UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

ESCUELA DE FARMACIA Y BIOQUMICA

PROYECTO DE INVESTIGACIN
EFECTO NORMOGLICEMIANTE DEL EXTRACTO HIDROALCOHLICO DE
Geranium ruizii Hieron EN RATAS INDUCIDAS CON ALOXANO

INTEGRANTES:

CASTILLO PARDO KLAUSS
FERNANDEZ REBAZA GUSTAVO
LLAHUILLA COTA LIZBETH
MAGALLANES QUISPE JHONNATAN
MONTES CJUNO JEANETT
QUIONES HUAYANEY MARA EUGENIA
TOLENTINO CHAVEZ JORGE LUIS
VIZCONDE MNDEZ SILVANA


DEPARTAMENTO ACADMICO DE BIOQUMICA

(UNIVERSIDAD DEL PER, DECANA DE AMRICA)
ASESORA: Dra. Gloria Gordillo
LIMA-PER
2014

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
(Universidad del Per, DECANA DE AMRICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA
I. TTULO
EFECTO NORMOGLICEMIANTE DEL EXTRACTO HIDROALCOHLICO DE
HOJAS DE Geranium ruizii Hieron EN RATAS INDUCIDAS CON ALOXANO
II. ANTECEDENTES
La diabetes es una enfermedad metablica crnica que aparece debido a que el pncreas no
fabrica la cantidad de insulina que el cuerpo humano necesita, o bien la fbrica de una calidad
inferior. La insulina, una hormona producida por el pncreas, es la principal sustancia
responsable del mantenimiento de los valores adecuados de azcar en sangre. Permite que la
glucosa sea transportada al interior de las clulas, de modo que stas produzcan energa o
almacenen la glucosa hasta que su utilizacin sea necesaria. Cuando falla, origina un aumento
excesivo del azcar que contiene la sangre (hiperglucemia).
1

Diabetes Mellitus se considera como una de las enfermedades crnicas ms complicadas de
tratar. La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que para el 2030 el nmero
de diabticos ser de 32.9 millones de personas en el mundo. El Per representa el 0.11% del
mercado farmacutico mundial. Hay que tener en cuenta que ms del 50% de los peruanos
se ubican en el nivel de pobreza y ms del 20% en extrema pobreza sin posibilidades de
acceso a medicamentos convencionales. Por lo tanto, se hace indispensable la bsqueda de
medicamentos eficaces y de bajo costo.
2

IMPORTANCIA DE LA REGULACIN DE LA GLICEMIA
La glucosa es el carbohidrato ms importante en los mamferos, por ser su principal fuente
de energa y, la nica en el feto y los tejidos glucodependientes (retina, eritrocitos y el epitelio
germinativo de las gonadas). Adems de esta vital funcin tiene otra de gran importancia,
por ejemplo: puede almacenarse como glucgeno, se puede transformar en lpidos, origina la
ribosa para los cidos nucleicos y puede formar complejos con protenas como en el
glucoclix.
3

En una persona normal, la concentracin de glucosa en la sangre, est regulada en limites
muy estrechos, habitualmente entre 70-110mg/dl en una persona en ayunas (8hs. aprox.).
Esta concentracin se eleva a 140mg/dl, una hora despus de la ingesta, pero un sistema
hormonal devuelve estos valores a los normales, cerca de las dos horas despus. A la inversa,
en momentos prolongados de inanicin, el hgado se encarga de mantener la glucemia
mediante la glucogenlisis y la gluconeognesis, principalmente. Como es de suponer este
fino balance es llevado a cabo por un preciso mecanismo hormonal.
Un valor elevado de glicemia promueve los siguientes efectos sobre el organismo:
La glucosa puede ejercer presin osmtica intensa en el lquido extracelular, y si
aumenta provocara una deshidratacin celular exagerada.
Diuresis osmtica renal que disminuye los lquidos y electrolitos orgnicos.
El incremento a largo plazo de la glicemia puede daar muchos tejidos, sobre todo,
los vasos sanguneos. Las lesiones vasculares, junto con una Diabetes Mellitus no
controlada, aumentan el riesgo de ataques al corazn, accidente cerebro vascular,
enfermedad renal terminal y ceguera.
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Existen dos principales mtodos para la determinacin de la glucosa: el mtodo PTGO y por
el mtodo de la glucosa oxidasa.
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a) DETERMINACION DE GLUCOSA POR EL METODO PTGO
Se puede realizar pero el mtodo PTGO (Prueba de tolerancia de la glucosa oral) en el cual
primero se toma una muestra de sangre para observar el nivel de glucosa en sangre, luego se
le proporciona un lquido que contiene una cierta cantidad de glucosa, despus de 30 a 60
minutos se realiza la toma de muestra de sangre para observar la variacin de los niveles de
glucosa.


b) DETERMINACIN DE GLUCOSA POR EL MTODO DE GLUCOSA OXIDASA
La reaccin de la glucosa oxidasa junto con una reaccin auxiliar se ha utilizado ampliamente
para la determinacin de la glucosa en los uidos biolgicos. Se han desarrollado multitud
de reacciones auxiliares distintas a n de mejorar la especicidad global del sistema de
reaccin o para retener la especicidad inherente de la glucosa oxidasa. El mtodo utilizado
en este reactivo se basa en la reaccin indicadora de perxido de hidrgeno que une 4-
aminoantipirina a un compuesto fenlico.






Figura 1: Reaccin de la glucosa oxidasa
EL CIDO URICO PLASMTICO
Se relaciona con factores de riesgo cardiovascular, especialmente con la hipertensin y la
Diabetes Mellitus. En el sndrome metablico, la hiperinsulinemia activa el sistema renina-
angiotensina-aldosterona y la angiotensina II acta como un inductor potente de actividad de
NADPH que aumenta las especies reactivas de oxgeno (EROX) y O2 en la intima-media
arterial. El estrs xido-reductivo agota los antioxidantes locales como la superxido
dismutasa (SOD), la glutatin peroxidasa y la catalasa; en estas condiciones, el cido rico
desarrolla su cambio de actividad antioxidante a prooxidante cuando penetra en la placa
aterosclertica, contribuyendo en ese medio a oxidar las lipoprotenas, en pacientes con
sndrome metablico y Diabetes Mellitus tipo 2.
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LAS TRANSAMINASAS

Las transaminasas GOT/AST y GPT/ALT son enzimas ampliamente difundidas en el
organismo con elevada concentracin en corazn, hgado, msculo esqueltico, rin y
eritrocitos. La actividad srica en condiciones normales es baja o nula. Un dao o enfermedad
en cualquiera de estos tejidos conduce a un aumento en los niveles sricos. As, luego de un
infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de GOT
(abundante en msculo cardaco).

En hepatitis virales y otras formas de enfermedad heptica que involucren necrosis tisular,
predominar la actividad srica de GPT (abundante en tejido heptico). Una elevada
actividad de transaminasas puede detectarse tambin en traumas accidentales o quirrgicos
y en distrofias musculares o miositis.

Fundamento del mtodo











Figura 2: Las reacciones de GOT

El piruvato formado (el oxalacetato es inestable y se transforma en piruvato), reacciona con
la 2,4-dinitrofenilhidracina producindose, en medio alcalino, un compuesto coloreado que
se mide a 505 nm.
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MECANISMOS HIPOGLICEMIANTES DE LAS PLANTAS
De acuerdo con Negri (2005), los mecanismos implicados en la accin de las plantas como
hipoglicemiante estn relacionados con los siguientes factores:
Aumento de la liberacin de insulina a travs de la estimulacin de las clulas -
pancreticas.
Resistencia a las hormonas que aumentan la cantidad de glucosa en sangre.
Aumento del nmero y de la sensibilidad de los sitios receptores de insulina
Disminucin de la prdida de glucgeno
Aumento del consumo de glucosa en rganos y tejidos
Eliminacin de radicales libres
Resistencia a la peroxidacin de los lpidos
Correccin de los trastornos metablicos causados en lpidos y protenas.
Estimulacin del aumento de la microcirculacin de la sangre en el cuerpo.
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Estudios In vitro
Los estudios in vitro, sirven como herramienta complementaria para explorar hallazgos
obtenidos con modelos in vivo y avanzar en el mecanismo de accin de un producto natural.
Los agentes antidiabticos convencionales pueden afectar diferentes vas del metabolismo de
la glucosa, como la secrecin de insulina, la captacin de glucosa por los rganos diana, y la
absorcin de nutrientes. Existen estudios in vitro, en los cuales se evala la secrecin de
insulina (con lneas celulares aisladas de los islotes pancreticos o, con lneas celulares
secretoras de insulina), o la captacin de glucosa. Otro de los enfoques teraputicos en este
tipo de estudios, es disminuir la hiperglicemia postprandial al retardar la absorcin de la
glucosa mediante la inhibicin de enzimas como la -amilasa y la -glucosidasa. Estudios
clnicos han demostrado que la ingesta de inhibidores de la -glucosidasa interfiere con la
degradacin de hidratos de carbono, reduciendo su tasa de absorcin y por tanto,
disminuyendo los niveles de glucosa postprandiales; previniendo de esta manera la aparicin
de diabetes y sus complicaciones.
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Se han realizado diversos estudios con plantas de efecto hipoglucemiante, pero solo hay
hiptesis de los posibles mecanismos de accin los cuales se presentan a continuacin:
El efecto hipoglucemiante observado es por la presencia de la enzima isomerasa
glucosa 6 fosfato, encontrada previamente en la Opuntia ficus-indica,5,6 pero no en
la Opuntia streptacantha.

Aislamiento e identificacin de compuestos tipo polisacridos en O. ficus-indica y O.
streptacantha con actividad hipoglucemiante proponen que los efectos observados
con el nopal, se deben a su contenido en fibra. Se sabe que la fibra es una mezcla de
lignina, celulosa, hemicelulosa, pectina, muclago y gomas, capaz de disminuir la
absorcin gastrointestinal de varios nutrientes; y en consecuencia los niveles
sanguneos de colesterol, triglicridos y glucosa disminuyen por falta de absorcin.

Para explicar el efecto de disminucin de insulina sangunea, se menciona una posible
accin inhibitoria de la fibra sobre el pptido gstrico, sustancia que normalmente
incrementa la sensibilidad del receptor de insulina e induce la liberacin de esta
hormona en los islotes de Langerhans. Los autores proponen un mecanismo
sensibilizante del receptor a la insulina. El argumento que apoya esta hiptesis es el
haber obtenido bajos niveles de insulina e importante efecto hipoglucmico.

Si consideramos que el modelo de produccin de hiperglicemia, utilizado por
nosotros, es el de diabetes qumica por aloxano, sustancia que destruye las clulas
beta del pncreas, encargadas de producir insulina, a priori, podramos inferir que
estas plantas protegen al pncreas de la accin txica del aloxano; sin embargo, en
estudios anteriores realizados, por nosotros, con Cuti Cuti, encontramos que esta
planta previene la hiperglicemia aloxnica y recupera, hasta lmites normales, la
glicemia incrementada por accin del aloxano, cuando suponemos que las clulas
beta ya fueron destruidas, como sera el caso del presente trabajo. Lo expuesto, nos
hace plantear la hiptesis de que estas plantas favoreceran la utilizacin de la
glucosa por parte de las clulas del organismo, con un efecto parecido a la insulina.
Los alcaloides constituyen los principios activos responsables del efecto
hipoglicemiante de las 4 plantas estudiadas.
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Las plantas medicinales con capacidad antidiabtica son una fuente de nuevos compuestos
en el tratamiento de la diabetes. La Pasuchaca (Geranium lechleri knuth ) es una de ellas,
oriunda del Per utilizada desde hace mucho tiempo para controlar los niveles de glucosa.
Esta planta se cultiva en la sierra del Per, a ms de 3500 metros sobre el nivel del mar, se
puede encontrar en los departamentos de Cajamarca, La Libertad, Cerro de Pasco y Ancash.
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Descripcin botnica
La planta es inherente, acaule, silvestre que crece en forma espontnea.
La raz es pivotante.
Las hojas son basales pubescentes, sostenidas por peciolos (21 mm de largo), alternas,
palmatipartidas en 7, dentibuladas. Los lbulos ampliamente cuneados - abovados.
Inflorescencia en umbela, pednculo, floral de 10 mm de largo.
Su flor es periantica, diclamidea, heteroclamidea, hermafrodita, actinomorfa.
Presenta en su base 5 verticilos de brcteas conolenas.
Su fruto es un esquizocrpico de tipo regma que procede de un gineceo pluricarpelar
con muchos estilos soldados entre s, pero al madurar el fruto se separa cada uno con
el correspondiente carpelo.
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Figura N 3: Pasuchaca
La pasuchaca en su composicin qumica presenta glucsidos (cianogenticos
antraquinnicos, anticinicos, saponnicos) gomas, muclagos, taninos, saponinas, clorofila,
grasas, esencias ceras, resinas, Flavonoides y Carotenoides que brindan un efecto
antioxidante, azucares reductoras.
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Las principales propiedades medicinales atribuidas a la Pasuchaca son: antidiabtico,
hipoglucemiante y depurador de la sangre; as mismo, se le considera un fuerte astringente,
se suele emplear para combatir diarreas crnicas, clera infantil, hemorragias, inflamaciones
de la garganta y lceras bucales.
En la medicina homeoptica se recomienda, adems de los casos ya mencionados, en las
blenorragias, diabetes, hemoptisis, menorragias, lceras de las mamas y atonas del estmago
y laringitis.
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Efecto hipoglucemiante: Segn varios estudios realizados sobre esta planta, se ha
podido verificar que la Pasuchaca es la especie vegetal que se le atribuye como
inhibidor de la -glucosidasa, la protena que degrada el glucgeno en la sntesis de
la glucosa.
Propiedades antidiabticas: Estimula la secrecin de la insulina por el pncreas con
el fin de eliminar el nivel de azcar en sangre. Otro beneficio importante mediante el
consumo de la Pasuchaca es que inhibe la gluconeognesis que es aumentada en los
diabticos o aumenta la captacin de insulina por sus receptores. Por lo tanto teniendo
en cuenta estas dos propiedades mencionadas anteriormente, esta planta est
recomendada para el tratamiento de ciertos tipos de diabetes (diabetes tipo I y II).
Poderoso astringente: Por lo que se utiliza para combatir la diarrea crnica,
hemorragias, inflamaciones de la garganta, clera infantil.
lceras bucales: De igual manera la Pasuchaca tambin se aplica como depurador de
la sangre.
Se utiliza desde hace muchos aos por el ser humano sin que se produzcan efectos colaterales,
se supone que su ingesta no implica riesgo para la salud.
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Se han llevado estudios en el Instituto Nacional de Salud, en cuanto a medir el efecto
hipoglicemiantes de la pasuchaca en conejos con diabetes experimental tratados con extracto
acuoso de Geranium delsianum Knuth, administrando una hora antes de cada determinacin
de glucosa (dosis de 10 g/kg p.c); observndose que la baja de glicemia empieza a la primera
hora, acentundose a la cuarta hora y mantenindose a la sptima.
Estos estudios revelaron que el extracto acuoso produjo un efecto hipoglicmico al ser
administrado por va oral a conejos diabticos (por accin del aloxano). Este efecto fue corto
y un poco menor a dosis nica de 5 g/kg p.c. que a dosis de 10 g/kg p.c. con la que lleg a
alcanzar el mximo efecto hipoglicemiante cuatro horas despus de la administracin del
extracto.
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Al administrar la droga cada dos horas (una antes de cada determinacin de la glicemia), se
verific que la hipoglicemia persiste hasta la sptima hora, siendo ms significativa con la
dosis de 10 g/kg p.c.
Se han efectuado estudios de toxicidad aguda, administrando extracto acuoso por va oral
mediante sonda metlica a ratones con ayuno de 14 horas; primero se busc por tanteo la
dosis aproximada (20, 30 y 100 g/kg p.c) que determina el efecto de un pequeo nmero de
animales, luego se procedi a hacer un ensayo de animales (10 ratones por grupo)
observndose la mortalidad en cada dosis empleada por un perodo de 7 das, sobre cuyos
resultados se practicaron los clculos estadsticos a fin de determinar la DL50 exacta.
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La dosis de 20 g/kg p.c. administrada al primer grupo no produjo muertes, en el segundo con
la dosis de 30 g/kg p.c. se produjo el 10% de muertes. El porcentaje de mortalidad aumenta
con el incremento de la dosis de 50 g/kg p.c. La DL50 corresponde a 35 g/kg p.c.
Despus de cada administracin de la droga y especialmente con las mayores dosis se
observ primero la fase de excitacin con aumento de la frecuencia respiratoria, por
aproximadamente 20 minutos, luego viene una fase de depresin disminuyendo la actividad
espontnea y la reaccin de alarma, y aumento de la pasividad; posteriormente algunos
experimentaron convulsiones seguidos de una muerte lenta. En la diseccin de los ratones se
observ distensin intestinal.
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III. PROBLEMA
El extracto hidroalcohlico de Geranium ruizii Hieron (Pasuchaca) tendr actividad
normoglicemiante sobre ratas hiperglicmicas inducidas con aloxano?

IV. HIPTESIS
El extracto hidroalcohlico de hojas de Geranium ruizii Hieron (pasuchaca) presenta
actividad normoglicemiante sobre una poblacin de ratas hiperglicmicas inducidas con
aloxano.


V. JUSTIFICACIN
En la actualidad, la diabetes se considera uno de los principales problemas de salud pblica
en el Per, debido a su elevada prevalencia, as como a la grave y variada morbilidad que
acompaa a esta enfermedad. Aunque no se conoce el nmero exacto de personas afectadas
por esta enfermedad se calcula que el 8% de la poblacin peruana (aproximadamente 2 400
000 personas) la padece.
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Es necesario buscar tratamientos alternativos como la herbolaria,
sin embargo debido a la poca informacin cientfica existente respecto a la eficacia, seguridad
y utilizacin de plantas como por ejemplo Geranium ruizii Hieron es necesario generar el
conocimiento que proporcione las bases necesarias en cuanto a la forma de utilizacin, dosis
y posibles efectos que estas plantas puedan producir, y as ofrecer una alternativa para el
mejor aprovechamiento de los recursos naturales.
VI. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL:
Determinar el efecto normoglicemiante del extracto hidroalcohlico de Geranium
ruizii Hieron (pasuchaca) en ratones macho con hiperglicemia inducida con aloxano
OBJETIVOS ESPECFICOS:
Elaborar el extracto hidroalcohlico de Geranium ruizii Hieron (pasuchaca)
Determinar los componentes qumicos del extracto hidroalcohlico de pasuchaca
Determinar los niveles de Glucemia en ratas
Determinar los niveles de cido rico y transaminasas en suero de ratas luego de la
administracin del extracto
Determinacin del posible mecanismo de accin hipoglicemiante
VII. MATERIAL Y EQUIPOS
MATERIALES
25 Papel Kraft
1 Tamiz N 16
5 bolsas de polietileno
3 frascos ambar de 2 L
Embudo de Buchner
1 pliego de papel filtro
1 recipiente de vidrio
Beakers
Tubos de ensayo
Probeta de 50 mL
Pipetas de 1 mL
Pipetas de 5 mL
Cromatofolios
Cuba cromatogrfica
Viales
Alcohol 96
Agua destilada
Metanol
Diclorometano
Cloroformo
n-Hexano
Benceno
Aloxano 5%
Reactivos

cido rico
in de transaminasas
terminacin de alfa glucosidasa
Reactivos de Precipitacin
Molish
Antrona
Fehling
Tricloruro de hierro
Gelatina
Shinoda
Ninhidrina
Dragendorff
Mayer
Bertrand
Sonnenschein
Borntrager
Leberman-Buchard
Hidrxido de amonio
Equipos
Estufa
Molino de cuchillas
Bomba de vaco o mquina de presin negativa DIVAC 0.6 L
Equipo de Bao Mara
Lmpara UV-infrarroja 365 nm-254nm Marca IVA Serial N M02 0955
Espectrofotmetro UV-visible
Glucosmetro
MATERIAL BIOLGICO
Se trabajar con cinco kilos de Pasuchaca (Geranium ruizii Hieron) obtenidas de los
alrededores del mercado mayorista La Parada, ubicado entre las avenidas Humboldt y
Aviacin.
ANIMALES DE EXPERIMENTACIN
Los animales que sern sometidos a este ensayo sern ratas albinas machos de la cepa
Holtzman con un peso promedio de 180g provenientes del Instituto Nacional de Salud.

VIII. METODOLOGA:
1. ETAPA FARMACOGNSTICA:
I. ELABORACIN DEL EXTRACTO
CONSERVACIN DE LA DROGA

Recoleccin de la muestra aproximadamente 5 kilos.
Identificacin de la muestra en el Museo de Historia Natural de la UNMSM, es este
caso se trata de Geranium ruizii Hieron Pasuchaca.
Seleccin de muestras en buen estado (se utiliz toda la planta).
Lavado y secado a temperatura ambiente de las plantas de Geranium ruizii Hieron
Pasuchaca.
Secado artificial en estufa (45C) de las plantas de Geranium ruizii Hieron
Pasuchaca.
Reduccin de tamao del material vegetal en molino de cuchillas.
Tamizado de la muestra (1 kilo en total) en mallas N10, N30, N40, N50 y N80
de los trozos de Geranium ruizii Hieron Pasuchaca.
Guardar en bolsas de polietileno el polvo de Geranium ruizii Hieron Pasuchaca.


ELABORACION DEL EXTRACTO

Maceracin hidroalcohlica (Agua: Alcohol 96) 50:50.
Los componentes solidos se colocan en un recipiente con el solvente y se deja reposar
durante un periodo de 2 semanas, agitndolo con frecuencia hasta la disolucin de
material soluble.
Filtracin al vaco (Embudo de Buchner, bomba de vaco).
Concentracin (Estufa de aire circulante, bandeja de vidrio).
Temperatura: 40C, Tiempo: 2 das.
Almacenamiento a temperatura ambiente.

Recoleccin Seleccin
Reduccion de tamao Almacenamiento
Tamizado
Figura 4: Proceso de elaboracin de extracto



II. COMPOSICIN QUMICA DE PASUCHACA (Geranium ruizii Hieron)
Pasuchaca revela la presencia de las sustancias tpicas para el gnero Geranium:
principalmente flavonoides, Alcaloides, taninos y tambin contiene glucsidos de
antocianinas, glucsidos de antraquinona, saponinas, gomas y muclagos de plantas, as como
los carotenoides, grasas (incluyendo cera), resinas y aceite etreo. Las cumarinas, esteroides
y triterpenos.
1

II.1 METABOLISMO Y TAMIZAJE FITOQUMICO

El tamizaje fitoqumico consiste en un conjunto de reacciones que se realizan para tener una
nocin de los posibles componentes qumicos de la planta en estudio.

II.2 COMPONENTES QUMICOS POR TAMIZAJE FITOQUMICO
Dentro de la gran variedad de componentes qumicos, tericamente la Tabebuia ochracea
presenta los siguientes componentes qumicos:
Macerado Filtrado
Secado Extracto seco
Figura 5: Proceso de elaboracin de extracto seco
FLAVONOIDES
De todos los compuestos fenlicos, el grupo de los flavonoides es el ms extendido en la
naturaleza y dentro de ellos, los flavonoles son los que poseen una mayor actividad
antioxidante. Estudios epidemiolgicos han demostrado que una ingestin rica en
flavonoides se correlaciona con un menor riesgo de enfermedad cardiovascular y se ha
observado que actan a diferentes niveles (tabla 2). Por un lado, disminuyen las tasas de
colesterol y de LDL oxidada debido a sus propiedades antioxidantes como fuertes quelantes
de metales y como donadores de hidrgeno (a travs de los grupos hidroxilo). As, en general,
el grado de actividad antioxidante se correlaciona con el nmero de grupos hidroxilo. Por
ello, los ortodifenoles son buenos antioxidantes, mientras que compuestos monofenol, como
el tirosol, no lo son tanto.
2
Segn un estudio de cuti cuti existen algunos principios activos aislados de las plantas como:
Los flavonoides y alcaloides que se encuentran en gran proporcin en esta y otras plantas con
efecto hipoglucemiante, entre los cuales tenemos a los flavonoides: rutina y quercetina que
cuentan con investigaciones probadas de su efecto hipoglucemiante; la quercetina ejerce un
efecto hipoglucemiante, inhibiendo a la enzima aldosa reductasa, la cual est relacionada con
la produccin de polioles, responsables de los efectos crnicos en la diabetes y, por sus
propiedades antioxidantes, reduce la incidencia de enfermedades cardiovasculares,
incluyendo las trombosis vasculares.
3, 4

En otro estudio relacionan el extracto etanlico, observaron mayor efecto hipoglicemiante (p
es menor que 0.05) y mejor proteccin del pncreas, hgado y rin del dao causado por
aloxano segn el estudio histopatolgico. Los hallazgos posiblemente justifican porque los
alcaloides podran inducir secrecin de insulina; los flavonoides libres actuaran como
barredores de especies reactivas de oxgeno, y los compuestos fenlicos que estaran ligados
a receptores proliferadores de peroxisomas.
5
II.3 RELACIN DE LOS COMPUESTOS QUIMICOS CON LA ACTIVIDAD
NORMOGLUCEMIANTE.
Grupos de compuestos qumicos relacionados con la actividad hipoglucemiante de plantas
son, de mayor a menor importancia: polisacridos, alcaloides, glucopptidos, terpenos,
pptidos, aminas, estero ides, flavonoides, lpidos, cumarinas, compuestos azufrados, iones
inorgnicos y otros.

La importancia del cromo en el metabolismo de los glcidos se debe a que, junto con el cido
nicotnico y aminocidos, forma parte del factor de tolerancia a la glucosa (GTF, Glucose
Toleran - ce Factor), protena cuya funcin es facilitar la unin de la insulina a los receptores
1. Drogas ricas en cromo.
celulares de insulina y por tanto aumentar la capacidad de esta hormona para transportar
aminocidos y glucosa al interior de la clula, ayudando a normalizar el nivel de glucosa en
sangre.









La actividad hipoglucemiante parece deberse a las saponinas esterodicas, a los pptidos
(similares a la insulina) y a los alcaloides, pero se desconoce si la actividad se debe
principalmente a uno de los grupos o al conjunto. Respecto al mecanismo de accin del
frmaco, todava no se conoce demasiado bien; algunos autores indican que la planta
momrdica incrementa el nmero de clulas beta en el pncreas, mientras que otros han
demostrado una actividad semejante a la insulina o de incremento de su liberacin.
Hallazgo de Aminoacidos
Causantes de la actividad hipoglucemiante parece tener un papel importante el aminocido
aislado como mayoritario, 4-hidroxi-isoleucina.cste parece ejercer un efecto directo sobre
islotes de Langerhans, incrementando la liberacin de insulina inducida por glucosa.
Hallazgo de Heterosido Cianogeneticos
Los extractos de diversas plantas pueden llegar a disminuir el nivel de glucosa como a la
alholva (se le ha llegado a llamar popularmente insulina vegetal). Algunos autores
atribuyen esta actividad a los hetersidos cianogenticos.
Hallazgo de Heterosido, Alcaloides, Peptidos
La actividad hipoglucemiante: Heterosidos de fitosteroles, pptidos bioactivos entre los que
destaca el polipptido P (pptido con 166 residuos, insulinomimtico) y alcaloides como la
momordicina. No se sabe cul de los tres grupos de principios es ms efectivo como
hipoglucemiante o si actan conjuntamente.
2. Especies vegetales ricas en polisacridos
CASO GOMA GUAR (Cyamopsis tetragonolobus L.): El efecto hipoglucemiante se debe
principalmente a la viscosidad que alcanza el muclago en contacto con el agua, capaz de
disminuir la velocidad de absorcin de los hidratos de carbono y de retrasar el vaciado
gstrico, lo que conlleva una mejor utilizacin de la insulina endgena, disminuyendo la
hiperglucemia y la insulinemia posprandial. Asimismo, tambin contribuye a disminuir la
colesterolemia, principalmente el cLDL, es un regulador intestinal, por lo que se puede
utilizar en algunos casos de diarreas. Adems, produce sensacin de saciedad, por lo que
tambin se utiliza en dietas de adelgazamiento.
3. Plantas con otros componentes qumicos
Hallazgo de Saponinas, pptidos y alcaloides
En un estudio realizado con animales, se ha demostrado que el jugo de los frutos aumenta el
nmero de clulas beta en el pncreas de ratas diabticas
Hallazgo de Peptidoglicanos
Los principales componentes con actividad hipoglucemiante son los panaxanos. Se ha
demostrado que los panaxanos A y B estimulan el uso heptico de la glucosa al aumentar la
actividad de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, la fosforilasa A y la fosfofructoquinasa. El
panaxano A no afecta a los niveles plasmticos de insulina ni a la sensibilidad a la misma
mientras que el panaxano B incrementa los niveles sanguneos de insulina al aumentar la
produccin de la misma desde los islotes pancreticos y aumenta la sensibilidad a la insulina
al aumentar el nmero de receptores para la misma
II.4 FUNDAMENTOS DE LAS REACCIONES QUMICAS DE LA
IDENTIFICACIN DE COMPONENTES QUMICOS
1.-Reconocimiento de carbohidratos: Entre las tcnicas de reconocimiento de
carbohidratos tenemos:
PRUEBA DE MOLISH: Al haberse depositado en el fondo del recipiente el cido sulfrico este
acta sobre la glucosa arrancndole una molcula de agua y volviendo la molcula de glucosa
un derivado del furfurral en este caso el hidroximetilenfurufural. Luego de esa reaccin se
mezcla con el alfa-naftol en presencia de cido sulfrico atacando la zona del doble enlace
del grupo carbonilo unindose en un compuesto mixto pues presenta sustituyentes cidos y
fenolicos que toma una coloracin rojiza violeta en un anillo del tubo de ensayo.
PRUEBA DE FEHLING: Coloracin rojiza en el fondo del recipiente demostrando que la sal
cprica se redujo a una sal cuprosa en este caso el xido cuproso, volvindose a regenerar el
tartrato de sodio, formndose el gluconato de sodio y el hidrxido de sodio.
2.-Reconocimiento de compuestos fenlicos:
Reaccin coloreada con el cloruro frrico:El fenol, as como otros compuestos que poseen
estructura enlica, da con el cloruro frrico color rojo o purpura. La reaccin es compleja y
no puede representarse por una ecuacin qumica simple; se cree que es debido a la formacin
de un complejo del hierro con ndice de coordinacin seis acompaada de una oxidacin del
fenol y reduccin por parte del frrico a ferroso. Reaccin muy sensible.
3.-Reconocimiento de taninos con gelatina: Los taninos precipitan las protenas en
solucin. Originan desde opalescencia blanca hasta precipitado. Tambin pueden hacer
precipitar alcaloides.
4.-Reaccin de Shinoda (Zn / HCl cc): El zinc en polvo reacciona con HClcc. El hidrgeno
generado produce por reduccin el in flavilio de color rojo escarlata (vara desde el rosa
muydbil hasta rojo escarlata). Todos los flavonoides, excepto chalconas, auronas, e
isoflavonas, dan positiva esta reaccin.
5.-Reaccin de Rosenheim: En la reaccin de Rosenheim, el cido clorhdrico produce una
deshidratacin del grupo hidroxilo de la posicin 3 de la leucoantocianidina y catequina, que
es favorecida por la temperatura (100C), adems se produce la ruptura del anillo
heterocclico. La deslocalizacin de 12 e y 2 e n, por todo el metabolito, produce la coloracin
roja de la leucoantocianidina y marrn de la catequina.
6.-Reaccin de Ninhidrina para aminocidos: La ninhidrina descarboxila y desamina al
aminocido gracias a su gran poder oxidante. La ninhidrina reducida reacciona con una
molcula de ninhidrina no reducida y con el amoniaco resultante de loa reaccin para formar
un compuesto complejo que presenta coloracin violeta.
7. Reconocimiento de Alcaloides: Las tcnicas de reconocimiento son basadas en la
capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal (extractos cidos), de combinarse con el
yodo y metales pesados como bismuto, mercurio, tugsteno formando precipitados; estos
ensayos preliminares se pueden realizar en el laboratorio o en el campo.
Se utilizan reactivos generales para detectar alcaloides como: la solucin de yodo-yoduro de
potasio (Reactivo de Wagner), mercurio tetrayoduro de potasio (reactivo de Mayer),
tetrayodo bismuto de potasio (reactivo de Dragendorff) la presencia de alcaloides se detecta
por la formacin de un precipitado naranja rojizo cuando se le adiciona esta reactivo a una
solucin cida de alcaloides. De los precipitados lavados se puede recuperar los alcaloides
con una solucin saturada de carbonato de sodio.Algunas sustancias oxigenadas con alta
densidad electrnica como es el caso de las cumarinas, chalconas, maltol, acetogeninas, etc.
pueden dar falsos alcaloides con el reactivo de Dragendorff.,cido slico tngtico (reactivo
de Bertrand).
6

8.- Reaccin de Borntrager: Pesamos unos gramos de droga en polvo, agregamos ml de
hidrxido de sodio diluido, decoccin 15 min, decantacin, mezclamos con HCl diluido,
adicionamos ter de petrleo, decantamos, fase no polar agregar hidrxido de amonio.
Observamos Coloracin rosada perteneciente a la genina y una coloracin amarillo
perteneciente al hetersido antroquinnico.
7
9.- Reaccin de Lieberman-Burchard: En un tubo de ensayo colocar 2 ml de solucin
clorofrmica de colesterol, aadir 10 gotas de anhdrido actico, y luego 3 gotas de cido
sulfrico concentrado.
8
10.- ndice afrosimtrico: Son sustancias que por disminucin de la tensin superficial
forman espuma (poder afrgeno) y forman emulsiones (emulgentes) Es la principal
propiedad fsica de las saponinas.
9
11.- Reaccin de Baljet: Las sesquiterpenlactonas producen coloraciones naranja cuando se
tratan con picrato de sodio o potasio.
10
12.- Ensayo de Legal: Las sesquiterpenlactonas con anillos g-lactona a,b-insaturados
producen coloracin rosa cuando se disuelven en piridina, se aade nitroprusiato de sodio y
un lcali. La prueba tambin la dan positiva las lactonas b,g-insaturadas cuando no se
controla el pH, ya que se isomerizan en medio alcalino. La prueba tambin la dan positiva
las metilncetonas.
11, 12
III. TAMIZAJE FITOQUMICO
Tabla N1: Tamizaje fitoqumico de pasuchaca
METABOLITO REACCIN PROCEDIMIENTO REACCIN POSITIVA
CARBOHIDRATOS
Molish X gotas de MP + III gotas de
Molish agitar +III gotas de
H2SO4CC
Anillo violeta
Antrona X gotas de MP + III gotas de
Antrona
Coloracion verde
Fehling X gotas de MP + III gotas de
Fehling A + III gotas de Fehling B +
calentar en B.M.
Precipitado rojo ladrillo
COMPUESTOS
FENLICOS
FeCl3 X gotas de MP + III gotas de FeCl3
10%
Taninos hidrolizables:
azul negruzco
Taninos condensados
(glicos y/o catquicos),
flavonoides: verde
TANINOS
Gelatina en suero
fisiolgico
X gotas de MP + III gotas de
gelatina
Precipitado denso
blanco
FLAVONOIDES
Shinoda X gotas de MP + 1-2 virutas de
magnesio metlico + III gotas de
HClcc
Chalconas, auronas,
isoflavanonas:
No hay coloracin.
Isoflavanonas: amarillo
rojizo.
Flavonolones: rojo a
magenta.
ANTOCIANINAS Y
FLAVONOIDES
CATQUICOS
Rosenheim
(sol. Yodo Yodurada)
X gotas de MP + III gotas de
Rosenheim
Coloracin rojo oscuro
AMINOCIDOS
LIBRES Y GRUPOS
AMINO
Ninhidrina (0,1%en
etanol)
X gotas de MP + III gotas de
Ninhidrina + calentar en B.M. 10
minutos.
Coloracin violcea
METABOLITO REACCIN PROCEDIMIENTO REACCIN POSITIVA
ALCALOIDES
Dragendorff X gotas de MP + evaporar el
solvente B.M + V gotas de HCl
10% +III gotas de Dragendorff
Precipitado naranja
Mayer X gotas de MP + evaporar el
solvente B.M + V gotas de HCl
10% + III gotas de Mayer
Precipitado blanco
Bertrand X gotas de MP + evaporar el
solvente B.M + V gotas de HCl
10% + III gotas de Bertrand
Precipitado blanco
Sonnenschein X gotas de MP + evaporar el
solvente B.M + V gotas de HCl
10% + III gotas de Sonnenschein
Precipitado amarillo-
verdoso
NAFTAQUINONAS,
ANTRAQUINONAS Y
ANTRONAS
Borntrager X gotas de MP + III gotas de
Borntrager
Coloracin roja
TRITERPENOIDES Y
ESTEROIDES
Lieberman-Burchard X gotas de MP + llevar a
sequedad en B.M + X gotas de
cloroformo + III gotas de
anhdrdo actico + H2 SO4CC en
zona sin agitar
Esteroides: Verde azul
Triterpenoides: Rojo-
naranja
SAPONINANS
Formacin de espuma 1mL de MP + 5mL de agua
destilada + agitar fuertemente
por 1min.
Formacin de 0.5 a 1cm
de espuma estable por
15min.
GLICSIDAS
Baljet X gotas de MP + V gotas de cido
pcrico 1% + V gotas de NaOH al
5%
Coloracin anaranjada
Vainilln Clorhdrico X gotas de MP + V gotas de
Vainilln clorhdrico
Coloracin rojiza
LACTONAS
Legal X gotas de MP + V gotas de
nitroprusiato de sodio 0.5% + V
gotas de KOH 2N
Coloracin rojo oscuro
CUMARINAS
NH4 OHcc X gotas de MP + papel
humedecido con NH4 OHcc en
boca de tubo + calentar por 5min
Fluorescencia celeste

IV. ENSAYO DE SOLUBILIDAD
En tubos de ensayo: mg del extracto seco en 1 mL de solvente.
Solvente
1.Agua
2.Metanol
3.Etanol
4.n-Butanol
5.Acetona
6.Acetato de etilo
7.Diclorometano
8.Cloroformo

IIV. Cromatografa
1. Cromatografa en capa fina
Preparacin de muestra: pesar 0,2 g de extracto seco y solubilizar en 1 ml de
agua destilada.
Fase estacionaria: cromatofolios de silicagel G 60F 254
Fase mvil: sistema de solventes diclorometano: metanol (1:1).
Deteccin: luz UV 254 nm y 365 nm.
Revelador: AlCl3.
2. Cromatografa preparativa
Preparacin de muestra: pesar 0,2 g de extracto seco y solubilizar en 1 ml de
agua destilada.
Fase estacionaria: cromatofolios de silicagel G 60F 254
Fase mvil: sistema de solventes diclorometano: metanol (1:1).
Deteccin: luz UV 254 nm y 365 nm.




2. ETAPA FARMACOLOGICA:
I. FASE FARMACOLGICA
Los animales de experimentacin fueron ratas Rattus norvegicus" cepa "Holtzman 180g a
220g y de dos meses de edad obtenidas del Centro Nacional de Produccin de Biolgicos del
Instituto Nacional de Salud. Las ratas fueron colocadas en jaulas con agua y alimento. La
alimentacin de estos animales fue con productos elaborados por la planta de alimentos del
Departamento de Nutricin de la Facultad de Zootecnia de la Universidad Nacional Agraria
La Molina.
II.1 INDUCCIN DE LA HIPERGLICEMIA EXPERIMENTAL
Se realiz con aloxano, producindose la necrosis de las clulas del pncreas. Se procedi
a seleccionar a las ratas en dosis 130 mg/kg de peso, va intraperitonial.
II.2 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO FARMACOLGICO
Las ratas fueron agrupadas en cuatro grupos: el primero para recibir el tratamiento con el
extracto hidroalcohlico de la planta Geranium ruizii Hieron. El segundo grupo para ser
tratadas con glibenclamida, el tercer grupo no recibir tratamiento y el cuarto grupo sera el
grupo control.
Se midi a las ratas la glucemia basal con ayuda del glucmetro ACCU- CHEK,
posteriormente a los tres primeros grupos se les administr aloxano 130 mg/kg de peso va
intraperitonial, el cuarto grupo no se le administr aloxano, al ser control.
El primer grupo de ratas aloxanadas se le administr por va oral un tratamiento diario con el
extracto hidroalcohlico de la planta Geranium ruizii Hieron tres dosis diferentes a un
subgrupo 125 mg/kg, a otro subgrupo 150 mg/kg y al ltimo 175mg/kg de peso.
El segundo grupo se le administr por va oral diariamente el frmaco glibenclamida que es
usado como hipoglicemiante a una dosis de 5mg/kg de peso.
Al tercer grupo de ratas aloxanadas no recibi ningn tratamiento, para poder comparar el
efecto hipoglucemiente del extracto en estudio y del frmaco glibeclamida.
El cuarto grupo de ratas no aloxanadas no recibi ningn tratamiento.
TABLA N 2 : Distribucin de los grupos de tratamiento.
GRUPO TRATAMIENTO
1 DIABTICAS + EXTRACTO DE PASUCHACA
125 mg/kg 150 mg/kg 175 mg/kg
2 DIABTICAS + GLIBENCLAMIDA
3 DIABTICAS
4 SANAS

II. 3. DETERMINACIN DE LOS NIVELES DE GLUCOSA
A las ratas se les hizo tomas de sangre los das 1, 2, 3, 4, 10, 13 da, para determinar los
niveles de glicemia. La sangre de las ratas se obtuvo mediante el corte de cola y midindole
en el glucmetro ACCU-CHEK.
II.4 REACCIONES BIOQUMICAS
Al terminar el tratamiento con el extracto y el frmaco se realiz los ensayos de transaminasas
(GOT y GPT), ureasa y creatinina directa. Se utiliz el plasma de las ratas el cual se obtuvo
al sacrificar al animal.
Se utiliz el kit de transaminasas 200 Wiener lab, creatinina directa Wiener lab para
determinar el dao ocasionado al hgado y al corazn al analizar estas enzimas.
II. DETERMINACIN DEL EFECTO NORMOGLICEMIANTE DEL EXTRACTO
Se utilizar el extracto a una concentracin de 250mg/kg (dosis adecuada para evaluar el
efecto hipoglucemiante segn el Instituto de Investigacin de la facultad de Medicina
USMP).
Los animales de experimentacin sern sometidos a las pruebas 48 horas despus de la
administracin del aloxano, momento en el cual se les tomar una prueba basal de glicemia
para evaluar si el nivel de glucosa est por encima de 300mg/dL (valor mnimo para
considerar diabetes qumica)
20
y todos los animales que cumplan este requisito se les
administrar la sustancia en estudio, por va oral, mediante sonda rgida.
Los controles sucesivos se efectuarn a la hora, dos, cuatro y 24 horas posteriores.
La determinacin los niveles de glucosa se realizar por medio de tiras reactivas ACCU-
CHEK y ledas mediante el glucmetro respectivo ROCHE. La sangre se obtendr de un
corte en la cola, que comprometer una vena marginal evitando la hemorragia.
III. DETERMINACIN DEL CIDO RICO EN SUERO
Se llevar a cabo mediante el mtodo cintico colorimtrico, utilizando kits Uricostat de
Laboratorios Wiener, considerando como valor normal en ratas machos concentraciones
sricas de 1.28 hasta 3.71 mg/dL.


IV. DETERMINACIN DE TRANSAMINASAS
Las enzimas AST y ALT sern valoradas utilizando un equipo de espectrofotometra, modelo
Konelab, se utilizar el kit comercial (Biosigma C.A). Se realizar el ensayo cintico basado
en las recomendaciones dictadas por la International Federation for Clinical Chemistry
(IFCC) para la determinacin de cada enzima, considerando como valor normal en ratas
machos concentraciones sricas de 61.4 hasta 276.2UI/L para AST y 41 hasta 83.1UI/L.
21

V. DETERMINACIN DEL MECANISMO DE ACCIN
De acuerdo con varias investigaciones sobre Geranium ruizii Hieron, esta planta
posiblemente aumenta la utilizacin perifrica de la glucosa o incrementa la captacin de la
misma por el msculo e inhibira la gluconeognesis heptica aumentada en los diabticos
o aumenta la recepcin de la insulina a sus receptores, considerando que la insulina no
ejerce efecto, para el transporte de la glucosa sobre ciertas clulas. La enzima en estudio
para este proyecto de investigacin ser la alfa glucosidasa.
IX. RESULTADOS
1. RESULTADOS FARMACOGNOSTICOS:
I. CONSERVACIN DE LA DROGA
TAMIZADO: Se realizaron 10 tamizados en las que se obtuvo como peso total
874,1902 gramos de la muestra.


Primera tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.7147g
Malla N30 44.8811g
Malla N40 21.3503g
Malla N50 10.0483g
Malla N80 9.1603g

Segunda tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.8102g
Malla N30 45.8177g
Malla N40 21.2354g
Malla N50 10.1422g
Malla N80 9.3545g

Tercera tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.6452g
Malla N30 45.1288g
Malla N40 21.1242g
Malla N50 10.1324g
Malla N80 9.0755g

Cuarta tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.8047g
Malla N30 46.4741g
Malla N40 22.1312g
Malla N50 10.0483g
Malla N80 10.0602g
Quinta tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.8466g
Malla N30 42.4622g
Malla N40 21.4566g
Malla N50 11.3214g
Malla N80 9.0032g

Sexta tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.6741g
Malla N30 44.1782g
Malla N40 22.2543g
Malla N50 10.9854g
Malla N80 9.7462g

Sptima tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.9120g
Malla N30 46.4041g
Malla N40 21.1012g
Malla N50 10.9351g
Malla N80 9.4003g

Octava tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.7147g
Malla N30 45.1701g
Malla N40 21.3503g
Malla N50 10.0483g
Malla N80 9.1603g

Novena tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.8902g
Malla N30 44.1145g
Malla N40 20.3541g
Malla N50 11.3687g
Malla N80 10.4589g
Decima tamizada.
N de malla Pesos
Malla N10 0.8450g
Malla N30 44.7101g
Malla N40 21.7481g
Malla N50 11.7140g
Malla N80 10.7033g

II. ELABORACION DEL EXTRACTO
Con la cantidad obtenida en el proceso de tamizado, se procedi al macerado usndose 2
frascos con 437.0951 gramos de muestra cada una, en un medio (Agua: Alcohol 96)
(50:50). Posteriormente se filtr y luego se concentr (Estufa de aire circulante, bandeja
de vidrio) a temperatura de 40C por el tiempo de 2 das obtenindose un extracto seco
de 46.47 gramos.
III. TAMIZAJE FITOQUIMICO
DROGA: TODA LA PLANTA
Tabla N : Resultados de las pruebas cualitativas
METABOLITO REACCIN OBSERVACIN
RESULTADOS
AGUA ALCOHOL
CARBOHIDRATOS
Molish
Formacin de un anillo violeta
(abajo)
++ ++
benedict Precipitado marrn +++ +++
Fehling
Precipitado rojo ladrillo muy
fino, se suspende rpido
+++ ++
COMPUESTOS FENLICOS FeCl3
Precipitado verde
oscuro/coloracin verde con
poco pp
+++ +
TANINOS
Gelatina Precipitado blanquecino +++ +
Agua de
Bromo
Precipitado rosado +++ -
TRITERPENOIDES Y
ESTEROIDES
Lieberman-
Burchard
Anillo rojizo en base ++ ++

FLAVONOIDES

Shinoda

Coloracin rosado naranja
+++ ++
GLICSIDAS Baljet Coloracin anaranjada ++ -
NAFTAQUINONAS,
ANTRAQUINONAS Y
ANTRONAS
Borntrager Coloracin rojiza +++ +++
AMINOCIDOS LIBRES Y
GRUPOS AMINO
Ninhidrina No se observ nada - -
Popoff No se observ nada - -
ALCALOIDES Dragendorff
Precipitado rojizo(casi
rosado)/solo coloracin
++ -
Mayer Turbidez/nada ++ -
Bertrand Precipitado blanco ++ -
Sonnenschein
Precipitado verde oscuro/solucin
mostaza con verde al fondo
+++ -
SAPONINAS

saponinas

Espuma (1,5 cm) que perdura por
ms de 10 minutos
++ No se hace
LEYENDA: (-) Negativo, (+)Trazas, (++)Moderado, (+++)Abundante












IV. Ensayo de solubilidad
Solvente Resultado
1.Agua +++
2.Metanol ++
3.Etanol +++
4.n-Butanol -
5.Acetona -
6.Acetato de etilo -
7.Diclorometano -
8. Cloroformo -
Figura N5 Reconocimiento cualitativo de alcaloides
V. Cromatografa
Cromatografa en capa fina
Fase mvil: diclorometano: metanol (1:1).
Deteccin: luz UV 254 nm y 365 nm.
Revelador: FeCl3.
Placa cromatogrfica sembrada

Revelado con luz UV 254 nm Revelado con luz UV 365 nm


1
2
3
4
5
Revelado con tricloruro frrico (FeCl3)


Cromatografa preparativa
Fase mvil: diclorometano: metanol (1:1).
Deteccin: luz UV 254 nm y 365 nm.
Placa cromatografica sembrada

1
2
3
Revelado con luz UV 254 nm Revelado con luz UV 365 nm



2. RESULTADOS FARMACOLGICOS:


Grupos Media Desv . Est . Prueba de Normalidad p
Blanco

108,7 11,02 0,463
Aloxano 130 mg/Kg

468,3 63,01 0,204
Glibenclamida 5 mg/Kg

475,2 51,45 0,246
Pasuchaca 125 mg/Kg

411,0 140,0
0.150
Pasuchaca 150 mg/Kg

527,0 37,48
Pasuchaca 175 mg /Kg

542,0 31,11
Tabla 1: Concentracin inicial de glucosa en sangre para cada grupo tratado, su Media y Desviacin
Estndar respectivamente, y la prueba de normalidad.
1
2
3
4
5
140 130 120 110 100 90 80
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
blanco
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
Media 108.7
Desv.Est. 11.02
N 3
KS 0.191
Valor P >0.150
Grfica de probabilidad de Blanco
Normal


650 600 550 500 450 400 350 300
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Aloxano
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
Media 468.3
Desv.Est. 63.01
N 6
KS 0.264
Valor P >0.150
Grfica de probabilidad de Aloxano
Normal


Figura 6: Grafica de probabilidad o curva de normalidad del grupo blanco con un p 0,05
Figura 7: Grafica de probabilidad o curva de normalidad del grupo Aloxano con un p 0,05


600 550 500 450 400 350
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Glibenclamida 5 mg /Kg
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
Media 475.2
Desv.Est. 51.45
N 5
KS 0.243
Valor P >0.150
Grfica de probabilidad de Glibenclamida 5 mg /Kg
Normal


800 700 600 500 400 300 200 100 0
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Pasuchaca 125 mg / Kg
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
Media 411
Desv.Est. 140.0
N 2
KS 0.260
Valor P >0.150
Grfica de probabilidad de Pasuchaca 125 mg/Kg
Normal


Figura 8: Grafica de probabilidad o curva de normalidad del grupo Glibenclamida con un p 0,05

Figura 9: Grafica de probabilidad o curva de normalidad del grupo Pasuchaca 125 mg/Kg con
un p 0,05.

625 600 575 550 525 500 475 450
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Pasuchaca 150 mg / Kg
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
Media 527.5
Desv.Est. 37.48
N 2
KS 0.260
Valor P >0.150
Grfica de probabilidad de Pasuchaca 150 mg / Kg
Normal



625 600 575 550 525 500 475 450
99
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
1
Pasuchaca 175 mg /Kg
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
Media 542
Desv.Est. 31.11
N 2
KS 0.260
Valor P >0.150
Grfica de probabilidad de Pasuchaca 175 mg / Kg
Normal


Figura 10: Grafica de probabilidad o curva de normalidad del grupo Pasuchaca 150 mg/Kg
con un p 0,05.
Figura 11: Grafica de probabilidad o curva de normalidad del grupo Pasuchaca 175 mg/Kg con
un p 0,05.
18 14 10 8 4 2 0
600
500
400
300
200
100
G
l
u
c
o
s
a
Aloxano 130 mg/Kg
Blanco
Glibenclamida 5 mg/Kg
Pasuchaca 125 mg/Kg
Pasuchaca 150 mg/Kg
Pasuchaca 175 mg/Kg
Tratamiento
Grfica Lineal Comparativa de Tratamientos

Figura 12: Grafica comparativa del efecto hipoglicemiantes de los grupos tratados a partir de
ratas diabticas.





Grupos

Eficacia %
Blanco

+7,38 %
Aloxano 130 mg/Kg

-28,12 %
Glibenclamida 5 mg/Kg

+65,03 %
Pasuchaca 125 mg/Kg

+14,84 %
Pasuchaca 150 mg/Kg

+20,97 %
Pasuchaca 175 mg /Kg

+44,83 %





Grupos Pre Tratamiento
(Induccin)
Post Tratamiento
(Da 18)
p
Blanco

108,7 11,02 100,67 2,31 0,055
Aloxano 130 mg/Kg 468,3 63,01 600,00,0 0,000
Glibenclamida 5 mg/Kg 475,2 51,45 166,240,0 0,000
Pasuchaca 125 mg/Kg 411,0 140,0 350,0135,8 0,702
Pasuchaca 150 mg/Kg 527,0 37,48 416,534,6 0,091
Pasuchaca 175 mg /Kg 542,0 31,11 299,032,5 0,017
Tabla 3: Comparacin de las concentraciones de glucosa antes y despus de cada tratamiento utilizando la prueba
estadstica T de Student con 0,05.
Tabla 4: Porcentaje de eficacia en el efecto hipoglicemiante de cada grupo tratado
P
a
s
u
c
h
a
c
a

1
7
5

m
g
/
K
g
P
a
s
u
c
h
a
c
a

1
5
0

m
g
/
K
g
P
a
s
u
c
h
a
c
a

1
2
5

m
g
/
K
g
G
l
i
b
e
n
c
l
a
m
i
d
a

5

m
g
/
K
g
B
l
a
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Grfica Comparativa de Eficacia





Figura 13: Grafica comparativa de eficacia en el efecto hipoglicemiante.
Tabla 5: Pruebas Bioqumicas de Transaminasas, Creatinina y BUN.
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Grfica de GPT (U/L)


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Grfica GOT (U/L)


Figura 14: Grfica comparativa en barras de las transaminasas GPT
Figura 15: Grfica comparativa en barras de las transaminasas GOT


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Grfica Creatinina (mg/L)


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Grfica de BUN (g/L)


Figura 16: Grfica comparativa en barras de Creatinina

Figura 12: Grfica comparativa en barras de la nitrgeno rico en sangre.

X. DISCUSION:
DISCUSION FARMACOGNOSTICA:
El proceso de conservacin de la droga es de suma importancia ya que depende mucho de
ello para obtener un resultado confiable en cualquier investigacin. Por ejemplo la
identificacin me evita las adulteraciones y sustituciones de la muestra y se debe realizar en
centros de referencia como herbarios nacionales. En cuanto a la seleccin y lavado de la
droga, me permite trabajar con muestras en buen estado y retirar tierra adherida
respectivamente. En cuanto al secado, este proceso es importante ya que interrumpe los
procesos de degradacin enzimtica y fermentacin, impide el desarrollo de
microorganismos y las reacciones de oxidacin e hidrolisis. En lo que respecta a la reduccin
del tamao de partculas, las drogas reducidas poseen membranas celulares parcialmente
reducidas que facilitan la disolucin de los constituyentes celulares en el lquido externo. El
tamizado es necesario para evitar reducir el rendimiento de la extraccin debido a la
compactacin de los polvos que dificultan el paso del solvente en el proceso de maceracin.
Y finalmente el almacenamiento de la droga que me permitir realizar posteriormente el
macerado.1
En proceso de elaboracin del extracto, la maceracin me permitir la extraccin de los
principios activos de la planta y para esto debemos tener en cuenta al momento de elegir el
solvente la cantidad de metabolitos a extraer, la velocidad de extraccin, diversidad de
metabolitos en la droga y no debe ser toxico ni interferir con el bioensayo.2
Algunas sustancias oxigenadas con alta densidad electrnica como es el caso de las
cumarinas, chalconas, maltol, acetogeninas, etc. pueden dar falsos alcaloides con el reactivo
de Dragendorff.
En trabajos anteriores el pool de alcaloides puede ser perjudicial para la salud debido a su
toxicidad, sin embargo la asociacin de este y flavonoides puede es buena debido a que
contrarresta la toxicidad.
La planta poseen gran cantidad de saponinas, alcaloides y flavonoides uno de estos
compuestos puede dar la actividad normoglicemiante o la actividad puede deberse en
conjunto. Para determinar si una molcula posee actividad ser necesario que se encuentre
su mecanismo, entre estos mecanismos sobre la normoglucemia destacan:
Antagonismo directo competitivo con la insulina, estimulacin de la secrecin de insulina,
estimulacin de la glucognesis y gluclisis heptica, adrenomimeticismo, bloqueo de los
canales de potasio de las clulas beta pancreticas, estimulacin del AMPc (segundo
mensajero) y modulacin de la absorcin de glucosa desde el intestino, entre otros.
El proceso de conservacin de la droga es de suma importancia ya que depende mucho de
ello para obtener un resultado confiable en cualquier investigacin. Por ejemplo la
identificacin me evita las adulteraciones y sustituciones de la muestra y se debe realizar en
centros de referencia como herbarios nacionales. En cuanto a la seleccin y lavado de la
droga, me permite trabajar con muestras en buen estado y retirar tierra adherida
respectivamente. En cuanto al secado, este proceso es importante ya que interrumpe los
procesos de degradacin enzimtica y fermentacin, impide el desarrollo de
microorganismos y las reacciones de oxidacin e hidrolisis. En lo que respecta a la reduccin
del tamao de partculas, las drogas reducidas poseen membranas celulares parcialmente
reducidas que facilitan la disolucin de los constituyentes celulares en el lquido externo. El
tamizado es necesario para evitar reducir el rendimiento de la extraccin debido a la
compactacin de los polvos que dificultan el paso del solvente en el proceso de maceracin.
Y finalmente el almacenamiento de la droga que me permitir realizar posteriormente el
macerado.1
En proceso de elaboracin del extracto, la maceracin me permitir la extraccin de los
principios activos de la planta y para esto debemos tener en cuenta al momento de elegir el
solvente la cantidad de metabolitos a extraer, la velocidad de extraccin, diversidad de
metabolitos en la droga y no debe ser toxico ni interferir con el bioensayo.2
DISCUSION FARMACOLOGICA:
En la presente investigacin se ha determinado la actividad hipoglicemiante empleando el
extracto hidroalcohlico de (planta) en ratas aloxanadas.
La diabetes experimental fue inducida con aloxano (130mg/Kg) el cual produce la toxicidad
selectiva de las clulas pancreticas, gran parte de estas clulas estn daadas pero no el
100% de ellas, quedando una pequea cantidad no necrosada, producindose una diabetes
tipo 2. El mecanismo del dao pancretico por el aloxano se justifica debido a su similitud
molecular con la estructura de la glucosa, por ello el aloxano debe ser recaptado por la clula,
va transportador de glucosa GLUT-2 de baja afinidad en la membrana plasmtica. El
aloxano pude generar especies reactivas de oxgeno (ROS), produciendo el cido dialrico,
por lo tando se asume que la accin txica del aloxano producida en las clulas es iniciada
por la formacin intracelular de radicales libres.
Los estudios realizados de la accin normoglicemiante de la pasuchaca tenemos al realizado
por Lara (2000)
1
, en su estudio determin el Efecto Hipoglucemiante y DL 50 del extracto
acuoso de hojas y flores de Geranium sessiliflorum Cav. "Pasuchaca" en animales de
experimentacin, no se encontr mortalidad en la dosis de 200,300 y 400 mg/Kg p.c. de los
extractos acuosos de dicha droga en estudio en las ratones; la dosis mnima efectiva del
extracto acuoso fue de 6.25 mg/Kg p.c en ratas normoglucmicas.
Chvez y Espinoza (1998)
2
, investigaron la Actividad biolgica de Geranium lechleri Knuth
(Pasuchaca) sobre la glucemia en animales de experimentacin cuyo extracto fue acuoso
atomizado de hojas; donde se hall la dosis media letal que es mayor a 12,5 g/kg de peso
corporal en ratas.
En este trabajo de investigacin se estudi la especie Geranium ruizii Hieron a dosis de 125
mg/kg, 150mg/kg y 175 mg/kg.
Antes de realizar el tratamiento se hizo la prueba de normalidad Tabla 1, con ello se verific
que los grupos tratados poseen una distribucin normal. Se puede observar en la figura
1,2,3,4,5,6 que los datos para cada grupo tratado ( Blanco, Aloxano, Pasuchaca,
Glibenclamida) presenta una curva casi lineal lo que nos indica que los datos no estn muy
dispersos y por lo tanto cumple con una distribucin normal. Una vez con ello se procedi al
anlisis de verificacin de hiptesis, la cual fue que el extracto hidroalcoholico de Geranium
ruizii Hieron tiene efecto hipoglicemiante en Rattus norvegicus de cepa Holtzman con
Diabetes Mellitus Tipo 2, para ello se utiliz la prueba estadstica T- Student con = 0,05,
se compar el estado inicial de las concentraciones de glucosa de las ratas diabticas con el
estado final despus de todo el tratamiento que fue por dieciocho das. En la Tabla 3 se
observa que el grupo tratado con pasuchaca a 125 mg/Kg su p es mayor que 0,05 lo cual
quiere decir que no hay una diferencia significatica, rechazando la hiptesis de su efecto
hipoglicemiante, lo mismo ocurre en el grupo tratado con pasuchaca a 150 mg/Kg. Sin
embargo, el grupo tratado con pasuchaca a 175 mg/Kg su p fue menor que 0,05, lo que quiere
decir que hay una diferencia significativa , aceptndose la hiptesis del efecto
hipoglicemiante de Geranium ruizii Hieron a esa concentracin. Paralelamente se realiz
esta prueba en un grupo tratado con un medicamento antihiperglicemiante Glibenclamida
que tambin mostr una diferencia significativa entre el estado inicial y final. En la Figura 7
se ve claramente las comparaciones del efecto hipoglicemiante en cada grupo, el grupo
Blanco que no fue inducido a la diabetes sus valores se mantienen constantes dentro del rango
normal, el grupo de ratas aloxanadas que no tuvieron algn tipo de tratamiento su glucosa se
elev al mximo HI, el grupo con Glibenclamida tuvo un buen efecto como era de esperar
por ser un medicamento seleccionado para esta enfermedad, el grupo con Pasuchaca mostr
su efecto a una concentracin de 175 mg/Kg .Una vez comprobado esto ,se realiz una
comparacin de eficacia entre el grupo tratado con Glibenclamida a 5 mg/Kg y la Pasuchaca
a 175 mg/Kg, y se observ Tabla 4 que la Glibenclamida es eficaz en un 65,03 % y la
Pasuchaca a 175 mg/Kg en un 44,83 % . Este resultado puede cambiar si se realiza estudios
complementarios trabajando con una mayor concentracin del extracto de pasuchaca, sin
embargo, a pesar de ello la planta presenta un efecto hipoglicemiante.
La dosis con mayor eficacia fue entonces de 175 mg/kg con 44,83 % de eficacia la dosis ms
alta presenta un mayor descenso de los niveles de glucosa.
El frmaco glibenclamida presenta mayor eficacia 65,03 % como en el estudio de Solgorr
(2005)
4
sobre el efecto del extracto hidroalcohlico de hojas y flores de Otholobium
pubescens culn la efecicaica de la glibenclamida es 74.44% y la planta 42.64%.
Cataeda (2011) demuestra que el extracto atomizado de Calophyllum brasiliense present
un buen efecto hipoglicemiante las tres dosis utilizadas de los extractos de Lagarto caspi
mostraron efecto hipoglicemiante, y fue mayor el efecto a la dosis de 1000 mg/kg de peso,
que super al efecto de la glibenclamida.
Es importante recalcar que nuestra biodiversidad es una importante fuente de productos
naturales para el mundo, es de vital importancia la identificacin de los principios activos
naturales, teniendo en cuenta que es necesario efectuar su caracterizacin completa y, se hace
imprescindible conseguir el establecimiento completo y correcto de su estructura. Sin
conocer la estructura correcta del compuesto no se puede progresar en la propuesta ni en la
realizacin de transformaciones que puedan servir para corregir algn efecto indeseable del
producto o para disminuir su toxicidad o para mejorar sus cualidades frmaco-teraputicas.
Teniendo en cuenta las limitaciones y los resultados obtenidos se recomienda realizar
estudios de mayor duracin por ser la diabetes mellitus una patologa crnica, as como
separar los metabolitos secundarios para verificar los posibles responsables de la actividad
farmacolgica, profundizar los estudios de seguridad con la finalidad de proyectar ensayos
clnicos controlados.
Las pruebas bioqumicas fueron realizadas para determinar si la enfermedad o el resultado
del tratamiento influyen en el equilibrio normal del buen funcionamiento de nuestro
organismo. En la Tabla 5 se observa los niveles de Creatinina, BUN, Transaminasas GOT y
GPT.
Las transaminasas GOT y GPT son enzimas ampliamente difundidas en el organismo con
elevada concentracin en corazn, hgado, msculo esqueltico, rin y eritrocitos.
La actividad srica en condiciones normales es baja o nula. Un dao o enfermedad en
cualquiera de estos tejidos conduce a un aumento en los niveles sricos. As, luego de un
infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de GOT
(abundante en msculo cardaco). En hepatitis virales y otras formas de enfermedad heptica
que involucren necrosis tisular, predominar la actividad srica de GPT (abundante en tejido
heptico).
26

En la Figura 9 se observa que el grupo tratado con Pasuchaca 175 mg/Kg y Glibenclamida
presenta mayor concentracin de GTP lo cual se sigue evidenciando problemas en el hgado,
en figura 10 las ratas diabticas del grupo aloxanado presenta mayor concentracin de GOT
lo que quiere decir que al no ser tratadas presentan problemas en el corazn, sin embargo, las
que presentan menor concentracin de estas son las que han sido tratadas con Glibenclamida
y Pasuchaca 175 mg/Kg.
La Creatinina producida diariamente est relacionada con la masa muscular. La creatinina
filtra libremente por el glomrulo (pequeas cantidades son reabsorbidas y tambin
secretadas por los tbulos renales).
La medicin de creatinina tiene utilidad casi exclusivamente para la evaluacin de la funcin
renal (perfusin renal alterada, prdida de la funcin de las nefronas) y en la monitorizacin
de la dilisis renal 3,5.
En la Figura 10 se observa que el grupo tratado con Pasuchaca a concentraciones menores de
125 mg/Kg presenta concentraciones elevadas de creatinina, presentando este grupo
problemas renales, esto puede deberse a la concentracin insuficiente del extracto lo cual no
ayuda a contrarrestar esta patologa. El grupo tratado con Glibenclamida y Pasuchaca 175
mg/Kg presentan menores niveles de creatinina, favoreciendo el tratamiento.
27

BUN corresponde a nitrgeno ureico en la sangre. El nitrgeno ureico es lo que se forma
cuando la protena se descompone. Los niveles superiores a lo normal pueden deberse a:
Insuficiencia cardaca congestiva, Niveles excesivos de protenas en el tubo digestivo,
Sangrado gastrointestinal, Hipovolemia (deshidratacin), Ataque cardaco, Enfermedad
renal, incluso glomerulonefritis, pielonefritis y necrosis tubular aguda, Insuficiencia renal.
Los niveles inferiores a lo normal pueden deberse a: Insuficiencia heptica, Dieta baja en
protena, Desnutricin, Sobrehidratacin. En la Figura 11 se observa que el grupo tratado con
Pasuchaca 150 mg/Kg presenta una mayor concentracin de UN, lo que significa que hay
problemas a nivel heptico, pancretico y renal, sin embargo, los que han sido tratados con
Glibenclamida y Pasuchaca 175 mg/Kg presentan niveles cercanos a lo normal, no se analiz
el grupo de ratas diabticas por la ausencia de datos.
28

XI. CONCLUSINES:
El extracto de pasuchaca presento actividad hipoglucemiante a dosis dadas, sin embargo se
podria extrapolar que a una mayor dosis la glicemia se normalizaria.
En cromatografia en capa fina y en preparativa con sistema de solventes
diclorometano:metanol (1:1) se obtuvo 5 manchas diferentes que se detecto con luz UV 254
nm y 365 nm.
En cromatografia en capa fina con el revelador tricloruro ferrico (FeCl3) se detecto
compuestos fenolicos en la 3 primeras manchas.
El extracto hidroalcohlicos de Geranium ruizii Hieron posee actividad hipoglicemiante,
pero no se lleg a demostrar que logre llegar a ndices normales de glucosa en sangre
(Normoglicemiante).
Se elabor el extracto estandarizado sin dificultades.
-Se determin constituyentes qumicos importantes como saponinas, alcaloides y flavonoides
los cuales podran dar el efecto hipoglicemiante.
-La accin del frmaco a dosis de 175mg/Kg es menos eficaz que la accin de la
glibenclamida, sin embargo esto podra variar si se aumenta la dosis de la planta.
















IX. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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