V o l . 3 6 , N o . 9 A N T I M I C R O B L A L A GEN T S A N D C HEM O T HER A PY, Se p t . 1 9 9 2 , p .

1 8 4 7 - 1 8 5 1
0 0 6 6 - 4 8 0 4 / 9 2 / 0 9 1 8 4 7 - 0 5 $ 0 2 . 0 0 / 0
C o p y r i g h t X ) 1 9 9 2 , A m e r i c a n So c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y
C r o s s - R e s i s t a n c e t o M e r o p e n e m , C e p h e m s , a n d Q u i n o l o n e s
i n Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a
N O B UHI SA M A SUDA * A N D SA T O SHI O HYA
B i o l o g i c a l R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , Sa n k y o C o . , L t d . , Sh i n a g a w a - k z , T o k y o 1 4 0 , J a p a n
R e c e i v e d 2 1 J a n u a r y 1 9 9 2 / A c c e p t e d 9 J u n e 1 9 9 2
M u l t i p l e - d r u g - r e s i s t a n t m u t a n t s w e r e i s o l a t e d f r o m Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a PA O 1 o n a g a r p l a t e s c o n t a i n -
i n g o f l o x a c i n a n d c e f s u l o d i n . T h e s e m u t a n t s w e r e f o u r t o e i g h t t i m e s m o r e r e s i s t a n t t o m e r o p e n e m , c e p h e m s ,
c a r b e n i c i l l i n , q u i n o l o n e s , t e t r a c y c l i n e , a n d c h l o r a m p h e n i c o l t h a n t h e p a r e n t s t r a i n w a s . I n c o n t r a s t , t h e s e
m u t a n t s s h o w e d n o s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n t h e i r s u s c e p t i b i l i t i e s t o a l l c a r b a p e n e m s e x c e p t m e r o p e n e m . I n t h e s e
m u t a n t s , t h e a m o u n t s o f a n o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n w i t h a n a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f 4 9 , 0 0 0 ( d e s i g n a t e d
O p r M ) w e r e i n c r e a s e d c o m p a r e d w i t h t h e a m o u n t i n PA 0 1 . M u l t i p l e - d r u g - r e s i s t a n t m u t a n t s o f t h i s t y p e w e r e
a l s o i s o l a t e d f r o m PA O 1 o n a g a r p l a t e s c o n t a i n i n g m e r o p e n e m . A p p r o x i m a t e l y 5 % o f c l i n i c a l i s o l a t e s s h o w e d
c r o s s - r e s i s t a n c e t o m e r o p e n e m , c e p h e m s , a n d q u i n o l o n e s , c o n c o m i t a n t w i t h o v e r p r o d u c t i o n o f O p r M .
M o r e o v e r , t h e s e t w o p h e n o t y p e s , i . e . , m u l t i p l e - d r u g r e s i s t a n c e a n d o v e r p r o d u c t i o n o f O p r M , w e r e c o t r a n s -
f e r a b l e b y t r a n s d u c t i o n . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t o v e r p r o d u c t i o n o f O p r M i s a s s o c i a t e d w i t h c r o s s - r e s i s t a n c e t o
m e r o p e n e m , c e p h e m s , a n d q u i n o l o n e s i n P. a e r u g i n o s a . T h e o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t m u t a n t r e q u i r e d
h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f m e r o p e n e m t o i n d u c e
1 3 - l a c t a m a s e
t h a n PA 0 1 d i d , i n d i c a t i n g t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h i s
m u t a t i o n i n v o l v e s d e c r e a s e d o u t e r m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y t o m e r o p e n e m .
Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a i s a c l i n i c a l l y i m p o r t a n t p a t h o -
g e n b e c a u s e o f i t s n a t u r a l r e s i s t a n c e t o m a n y a n t i m i c r o b i a l
a g e n t s . O n l y a f e w a n t i m i c r o b i a l a g e n t s , s u c h a s c a r b a p e n -
e m s a n d q u i n o l o n e s , h a v e p o t e n t a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y
a g a i n s t a b r o a d s p e c t r u m o f b a c t e r i a i n c l u d i n g P. a e r u g i -
n o s a . T h e m a i n r e a s o n f o r t h i s b a c t e r i a l r e s i s t a n c e i s t h o u g h t
t o b e t h e o r g a n i s m ' s l o w o u t e r m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y t o
a n t i m i c r o b i a l a g e n t s ( 1 , 2 2 ) . I n r e c e n t y e a r s , t h e n u m b e r o f
P. a e r u g i n o s a c l i n i c a l i s o l a t e s t h a t a r e r e s i s t a n t t o s o m e o f
1 9 , 2 1 ) . T h i s i s t h e r e a s o n t h a t t h e s e s t r a i n s d o n o t s h o w
c r o s s - r e s i s t a n c e t o o t h e r a n t i m i c r o b i a l a g e n t s , i n c l u d i n g
c e p h e m s a n d p e n i c i l l i n s . Ho w e v e r , w e r e c e n t l y i s o l a t e d
m e r o p e n e m - r e s i s t a n t P. a e r u g i n o s a s t r a i n s f r o m c l i n i c a l
s o u r c e s , a n d t h e s e s t r a i n s s h o w c r o s s - r e s i s t a n c e t o c e p h -
e m s , q u i n o l o n e s , a n d s o m e o t h e r a n t i b i o t i c s b u t n o t t o
i m i p e n e m a n d p a n i p e n e m .
I n t h i s a r t i c l e , w e d e s c r i b e t h e a s s o c i a t i o n o f t h i s c r o s s -
r e s i s t a n c e w i t h o v e r p r o d u c t i o n o f a n o u t e r m e m b r a n e p r o -
T A B L E 1 . Su s c e p t i b i l i t i e s o f P. a e r u g i n o s a c l i n i c a l i s o l a t e s t o a n t i b i o t i c s
St r a i n
M I C
( l L g / m l ) a
I PM PA PM M EPM L - 6 2 7 C FS C A Z C PZ C B PC O FL X C PFX T C C P GM
b
3 . 1 3 c 6 . 2 5 c 0 . 7 8 c 1 . 5 6 c
1 . 5 6 c 1 . 5 6 c 3 . 1 3 c
l o o 1
0 . 3 9 c 0 . 0 2 5 c
2 5 c 2 0 0 c
0 . 7 8 c
8 5 1 0 1 . 5 6 6 . 2 5 3 . 1 3 0 . 7 8 1 2 . 5 6 . 2 5 5 0 4 0 0 6 . 2 5 0 . 3 9 1 0 0 4 0 0 1 . 5 6
8 5 5 5 3 . 1 3 6 . 2 5 6 . 2 5 0 . 7 8 6 . 2 5 3 . 1 3 2 5 2 0 0 3 . 1 3 0 . 3 9 5 0 2 0 0 3 . 1 3
8 4 8 0 1 . 5 6 1 2 . 5 6 . 2 5 1 . 5 6 > 2 0 0 1 0 0 > 2 0 0 > 4 0 0 5 0 6 . 2 5 1 0 0 > 4 0 0 > 1 0 0
3 7 1 9 0 . 7 8 6 . 2 5 1 2 . 5 0 . 3 9 1 2 . 5 3 . 1 3 2 5 2 0 0 2 5 6 . 2 5 1 0 0 > 4 0 0 1 . 5 6
1 5 7 3 6 . 2 5 2 5 5 0 3 . 1 3 1 0 0 6 . 2 5 1 0 0 > 4 0 0 1 2 . 5 3 . 1 3 5 0 > 4 0 0 1 . 5 6
1 5 8 4 1 2 . 5 5 0 5 0 3 . 1 3 > 2 0 0 6 . 2 5 2 0 0 > 4 0 0 2 5 3 . 1 3 > 2 0 0 > 4 0 0 > 1 0 0
a
A b b r e v i a t i o n s : I PM , i m i p e n e m ; PA PM , p a n i p e n e m ; M EPM , m e r o p e n e m ; C FS, c e f s u l o d i n ; C A Z, c e f t a z i d i m e ; C PZ, c e f o p e r a z o n e ; C B PC , c a r b e n i c i l l i n ;
O FL X , o f l o x a c i n ; C PFX , c i p r o f l o x a c i n ; T C , t e t r a c y c l i n e ; C P, c h l o r a m p h e n i c o l ; GM , g e n t a m i c i n .
b
5 4 r a n d o m l y s e l e c t e d c l i n i c a l i s o l a t e s .
c
M I C f o r 5 0 % o f i s o l a t e s t e s t e d .
t h e s e a n t i b i o t i c s , e s p e c i a l l y t o q u i n o l o n e s , h a s i n c r e a s e d .
C a r b a p e n e m s , s u c h a s i m i p e n e m , p a n i p e n e m , a n d m e r o -
p e n e m , h a v e p o t e n t a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t i e s a g a i n s t P. a e r u g -
i n o s a . Ho w e v e r , c a r b a p e n e m - r e s i s t a n t P. a e r u g i n o s a s t r a i n s
h a v e a l r e a d y b e e n i s o l a t e d c l i n i c a l l y . M o s t o f t h e m l a c k t h e
o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n D2 ( 2 , 1 5 , 2 0 ) , w h i c h f o r m s a
s p e c i f i c c h a n n e l f o r b a s i c a m i n o a c i d s a n d c a r b a p e n e m s ( 7 ,
*
C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .
t e i n w i t h a n a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f 4 9 , 0 0 0 .
M A T ER I A L S A N D M ET HO DS
C h e m i c a l s . I m i p e n e m , p a n i p e n e m , m e r o p e n e m , a n d L - 6 2 7
( L J C 1 0 , 6 2 7 ) w e r e s y n t h e s i z e d a t t h e R e s e a r c h L a b o r a t o -
r i e s , Sa n k y o C o . , L t d . , T o k y o , J a p a n . O t h e r a n t i b i o t i c s u s e d
i n t h i s s t u d y w e r e a l l c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e p r o d u c t s . T h e
a n t i b i o t i c s a n d t h e i r s o u r c e s w e r e a s f o l l o w s : c e f s u l o d i n ,
T a k e d a C h e m i c a l I n d u s t r i e s , O s a k a , J a p a n ; c e f t a z i d i m e ,
1 8 4 7
A N T I M I C R O B . A GEN T S C HEM O T HER .
FI G. 1 . SDS- PA GE s h o w i n g t h e o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n s o f P.
a e r u g i n o s a PA O 1 ( l a n e 1 ) , m e r o p e n e m - s u s c e p t i b l e c l i n i c a l i s o l a t e s
1 8 8 2 ( l a n e 2 ) , 2 3 9 4 ( l a n e 3 ) , 1 5 9 6 ( l a n e 4 ) , 3 4 9 8 ( l a n e 5 ) , a n d 3 4 4 9
( l a n e 6 ) , a n d m e r o p e n e m - r e s i s t a n t c l i n i c a l i s o l a t e s 8 5 1 0 ( l a n e 7 ) ,
8 5 5 5 ( l a n e 8 ) , 8 4 8 0 ( l a n e 9 ) , 3 7 1 9 ( l a n e 1 0 ) , 1 5 7 3 ( l a n e 1 1 ) , a n d 1 5 8 4
( l a n e 1 2 ) . N u m b e r s o n t h e l e f t a r e m o l e c u l a r w e i g h t s ( i n t h o u s a n d s ) .
Gl a x o J a p a n , T o k y o , J a p a n ; c e f o p e r a z o n e , T o y a m a C h e m i -
c a l C o . , T o k y o , J a p a n ; c a r b e n i c i l l i n , Fu j i s a w a Ph a r m a c e u -
t i c a l C o . , O s a k a , J a p a n ; o f l o x a c i n , Da i i c h i Ph a r m a c e u t i c a l
C o . , T o k y o , J a p a n ; c i p r o f l o x a c i n , B a y e r Ph a r m a c e u t i c a l
C o . , O s a k a , J a p a n ; t e t r a c y c l i n e , L e d e r l e J a p a n , T o k y o ,
J a p a n ; c h l o r a m p h e n i c o l , Sa n k y o C o ; L t d . ; a n d g e n t a m i c i n
a n d c e p h a l o r i d i n e , Sh i o n o g i Ph a r m a c e u t i c a l C o . , O s a k a ,
J a p a n .
B a c t e r i a l s t r a i n s a n d b a c t e r i o p h a g e . P. a e r u g i n o s a c l i n i c a l
i s o l a t e s w e r e r a n d o m l y s e l e c t e d f r o m o u r c o l l e c t i o n a t
B i o l o g i c a l R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s . P. . a e r u g i n o s a PA O 1 , i t s
i s o g e n i c m u t a n t s , a n d PA 0 9 6 9 ( p r o C 1 3 0 ) w e r e a l s o u s e d .
Ph a g e F1 1 6 L w a s u s e d f o r t r a n s d u c t i o n .
I s o l a t i o n o f m u t a n t s . M e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s w e r e
i s o l a t e d b y p l a t i n g PA O 1 o n L - a g a r p l a t e s c o n t a i n i n g 3 , u g o f
m e r o p e n e m p e r m l . O f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t m u t a n t s
w e r e i s o l a t e d b y p l a t i n g PA O 1 o n L - a g a r p l a t e s t h a t c o n -
t a i n e d 1 , u g ( e a c h ) o f o f l o x a c i n a n d c e f s u l o d i n p e r m l .
Su s c e p t i b i l i t y t e s t i n g . M I C s w e r e d e t e r m i n e d b y t h e u s u a l
t w o f o l d a g a r d i l u t i o n t e c h n i q u e w i t h M u e l l e r - Hi n t o n I I a g a r
( B e c t o n Di c k i n s o n M i c r o b i o l o g i Sy s t e m s , C o c k e y s v i l l e ,
M d . ) a n d a n i n o c u l u m s i z e o f 1 0 c e l l s .
A s s a y o f o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n s . O u t e r m e m b r a n e p r o -
t e i n s o f P. a e r u g i n o s a g r o w n i n L b r o t h w e r e p r e p a r e d a n d
a n a l y z e d b y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c -
t r o p h o r e s i s ( SDS- PA GE) a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 6 ) .
A s s a y o f 1 3 - l a c t a m a s e . C e l l s w e r e g r o w n o v e r n i g h t i n
M u e l l e r - Hi n t o n b r o t h a n d t h e n d i l u t e d w i t h a 2 0 - f o l d v o l u m e
o f t h e s a m e p r e w a r m e d m e d i u m a n d i n c u b a t e d f o r 2 h a t
3 7 C w i t h s h a k i n g . A 1 / 2 0 t h v o l u m e o f m e r o p e n e m s o l u t i o n
w a s a d d e d , a n d t h e i n c u b a t i o n w a s c o n t i n u e d f o r 1 h a t 3 7 C .
Sa m p l e s w e r e w i t h d r a w n a n d m i x e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f
i c e - c o l d s a l i n e c o n t a i n i n g 8 0 0 , u g o f c h l o r a m p h e n i c o l p e r m l
t o i n h i b i t p r o t e i n s y n t h e s i s . C e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f -
u g a t i o n a t 7 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n a t 4 C , s u s p e n d e d i n i c e - c o l d
1 0 m M 3 - ( N - m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i c a c i d ( M O PS)
b u f f e r ( p H 7 . 5 ) , a n d t h e n b r o k e n w i t h a s o n i c a t o r ( B r a n s o n
So n i c Po w e r C o . , Da n b u r y , C o n n . ) f o r 2 0 s . Un b r o k e n c e l l s
w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n . T h e e n z y m e a c t i v i t y i n t h e
s u p e r n a t a n t w a s a s s a y e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t 2 6 0 n m
w i t h 5 0 , u M c e p h a l o r i d i n e i n 1 0 m M M O PS b u f f e r ( p H 7 . 5 ) a s
a s u b s t r a t e a t 3 7 C .
T r a n s d u c t i o n . T r a n s d u c t i o n s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d
b y Ha a s a n d Ho l l o w a y ( 8 ) .
R ESUL T S
Su s c e p t i b i l i t i e s a n d o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n s o f m e r o -
p e n e m - r e s i s t a n t c l i n i c a l i s o l a t e s . T h e m a j o r i t y o f P. a e r u g i -
n o s a c l i n i c a l i s o l a t e s s h o w e d h i g h e r s u s c e p t i b i l i t i e s t o m e r o -
p e n e m t h a n t o i m i p e n e m , a s r e p o r t e d p r e v i o u s l y b y Ed w a r d s
e t a l . ( 4 ) . Ho w e v e r , a p p r o x i m a t e l y 5 % o f t h e m s h o w e d l o w e r
s u s c e p t i b i l i t i e s t o m e r o p e n e m t h a n t o i m i p e n e m . T h e s u s -
c e p t i b i l i t i e s o f s i x P. a e r u g i n o s a c l i n i c a l i s o l a t e s t h a t s h o w e d
l o w e r s u s c e p t i b i l i t i e s t o m e r o p e n e m t h a n t o i m i p e n e m a r e
s h o w n i n T a b l e 1 , a l o n g w i t h m i n i m a l c o n c e n t r a t i o n s r e -
q u i r e d t o i n h i b i t 5 0 % o f r a n d o m l y s e l e c t e d c l i n i c a l i s o l a t e s .
T A B L E 2 . Su s c e p t i b i l i t i e s o f P. a e r u g i n o s a PA O 1 a n d i t s m u t a n t s t o a n t i b i o t i c s
M I C ( I g / m l ) a
St r a i n
I PM PA PM M EPM L - 6 2 7 C FS C A Z C PZ C B PC O FL X C PFX T C C P GM
Pa r e n t ( PA O 1 ) 0 . 7 8 6 . 2 5 0 . 2 0 0 . 2 0 0 . 7 8 0 . 3 9 1 . 5 6 2 5 0 . 3 9 0 . 0 5 1 2 . 5 2 5 1 . 5 6
W e a k l y
m e r o p e n e m
r e s i s t a n t
M R 0 2 1 2 . 5 2 5 3 . 1 3 6 . 2 5 0 . 7 8 0 . 7 8 3 . 1 3 2 5 0 . 3 9 0 . 0 5 1 2 . 5 2 5 3 . 1 3
M R 0 8 1 2 . 5 2 5 3 . 1 3 6 . 2 5 1 . 5 6 0 . 7 8 3 . 1 3 2 5 0 . 3 9 0 . 0 5 1 2 . 5 2 5 1 . 5 6
M R 3 9 1 2 . 5 2 5 3 . 1 3 6 . 2 5 1 . 5 6 0 . 7 8 3 . 1 3 2 5 0 . 3 9 0 . 0 5 1 2 . 5 2 5 1 . 5 6
Hi g h l y
m e r o p e n e m
r e s i s t a n t
M R 9 1 2 . 5 1 2 . 5 1 2 . 5 3 . 1 3 3 . 1 3 1 . 5 6 1 2 . 5 2 0 0 1 . 5 6 0 . 2 0 2 5 1 0 0 1 . 5 6
M R 2 7 1 2 . 5 1 2 . 5 1 2 . 5 3 . 1 3 3 . 1 3 1 . 5 6 1 2 . 5 2 0 0 3 . 1 3 0 . 3 9 5 0 2 0 0 1 . 5 6
M R 3 6 1 2 . 5 2 5 1 2 . 5 1 2 . 5 6 . 2 5 3 . 1 3 1 2 . 5 2 0 0 3 . 1 3 0 . 3 9 5 0 2 0 0 1 . 5 6
O f l o x a c i n -
c e f s u l o d i n
r e s i s t a n t
O C R 1 0 . 7 8 6 . 2 5 1 . 5 6 0 . 2 0 6 . 2 5 3 . 1 3 1 2 . 5 2 0 0 3 . 1 3 0 . 3 9 5 0 2 0 0 0 . 7 8
O C R 3 0 . 7 8 6 . 2 5 1 . 5 6 0 . 2 0 6 . 2 5 1 . 5 6 1 2 . 5 2 0 0 3 . 1 3 0 . 3 9 5 0 2 0 0 0 . 7 8
O C R 4 0 . 7 8 6 . 2 5 1 . 5 6 0 . 2 0 6 . 2 5 1 . 5 6 1 2 . 5 2 0 0 3 . 1 3 0 . 3 9 5 0 2 0 0 0 . 7 8
a
Fo r a b b r e v i a t i o n s , s e e T a b l e 1 .
1 8 4 8 M A SUDA A N D O HYA
C R O SS- R ESI ST A N C E I N P. A ER UGI N O SA 1 8 4 9
FI G. 2 . SDS- PA GE s h o w i n g t h e o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n s o f P.
a e r u g i n o s a PA 0 1 ( l a n e 1 ) a n d i t s m e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s
M R 0 2 ( l a n e 2 ) , M R 0 8 ( l a n e 3 ) , M R 3 9 ( l a n e 4 ) , M R 9 ( l a n e 5 ) , M R 2 7
( l a n e 6 ) , a n d M R 3 6 ( l a n e 7 ) . N u m b e r s o n t h e l e f t a r e m o l e c u l a r
w e i g h t s ( i n t h o u s a n d s ) .
T h e s e s t r a i n s a l s o s h o w e d r e d u c e d s u s c e p t i b i l i t i e s t o c e p h -
e m s ( i . e . , c e f s u l o d i n , c e f t a z i d i m e , a n d c e f o p e r a z o n e ) , c a r -
b e n i c i l l i n , q u i n o l o n e s ( i . e . , o f l o x a c i n a n d c i p r o f l o x a c i n ) ,
t e t r a c y c l i n e , a n d c h l o r a m p h e n i c o l .
T h e a m o u n t o f a n o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n w i t h a n a p p a r -
e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f 4 9 , 0 0 0 ( d e s i g n a t e d O p r M [ o u t e r
m e m b r a n e p r o t e i n r e s p o n s i b l e f o r m u l t i p l e - d r u g r e s i s t a n c e ] )
w a s i n c r e a s e d i n e a c h o f t h e s i x P. a e r u g i n o s a s t r a i n s ( Fi g .
1 , l a n e s 7 t h r o u g h 1 2 ) c o m p a r e d w i t h t h e a m o u n t s i n s t r a i n s
t h a t s h o w e d h i g h e r s u s c e p t i b i l i t i e s t o m e r o p e n e m t h a n t o
i m i p e n e m ( Fi g . 1 , l a n e s 2 t h r o u g h 6 ) . T h e r e w e r e a l s o s o m e
d i f f e r e n c e s i n t h e a m o u n t s o f o t h e r p r o t e i n s . T h e a m o u n t s o f
D2 p r o t e i n t e n d e d t o b e d e c r e a s e d i n t h e s t r a i n s t h a t s h o w e d
l o w e r s u s c e p t i b i l i t i e s t o a l l c a r b a p e n e m s . Ho w e v e r , t h e
d i f f e r e n c e s i n t h e a m o u n t o f O p r M w e r e t h e m o s t r e m a r k -
a b l e .
I s o l a t i o n o f m e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s f r o m PA O 1 . T o
s t u d y t h e m e c h a n i s m o f r e s i s t a n c e t o m e r o p e n e m i n P.
a e r u g i n o s a , w e i s o l a t e d m e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s f r o m
P. a e r u g i n o s a PA 0 1 o n L - a g a r p l a t e s c o n t a i n i n g 3 , u g o f
m e r o p e n e m p e r m l . T h e y w e r e i s o l a t e d a t a f r e q u e n c y o f
1 0 - 9 t o 1 0 - 8 . T h e s e m u t a n t s f e l l i n t o t w o t y p e s a c c o r d i n g t o
t h e i r s u s c e p t i b i l i t i e s t o m e r o p e n e m a n d o t h e r a n t i m i c r o b i a l
a g e n t s . T a b l e 2 s h o w s t h e s u s c e p t i b i l i t i e s o f r e p r e s e n t a t i v e
s t r a i n s o f e a c h t y p e a n d t h e i r p a r e n t s t r a i n , PA 0 1 , t o
a n t i m i c r o b i a l a g e n t s . O n e t y p e ( w e a k l y m e r o p e n e m r e s i s -
t a n t ) o f m u t a n t , c o m p r i s i n g M R 0 2 , M R 0 8 , a n d M R 3 9 , w a s 4
t o 3 2 t i m e s m o r e r e s i s t a n t t o a l l c a r b a p e n e m s t e s t e d t h a n i t s
p a r e n t s t r a i n . T h e w e a k l y m e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s
s h o w e d n o s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n s u s c e p t i b i l i t i e s t o t h e o t h e r
a n t i m i c r o b i a l a g e n t s . T h e o t h e r t y p e ( h i g h l y m e r o p e n e m -
r e s i s t a n t ) o f m u t a n t , c o m p r i s i n g M R 9 , M R 2 7 , a n d M R 3 6 ,
s h o w e d t h e s a m e l e v e l o f r e s i s t a n c e t o t h e c a r b a p e n e m s ,
FI G. 3 . SDS- PA GE s h o w i n g t h e o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n s o f P.
a e r u g i n o s a PA O 1 ( l a n e 1 ) a n d i t s o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t
m u t a n t s O C R 1 t h r o u g h O C R 8 ( l a n e s 2 t h r o u g h 9 ) a n d t h e m e r o -
p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t M R 2 7 ( l a n e 1 0 ) . N u m b e r s o n t h e l e f t a r e
m o l e c u l a r w e i g h t s ( i n t h o u s a n d s ) .
1 . 0 FL
f 0 . 8 1 .
I O
o 0 . 0 1 2 0 . 0 5 0 . 2 0 0 . 7 8 3 . 1 3
m e r o p e _ n ( Pg m l )
FI G. 4 . I n d u c t i o n o f 3 - l a c t a m a s e i n P. a e r u g i n o s a PA O 1 ( 0 ) a n d
t h e o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t m u t a n t O C R 1
( @ )
b y m e r o p e n e m .
w i t h t h e e x c e p t i o n o f m e r o p e n e m , a s t h e w e a k l y m e r o -
p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s . T h e h i g h l y m e r o p e n e m - r e s i s t a n t
m u t a n t s w e r e f o u r f o l d l e s s s u s c e p t i b l e t o m e r o p e n e m t h a n
t h e w e a k l y m e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s . T h e h i g h l y m e r o -
p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s a l s o h a d r e d u c e d s u s c e p t i b i l i t i e s t o
c e p h e m s , c a r b e n i c i l l i n , q u i n o l o n e s , t e t r a c y c l i n e , a n d c h l o r -
a m p h e n i c o l . T h e r e w e r e n o s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n t h e s u s -
c e p t i b i l i t i e s o f t h e h i g h l y m e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s t o
g e n t a m i c i n .
Fi g u r e 2 s h o w s o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n p r o f i l e s o f s i x
m e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s c o m p a r e d w i t h t h a t o f t h e i r
p a r e n t s t r a i n , PA Q 1 . N o n e o f t h e m u t a n t s p r o d u c e d D2
p r o t e i n . T h e a m o u n t s o f O p r M w e r e i n c r e a s e d i n t h e h i g h l y
m e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s , M R 9 , M R 2 7 , a n d M R 3 6 ,
c o m p a r e d w i t h t h e a m o u n t s i n PA 0 1 a n d t h e w e a k l y m e r o -
p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t s , M R 0 2 , M R 0 8 , a n d M R 3 9 . T h e
a m o u n t s o f a l l o t h e ' r p r o t e i n s w e r e c o m p a r a b l e t o t h o s e o f
PA O 1 .
I s o l a t i o n o f o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t m u t a n t s f r o m
PA O 1 . T o s t u d y t h e m e c h a n i s m o f c r o s s - r e s i s t a n c e t o m e r o -
p e n e m , c e p h e m s , a n d q u i n o l o n e s i n P. a e r u g i n o s a , w e
i s o l a t e d o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t m u t a n t s f r o m PA 0 1
o n L - a g a r p l a t e s t h a t c o n t a i n e d 1 , g ( e a c h ) o f o f l o x a c i n a n d
c e f s u l o d i n p e r m l . T h e o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t m u -
t a n t s w e r e o b t a i n e d a t a f r e q u e n c y o f 1 0 - 8 t o 1 0 - 7 . T h e
s u s c e p t i b i l i t i e s o f t l *f e e m u t a n t s , O C R 1 , O C R 3 , a n d O C R 4 ,
t o a n t i m i c r o b i a l a g e n t s a r e s h o w n i n T a b l e 2 . T h e o f l o x a c i n -
c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t m u t a n t s w e r e f o u r t o e i g h t t i m e s m o r e
r e s i s t a n t t o m e r o p e n e m , c e p h e m s , c a r b e n i c i l l i n , q u i n o l o n e s ,
t e t r a c y c l i n e , a n d c h l o r a m p h e n i c o l t h a n t h e p a r e n t s t r a i n
w a s . I n c o n t r a s t , t h e s e m u t a n t s s h o w e d n o s i g n i f i c a n t
c h a n g e s i n t h e i r s u s c e p t i b i l i t i e s t o a l l t h e c a r b a p e n e m s
e x c e p t m e r o p e n e m . T h e r e w e r e n o s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n t h e
s u s c e p t i b i l i t i e s o f t h e s e m u t a n t s t o g e n t a m i c i n .
Fi g u r e 3 s h o w s o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n p r o f i l e s o f e i g h t
o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t m u t a n t s t o g e t h e r w i t h t h o s e o f
PA 0 1 a n d a h i g h l y m e r o p e n e m - r e s i s t a n t m u t a n t , M R 2 7 . T h e
a m o u n t s o f O p r M w e r e i n c r e a s e d i n a l l o f t h e m u t a n t s
c o m p a r e d w i t h t h e a m o u n t i n PA O 1 . T h e r e w e r e n o s i g n i f i -
c a n t c h a n g e s i n t h e p r o d u c t i o n o f o t h e r p r o t e i n s .
1 3 - L a c t a m a s e i n d u c i b i l i t y o f t h e o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s -
t a n t m u t a n t . PA Q 1 a n d i t s o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t
m u t a n t , O C R 1 , w e r e t e s t e d f o r t h e i r 1 3 - l a c t a m a s e i n d u c i b i l i t y
t o c h e c k f o r t h e p o s s i b i l i t y o f a c h a n g e i n t h e p e r m e a b i l i t y o f
t h e m u t a n t t o
m e r o p e n e m . T h e y w e r e i n c u b a t e d w i t h v a r i -
o u s c o n c e n t r a t i o n s . ( 0 0 1 2 t o 3 . 1 3 p , g / m l ) o f m e r o p e n e m f o r 1
h , a n d t h e i n d u c e d 3 - l a c t a m a s e w a s q u a n t i f i e d . T h e r e w a s a
p r o g r e s s i v e i n d u c t i o n o f f - l a c t a m a s e i n b o t h PA Q 1 a n d
O C R 1 a s t h e c o n c e n t r a t i o n o f m e r o p e n e m w a s i n c r e a s e d
( Fi g . 4 ) . O C R 1 r e q u i r e d h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f m e r o -
p e n e m t h a n PA 0 1 t o . s h o w t h e s a m e l e v e l s o f i n d u c t i o n .
O C R 1 r e q u i r e d a l m o s t t h e s a m e c o n c e n t r a t i o n s o f i m i -
V O L . 3 6 , 1 9 9 2
A N T I M I C R O B . A GEN T S C HEM O T HER .
T A B L E 3 . Su s c e p t i b i l i t i e s o f P. a e r u g i n o s a PA 0 9 6 9 a n d t r a n s d u c t a n t s t o a n t i b i o t i c s
St r a i n
I PM PA PM M EPM L - 6 2 7 C FS C A Z C PZ C B PC O FL X C PFX T C C P GM
PA 0 9 6 9 0 . 7 8 6 . 2 5 0 . 1 0 0 . 1 0 0 . 7 8 0 . 7 8 6 . 2 5 5 0 0 . 2 0 0 . 0 1 2 1 2 . 5 5 0 0 . 2 0
T 9 0 . 3 9 6 . 2 5 0 . 7 8 0 . 1 0 6 . 2 5 6 . 2 5 2 5 4 0 0 3 . 1 3 0 . 2 0 5 0 4 0 0 0 . 2 0
T 2 7 0 . 3 9 6 . 2 5 0 . 7 8 0 . 1 0 6 . 2 5 6 . 2 5 2 5 4 0 0 3 . 1 3 0 . 2 0 5 0 4 0 0 0 . 2 0
T 3 6 0 . 3 9 6 . 2 5 0 . 7 8 0 . 1 0 6 . 2 5 6 . 2 5 5 0 4 0 0 3 . 1 3 0 . 2 0 1 0 0 4 0 0 0 . 2 0
a
Fo r a b b r e v i a t i o n s , s e e T a b l e 1 .
p e n e m , p a n i p e n e m , a n d L - 6 2 7 a s PA O 1 t o i n d u c e t h e s a m e
l e v e l s o f 3 - l a c t a m a s e ( d a t a n o t s h o w n ) .
T r a n s d u c t i o n o f m u l t i p l e - d r u g r e s i s t a n c e . C e l l - f r e e l y s a t e
o f t h e g e n e r a l i z e d t r a n s d u c i n g p h a g e F1 1 6 L w a s p r e p a r e d
w i t h O C R 1 a n d u s e d f o r t r a n s d u c t i o n t o a r e c i p i e n t , PA 0 9 6 9
( p r o C 1 3 0 ) . T h e t r a n s f e r o f a m i n o a c i d p r o t o t r o p h y w a s u s e d
a s t h e p r i m a r y c r i t e r i o n o f s e l e c t i o n f o r t r a n s d u c t a n t s .
Ei g h t y - s e v e n t r a n s d u c t a n t s w e r e o b t a i n e d o n m i n i m a l m e -
d i u m c o n t a i n i n g g l u c o s e a s t h e o n l y c a r b o n s o u r c e . T w e n t y -
o n e ( 2 4 %) o f 8 7 t r a n s d u c t a n t s i s o l a t e d g r e w o n L - a g a r p l a t e s
t h a t c o n t a i n e d 1 , u g ( e a c h ) o f o f l o x a c i n a n d c e f s u l o d i n p e r m l .
T a b l e 3 s h o w s t h e s u s c e p t i b i l i t i e s o f t h r e e r e p r e s e n t a t i v e
t r a n s d u c t a n t s t h a t w e r e r e s i s t a n t t o o f l o x a c i n a n d c e f s u l o d i n .
T h e y s h o w t h e s a m e p h e n o t y p e o f r e s i s t a n c e t o t h e d o n o r ,
O C R 1 . Fi g u r e 5 s h o w s o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n p r o f i l e s o f
n i n e r e p r e s e n t a t i v e t r a n s d u c t a n t s t h a t s h o w e d m u l t i p l e - d r u g
r e s i s t a n c e . Ea c h o f t h e m p r o d u c e d a h i g h e r a m o u n t o f O p r M
t h a n t h e r e c i p i e n t s t r a i n , PA 0 9 6 9 .
DI SC USSI O N
O f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t m u t a n t s p r o b a b l y h a v e a
s i n g l e m u t a t i o n , b e c a u s e s u c h m u t a n t s c o u l d b e i s o l a t e d a t a
f r e q u e n c y o f 1 0 - 8 t o 1 0 ' . T h e c r o s s - r e s i s t a n c e t o a n t i m i -
c r o b i a l a g e n t s o f s e v e r a l d i f f e r e n t c a t e g o r i e s s u g g e s t s t h a t
t h i s r e s i s t a n c e i n v o l v e s a c h a n g e i n o u t e r m e m b r a n e p e r m e -
a b i l i t y . T h e r e s u l t s o f , - l a c t a m a s e i n d u c t i o n a r e c o n s i s t e n t
w i t h r e d u c e d d r u g p e r m e a t i o n , a l t h o u g h a n a l t e r n a t i v e p o s -
s i b i l i t y - t h a t t h e c e l l m e m b r a n e c o m p o n e n t ( s ) t h a t i n t e r a c t s
w i t h 1 - l a c t a m s t o i n i t i a t e i n d u c t i o n h a s r e d u c e d a f f i n i t y f o r
m e r o p e n e m - c a n n o t b e e x c l u d e d .
A n a s s o c i a t i o n o f o v e r p r o d u c t i o n o f O p r M w i t h c r o s s -
r e s i s t a n c e t o m e r o p e n e m , c e p h e m s , c a r b e n i c i l l i n , q u i n o l o -
n e s , t e t r a c y c l i n e , a n d c h l o r a m p h e n i c o l i n P. a e r u g i n o s a w a s
d e m o n s t r a t e d i n b o t h c l i n i c a l i s o l a t e s a n d PA O 1 m u t a n t s
i s o l a t e d w i t h m e r o p e n e m o r o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n . A s i g n i f i -
c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n - r e s i s t a n t
1 4 5
J
7 8 1 1 1
FI G. 5 . SDS- PA GE
s h o w i n g t h e o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n s o f P.
a e r u , g i n o s a
PA 0 9 6 9 ( l a n e 1 ) , t r a n s d u c t a n t s T 9 ( l a n e 2 ) , T 1 6 ( l a n e 3 ) ,
T 2 7 ( l a n e 4 ) , T 2 8 ( l a n e 5 ) , T 3 6 ( l a n e 6 ) , T 4 4 ( l a n e 7 ) , T 1 6 4 ( l a n e 8 ) ,
T 1 6 6 ( l a n e 9 ) , a n d T 1 7 3 ( l a n e 1 0 ) , a n d t h e o f l o x a c i n - c e f s u l o d i n -
r e s i s t a n t m u t a n t O C R i ( l a n e 1 1 ) . N u m b e r s o n t h e l e f t a r e m o l e c u l a r
w e i g h t s ( i n t h o u s a n d s ) .
m u t a n t s a n d a w i l d - t y p e s t r a i n c o u l d b e f o u n d o n l y i n O p r M .
M o r e o v e r , t w o p h e n o t y p e s , m u l t i p l e - d r u g r e s i s t a n c e a n d
o v e r p r o d u c t i o n o f O p r M , w e r e c o t r a n s f e r a b l e b y t r a n s d u c -
t i o n f o r a l l s t r a i n s t e s t e d . T h e r e f o r e , o v e r p r o d u c t i o n o f
O p r M i n t h e s e m u t a n t s i s p r o b a b l y a s s o c i a t e d w i t h a n
a l t e r a t i o n o f o u t e r m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y t o m e r o p e n e m ,
c e p h e m s , c a r b e n i c i l l i n , q u i n o l o n e s , t e t r a c y c l i n e , a n d c h l o r -
a m p h e n i c o l . A l t h o u g h a r e d u c t i o n i n t h e a m o u n t o f a 5 5 - k Da
b a n d w a s s e e n i n s o m e s t r a i n s ( Fi g . 1 , 2 , a n d 5 ) , i t w a s
i n d e p e n d e n t o f t h e i r s u s c e p t i b i l i t i e s t o a n t i b i o t i c s . T h i s
p r o t e i n w a s p r o b a b l y a n e s t e r a s e ( 1 4 ) , a n d i t s e e m e d n o t t o
b e r e l a t e d t o m u l t i p l e - d r u g r e s i s t a n c e .
T w o t y p e s o f q u i n o l o n e r e s i s t a n c e i n P. a e r u g i n o s a a r e
w e l l k n o w n : ( i ) a l t e r a t i o n s i n DN A g y r a s e ( 9 , 1 0 , 1 7 , 1 8 ) a n d
( i i ) a l t e r a t i o n s i n o u t e r m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y ( 3 , 5 , 9 , 1 7 ,
1 8 ) . n a l B m u t a n t s a r e k n o w n t o s h o w r e s i s t a n c e t o q u i n o l o -
n e s , , B - l a c t a m s , t e t r a c y c l i n e , a n d c h l o r a m p h e n i c o l w h i c h i s
d u e t o d e c r e a s e d o u t e r m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y ( 5 , 1 7 ) . n a l B
a n d p r o C a r e r e p o r t e d t o b e c o t r a n s d u c i b l e a t a f r e q u e n c y o f
2 . 5 % w i t h p h a g e G1 0 1 ( 1 7 ) . W e s h o w e d t h a t t h e m u t a t i o n f o r
m u l t i p l e - d r u g r e s i s t a n c e a n d p r o C i n O C R 1 w e r e c o t r a n s -
d u c i b l e a t a f r e q u e n c y o f 2 4 % w i t h p h a g e F1 1 6 L . T h e s e
r e s u l t s s t r o n g l y s u g g e s t t h a t o u r i s o l a t e d o f l o x a c i n - c e f s u l o -
d i n - r e s i s t a n t m u t a n t s p r o b a b l y h a v e m u t a t i o n s a t t h e n a l B
l o c u s .
L i v e r m o r e a n d Ya n g ( 1 2 ) r e p o r t e d t h a t c a r b e n i c i l l i n - r e s i s -
t a n t m u t a n t s o f P. a e r u g i n o s a h a d d e c r e a s e d s u s c e p t i b i l i t i e s
t o m e r o p e n e m , c e p h e m s , p e n i c i l l i n s , n a l i d i x i c a c i d , t e t r a c y -
c l i n e , a n d c h l o r a m p h e n i c o l b u t n o t t o i m i p e n e m . T h i s p h e -
n o t y p e o f r e s i s t a n c e i s s i m i l a r t o t h a t o f o u r i s o l a t e d m u t a n t s .
Ho w e v e r , t h o s e a u t h o r s d i d n o t m e n t i o n c h a n g e s i n t h e
o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n p r o f i l e s , e x c e p t f o r a d e c r e a s e d
e x p r e s s i o n o f D2 p r o t e i n . M u l t i p l e - d r u g - r e s i s t a n t m u t a n t s
t h a t s h o w c r o s s - r e s i s t a n c e t o q u i n o l o n e s a n d i m i p e n e m h a v e
a l s o b e e n r e p o r t e d ( 5 , 1 6 ) . I n t h e s e s t r a i n s , r e s i s t a n c e t o
i m i p e n e m s e e m s t o r e s u l t f r o m d e c r e a s e d p r o d u c t i o n o f D2
p r o t e i n . T h e s e s t r a i n s h a v e a n n f x C m u t a t i o n , w h i c h i s
d i f f e r e n t f r o m t h e n a l B m u t a t i o n ( 5 ) .
De c r e a s e s i n s u s c e p t i b i l i t y t o m e r o p e n e m , a s s o c i a t e d w i t h
o v e r p r o d u c t i o n o f O p r M i n o u r PA O 1 m u t a n t s , w e r e s e e n i n
b o t h D2 - p r o d u c i n g a n d D2 - d e f i c i e n t s t r a i n s , w h e r e a s t h e
l e v e l o f r e s i s t a n c e t o m e r o p e n e m w a s h i g h e r i n D2 - d e f i c i e n t
s t r a i n s t h a n i n D2 - p r o d u c i n g s t r a i n s . T h i s i n d i c a t e s t h a t
p e r m e a t i o n t h r o u g h t h e D2 c h a n n e l i s n o t r e s p o n s i b l e f o r t h e
m e c h a n i s m ( s ) o f t h e r e s i s t a n c e a s s o c i a t e d w i t h o v e r p r o d u c -
t i o n o f O p r M .
Ko m a t s u e t a l . ( 1 1 ) r e p o r t e d t h a t i n t r o d u c t i o n o f t h e r o m A 4
g e n e o f En t e r o b a c t e r c l o a c a e i n t o Es c h e r i c h i a c o l i r e s u l t e d
i n r e s i s t a n c e t o a m p i c i l l i n , c e p h e m s , q u i n o l o n e s , t e t r a c y -
c l i n e s , a n d c h l o r a m p h e n i c o l , w i t h t h e c o n c o m i t a n t a p p e a r -
a n c e o f a n e w o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n . N i c a s a n d Ha n c o c k
( 1 3 ) a l s o r e p o r t e d t h a t o v e r e x p r e s s i o n o f o u t e r m e m b r a n e
p r o t e i n Hi i n P. a e r u g i n o s a r e s u l t e d i n d e c r e a s e d s u s c e p t i -
b i l i t i e s t o g e n t a m i c i n , p o l y m y x i n B , a n d EDT A . T h e y h y -
1 8 5 0 M A SUDA A N D O HYA
C R O SS- R ESI ST A N C E I N P. A ER UGI N O SA 1 8 5 1
p o t h e s i z e d t h a t Hi p r o t e i n r e p l a c e s d i v a l e n t c a t i o n s a t
n e g a t i v e l y c h a r g e d s i t e s o n l i p o p o l y s a c c h a r i d e s a n d b l o c k s
p e n e t r a t i o n o f t h e s e a n t i b i o t i c s . T h e f u n c t i o n o f O p r M i n P.
a e r u g i n o s a i s u n c l e a r . I t i s , h o w e v e r , p o s s i b l e t h a t o v e r p r o -
d u c e d O p r M i n t e r a c t s w i t h e i t h e r l i p o p o l y s a c c h a r i d e s o r
p h o s p h o l i p i d s a n d t h u s a l t e r s o u t e r m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y
t o m e r o p e n e m , c e p h e m s , c a r b e n i c i l l i n , q u i n o l o n e s , t e t r a c y -
c l i n e , a n d c h l o r a m p h e n i c o l t h r o u g h a n u n k n o w n p e n e t r a t i o n
p a t h w a y ( s ) .
O u r d a t a s u g g e s t t h a t o v e r p r o d u c t i o n o f O p r M , w i t h a n
a s s o c i a t e d l a c k o f D2 p r o t e i n , l e a d s t o h i g h e r r e s i s t a n c e t o
m e r o p e n e m i n P. a e r u g i n o s a . M e r o p e n e m m a y s e l e c t t h i s
t y p e o f m u l t i p l e - d r u g - r e s i s t a n t s t r a i n s .
A C KN O W L EDGM EN T
W e a r e g r a t e f u l t o M a t s u h i s a I n o u e , Ki t a s a t o Un i v e r s i t y , Ka n a -
g a w a , J a p a n , f o r h i s h e l p f u l a d v i c e a n d k i n d g i f t s o f P. a e r u g i n o s a
PA 0 9 6 9 a n d b a c t e r i o p h a g e .
R EFER EN C ES
1 . A n g u s , B . L . , A . M . C a r e y , D. A . C a r o n , A . M . B . Kr o p i n s k i ,
a n d R . E. W . Ha n c o c k . 1 9 8 2 . O u t e r m e m b r a n e p e r m e a b i l i t y i n
Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a : c o m p a r i s o n o f a w i l d - t y p e w i t h a n
a n t i b i o t i c - s u p e r s u s c e p t i b l e m u t a n t . A n t i m i c r o b . A g e n t s C h e -
m o t h e r . 2 1 : 2 9 9 - 3 0 9 .
2 . B u s c h e r , K. - H. , W . C u l i m a n n , W . Di c k , a n d W . O p f e r k u c h .
1 9 8 7 . I m i p e n e m r e s i s t a n c e i n Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a r e s u l t -
i n g f r o m d i m i n i s h e d e x p r e s s i o n o f a n o u t e r m e m b r a n e p r o t e i n .
A n t i m i c r o b . A g e n t s C h e m o t h e r . 3 1 : 7 0 3 - 7 0 8 .
3 . C h a m b e r l a n d , S. , A . S. B a y e r , T . Sc h o l l a a r d t , S. A . W o n g , a n d
L . E. B r y a n . 1 9 8 9 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f m e c h a n i s m s o f q u i n o l o n e
r e s i s t a n c e i n Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a s t r a i n s i s o l a t e d i n v i t r o
a n d i n v i v o d u r i n g e x p e r i m e n t a l e n d o c a r d i t i s . A n t i m i c r o b .
A g e n t s C h e m o t h e r . 3 3 : 6 2 4 - 6 3 4 .
4 . Ed w a r d s , J . R . , P. J . T u r n e r , C . W a n n o p , E. S. W i t h n e l l , A . J .
Gr i n d e y , a n d K. N a i r n . 1 9 8 9 . I n v i t r o a n t i b a c t e r i a l a c t i v i t y o f
SM - 7 3 3 8 , a c a r b a p e n e m a n t i b i o t i c w i t h s t a b i l i t y t o d e h y d r o p e p -
t i d a s e I . A n t i m i c r o b . A g e n t s C h e m o t h e r . 3 3 : 2 1 5 - 2 2 2 .
5 . Fu k u d a , H. , M . Ho s a k a , K. Hi r a i , a n d S. l y o b e . 1 9 9 0 . N e w
n o r f l o x a c i n r e s i s t a n c e g e n e i n Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a PA O .
A n t i m i c r o b . A g e n t s C h e m o t h e r . 3 4 : 1 7 5 7 - 1 7 6 1 .
6 . Fu k u o k a , T . , N . M a s u d a , T . T a k e n o u c h i , N . Se k i n e , M . I j i m a ,
a n d S. O h y a . 1 9 9 1 . I n c r e a s e i n s u s c e p t i b i l i t y o f Ps e u d o m o n a s
a e r u g i n o s a t o c a r b a p e n e m a n t i b i o t i c s i n l o w - a m i n o - a c i d m e d i a .
A n t i m i c r o b . A g e n t s C h e m o t h e r . 3 5 : 5 2 9 - 5 3 2 .
7 . Go t o h , N . , a n d T . N i s h i n o . 1 9 9 0 . De c r e a s e s o f t h e s u s c e p t i b i l i t y
t o l o w m o l e c u l a r w e i g h t 1 - l a c t a m a n t i b i o t i c s i n i m i p e n e m -
r e s i s t a n t Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a m u t a n t s : r o l e o f o u t e r m e m -
b r a n e p r o t e i n D2 i n t h e i r d i f f u s i o n . J . A n t i m i c r o b . C h e m o t h e r .
2 5 : 1 9 1 - 1 9 8 .
8 . Ha a s , D. , a n d B . W . Ho l l o w a y . 1 9 7 7 . T h e g e n e t i c o r g a n i z a t i o n o f
a r g i n i n e b i o s y n t h e s i s i n Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a . M o l . Ge n .
Ge n e t . 1 5 4 : 7 - 2 2 .
9 . Hi r a i , K. , S. Su z u e , T . I r i k u r a , S. l y o b e , a n d S. M i t s u h a s h i .
1 9 8 7 . M u t a t i o n s p r o d u c i n g r e s i s t a n c e t o n o r f l o x a c i n i n Ps e u d o -
m o n a s a e r u g i n o s a . A n t i m i c r o b . A g e n t s C h e m o t h e r . 3 1 : 5 8 2 -
5 8 6 .
1 0 . I n o u e , Y. , K. Sa t o , T . Fu j i i , K. Hi r a i , M . , I n o u e , S. I y o b e , a n d
S. M i t s u h a s h i . 1 9 8 7 . So m e p r o p e r t i e s o f s u b u n i t s o f DN A g y r a s e
f r o m Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a PA O 1 a n d i t s n a l i d i x i c a c i d -
r e s i s t a n t m u t a n t . J . B a c t e r i o l . 1 6 9 : 2 3 2 2 - 2 3 2 5 .
1 1 . Ko m a t s u , T . , M . O h t a , N . Ki d o , Y. A r a k a w a , H. I t o , a n d N .
Ka t o . 1 9 9 1 . I n c r e a s e d r e s i s t a n c e t o m u l t i p l e d r u g s b y i n t r o d u c -
t i o n o f t h e En t e r o b a c t e r c l o a c a e r o m A g e n e i n t o O m p F p o r i n -
d e f i c i e n t m u t a n t s o f Es c h e r i c h i a c o l i K- 1 2 . A n t i m i c r o b . A g e n t s
C h e m o t h e r . 3 5 : 2 1 5 5 - 2 1 5 8 .
1 2 . L i v e r m o r e , D. M . , a n d Y. J . Ya n g . 1 9 8 9 . C o m p a r a t i v e a c t i v i t y o f
m e r o p e n e m a g a i n s t Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a s t r a i n s w i t h w e l l -
c h a r a c t e r i z e d r e s i s t a n c e m e c h a n i s m s . J . A n t i m i c r o b . C h e m o -
t h e r . 2 4 ( Su p p l . A ) : 1 9 1 - 1 9 8 .
1 3 . N i c a s , T . I . , a n d R . E. W . Ha n c o c k . 1 9 8 0 . O u t e r m e m b r a n e
p r o t e i n Hi o f Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a : i n v o l v e m e n t i n a d a p -
t i v e a n d m u t a t i o n a l r e s i s t a n c e t o e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e ,
p o l y m y x i n B , a n d g e n t a m i c i n . J . B a c t e r i o l . 1 4 3 : 8 7 2 - 8 7 8 .
1 4 . O h k a w a , I . , S. Sh i g a , a n d M . Ka g e y a m a . 1 9 7 9 . A n e s t e r a s e o n
t h e o u t e r m e m b r a n e o f Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a f o r t h e h y d r o l -
y s i s o f l o n g c h a i n a c y l e s t e r s . J . B i o c h e m . 8 6 : 6 4 3 - 6 5 6 .
1 5 . Q u i n n , H. P. , E. J . Du d e k , C . A . Di V i n c e n z o , D. A . L u c k s , a n d
S. A . L e r n e r . 1 9 8 6 . Em e r g e n c e o f r e s i s t a n c e t o i m i p e n e m d u r i n g
t h e r a p y f o r Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a i n f e c t i o n s . J . I n f e c t . Di s .
1 5 4 : 2 8 9 - 2 9 4 .
1 6 . R h d b e r g , G. , L . E. N i l s s o n , a n d S. Sv e n s s o n . 1 9 9 0 . De v e l o p m e n t
o f q u i n o l o n e - i m i p e n e m c r o s s r e s i s t a n c e i n Ps e u d o m o n a s a e r u g -
i n o s a d u r i n g e x p o s u r e t o c i p r o f l o x a c i n . A n t i m i c r o b . A g e n t s
C h e m o t h e r . 3 4 : 2 1 4 2 - 2 1 4 7 .
1 7 . R e l l a , M . , a n d D. Ha a s . 1 9 8 2 . R e s i s t a n c e o f Ps e u d o m o n a s
a e r u g i n o s a PA O t o n a l i d i x i c a c i d a n d l o w l e v e l s o f 3 - l a c t a m
a n t i b i o t i c s : m a p p i n g o f c h r o m o s o m a l g e n e s . A n t i m i c r o b .
A g e n t s C h e m o t h e r . 2 2 : 2 4 2 - 2 4 9 .
1 8 . R o b i l l a r d , N . J . , a n d A . L . Sc a r p a . 1 9 8 8 . Ge n e t i c a n d p h y s i o -
l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f c i p r o f l o x a c i n r e s i s t a n c e i n Ps e u d o -
m o n a s a e r u g i n o s a PA O . A n t i m i c r o b . A g e n t s C h e m o t h e r . 3 2 :
5 3 5 - 5 3 9 .
1 9 . Sa t a k e , S. , E. Yo s h i h a r a , a n d T . N a k a e . 1 9 9 0 . Di f f u s i o n o f
P- l a c t a m a n t i b i o t i c s t h r o u g h l i p o s o m e m e m b r a n e s r e c o n s t i t u t e d
f r o m p u r i f i e d p o r i n s o f t h e o u t e r m e m b r a n e o f Ps e u d o m o n a s
a e r u g i n o s a . A n t i m i c r o b . A g e n t s C h e m o t h e r . 3 4 : 6 8 5 - 6 9 0 .
2 0 . T r i a s , J . , a n d H. N i k a i d o . 1 9 9 0 . O u t e r m e m b r a n e p r o t e i n D2
c a t a l y z e s f a c i l i t a t e d d i f f u s i o n o f c a r b a p e n e m s a n d p e n e m s
t h r o u g h t h e o u t e r m e m b r a n e o f Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a . A n -
t i m i c r o b . A g e n t s C h e m o t h e r . 3 4 : 5 2 - 5 7 .
2 1 . T r i a s , J . , a n d H. N i k a i d o . 1 9 9 0 . Pr o t e i n D2 c h a n n e l o f t h e
Ps e u d o m o n a s a e r u g i n o s a o u t e r m e m b r a n e h a s a b i n d i n g s i t e f o r
b a s i c a m i n o a c i d s a n d p e p t i d e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 5 : 1 5 6 8 0 -
1 5 6 8 4 .
2 2 . Yo s h i m u r a , F. , a n d H. N i k a i d o . 1 9 8 2 . Pe r m e a b i l i t y o f Ps e u d o -
m o n a s a e r u g i n o s a o u t e r m e m b r a n e t o h y d r o p h i l i c s o l u t e s . J .
B a c t e r i o l . 1 5 2 : 6 3 6 - 6 4 2 .
V O L . 3 6 , 1 9 9 2