COLORAO PELO MTODO DE GRAM

o mtodo de colorao mais empregado em bacteriologia.

Importncia do mtodo:
. separa as bactrias em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS (G+/GP) e
GRAM NEGATIVAS (G- /GN);
. taxonomia ( identificao, classificao e nomenclatura, sendo o primeiro
passo no processo de
identificao);
. possibilita o diagnstico presuntivo (preliminar), principalmente em casos de
infeces graves e de evoluo
fatal quando o mdico necessita introduzir uma teraputica, antes mesmo da
identificao do microrganismo
causador da infeco ;
. permite evidenciarmos a contaminao a partir de diferentes materiais.
SOLUES EMPREGADAS:
1- CRISTAL VIOLETA - funo: corante principal ( cora igualmente todas as
bactrias )
2- LUGOL ( soluo de iodo-iodeto de potssio) - funo: mordente. O
mordente tem a finalidade de
aumentar a afinidade do corante pela clula, permitindo que ela se core mais
intensamente.
3- LCOOL ETLICO - funo: agente descorante e diferenciador. Sua
utilizao permite que algumas clulas
se descorem mais facilmente que outras. Este comportamento distinto de
descolorao que diferencia as
bactrias.
4-- FUCSINA DILUDA - funo: corante de contraste, corante secundrio ou
contracorante. o corante que
d s clulas descoradas uma cor diferente daquelas que mantm a cor do
corante principal.
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Os microrganismos que no se descoram facilmente retm a cor do corante
principal ( cristal
violeta ) enquanto que aqueles que se descoram facilmente podero ser
visualizados, pois corar-se-o com o
corante de contraste ( fucsina. ).
TCNICA:
1- Cobrir o esfregao j fixado com soluo de Cristal Violeta por um (1)
minuto.
2-Escorrer o cristal violeta, lavar em fio dgua e cobrir o esfregao com Lugol
por um (1) minuto.
3-Escorrer o lugol, lavar em fio dgua .
4- Descorar rapidamente com lcool Etlico ( +/- 20 segundos)
5-Interromper o processo de descoramento lavando o esfregao com fio d
gua.
6-Cobrir o esfregao com Fucsina diluda por 30 segundos.
7-Lavar e secar com papel filtro, pressionando o esfregao cuidadosamente.
8-Colocar uma gota de leo de imerso sobre o esfregao e observar ao
microscpio, utilizando a objetiva de
imerso.
RESULTADO: Bactrias coradas em roxo ( cor do cristal violeta ) - GRAM
POSITIVAS
Bactrias coradas em vermelho ( cor da fucsina ) - GRAM NEGATIVAS


FUNDAMENTO DA TCNICA DE GRAM:
Muitas explicaes j foram sugeridas na tentativa de elucidar o mecanismo
da reao de Gram. As
mais plausveis dizem respeito diferena na estrutura qumica da parede
celular.
Num primeiro momento, todas as bactrias ( G+ e G- ) absorvem igualmente o
cristal violeta ( corante
bsico que possui afinidade pelos seus citoplasmas, devido a carga eltrica
negativa oriunda principalmente
dos radicais fosfatos dos cidos nuclicos ). A seguir, o lugol reage com o
cristal violeta formando o
complexo iodo-pararosanilina, que se fixa e cora a clula mais intensamente.
Posteriormente, quando tratamos o esfregao com lcool, as bactrias se
comportam de maneira
diferente:
-1) as Gram-positivas no se descoram facilmente pelo tratamento com o
lcool. Isto se explica pelo
fato de comporem sua parede celular uma espessa camada de
peptideoglicano, alm de outros possveis
componentes, como: c. teicicos, protenas. polissacrides e etc.,
substncias estas, no solveis em lcool.
O lcool atua desidratando as vrias camadas desta parede, o que traz como
conseqncia uma diminuio
na sua porosidade e esta diminuio reduziria a permeabilidade da parede,
dificultando a extrao (sada) do
complexo CV-I ( que se encontra no citoplasma ) de dentro da clula. Alm
disto, parece haver uma reteno
do CV-I na parede aps a ao do lcool, o que tambm contribuiria para a
diminuio de sua porosidade. A
bactria Gram-positiva permanece ento com a mesma colorao at o final.
-2) as bactrias Gram-negativas so descoradas pelo tratamento com o lcool.
Tal fato se explica por
comporem a parede destas bactrias: delgada camada de peptideoglicano
(menor entrecruzamento, o que
no suficiente para impedir a passagem do solvente ) alm de substncias
ricas em lpides (lipoproteina de
apoio, fosfolpides da membrana externa e lipdio A que participa do LPS). O
lcool solubiliza (dissolve)
estes lpideos (muitas vezes extraindo a camada da membrana externa),
aumentando a porosidade da
parede, o que contribuiria para um aumento da permeabilidade. Assim sendo,
o lcool penetra dentro da
clula (atravessando a membrana citoplasmtica), removendo o complexo CV-
I, descorando a clula.
Finalmente as bactrias descoradas pelo lcool, por no apresentarem
contraste que permita sua
visualizao, seriam coradas pelo corante secundrio que a fucsina. As
clulas que no foram descoradas
pelo lcool (e tiveram sua permeabilidade diminuda) permaneceriam coradas
com a cor do corante principal
at o final da colorao, pois no absorveriam a fucsina.