um dos trs mtodos
Positivos para o procedimento de cultura convencional exclusivamente
Positivos presuntivo pelo TEGRA Salmonella VIA exclusivamente
Positivos confirmado pelo TEGRA Salmonella VIA exclusivamente
Positivos presuntivo pelo TEGRA Salmonella UNIQUE exclusivamente
Positivos confirmado pelo TEGRA Salmonella UNIQUE exclusivamente
Positivos pelo procedimento de cultura convencional e presuntivo positivos TEGRA Salmonella VIA simultaneamente
Positivos pelo procedimento de cultura convencional e confirmado positivo pelo TEGRA Salmonella VIA simultaneamente
Positivos pelo procedimento de cultura convencional e presuntivo positivo TECRA Salmonella UNI QUE simultaneamente
Positivos pelo procedimento de cultura convencional e confirmado positivo TEGRA Salmonella UNIQUE simultaneamente
Positivos confirmados pelo TEGRA Salmonella VIA e TEGRA Salmonella UNIQUE simultaneamente
Positivos pelo procedimento de cultura conven., presuntivo positivo pelo TEGRA Salmonella VIA e pelo TEGRA Sal. UNIQUE simult.
Positivos pelo procedimento de cultura conven., confirmado positivo pelo TECRA Salmonella VIA e pelo TECRA Sal. UNIQUE simult.
n %
45 100
4 8,8
6 13,3
1
2,2
10 22,2
7 15,5
26 57,8
25 55,6
24 53,3
17 37,8
17 37,8
20 44,4
14 31,1
w
"'"
35
Os resultados obtidos neste estudo reforam os resultados reportados
anteriormente em outras avaliaes, embora poucos estudos tenham sido
publicados a respeito do desempenho dos sistemas TECRA SalmonelJa VIA
e TECRA SalmonelJa UNI QUE. O primeiro estudo data de 1988, no qual foi
avaliada a eficincia de um sistema denominado TECRA SalmonelJa Visual
Immunoassay, que corresponde ao precursor do atual sistema TECRA
SalmonelJa VIA (FLOWERS et ai, 1988). Nesse estudo, os autores
analisaram um nmero grande de amostras, naturalmente e
experimentalmente contaminados com Salmonel/a. Os resultados mostraram
que, embora os resultados de positividade tenham sido ligeiramente
diferentes, o mtodo novo foi to eficiente quanto o mtodo convencional de
cultura para deteco de Salmonel/a. O ndice de concordncia entre os
resultados foi de 96,7%. Tendo esses resultados como ponto de referncia,
o sistema TECRA Salmonella VIA foi recomendado para receber a
classificao 11 Offici ai AOAC First Action". A aprovao final ("0fficial AOAC
Final Action") foi obtida em 1991, e atualmente esse sistema corresponde ao
Mtodo Oficial AOAC 989.14 (AOAC, 2000).
Em um novo estudo realizado com o TECRA Salmonella Visual
Immunoassay, no qual empregou-se gua peptonada tamponada para o pr
enriquecimento e substituiu-se o caldo Selenito Cistina por caldo Rappaport-
Vassiliadis incubado a 42 C para o enriquecimento seletivo, o desempenho
do sistema foi melhorado. Esse dado foi observado na comparao entre os
dois caldos de enriquecimento seletivo, quanto a incidncia de resultados
positivos e negativos. O caldo Rappaport-Vassiliadis no apresentou
nenhum resultado falso negativo. Nesse estudo foram analisados somente
alimentos naturalmente contaminados e o ndice de concordncia com os
resultados obtidos atravs do mtodo convencional de cultura foi 95%
(LAMBIRI et ai, 1990).
36
Em 1996, avaliou-se uma verso modificada do sistema TECRA
Salmonella Visual Immunoassay, no qual os anticorpos originais foram
suplementados com novos anticorpos policlonais para os sorotipos imveis
de Salmonella (S. Pullorum e S. Gallinarum) (HUGHES et ai, 1996). Essa
nova verso do sistema foi comparada ao imunoensaio original e aos
mtodos convencionais de cultura recomendados pela AOAC (Mtodos
967.25 e 967.28), empregando caldo Rappaport Vassiliadis a 42C na etapa
de enriquecimento seletivo. O estudo foi realizado com trezentos sorotipos
de Salmonella, cem cepas no-Salmonella e alimentos experimentalmente
inoculados com esses microrganismos. O novo TECRA Salmonella VIA
apresentou um melhor desempenho que o sistema original, com
sensibilidade e especificidade semelhantes. A capacidade de isolamento de
Salmonella dos alimentos contaminados artificialmente no foi
significativamente diferente daquela apresentada pelos mtodos
convencionais de cultura, e o novo sistema recebeu a classificao "AOAC
Official First Action".
Em relao ao sistema TECRA Salmonella UNIQUE, JONES et aI.,
1995, compararam seu desempenho ao apresentado pelo mtodo de cultura
padro britnico (Mtodo BS 5763 -ISO 6579) para pesquisa de Salmonella
em uma variedade de alimentos experimentalmente contaminados. Os
autores observaram que esse sistema apresentava maior sensibilidade que
outros imunoensaios comerciais, apresentando especificidade para deteco
de todos os quarenta e dois sorotipos de Salmonella testados (JONES et aI.,
1995).
37
TECRA Salmonella UNIQUE foi tambm comparado ao mtodo de
cultura do FDA (Food and Drug Administration) para deteco de Salmonella
em alimentos experimentalmente contaminados (laticnios, carnes, vegetais
e pescado). O ndice de concordncia entre os resultados foi bom: para cada
nvel de inculo, houve deteco de Salmonella em mais amostras utilizando
o TECRA Salmonella UNIQUE do que o procedimento do FDA. Os autores
enfatizaram a convenincia desse mtodo rpido, onde os resultados
estavam disponveis em 24 horas, contrastando com as 96 horas
necessrias para o mtodo do FDA (FLlNT e HARTLEY, .1993).
POPPE e DUNCAN, 1996, empregaram TECRA Salmonella
UNI QUE e o meio Rappaport Vassiliadis Semi-slido Modificado (MSRV)
para testar cem amostras de carnes cruas de aves quanto presena de
Salmonella. A sensibilidade e especificidade do mtodo rpido, quando
comparado ao meio MSRV, foram 59,3% e 97,6%, respectivamente (POPPE
e DUNCAN, 1996).
Em um estudo colaborativo mais recente, HUGHES e col.,2001
compararam o TECRA Salmonella UNIQUE com o mtodo cultural de
referncia do Bacteriological Analytical Manual (BAM). Trs tipos de
alimentos (leite em p, pimenta e farinha de soja) foram analisados na
Austrlia e 2 tipos de alimentos (achocolatado e ovo pasteurizado) nos
Estados Unidos. Para cada tipo de alimento, foram feitos trs nveis de
inoculao. A comparao dos resultados no demonstrou diferenas
significativas (p :2: 0,05) na proporo de amostras positivas pelo teste
UNIQUE e pelo mtodo de cultura de referncia, quando realizada a anlise
estatstica pelo teste de -l. Os autores recomendaram que o teste UNIQUE
para deteco de Salmonella em alimentos fosse adotado como mtodo
oficial (HUGHES et.al., 2001).
38
Um aspecto importante a ser considerado que o protocolo de teste
empregado nesse estudo para avaliao do TECRA Salmonella VIA foi
recentemente modificado pelo fabricante. Para a pesquisa de Salmonella em
alimentos com elevada carga microbiana (carne, peixe, frango, etc.), passou-
se a recomendar o emprego do caldo lactosado como meio de pr-
enriquecimento e caldo Rappaport-Vassiliadis a 41-43 C como meio de
enriquecimento seletivo. oportuno lembrar que nesse estudo foi
empregado APT (gua peptonada tamponada) como meio para pr-
enriquecimento pois esse o meio utilizado rotineiramente na Seo de
Microbiologia Alimentar do Instituto Adolfo Lutz para pesquisa de Salmonella
em alimentos e era o indicado tambm no protocolo de anlise. Outro ponto
importante que o novo protocolo de anlise inclui a suplementao do
caldo lactosado com Imbentin AGS/35 ou Triton X-100, o que no era
preconizado ainda quando esse estudo foi desenvolvido. Essas
modificaes no protocolo de anlise, caso tivessem sido implementadas,
poderiam ter melhorado o desempenho desse sistema rpido.
Em relao ao TECRA Salmonella UNIQUE, h tambm um novo
protocolo de teste, no qual a etapa de confirmao de um teste presuntivo
positivo (bastes com cor prpura) diferente daquela executada nesse
estudo. Ao invs de semear o caldo do tubo 3 diretamente em meios slidos
seletivos, o atual protocolo para alimentos com elevada carga microbiana
recomenda que esse caldo seja transferido para um tubo com caldo
Rappaport-Vassiliadis, antes da semeadura em placas seletivas. Esse
procedimento diminui o excessivo crescimento dos microrganismos
contaminantes nas placas com meios seletivos, aumentando a possibilidade
de observao da presena de Salmonella nessas placas. razovel
concluir que esse detalhe melhora o desempenho da confirmao dos
resultados positivos do sistema TECRA Salmonella UNI QUE, pois verificou-
se no estudo grande freqncia de resultados presuntivos positivos que no
puderam ser confirmados pela metodologia de confirmao empregada.
39
Algumas vantagens interessantes dos sistemas TECRA Salmonella
VIA e TECRA Salmonella UNIQUE foram observadas durante o
desenvolvimento desse trabalho. A mais importante, com certeza, a
reduo no tempo total de anlise (Fig. 6). O sistema TECRA Salmonella
VIA requer um tempo total de 42-52 horas, enquanto o TECRA Salmonella
UNIQUE necessita de apenas 20-22 horas. Esses tempos contrastam com
os trs dias necessrios para um resultado presuntivo pelo mtodo
convencional de cultura, que requer dois dias adicionais para um resultado
positivo confirmado.
Outra vantagem observada para os dois sistemas avaliados a sua
simplicidade de execuo. Nesse aspecto, o sistema TECRA Salmonella
UNIQUE mais conveniente que o TECRA Salmonella VIA, j que um
sistema pronto para uso, isto , menos trabalhoso e menos sujeito a erros do
analista.
escala de tempo
mtodo segunda-feira tera-feira quarta-feira quinta-feira sexta-feira sbado
manh tarde manh tarde manh tarde manh tarde manh tarde manh tarde
convencional
TECRA Salmonella VIA
TECRA Salmonella UNIQUE
pr-enriquecimento enriquecimento seletivo semeadura em placa leitura
semeadura de IAL
leitura
sorologia
I _
_____________---'1,:...,." .. ..... 1 _
Figura 6 Quadro comparativo do tempo necessrio para o desenvolvimento do trs mtodos para deteco de Salmonella em alimentos
+:-
o41
5 - CONCLUSES:
Baseado nos resultados obtidos neste trabalho, possvel chegar s
seguintes concluses:
1 - O desempenho dos trs mtodos (TECRA Salmonella VIA, TECRA
Salmonella UNIQUE e mtodo convencional de cultura) para a deteco de
Salmonella foi similar. As diferenas no nmero de amostras positivas para
Salmonella detectadas pelos dois imunoensaios rpidos, quando
comparados ao mtodo convencional utilizado no Instituto Adolfo Lutz, no
foram estatisticamente significantes (p>O,05).
2 - Os dois imunoensaios apresentam a vantagem da rapidez na obteno
de resultados, quando comparados com o mtodo convencional de cultura.
Para o TECRA Salmonella UNIQUE so necessrios 20-22 horas e para o
TECRA Salmonella VIA, 42-52 horas, enquanto para o mtodo convencional
utilizado no Instituto Adolfo Lutz so necessrios pelo menos 5 dias.
3 - Pela facilidade de execuo dos dois sistemas rpidos, economia de
material de laboratrio e pela confiabilidade dos resultados apresentados, os
sistemas podem ser recomendados para triagem de amostras negativas
para Salmonella. importante ressaltar que as amostras presuntivas
positivas necessitam ser confirmadas pela metodologia convencional de
cultura.
42
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48
Resumo
A presena de Salmonella em 200 amostras de alimentos crus de origem
animal foi investigada empregando-se os dois ensaios imunoenzimticos
rpidos TECRA n.II Salmonella VIA e TECRA n.II Salmonella UNIQUE (TECRA
Diagnostics, Rosewille, NSW, Australia) e o mtodo de cultura convencional
empregado rotineiramente no Instituto Adolfo Lutz, So Paulo, SP. Quarenta
e cinco amostras (22.5%) foram Salmonella positivas por pelo menos um
dos trs mtodos. O nmero de amostras positivas de acordo com o mtodo
analtico foi 34 (75,6%) para o mtodo de cultura convencional, 29 (64,4%)
para TECRA TM Salmonella VIA e 27 (60.0%) para TECRA n.II Salmonella
UNIQUE. O mtodo de cultura convencional detectou quatro amostras
positivas no detectadas por nenhum dos outros dois mtodos rpidos.
TECRA Salmonella UNIQUE detectou sete amostras positivas no
detectadas pelos demais mtodos. Uma amostra foi positiva apenas pelo
mtodo TECRA Salmonella VIA. Considerando todos os resultados
(positivos e negativos) o teste de qui quadrado de McNemar indicou que as
diferenas entre os resultados obtidos pelos mtodos rpidos, quando
comparados aos obtidos pelo mtodo convencional, no foram
estatisticamente signrficativas (p>O.05).
49
Detection of Salmonella in Raw Foods of Animal Origin Using Tecra TM
Salmonella VIA and Tecra Salmonella UNIQUE Rapid Immunoassays
and a Cultural Procedure
Abstract
The presence of Salmonella in 200 raw food samples of animal origin
was investigated by means of rapid immunoassays TECRA TM Salmonella
VIA and TECRA TM Salmonella UNIQUE (TECRA Diagnostics, Rosewille,
NSW, Australia) and the cultural procedure used routinely in Instituto Adolfo
Lutz, Sao Paulo, SP. Forty-five samples (22.5%) were Salmonella positive by
at least one of the three methods. The number of positive samples according
to the analytical method was 34 (75.6%) for the cultural procedure, 29
(64.4%) for TECRA Salmonella VIA and 27 (60.0%) for TECRA
Salmonella UNIQUE.
The cultural method detected four positive samples that both rapid
methods were unable to detect. TECRA Salmonella UNIQUE detected
seven positive samples that were not detected by the Mfa other methods.
One sample was positive by the TECRA Salmonella VIA exclusively.
Considering overall results (positive and negative) McNemar's chi square
tests indicated that the differences between results given by the rapid
immunoassays when compared to those of the cultural method were not
significant (p>0.05).