Transformao de Plantas

Seleo de tecido vegetal competente para

propagao ou regenerao
Mtodo de transferncia de gene
Identificao de clulas transformadas por
seleo
Regenerao de plantas de clulas transformadas
Plantas transgnicas analisadas para confirmar
presena do transgene - herana e estabilidade
Plantas transgnicas avaliadas para desempenho
Transferindo DNA para
clulas de plantas
Clula Vegetal
ncleo
parede celular
Membrana
plasmtica
transgene
1. DNA pode ser transferido
por meio biolgico
(Agrobacterium) ou fsico
(bombardeamento)
2. DNA deve cruzar vrias
barreiras
3. DNA deve se integrar ao
cromossomo no ncleo da clula
4. Cada clula transformada
nica
5. Nmero de clulas
transformadas mnimo
citoplasma
Cronologia da
Transformao de Plantas
1907 Identificao de Agrobacterium tumefaciens como agente causal
de galhas
1974 Descoberta de elemento extra-cromossomial ligado induo de
galhas plasmdeo Ti
1975 Aquisio de habilidade oncognica por transferncia de
plasmdeo
1977 Transferncia e manuteno de T-DNA em clulas de plantas
1980 Uso de plasmdeo Ti para introduo de genes em plantas
1981 Transmisso Mendeliana de genes introduzidos por Ti
1983 Construo de genes marcadores quimricos
Engenharia de vetor Ti para introduo de genes sem oncognese
1984 Regenerao de plantas resistentes a kanamicina com herana
Mendeliana
1985 Estabelecimento de transformao e regenerao por disco foliar
1987 Transformao atravs de bombardeamento com micropartculas
Transformao de Plantas
1. Agrobacterium tumefaciens como vetor
mtodo de escolha
limitao de hospedeiro
2. Bombardeamento com micropartculas
usado em Monocotiledneas e Legumes
versatilidade de tecido alvo
3. Protoplastos
clula vegetal sem parede celular
totipotncia - similar a bactria
permeabilizao reversa membrana
PEG
Eletroporao
Anami et al. 2013. Int. J. Dev. Biol. 57
Regenerao de Plantas
Competncia x Recalcitrncia
Anami et al. 2013. Int. J. Dev. Biol. 57
Transformao de Plantas
Competncia de regenerao
Bombardeamento com Micropartculas
ou Biolstica
micropartculas cobertas com DNA construdo,
acelerados por exploso, introduzidos em clulas
vegetais
Vantagens:
1. transformao de Monocot e Legumes
2. simplificao nas construes
3. co-transformao com vrias construes
4. ausncia de falsos positivos
5. protocolos de transformao simplificados
Transformao por Bombardeamento
Transformao por Bombardeamento
Transformao de Planta
Protoplasto
Agrobacterium tumefaciens
Bactria de solo Gram-negativa, tipo bacilo
Causa galha da coroa (crown gall)
Afeta mais dicotiledneas e pouco
monocotiledneas
Famlia Rhizobiaceae
Outras espcies:
Agrobacterium rhizogenes - raiz em cabeleira (hairy root)
Agrobacterium rubi - hospedeiros limitados
Agrobacterium vitis - videira
Agrobacterium radiobacter - no tumorognica (sem Ti)
Agrobacterium
Biovar: caractersticas fisiolgicas, qumicas
e nutricionais
Biovar I: A. tumefaciens, A. radiobacter e poucas A.
rhizogenes
Biovar II: maioria A. rhizogenes e A. rubi
Biovar III: A. vitis (A. tumefaciens)
Brasileiro & Carneiro 1998
Agrobacterium
Infeco natural - ferimentos
Quimiotactismo - fenis, acares, amino cidos
Formao de tumores
Expresso de genes da bactria transferidos e
integrados de forma estvel ao genoma vegetal
Capacidade tumorognica - plasmdeo Ti
Ti = Tumor Inducing 200 a 800 Kpb
Regies do plasmdeo Ti importantes:
regio T-DNA - Transfer DNA 10-30 Kb
(<10% do Ti)
regio vir - genes de virulncia
Agrobacterium
Transferncia requer trs elementos
1. Borda repetida direta (25 bp) do T-DNA
define regio a ser transferida
2. Regio vir do plasmdeo Ti
3. Alguns genes cromossomiais de Agrobacterium
genes chv
Agrobacterium
Regio T-DNA
Tamanho: de 12 a 24 kb
Limitada por sequncias repetidas diretas imperfeitas
bordas direita (RB) e esquerda (LB) - delimitam T-
DNA
Contem genes de sntese de reguladores de
crescimento (hormnios vegetais) e de opinas
Transferem genes para direcionar metabolismo para
manuteno da Agrobacterium
Plasmdeo Ti
Agrobacterium
Regio T-DNA
Sntese de reguladores de crescimento
Auxina
genes iaaM (tms1): triptofano 2-monooxigenase
gene iaaH (tms2): indol-3-acetamida
Citocinina
gene tmr: isopentenil transferase
adio de cadeia isopentenil a 5-AMP
adio de OH = transzeatina
iaaM (tms1)
iaaH (tms2)
ipt (tmr)
Agrobacterium
Regio T-DNA
Sntese de opinas
compostos nicos e incomuns
fonte de C e N para Agrobacterium
favorece transferncia conjugativa de Ti
condensao de acares ou cido orgnico + amino
cido
arginina + piruvato = octopina
arginina + a-ketoglutaraldedo = nopalina
glutamato bicclico = agropina
Catlise de opinas
no Ti, mas fora regio T-DNA
especfico para a cepa indutora do tumor
Agrobacterium
Regio vir
genes responsveis pelas enzimas sensoras de fenis,
processamento, secreo e integrao do T-DNA
transporte do ssT-DNA por membranas, direcionado ncleo
proteo contra nucleases
regio de 35-40 Kb
8 operons: virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG e virH
25 genes
virA, virF e virG - monocistrnicos
outros policistrnicos
animao
Agrobacterium
Regio vir
Sensor de fenlicos e transduo de sinal
Sistema regulador positivo: virA e virG
Regulam os outros genes vir
VirA: expressa constitutivamente
protena de membrana interna - histidina kinase
reconhece compostos fenlicos sob pH 5-5,8
autofosforilao e fosforilao de VirG
VirG: fosforilada se torna ativa
ativa sua prpria transcrio
ativa transcrio outros genes vir
sequncia de 12 pb - vir box
Agrobacterium
Regio vir
virC e virD - gerao e processamento do T-DNA
reconhecem borda direita do T-DNA
virD1:- relaxamento da fita dupla (helicase)
virD2:- corte da fita simples (endonuclease) e ligao-5
formao de complexo-T com o ssT-DNA e direcionamento
virC1 e virC2: complementam atividade de virD1 e virD2
virB e virE - formao de elementos estruturais de
movimento do T-DNA
virE2: protena do tipo single strand binding ptn protegendo
T-DNA de degradao por nucleases e direcionamento
virB1 a virB11: formao de Sistema de Secreo Tipo IV
virH (ou pinF): responsvel desintoxicao (tipo citocromo)
Gelvin S. 2012. Frontiers In Plant Sciences
Agrobacterium
Regio vir
mutaes em virA, virB, virD e virG : eliminam
formao de tumores
mutaes de virC , virE, virF e virH: restringem gama
de hospedeiro
animao
Brasileiro & Carneiro 1998
Agrobacterium
Gene indutores de tumores (oncogenes)
podem ser retirados e substitudos no T-
DNA
Ti desarmado - helper
Regio vir suficiente para transferir
qualquer T-DNA - reconhece bordas
1983 - Regio vir e T-DNA em replicons
distintos efetivo para transformao
Plasmdeos Binrios
Vir helper Ti desarmado
Gerao de
Linhagens
de
Agrobacterium
Desarmadas
Remoo de
oncogenes
Brasileiro & Carneiro 1998
Sistema de
vetores de
Agrobacterium
para transformao
A. Co-integrado
B. Binrio
Brasileiro & Carneiro 1998
Lee & Gelvin 2008. Plant Phys. 146
Plasmdeo Binrio
1. Bordas LB e RB delimitando T-DNA
2. Marcador de seleo em planta
3. Stio de clonagem enzimas corte nico
4. Origem de replicao em E.coli e A. tumefaciens
5. Marcador de seleo do plasmdeo binrio e cromossmico
Lee & Gelvin 2008.
Plant Phys. 146
Cepas de A. tumefaciens desarmadas
Lee & Gelvin 2008. Plant Phys. 146
Brasileiro & Carneiro 1998
Genes de seleo e
reprteres
Anami et al. 2013. Int. J. Dev. Biol. 57
Agrobacterium
Insero em regio rica em A-T, usualmente
nico ou poucos locos
Problemas:
Cpias mltiplas
T-DNA pode estar truncado na regio prxima
a LB
Introduo de parte do DNA do vetor
Introduo de sequencias cromossomiais
Anami et al. 2013. Int. J. Dev. Biol. 57
Cruzamento
Triparental
Agrobacterium
e Escherichia
com auxlio
pRK2013
helper
Brasileiro & Carneiro 1998
Agrobacterium
Genoma sequenciado C58: 5.674.062 bases
cromossoma circular:
2.841.490 pb (59,4% G+C) 2.789 ptn
cromossoma linear:
2.075.560 pb (59,3% G+C) 1.882 ptn
plasmdeo pAtC58:
542.779 pb (57,3% G+C) - 550 ptn
plasmdeo pTiC58:
214.233 pb (56,7% G+C) - 198 ptn