Seminario 8 Electroforesis

Universidad nacional Jos Faustino Snchez Carrin
Medicina Humana Ciclo I - 2009 I Docente: Dr. HUGO SEGAMI SALAZAR

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Introduccin
La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente
elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga
elctrica a travs de una matriz gelatinosa.
Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a
incrementarse cuando en los aos cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius ,
impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asigno a la separacin de
materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte; aunque este
trmino se limito originalmente al anlisis de coloides y partculas submicroscpicas ,
se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa aplicada a sustancias de
bajo peso molecular.
Este mtodo, cada da ms empleado en el estudio de casi todas las enfermedades en
que el suero y plasma sanguneos juegan algn papel (y sabemos que es muy difcil que
haya alguna que no altere o cambie en alguna forma la constelacin albuminoidea de
estos lquidos), consiste fundamentalmente en valorar la cantidad y calidad de las
diversas fracciones proteicas que los forman. La determinacin de estas, separadas
dentro de un campo elctrico por la influencia ejercida por los electrodos clsicos,
nodo (-1-} y ctodo (), permite, por comparacin de sus valores normales con los
encontrados en la enfermedad, conocer y precisar mejor numerosos cuadros
patolgicos.
No solo las albuminas del suero y plasma sanguneos son susceptibles de un estudio
electrofortico sino que tambin las de tejidos orgnicos, msculos, cuerpo vtreo y
cristalino as como las de toxinas, venenos albuminoideos y exudados diversos, las de
la leche y las aparecidas en la orina y en el L.C.R.



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Electroforesis
Se denomina electroforesis al transporte de partculas en un campo elctrico.
Cualquier in o molcula cargada elctricamente migrar cuando se someta a la accin
de un campo elctrico. A un pH determinado, muchas molculas biolgicas poseen
carga elctrica, cuya magnitud depende del pH y composicin del medio en que se
encuentren. Con tcnicas electroforticas, es posible separar los diferentes
componentes de una mezcla de aminocidos, protenas, cidos nucleicos y otras
biomolculas cargadas.
En el laboratorio clnico, la aplicacin ms importante de la electroforesis es la
separacin de protenas presentes en el suero, orina y otros fluidos biolgicos como el
lquido cefalorraqudeo y el lquido sinovial.



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Movilidad electrofortica
Si se aplica un campo elctrico a una mezcla de molculas cargadas, stas migrarn al
electrodo de polaridad opuesta. Cuando una molcula de carga q se encuentra en un
campo elctrico de magnitud E, la fuerza que provoca la aceleracin de la partcula
ser qE. Dicha fuerza se ver contrarrestada por la resistencia friccional f dando una
velocidad resultante v, de forma que:
qE = fv
Aplicando las leyes de Stokes para una molcula esfrica de radio r que se mueva a
travs de un medio de viscosidad n, se cumple:
f= 6 nr
A partir de las anteriores expresiones se obtiene:
qE= 6nrv
La movilidad electrofortica V de una molcula se define como la migracin por unidad
de campo de fuerza, de modo que:
V=v/E=q/f= q/6 nr
Por tanto, la movilidad electrofortica depende de la carga de las partculas y del
coeficiente de friccin f, que es dependiente del tamao de la molcula, de su forma y
de la viscosidad del medio.



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Tipos de electroforesis
1. Electroforesis de frente mvil o libre
Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un
tampn de pH y fuerza inica adecuados. Se colocan dos electrodos en sendos brazos
del dispositivo, entre los que se crea un campo elctrico, provocando que las
molculas de protena cargadas emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta. Las
diferentes protenas se desplazan a velocidades diferentes de acuerdo con sus cargas y
coeficientes de friccin respectivos, formndose nubes (o frentes) que se desplazan en
la disolucin tampn.
Este desplazamiento puede seguirse con diversos sistemas pticos que ponen de
manifiesto las sustancias segn se van separando. Para impedir la mezcla por
conveccin de las protenas que emigran se necesita un sofisticado aparato y a su vez
se precisa el empleo de muestras muy grandes. Esta es la razn por la que la
electroforesis de frente mvil ha sido sustituida por la electroforesis de zona.



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2. Electroforesis de zona
En esta tcnica, la muestra est obligada a desplazarse sobre un soporte slido de
papel, celulosa o gel. La pequea cantidad necesaria de muestra permite que las
molculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomolculas
cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolucin estabilizada con un medio
que sirve de soporte.

2.1 Electroforesis en papel
La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una disolucin
tampn, bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de
las sustancias a separar y del pH del tampn. Los extremos de la tira se sumergen en
dos recipientes separados que contienen la disolucin tampn y en los que se hallan
colocados los electrodos.
Se conectan los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una diferencia
de potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las
molculas cargadas de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta
formando bandas en el papel. La velocidad de emigracin de una molcula, depende
preferentemente de su carga. Completada la electroforesis, se desconecta la fuente de
tensin y se secan las tiras sobre una superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo,
etc.).


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El revelado se realiza empleando los mismos mtodos que los utilizados en
cromatografa sobre papel, mediante la accin de los colorantes adecuados.
La electroforesis y la cromatografa en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo,
mientras que la electroforesis separa las molculas fundamentalmente en funcin de
su carga, la cromatografa lo hace en base a una amplia gama de caractersticas
(ejemplos, solubilidad en la cromatografa de reparto, polaridad en la de adsorcin,
carga en la de intercambio inico, etc.).
La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separacin de sustancias de
bajo peso molecular como aminocidos y pptidos. La difusin que se produce puede
disminuirse aumentando la diferencia de potencial entre los electrodos con lo que se
reduce el tiempo de desarrollo. Este tipo de electroforesis se denomina de alto
voltaje. El revelador para localizar las sustancias sera la ninhidrina en el caso de
pptidos y aminocidos.
Las electroforesis en papel tambin pueden hacerse en tiras de acetato de celulosa,
que son qumicamente ms homogneas y tienen la ventaja de ser transparentes, con
lo que las sustancias a separar, una vez teidas o reveladas, pueden cuantificarse por
densitometra. Es muy til en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y su
rpido desarrollo.
La principal aplicacin es la separacin de protenas del suero, conocindose el
resultado como proteinograma. Las fracciones proteicas del suero que se separan
mediante este tipo de electroforesis son la albmina y las globulinas
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,
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, y .
El acetato de celulosa se utiliza tambin para separar lipoprotenas. El resultado
obtenido se denomina lipidograma. Las fracciones lipoproteicas son denominadas ,
pre- y . El tampn ms usado es el veronal, a pH 8,6. La separacin se realiza de
forma anloga a la de protenas y se produce en unos 30 minutos. Las lipoprotenas,
una vez separadas, se localizan tindolas con colorantes que se unen a la fraccin
lipdica, como Negro Sudn o Ciba 7B Fat Red.
Electroforesis anlogas a las de protenas y lipoprotenas, utilizando como soporte el
acetato de celulosa, se han aplicado tambin para la separacin de isoenzimas de la
lactato deshidrogenasa y la creatn-quinasa.



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2.2 Electroforesis en gel
Un gel es un estado intermedio entre el slido y el lquido. Este tipo de electroforesis
se halla entre los mtodos ms resolutivos y convenientes empleados en la separacin
de macromolculas. Los geles de uso ms generalizado son: poliacrilamida y agarosa.
stos poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad
de traslado y molculas trasladadas durante el proceso electrofortico.
De esta forma, la separacin no se produce slo por las diferentes cargas de las
molculas, sino tambin por las diferencias de tamao. Los geles estn formados por
un reticulado de polmeros (constituyendo una red enmaraada) y el lquido
intersticial en el que se encuentra inmerso esta red.
Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en
dos categoras:
Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo)
Electroforesis en gel de poliacrilamida.
Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por
accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades
uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma,
adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua,
relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas
durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la
concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el
tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico
debido a su neurotoxicidad.



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Electroforesis en geles de gradientes.
El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de
concentracin de archilamida + bisacrilamida, y en consecuencia un gradiente
decreciente en el tamao del poro, pueden tener ventajas sobre los geles de
concentraciones uniformes de acrilamida. En un gel en gradiente la protena
migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro impida cualquier
avance. Una vez se alcanza el lmite del poro no se produce una migracin
apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este
tipo de geles es que resuelve mejor las bandas pues las concentra en regiones
ms estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares que se
pueden resolver en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija.
(Diapositiva n 9)

Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-
agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5
a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C
y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel est constituido por una matriz
o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de
medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para
separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.



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Isoelectroenfoque.
Esta tcnica, habitualmente denominada electroenfoque se basa en el
desplazamiento de las molculas en un gradiente de pH. Las molculas
anfotricas, como los aminocidos, se separan en un medio en el que existe
una diferencia de potencial y un gradiente de pH . La regin del nodo es cida
y la del ctodo es alcalina. Entre ambos se establece un gradiente de pH tal
que las molculas que se han de separar tenga su punto isoelctrico dentro del
rango.
Las sustancias que inicialmente se encuentran en regiones de pH inferior a su
punto isoelctrico estarn cargadas positivamente y migraran hacia el ctodo,
mientras aquellas que se encuentran en medios con pH ms bajos que su punto
isoelctrico tendrn carga negativa y migraran hacia el nodo. La migracin les
conducir a una regin dnde el pH coincidir con su punto isoelctrico,
tendrn una carga neta nula y se detendrn. De esta forma las molculas
anfotricas se sitan en estrechas bandas donde coincide su punto isoelctrico
con el pH.

Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)
Segn las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una prctica o
experimento, se utilizar un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos
mejoran la resolucin de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran
medida por el uso de esta tcnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que
precisa de dos geles y dos tampones diferentes.


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La PAGE-nativa se utiliza para separar protenas en condiciones no desnaturalizantes,
por tanto, en funcin de la carga intrnseca de las mismas. La SDS-PAGE es muy til
para calcular el peso molecular de una protena concreta ya que separa las protenas
segn su tamao. El isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensin que se
basa en la separacin de molculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoelctricos.
La electroforesis en gel en dos dimensiones combina el isoelectroenfoque (primera
dimensin) con la SDS-PAGE (segunda dimensin). Es una tcnica muy resolutiva, y el
mejor mtodo analtico para separar protenas que existe hoy en da.



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3. Electroforesis capilar
Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un mtodo comn y
efectivo para la separacin de molculas, el proceso de separacin puede durar varias
horas, siendo difcil de cuantificar y automatizar.
La tcnica aqu presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (110 m de
dimetro). Estos capilares disipan el calor rpidamente permitiendo la aplicacin de
campos elctricos elevados, reduciendo as los tiempos de separacin.

Factores que Afectan a la Electroforesis
Factores del Campo Elctrico
Potencial Elctrico, V, en Voltios
Voltaje normal: 10 500 V
Intensidad de Corriente, i, en Amperios
Relacionadas por la ley de Ohm
V = i R , R: resistencia, en ohmios
Condiciones ambientales
Temperatura
Aumenta con el paso de corriente (Efecto Joule).



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Caractersticas del soporte
Efectos de adsorcin, friccin y tamizado.
Propiedades de las molculas de la muestra
Carga y tamao (relacin carga/masa).
Mayor e cuanto mayor sea la carga neta y menor el tamao.
Factores de la disolucin
PH
Determina la carga de las molculas.
Tiende a variar por hidrlisis en los electrodos.
Siempre se utiliza un tampn.
Fuerza inica
Afecta a la conductividad elctrica.
Influye en el tamao efectivo de las molculas.

Tratamiento Postelectroforesis
Necesario para la deteccin y anlisis de resultados
Tratamiento del soporte
Fijacin: Precipitacin mediante cidos (actico, tricloroactico) o por
deshidratacin (metanol)
Tincin
No especfica
Para protenas: azul coomassi, negro amido, rojo Ponceau.
Para cidos nucleicos: bromuro de etidio (fluorescente).
Especfica
Implica la utilizacin de anticuerpos
Decoloracin
Anlisis de las bandas
Cuantificacin por densitometra



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Soluciones para la electroforesis
1. Tampn veronal/veronato sdico
Veronal/veronato sdico, pH 8,6
1 litro (g) 1 litro (g)
Veronal (cido
dietilbarbitrico)
1,84 15,45
Veronal sdico 10,40 2,76
Agua destilada Hasta 1 litro Hasta 1 litro

2. Tampn acetato/veronal
Acetato/veronal, pH 8,6
1 litro
Veronal sdico 10 g
Acetato sdico 6,5 g
HCl 0,1 M 64,5 ml
Agua destilada Hasta 1 litro

Soluciones de colorantes utilizados en las tinciones
1. Solucin de negro amido
Negro Amido
1 litro
Metanol 450 ml
cido actico 100 ml
Negro amido 6,0 g


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Agua destilada 450 ml

2. Solucin de azul de bromofenol
Azul de bromofenol
100 ml
Metanol 100 ml
Bicloruro de Hg A saturacin
Azul de bromofenol 100 mg

3. Solucin de azocarmin B
Azocarmin B
100 ml
Azocarmin B 10 g
Metanol (50%) 90 ml
cido actico 10 ml

Aplicaciones
cidos nucleicos
En los cidos nucleicos la direccin de migracin es del electrodo negativo al positivo, y
esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azcar-fosfato. En los
fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble hlice) la velocidad de migracin
es inversamente proporcional a su tamao. En fragmentos simples de ADN (una sola
cadena) y ARN, dichas molculas tienden a plegarse de forma compleja y a migrar de
forma ms complicada, segn la estructura terciaria formada tras el plegamiento.
Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces de puente de hidrgeno,
como el hidrxido de sodio o la formamida, son empleados para desplegar las
molculas plegadas y permitir que la velocidad de migracin dependa nicamente del
tamao y no de la estructura formada tras el plegamiento.



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Protenas
Por otra parte, las protenas no tienen una estructura predecible como los cidos
nucleicos, y por tanto sus velocidades de migracin no son similares entre ellas. Incluso
puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su punto
isoelctrico). En estos casos, las protenas se desnaturalizan mediante la adicin de un
detergente como el dodecilsulfato sdico/dodecilfosfato sdico (SDS/SDP).
Estos detergentes son agentes reductores que rompen los enlaces disulfuro,
separando a la protena en sus sub-unidades y adems le otorgan una carga neta
negativa que les permite migrar a travs del gel en relacin directa a su tamao, ya
que la cantidad de cargas negativas que se unen a la protena depende del tamao de
sta, existiendo una relacin masa/carga similar. Adems, la desnaturalizacin hace
que pierdan su estructura terciaria y por tanto su velocidad de migracin es
proporcional al tamao y no a su estructura terciaria. As, los ms grandes se desplazan
ms lentamente.
Revelado y visualizacin
Cuando se ha completado la electroforesis, las molculas ms pequeas han llegado al
nodo. Entonces se pueden revelar mediante la adicin de un colorante especfico
para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio, para los
cidos nucleicos, o la plata, para las protenas. Asimismo se emplean otros mtodos
para visualizar la separacin de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la
luz UV, se puede simplemente hacer una fotografa de la placa bajo dicha luz. Tambin,
si las molculas contienen tomos radiactivos se puede efectuar una autorradiografa.
Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producirn
separaciones paralelas. Cada separacin mostrar distintas bandas correspondientes a
cada componente de la mezcla. Si las separaciones son incompletas, se dar un
solapamiento entre bandas haciendo indistinguibles dos o ms componentes.
Las bandas en diferentes separaciones paralelas que estn a la misma distancia del
principio significa que contienen molculas que han atravesado el gel a la misma
velocidad.
Existen marcadores especiales que contienen una mezcla de molculas de tamao
conocido. Si se hace una electroforesis de un marcador con una mezcla desconocida,
las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las obtenidas en la
mezcla desconocida para determinar su tamao. La distancia a la que se encuentra la


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banda del principio es (aproximadamente) inversamente proporcional al logaritmo del
tamao de la molcula.

Fragmentos de ADN teidos en
bromuro de etidio tras una
electroforesis en un gel de agarosa

Protenas teidas con Coomassi tras
una electroforesis desnaturalizante
en geles de poliacrilamida



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Bibliografa

E.D.P. de Robertis, E.M.F. de Robertis I y II. Biologa Molecular y Celular
Krause, U., Thomson-carter, F.M. ? Pennington, T.H. 1996. Molecular
Epidemiology of Escherichia coli O157:H7 by Pulsed-Field Gel Electrophoresis
and Comparison with That by Bacteriophage Typing. J.Clin. Microbiol. 34:959-
961
Gonzlez de Buitrago JM (1985): Electroforesis . En Gonzlez de Buitrago JM
(eds): Tcnicas de Laboratorio Clnico, 1 ed. Editorial Alambra (Madrid,
Espaa), pp. 117 125.
Gonzlez de Buitrago JM (1998): Osmometra. Cromatografa. Electroforesis.
Tcnicas electroqumicas. En Gonzlez de Buitrago JM, Arilla E, Rodrguez-
Segade M, Snchez A (eds): Bioqumica Clnica, 1 ed. Editorial McGraw-Hill
Interamericana(Madrid, Espaa), pp. 17 27.
Vidal C (1988): Electroforesis. En Lozano JA, Tudelo J (eds): Prcticas de
Bioqumica. Experimentacin y Simulacin, 1 ed. Editorial Sntesis (Madrid,
Espaa), pp. 37 45.
Bioqumica y Biologa Molecular, Jess Salgado: Licenciatura en Medicina
(Curso 200708)
Asirvatham V. S., Watson B. S., Summer L. W. Analytical and biological
variances associated with proteomic studies of Medicago truncatula by two-
dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. Proteomics 2002, 2, 960-968.
Berkelman T., Stenstedt T. 2-D Electrophoresis using immobilized pH
gradients. Principles & methods. Amersham Pharmacia Biotech Inc. 1998.
Chen G., Gharib T. G., Huang C.-C., Taylor J. M. G., Misek D. E., Kardia S. L. R.,
Giordano T. J., Iannetonni M. D., Orringer M. B., Hanash S. M., Beer D.
G.Discordant Protein and mRNA Expression in Lung Adenocarcinomas. Mol Cell
Proteomics 2002, 1, 304-313.

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