Reaccin en cadena de la polimerasa

Gel de agarosa teido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante
distintoscebadores, con un bajo nivel de especificidad.
La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls
(polymerase chain reaction), es una tcnica debiologa molecular desarrollada
en 1986 por Kary Mullis,
1
cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento
de ADNparticular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese
fragmento original, o molde.
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin
resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes
de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el
ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una
tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a
cabo.
ndice
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1 Fundamento e importancia
2 Reactivos
3 Conceptos de la PCR
4 Ciclo de amplificacin
o 4.1 Inicio
o 4.2 Desnaturalizacin
o 4.3 Alineamiento o unin del cebador
o 4.4 Extensin o elongacin de la cadena
o 4.5 Elongacin final
o 4.6 Conservacin
5 Optimizacin de la PCR
6 Tipos de PCR
o 6.1 PCR anidada
o 6.2 PCR de extensin solapada (Mutagnesis)
o 6.3 PCR in situ
o 6.4 PCR mltiple
o 6.5 PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)
o 6.6 PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)
o 6.7 Variaciones de la PCR bsica
7 Aplicaciones
o 7.1 Investigacin
o 7.2 Medicina
o 7.3 Paleontologa, antropologa biolgica, y ciencias forenses
o 7.4 Agronoma y diversidad
8 Historia
o 8.1 Guerras de patentes
9 Vase tambin
10 Referencias
11 Bibliografa
12 Enlaces externos
Fundamento e importancia[editar]
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar
hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para
separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a
continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas
nuevamente. La reaccin en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary
Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la dcada de 1980.
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los
cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto
que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de desnaturalizacin del ADN) suponen la
inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas termoestables,
extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la
mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmentearqueas, son: Thermus
aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent)
y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy
procesivas (Taq) con otras capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent).


Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional.
Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato
llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la
temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin. Muchos termocicladores modernos
hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente
invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que
favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente
el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de
cierre con el fin de evitar la condensacin sobre los tubos de reaccin. Los termocicladores
ms antiguos carecan de este sistema y solucionaban el problema de la condensacin con
una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro
de los tubos.
Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de
investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se
incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis
funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas
genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico
de enfermedades infecciosas.
Reactivos[editar]


Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de 100 L.
Para realizar la tcnica se necesitan:
2

Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), oligonucletidos que son, cada uno,
complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y
cuarenta nucletidos, normalmente de dieciocho a veintids, que permiten que la
polimerasa inicie la reaccin. Deben estar enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan
la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucletidos que definen los
extremos de la secuencia que se desea replicar.
Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg
2+
), agregado comnmente como cloruro de
magnesio (MgCl
2
), o algn otro catindivalente. Tambin se puede
emplear manganeso (Mn
2+
), para mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas
concentraciones de Mn
2+
incrementan la tasa de error durante la sntesis de ADN. Actan
como cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de
la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de
70 C (la ms comn es la polimerasa Taq).
ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.
Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las
etapas que conforman un ciclo.
Conceptos de la PCR[editar]
Sensibilidad: se refiere a la cantidad mnima de ADN necesaria para que se produzca la
amplificacin, es decir, para obtener una banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya
que puede que una muestra sea positivas pero sea dada como negativa porque no se ha
amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.
Especificidad: se refiere a la obtencin de un solo producto amplificado. Viene
determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta
forma, si los oligos tienen ms de un sitio al que se pueden unir aparecer ms de un
producto amplificado.
Eficiencia: se refiere a la amplificacin mxima que se puede obtener en un nmero
determinado de ciclos.
Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificacin.
Este concepto es de especial importancia en la secuenciacin, pero en otros casos no es
tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.
Ciclo de amplificacin[editar]


Esquema general de la PCR.


Grado de amplificacin segn el nmero de ciclos empleados. A: gel de agarosa (1: ladder, 2: producto
especfico, 3: producto inespecfico); B concentracin de ADN respecto del tiempo; C logaritmo de la
concentracin de ADN respecto del tiempo.
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de
temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas.
La PCR comn se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de
ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura
(> 90 C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensin de producto final o el
breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de
gran variedad de parmetros. stos incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la
concentracin de iones divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la temperatura de unin de
los cebadores, as como la longitud del ADN que se desea amplificar.
2

Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opcin de realizar la reaccin de PCR con
la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicar calor a la parte
de arriba del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que
empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que no incluan este
sistema tenan que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este
procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensacin de la muestra, ya
que en el eppendorf se encuentran dos fases:lquido y gas. Al condensarse la muestra,
perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o poniendo las gotas de
aceite evitamos este proceso fsico, conservando casi intacto el volumen de la muestra.
Inicio[editar]
Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C ( 98 C si se est
usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto
slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor.
Desnaturalizacin[editar]
En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales est
constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-
95 C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la
desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la cadena, como
tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR,
seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin.
Alineamiento o unin del cebador[editar]
A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su
secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-
68 C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes
de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la
secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el
hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn
como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada.
Extensin o elongacin de la cadena[editar]
Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y
partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La
polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los
dNTP complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el
grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura
para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la
temperatura de mxima actividad est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de
extensin depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de
ADN que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la
polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto.
Elongacin final[editar]
Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el
ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea
totalmente ampliado.
Conservacin[editar]
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la
reaccin a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en pequeos
tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.
Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean tcnicas
de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto
es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao:
tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes;
en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a
marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.
3
El/los tamao/s de los productos de la PCR
vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos
de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.
Optimizacin de la PCR[editar]
En la prctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:
La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mnima cantidad de
ADN para obtener un gran nmero de copias. Adems, puede ser muy propensa a errores
si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la
amplificacin de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a
conclusiones inciertas). Se han de tomar una serie de precauciones para evitar
la contaminacin con ADN extrao. Ejemplos en los que es especialmente importante
evitar la amplificacin son la deteccin de enfermedades (para no diagnosticar
errneamente a los pacientes) o el diagnstico de identidad y parentesco.
Posibles precaucionesson:
Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificacin: recogida, envo,
custodia y procesado de muestras.
Limpieza exhaustiva y esterilizacin (leja, etanol, luz UV, psoralenos...) de la
superficie de trabajo entre la realizacin de una PCR y la siguiente.
En laboratorios de diagnstico gentico, se suelen tener reas separadas de trabajo:
un laboratorio para la preparacin de la mezcla madre para la PCR, otro para la
adicin del ADN a amplificar, otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la
PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya amplificada.
Cabinas de seguridad biolgica para reducir vapores cargados de amplicones de
enfermedades.
Proteccin adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos
del laboratorio: guantes, bata, cubrezapatos, gafas de seguridad, pelo recogido... En
el diagnstico molecular es conveniente que se cambien estos elementos al pasar de
una zona de trabajo a otra.
Controles positivos y negativos.
Tipado de todo el personal del laboratorio. En el caso de encontrar una amplificacin
no esperada se podr comprobar si proviene de uno de los operarios.
Las tcnicas de diseo de cebadores son importantes en la mejora de la obtencin de
productos de PCR y en evitar la formacin de productos falsos.
Algunasconsideraciones al disear estos cebadores son:
Se recomienda usar primers de ms de 15 nucletidos (18-30 nn) Normalmente, se
suelen disear de 20 nucletidos. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR
no sea muy especfica, y los que se excedan en longitud harn que perdamos
rendimiento en la reaccin.
Los primers no deben diferir en ms de 3 bases.
La proporcin entre bases pricas y pirimidnicas de los dos oligos sea 1:1 (40-60% a
lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 2 bases pricas.
Se requiere una distribucin homognea de los cuatro nucletidos en la secuencia,
evitando los poliT/A/G/C.
La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en ms de 5 C.
Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias
entre s, o se formarn dmeros entre ellos.
Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que ms se
ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en
otras o las realizan de forma ms eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en
los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Las ms habituales son lataq y
la pfu.
Los componentes del tampn de reaccin debern ajustarse a las exigencias de
nuestras enzimas.
El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de
la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecern termocicladores elaborados
con materiales que hagan ms eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas,
adems de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo,
mantenimiento y ubicacin ser clave.
Aparte de aspectos como la contaminacin y algn fallo en la hibridacin de primers, puede
haber otras complejidades que afecten a la PCR, como son:
Degradacin del ADN: esto puede ocurrir cuando se manipula la muestra en condiciones
subptimas o cuando se hace una autopsia, por ejemplo, y resulta en ausencia de
amplificacin o resultados parciales. Un caso particular es el "allele dropout", o bien
prdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con ser homocigtico para dicho
alelo.
Inhibicin de la PCR: puede haber agentes que interfieran en el correcto transcurso de la
PCR. Requerir un procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos compuestos
del medio antes de preparar la mezcla de PCR. Tanto la sangre como el semen contienen
este tipo de inhibidores, por lo que es necesario una purificacin previa.
Modificacin del ADN: las sustancias como el formol (empleado en conservacin de
tejidos) o la luz ultravioleta modifican el ADN, alterando as los resultados de la
amplificacin.
Artefactos: pueden darse situaciones como las bandas "stutter" o "shadow", que
consisten en que la polimerasa amplifica una repeticin de ms de un microsatlite o
repeticin en tndem.
Alelo fuera de patrn: un alelo amplificado puede no coincidir con el patrn de picos de
la referencia. Esto es seal de que algo ha ido mal durante la PCR.
Mezclas: es posible que dos muestran se mezclen de alguna forma y el resultado sea una
combinacin del patrn de picos que cabe esperar tras la amplificacin de cada una de
ellas por separado. Esto y el caso anterior dificulta la interpretacin de los resultados.
Tipos de PCR[editar]
PCR anidada[editar]
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como
molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la
primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicn se pueden unir
los cebadores y se hace de nuevo una amplificacin dentro del amplicn inicial. Este tipo de
PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta
porque como es amplificacin de un amplicn obtenido previamente, los cebadores slo van a
hibridar en un sitio dentro de la molcula y el resultado ser una nica banda. As, evitamos
posibles hibridaciones inespecficas de los cebadores. Ladesventaja de esta tcnica es que
no nos permite cuantificar la muestra.
PCR de extensin solapada (Mutagnesis)[editar]
Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se requieren 2
cebadores (primmers) mutagnicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un fragmento 3'
que se solapan portando ambos la mutacin. Se usan los productos en otra reaccin para
producir el ADN mutado de longitud completa
PCR in situ[editar]
La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde
los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera
amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situconvencional
con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas
de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de amplificar especficamente
una poblacin de secuencias de menor representacin.
PCR mltiple[editar]
PCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una secuencia. Para ello, se combinan
dos o ms pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de
la reaccin en cantidades suficientes, para amplificar simultneamente varios segmentos de
ADN. Ventajas: informacin sobre varios locus en una sola reaccin, menor cantidad de
molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de bases de
datos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una
cuidadosa optimizacin del proceso.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)[editar]
Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y
emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la sntesis de un ADN
complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera:
1.
er
paso: retrotranscripcin a partir del ARN.
2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc.
3.
er
paso: PCR estndar.
PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)[editar]
Artculo principal: PCR en tiempo real
Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o
ARN presente en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad,
muestras de ADN especficas a partir de su temperatura de fusin (tambin denominado
valor T
m
, del ingls melting temperature).
Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las tcnicas
basadas en sondas especficas.
En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada
ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es
medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una
secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su
realizacin. Es mucho ms econmica que la que usa sondas especficas.
Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que
hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando
la sonda est intacta, presenta una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia
(FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos
estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite
monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen.
La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR
realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que
monitoriza la progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A diferencia de la
PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin del ADN al final de un nmero
predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificacin
usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN
formada. El proceso se puede automatizar fcilmente usando un sistema que realice la
amplificacin (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una
amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayora pueden trabajar con las diversas
opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las
condiciones de amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos
determinados.

Variaciones de la PCR bsica[editar]
PCR especfica de alelo: esta tcnica de diagnstico o clonacin es usada para
identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs).
PCR "assembly": consiste en la sntesis artificial de largas secuencias de ADN,
realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucletidos largos con secuencias
solapantes cortas.
PCR asimtrica: usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con
respecto a la otra.
PCR de colonia: mediante esta tcnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser
rpidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN.
Amplificacin dependiente de helicasa: esta tcnica es muy parecida a la PCR
convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en
lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de hibridacin-elongacin.
PCR hot-start: esta tcnica reduce la amplificacin inespecfica durante las etapas
iniciales de la PCR: mientras que la mquina alcanza la temperatura de la primera etapa
(unos 95) puede que ocurra la unin de los cebadores y se produzca amplificacin, ya
que en el camino para alcanzar estos 95 se pasa por la temperatura de anillamiento (que
es ms baja).
Para evitar esto, la PCR hot-start se basa en que la reaccin comience cuando la
mquina ya est a 95, debido a que antes no se encuentran presentes la polimerasa
o el cloruro de magnesio, lo que podemos conseguir mediante varias tcnicas:
- Aadir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de calentamiento
- Separar por una capa de cera los distintos componentes de la reaccin. La cera se
funde al alcanzar los 95 y es entonces cuando los componentes entran en contacto
- Anticuerpos anti-polimerasa que estn bloqueando a la polimerasa. Al alcanzar los
95 estos anticuerpos se inactivan debido a que se desnaturalizan y la polimerasa
puede actuar
PCR especfica de intersecuencia (ISSR): se trata de un mtodo de PCR para su
uso en huella gentica, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple
para producir una huella gentica nica de longitudes de fragmento amplificadas.
PCR inversa: es un mtodo usado para poder realizar la PCR cuando slo es
conocida una secuencia interna. Muy til en la identificacin de secuencias que
flanquean insertos genmicos.
PCR mediada por ligacin: este mtodo usa pequeos linkers de ADN ligados al ADN
de inters y mltiples cebadores hibridando estos linkers.
PCR especfica de metilacin (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG
de ADN genmico.
Amplificacin Mltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent
Probe Amplification o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un
nico par de cebadores, evitando as las limitaciones de resolucin de la PCR
multiplex.
PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR. En la
tcnica clsica de PCR, se cuantifica por aproximacin con diluciones y amplificacin
de concentraciones conocidas de la secuencia diana. Tambin se puede cuantificar
por mtodo competitivo: se trabaja con concentraciones crecientes conocidas de un
fragmento que puede ser amplificado por los mismos oligos que la muestra de
estudio, pero de menor tamao que sta, de forma que con los resultados obtenidos
se puede estimar qu concentracin del competidor es equivalente a la de la muestra
de cantidad desconocida. La cuantificacin en PCR est optimizada en la tcnica
de PCR en tiempo real.
PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimtrico es usada para aislar una
secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida.
PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se
desconoce la secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo
que se asume que puede existir alguna base desapareada en el alineamiento
cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no especfico bajando
gradualmente la temperatura de hibridacin a lo largo del progreso de la PCR.
PAN-AC: este mtodo usa condiciones isotermas para la amplificacin, y puede ser
usado en clulas vivas.
Ciclo trmico rpido para PCR:
4
La amplificacin del DNA puede llevarse a cabo
rpidamente, como completar 30 ciclos en menos de 30 minutos: ciclo trmico rpido.
Normalmente se ha considerado que las etapas de cada ciclo son tres reacciones que
ocurren en tres periodos separados y a tres temperaturas diferentes. Este paradigma
del equilibrio secuencial no tiene en cuenta que la temperatura de la muestra no
cambia instantneamente, de hecho, durante una PCR la muestra est la mayora del
tiempo en temperaturas de transicin. El ciclo trmico rpido aprovecha la ventaja de
la instantnea desnaturalizacin e hibridacin, cuyas temperaturas necesitan
alcanzarse, pero no mantenerse. Adems, para productos cortos, la extensin puede
llevarse a cabo durante la transicin a la temperatura de extensin, y por lo tanto,
tampoco es necesario mantenerla. Un ciclo rpido podra entonces describirse como
94C, 0 seg; 55C, 0 seg y 72C, 0 seg. Como vemos, este modelo no ayuda, porque
nos lleva solo a temperaturas extremas y no nos da informacin sobre lo que pasa
entre ellas. En cambio, en el paradigma cintico para PCR de ciclo rpido se describe
completamente el historial de temperaturas de la muestra. Se considera que
desnaturalizacin, hibridacin y elongacin ocurren en un rango de temperaturas y
adems pueden solapar temporalmente. Hay termocicladores que permiten que un
ciclo se complete en 20-60 segundos, por lo que 30 ciclos tardan de 10 a 30 minutos.
Aplicaciones[editar]
La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia bsica, como
herramienta de deteccin y/o generacin de acervos de fragmentos de ADN de inters; ya
en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en s mismo, por ejemplo en diagnstico
clnico.
Investigacin[editar]
La PCR convencional, se emplea como base para multitud de tcnicas en el laboratorio
debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y
detectar los fragmentos de ADN de inters.


Clonacin de un segmento de ADN mediante amplificacin con cebadores que contienen una
secuencia apta para la recombinacin dirigida con un plsmido.
Una aplicacin de la PCR de extrema importancia es la clonacin de secuencias de ADN
en vectores, como pueden ser los plsmidos. Para ello, se emplean cebadores que
contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interaccin posterior con
otra complementaria situada en el vector de clonacin a emplear. Por ejemplo, se puede
incluir una diana de restriccin en dichos cebadores, de modo que, y si sta no exista
previamente en el fragmento y es nica en el vector, pueda efectuarse una ligacin
mediante la ligasa de T4 tras la digestin con la enzima de restriccin apropiada de ambos
elementos. Otro mtodo asimilable a esta va es el empleo de larecombinacin dirigida;
esto es, se adapta al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la
recombinacin dirigida con un vector dado.
5

Medicina[editar]
En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta
de diagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006):
Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro
infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de
PCR posea unas caractersticas de tamao o temperatura de fusin que permitan
identificarlo de forma inequvoca. En el caso de infecciones virales que implican la
integracin del genoma del patgeno en el ADN del hospedador, como es el de la
infeccin por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinacin de la carga
viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad.
6

La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias, como en los servicios
de donantes de sangre, para test de rutina. A travs de esta tcnica se pueden
detectar infecciones en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras an estn en el
periodo de incubacin. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar
muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas
muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente
menores hasta que se encuentra el causante.
El diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso
largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada
uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes
cebadores y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.
Paleontologa, antropologa biolgica, y ciencias forenses[editar]
Los campos de la paleontologa, antropologa biolgica y la medicina y antropologa
forense se han visto enormemente beneficiados por esta tcnica, puesto que todas ellas
construyen con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a
restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales biolgicos que ms informacin
puede proporcionar es el ADN.
La relativa estabilidad de ste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante
largos perodos si las condiciones son propicias.
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En ocasiones las muestras intactas con
las que se puede contar son extraordinariamente pequeas o estn deterioradas. La PCR
soluciona ambos problemas y proporciona cantidades tiles para posteriores pasos de
anlisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material recuperado a partir de muestras
escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente, en teora basta una sola molcula
para que el proceso pueda tener lugar. Tambin debido a la naturaleza de la tcnica y su
propsito de amplificacin de fragmentos pequeos, esta fragmentacin no impide que
este ADN pueda ser empleado como molde para una reaccin de PCR.
En paleontologa y Antropologa la PCR permite recuperar las escasas cantidades de
ADN que an no se han degradado. Algunos lugares en que el ADN podra
preservarse son la brea las cenizas volcnicas, el mbar, hielos histricos polares
o glaciares y ambientes ridos, sedimentos, as como en los cristales de apatita de
restos deesqueleto,
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siendo posible de ese modo caracterizar cadveres, fsiles u
otros restos mediante genotipado por anlisis de microsatlites o incluso genomas
de taxonesextintos, amplificados de este modo, como pueden ser los realizados
mediante el ADN genmico del hombre de Neanderthal.
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El propsito sera utilizar
este ADN amplificado para posteriormente realizar
estudios filogenticos o etnogrficos o de poblaciones mediante la comparacin de
secuencias de ADN, o el estudio de las causas de laseparacin evolutiva de dos
especies.
En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiacin de una persona o para
obtener pruebas a partir de muestras mnimas dejadas por el autor de
un crimen comosaliva, semen u otros restos de tejidos (Butler, 2005).
Agronoma y diversidad[editar]
Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genticas de individuos concretos,
dentro del marco de la gentica forense, existen mtodos basados en la PCR que
permiten discernir entre grupos infraespecficos de cultivos de inters agronmico; por
ejemplo, de cultivares.
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Para ello, se emplean oligonucletidos de un tamao lo
suficientemente pequeo como para que ceben de forma relativamente inespecfica,
aunque siempre de tal forma que produzcan un patrn de bandas discreto e interpretable.
De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos tiende a agrupar
a los individuos de mayor semejanza, que poseen un comportamiento similar, de los que
divergen...
Historia[editar]


Electroforesis de protenas SDS-PAGE resolviendo la polimerasa Taq.
En 1971, un artculo publicado por Kleppe et al. en Journal of Molecular Biology describi
por primera vez un mtodo que usaba enzimas para replicar una secuencia pequea de
ADN con cebadores in vitro.
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Sin embargo, este temprano ejemplo del principio bsico de
la PCR no recibi mucha atencin, y la invencin de la reaccin en cadena de la
polimerasa en 1983 es generalmente atribuida a Kary Mullis.
11

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Mullis gan el Premio
Nobel por su trabajo en PCR.
Algo muy a tener en cuenta en la PCR es que la ADN polimerasa que se use sea capaz
de soportar las altas temperaturas de >90 C necesarias para la separacin de las dos
hebras de ADN de la doble hlice tras cada ciclo de replicacin. Las ADN polimerasas que
se utilizaron originariamente para los experimentos in vitro previos a la PCR no eran
capaces de soportar estas altas temperaturas, por lo que los primeros procedimientos
para replicar el ADN eran muy ineficientes, largos y requeran grandes cantidades de ADN
polimerasa.
El descubrimiento en 1976 de la polimerasa Taq, una polimerasa de ADN extrada de
la bacteria termfila Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-
80 C), elimin los grandes inconvenientes del mtodo de la PCR. Este ADN polimerasa
es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa hasta despus de la
desnaturalizacin del ADN, eliminando la necesidad de aadir a la reaccin nueva
polimerasa tras cada ciclo. Este descubrimiento permiti automatizar el proceso, antes tan
tedioso, acoplndolo al uso del termociclador.
Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullis trabajaba en
Emeryville, California (EE UU), para una de las primeras empresas biotecnolgicas, Cetus
Corporation, donde era responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis afirma
que concibi la idea para la PCR una noche mientras cruzaba la Autopista de la
Costa Pacfica (EE UU) en su coche.
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Estaba imaginando una nueva forma de analizar
mutaciones en el ADN cuando se percat de que, en lugar de eso, haba inventado un
mtodo para amplificar regiones especficas de ADN mediante ciclos de duplicacin
repetidos usando ADN polimerasas. Mullis atribuye la invencin de esta tcnica a los
efectos de la droga psicodlica y alucingena LSD.
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En la revista Scientific American, Mullis resumi el procedimiento: "Comenzando con una
nica molcula del material gentico ADN, la PCR puede generar 100 billones de
molculas iguales en una tarde. La reaccin es fcil de hacer, no requiere ms que un
tubo de pruebas, unos pocos reactivos simples y una fuente de calor."
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Fue premiado con
el Premio Nobel de Qumica en 1993 por su invencin, y siete aos despus, l y sus
colegas del Cetus llevaron a la prctica su propuesta. Sin embargo, han aparecido
controversias y diferentes versiones sobre las contribuciones intelectuales y prcticas de
otros cientficos al trabajo de Mullis, y sobre si l fue el inventor nico del principio de la
PCR.
Guerras de patentes[editar]
La tcnica de la PCR fue patentada por Cetus Corporation, donde Mullis trabajaba cuando
invent la tcnica en 1983. La enzima polimerasa Taq fue tambin cubierta de patentes.
Tuvieron lugar varios pleitos relacionados con la tcnica, incluyendo un pleito fracasado
generado por DuPont. La compaa farmacutica Hoffmann-La Roche adquiri los
derechos de las patentes en 1992 y actualmente mantiene las que an estn protegidas.