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qPCR

El RNA tiene una sola hebra.


La pentosa de los nucletidos
constituyentes es ribosa.
Sus cuatro bases son: A, G, C, U.
Es la molcula que dirige las
etapas intermedias de la sntesis
de protenas.
RNA
EXTRACCIN DE RNA
La extraccin de RNA es un mtodo fundamental utilizado en la
biologa molecular.
Puede ser aislado de cualquier material biolgico, tales como tejidos
vivos o conservados, fluidos (sangre total o plasma),clulas, partculas de
virus u otras muestras.
Actualmente existen muchos mtodos especializados que pueden ser
utilizados para extraer biomolculas puras.
Estos mtodos permiten un alto rendimiento de la muestra, exactitud y
fiabilidad de la prueba; y reduce la contaminacin cruzada.
MTODOS DE EXTRACCIN DE
RNA.
MTODOS
CONVENCIONALES
Tiocianato de
guanidinio-fenol-
cloroformo
Extraccin
alcalina
Mtodo de
Extraccin
CTAB
Centrifugacin en
gradiente de
bromuro de etidio-
cloruro de cesio.
Purificacin de ARN
Poli (A) por
cromatografa de
celulosa de oligo
(dT).
EXTRACCIN EN
FASE SLIDA
Matrices de
Slica
Partculas de
vidrio
Tierra de
Diatomeas
Perlas
Magnticas
Material de
intercambio
aninico
MTODO CONVENCIONAL

DISGREGACIN O
FRAGMENTACIN DEL TEJIDO
1.Homogeneizacin de las
clulas y liberacin de los
orgnulos.
2. Macro filtracin.
3. Purificacin de componentes
celulares o fraccionamiento
celular.
MTODOS DE FRAGMENTACIN Y LISIS
PARA LA EXTRACCIN DE ACIDOS
NUCLICOS
MTODOS MECNICOS
- MOLIENDA MANUAL EN MORTERO
- CONGELACIN/DESCONGELACIN
- ULTRASONICACIN
MTODOS NO
MECNICOS
- AGENTES QUMICOS
Detergentes: CTAB , SDS
ENZIMTICOS
- Proteasas
- ARNasas
EXTRACCIN DE ADN CON SOLUCIN DE
CHONCZYNSKI (RNA).
Muestra
PREVIA FRAGMENTACIN
DE MUESTRA CON MTODO
MECNICO O NO MECNICO
SOLUCIN DE TIOCIANATO DE
GUANIDINO(TRIZOL LS).
- LISIS DE MEM. CELULAR Y NUCLEAR
- DEGRADACIN DE PROTENAS E
INACTIVACINDE ENDONUCLEASAS
- MANTIENE INTEGRIDADDE RNA.
FASE ORGANICA
ADN, PROTEINAS Y
LIPIDOS DISUELTOS
FASE ACUOSA
ARN TOTAL
SEPRACION DE
FASE ACUOSA
CENTRIFUGA A
4C
CENTRIFUGA A
4c
ALCOHOL
ETLICO PURO
PELLET DE RNA
TOTAL
ISOPROPANOL
CLOROFORMO.
REFRIGERAR
A -20 TODA
LA NOCHE
BAO MARIA A 55-
60C
A260/A280 = 2.0 ALTO GRADO
PUREZA
= 1.8 PURO
< 1.8 CONTAMINACIN
TRANSCRIPCIN INVERSA o
RETROTRANSCRIPCION
(cDNA)
Reaccin por la cual se sintetiza ADN de doble cadena a
partir de una hebra molde de ARN monocatenaria.
Donde una enzima tipo DNA-polimerasa que utiliza como
hebra molde para sintetizar cDNA con ayuda de RT-PCR.
.
Utiliza:
-RNA
-DNA-polimerasa
-DNTPs
-Primers(iniciadores)
-Agua libre de RNAsas
-Inhibidor RNAsas
-Buffer
PCR
Amplificacin enzimtica de un fragmento de DNA (simulando una
replicacin natural del DNA in vitro).
ENZIMA (Taq)
Estable a altas temperaturas 72-85C.
Termoestabilidad.- Vida media a 95C-40 min
Enzima de 95kd.
Actividad Exonucleasa: 53
Thermococcus litoralis
85-88C
(Vent)
Pyrococcus furiosus
70-103C
(Pfu)
Thermus thermophilus
65C
(Tth)
MAGNESIO
La polimerasa necesita de iones de magnesio para
funcionar adecuadamente.
Mucho magnesio inhibe a la polimerasa y poco
genera productos inespecficos
dNTPs
Donadores de Bases Nitrogenadas del ADN
(dATP, dCTP, dTTP y dGTP)
TARGET
Segmento de DNA ha
seleccionado para amplificar.
Es el molde (muestra)
TERMOCICLADOR, BUFFER E
INHIBIDORES DE RNAsas
Termociclador.-Un aparato el cual rene las
condiciones necesarias de temperatura para que
nuestra amplificacin enzimtica pueda suceder.
Buffer.- solucin que rene condiciones
necesarias para que la reaccin de amplificacin
se de.
Inhibidores de RNAsas.- protegen la muestra
de la degradacin por parte de las RNAsas
ambientales.
PRIMERS O CEBADORES
Primers.- Dos oligonucletidos que
son cada uno complementarios a
una de las dos hebras del DNA,
estos son nicos para recocer una
secuencia especifica por lo cual
tienen una alta especificidad, punto
inicial de la actividad de la ADN pol.
DISEO DE PRIMERS
I Cada primer individual debe contar con una longitud de
18-24 bases.
II Deben de ser ricos en contenido de GC entre 40 y 60 %.
III Los dos primers del par deben de tener temperatura de
fusin Tm cercanos, dentro de los 5 C.
IV La secuencia de los primers individuales debe iniciarse y
terminarse con 1 o 2 bases pricas.
V Evitar regiones con potencialidad para formar
estructuras secundarias internas.
VI Es requisito que las secuencias de los cebadores no
formen horquillas internas , ni sean complementarios.
VII Secuencias adicionales pueden ser agregadas en el
extremo 5 del primer .
VIII Se pueden agregar degeneraciones en algunas
posiciones del primer:
PRIMER 3
-Especificar un gran nmero de variables y
obtener primers segn las indicaciones solicitadas
-Agregar el nmero de acceso de la
Secuencia
-Discriminar las regiones de la secuencia que se
deben incluir, las que se deben excluir y el rango
de tamaos del producto
-Incluye la posibilidad de especificar las
caractersticas mnimas de los primers deseados,
como Tm, porcentaje de GC, mxima
autocomplementariedad, y otros parmetros.
http://www.justbio.com/.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
EVENTOS EN LA REPLICACIN
DEL DNA
Apertura de las cadenas (origen de replicacin)
Colocacin de los iniciadores (primers de RNA)
( La cadena lder utilizar un solo iniciador mientras
que las
cadenas rezagadas utilizarn varios iniciadores de
RNA.)
Sntesis de cadenas de DNA (partiendo de los
iniciadores)
Eliminacin de los iniciadores de RNA.
Unin de los fragmentos de DNA (por la enzima
DNA
ligasa)
ETAPAS DE LA PCR
1. Desnaturalizacin: Apertura de la doble cadena
2. Alineamiento: Anillaje o hibridacin de primers
3. Extensin: Generacin de la nueva cadena
ELECTROFORESIS REVELADO.
Separacin de molculas en un campo elctrico
Cmara de electroforesis
Electrodo (+)
Electrodo (-)
Camas para preparacin del gel
de agarosa
Fuente de poder
TINCIN CON BROMURO DE ETIDIO
Agente intercalante
Bromuro de Etidio
Molcula fluorescente que se
intercala entre las bases de la
molcula de DNA.
Absorcin a 330 nm
(UV)emisin en luz visible
La tcnica RT-PCR combina la amplificacin del DNA con la deteccin de
los productos en un solo tubo.
Tiempo Real: Deteccin de productos de PCR en la medida que se van
generando
Monitoreando la amplificacin de una secuencia especifica en tiempo real
utilizando tecnologas fluorescentes(sondas)
PCR EN TIEMPO REAL (RT-PCR)
UTILIDADES
- Genotipificacin
- Cuantificacin de carga viral
- Cuantificacin del numero de copias
de un gen
- Expresin gnica (RNA)
Retrotranscripcin
COMPONENTES
SISTEMAS DE DETECCIN
USO DE MOLCULAS FLUORESCENTES
No-Especfico
SYBR Green I
Molecular fluorescente que se unen
a ADN
Emisin a 520nm
DESVENTAJAS
Inespecfico(baja especificidad).
Condiciones optimas de reaccin.
Cuidadosa seleccin de cebadores.
Solo es posible amplificar un producto por reaccin.
VENTAJAS
Baratos.
Requiere solo un par de cebadores.
SONDAS
Especfico
Sondas de hidrolisis
Taq-Man
Molecular Beacons
Scorpion
FRET
Fragmento de DNA de pequeo
tamao ( aprox. 50pb) marcado
fluorescentemente.
Ventajas Desventajas
Incrementa la especificidad de la
reaccin.
Debe disearse una sonda
diferente para cada blanco a
estudiar.
Permite la realizacin de PCR
multiplex.
Relativamente ms costoso.
Permite realizar discriminacin
allica mediante el uso de sondas
ASO
Se lleva a cabo mediante la hibridacin con una
sonda complementaria a una regin interna de la
secuencia blanco, previamente a la amplificacin.
Tm sonda debe ser 10C > que el de los
cebadores, de modo que hibride antes que los
mismos.
SONDAS DE HIDROLISIS
Ventajas Desventajas
Incrementa la especificidad de la
reaccin.
Debe disearse una sonda diferente
para cada blanco a estudiar.
Permite la realizacin de PCR
multiplex.
Relativamente ms costoso.
Permite realizar discriminacin allica
mediante el uso de sondas ASO
SONDA DE HIDROLISIS TAQ-MAN
Oligonucletidos marcados con un fluorocromo donador en
el extremo 5que emite fluorescencia al ser excitado y un
aceptor en el extremo 3que absorbe la fluorescencia
liberada por el donador.
SONDA FRET
El sistema se compone de dos sondas
que se unen a secuencias adyacentes
del DNA.
Una sonda lleva donador en el
extremo 3y la otra el aceptor en el
extremo 5.
SONDA MOLECULAR BEACONS Y
SONDA SCORPIONS
Presenta una estructura
secundaria en forma de
horquilla.
Un cebador especfico para el
amplicn unido covalentemente a
una horquilla .
Exponencial: Duplicacin
exacta del producto se
acumula en cada ciclo.
Lineal: Componentes
consumidos, productos
empiezan a degradarse.
Plateau: Reaccin se
consume y no se generan ms
productos.
CINTICA DE PCR
Umbral: Fluorescencia basal de las muestras debido al SYBR Green y
Sondas de Hibridacin (determinado automticamente por el
instrumento).
C
T
(C
P
): Nmero de ciclo en donde la fluorescencia supera el umbral.
Nmero de ciclos
Fase
logartmica
Plateau
C
T
(C
P
)
UMBRAL
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
i
a

PCR
tradicional
PCR en
Tiempo Real
Preparacin de la
Muestra
Amplificacin Deteccin
Preparacin de la
Muestra
Amplificacin y Deteccin
PCR Convencional Vs. PCR en Tiempo Real