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Universidad de Santiago de chile, Departamento de Ingeniera qumica, Ingeniera en Biotecnologa,

Laboratorio de Microbiologa

SEMBRADO, AISLAMIENTO Y TINCIN GRAM
RESUMEN
En el presente prctico se sembraron y aislaron bacterias, lo cual consiste en obtener colonias, es
decir, conjunto de clulas bacterianas que se han originado desde una sola clula. Las celulas con
las que se trabajaron provenian de diferentes medios; ambientales, de una cascara de papa y se
tomo una muestra corporal. Esta celulas necesitan de condiciones ambientales favorables para
crecer, para ello se pusieron en medios de cultivos complejos, es decir no selectivos. Los medios
nutricionales usados fueron: PDA para una muestra ambiental, TSA para otra muestra ambiental y
corporal (fosas nasales) y TSB para una muestra proveniente de cascara de papa.
Para el estudio de los microorganismos es necesario conocer tanto su morfologa microscpica as
como su morfologa macroscpica en medios de cultivo especficos para su crecimiento; estas
caractersticas se observan en las colonias microbianas. La colonia a estudiar en este practico de
manera microscpica fue la obtenida a partir de la cascara de papa. Para poder observar la
morfologa microscpica se realiz tincin Gram. Las colonias de la cascara de papa mostraron ser
irregulares, con bordes ondulados, elevacin convexa y su superficie es arrugada. Al verlas bajo
microscopio se aprecia que las bacterias gram positivas resultaron ser cocobacilos, mientras que
las gram negativo resultaron ser bacilos.
Para disminuir la probabilidad de la obtencin de bacterias contaminantes en el anlisis de una
muestra, se mantuvieron condiciones de esterilidad ptima, los materiales fueron autoclavados, el
mesn de trabajo fue limpiado con etanol, y el manejo de los materiales y reactivos se hizo bajo la
llama del mechero de Bunsen.

OBJETIVOS

1) Observacin de la distribucin de colonias luego del por sembrado por agotamiento.
2) Distincin de bacterias Gram positivas y Gram negativas por tincin Gram.
3) Determinar la morfologa microscpica y macroscpica de bacterias presentes en la
cascara de papa.


INTRODUCCIN
Las bacterias son Son seres generalmente
unicelulares que pertenecen al grupo de los
protistas inferiores. Son clulas de tamao
variable cuyo lmite inferior est en las 0,2m y
el superior en las 50m; sus dimensiones
medias oscilan entre 0,5 y 1m.
Las bacterias tienen una estructura menos
compleja que la de las clulas de los
organismos superiores: son clulas
procariotas (su ncleo est formado por un
nico cromosoma y carecen de membrana
nuclear). (1)



Existen diversas clasificaciones para las
bacteria, una manera de clasificarlas es de
acuerdo a su morfologa y agrupamiento,
Bsicamente, se diferencian en: cocos,
diplococo, cocos en cadenas, cocos en
racimos, cocos en ttradas, cocobacilos,
bacilos, bacilos bordes redondeados, bacilos
bordes rectos, bacilos fusiformes, bacilos
curvos y espiroquetas.(3)
Otra clasificacin es de acuerdo a las
paredes celulares, la cual est dado por la
tincin Gram. La tincin Gram es una prueba
potente y rpida que nos permite diferenciar
dos clases de bacterias estas son: Bacterias
Gram positivas y las Gram negativas.
Las Gram positivas se tien de morado ya
que el colorante se queda atrapado en la
capa gruesa de peptidoglucanos que rodea a
la clula. Las Gram negativas tienen una
capa de petidoglucano mucho ms delgada
es por ello que no retiene el violeta cristal y
por esto las clulas se tien con safranina y
las observamos rojas. (5)
El conocimiento de las diferentes estructuras
y composicin de las bacterias ha permitido
comprender como muchas bacterias se
relacionan con el hombre, ya sea como
integrantes de la flora normal o como
agresoras para el mismo
Debido a su simplicidad, las bacterias han
sido manipuladas por mucho tiempo en
laboratorios, una manera eficiente de poder
estudiar bacterias es mediante la obtencin
de colonias, las cuales se obtienen a partir
del sembrado.
Sembrar o inocular es introducir
artificialmente una porcin de muestra
(inculo) en un medio adecuado, con el fin de
iniciar un cultivo microbiano, para su
desarrollo y multiplicacin. Una vez
sembrado, el medio de cultivo se incuba a
una temperatura adecuada para el
crecimiento. Existen diversos tipos de
sembrado, entre ellos estn: siembra por
agotamiento, siembra masiva en placa Petri,
por puncin, en estra por tubo inclinado, por
picadura en tubo, mixta en tubo y siembre en
medio lquido. (2)
Para la sobrevivencia de las bacterias,
necesitamos darle las condiciones ptimas,
es decir proporcionarle los nutrientes para
que se puedan reproducir, estas condiciones
se dan en los medios de cultivo, dentro de los
cuales encontramos los complejos, el cual
tiene nutrientes en abundancia, y los medios
especficos, en donde sabemos cules son
de manera precisa los nutrientes que
requiere la bacteria. En estos medios
necesitamos tener los macro y
micronutrientes que la bacteria utilizar para
su metabolismo. (4)
Es de gran importancia que cada vez que
estudiemos bacterias, los materiales y el
ambiente estn esterilizados, es decir, libre
de bacterias agenas que puedan contaminar
mi estudio.
Existen diversos mtodos de esterilizacin,
entre ellos encontramos los siguientes
mtodos fsicos: calor seco, calor hmedo y
radiaciones. Dentro del calor seco
encontramos la accin directa de la llama,
esterilizacin al rojo, otro ejemplo en el calor
hmedo encontramos la accin del vapor de
agua, como es el autoclave. (6)
Otro tipo de esterilizacin son los mtodos
qumicos, los cuales involucran el empleo de
sustancias letales para los microorganismos,
tales como el xido de etileno y el perxido
de hidrgeno. El uso de este mtodo es muy
limitado para la Industria Alimentaria pero
muy utilizado en otras industrias como la
farmacutica.





MATERIALES Y METODOLOGA

1) Esterilizacin
Los materiales utilizados se esterilizaron
mediante el autoclave:
Las placas Petri se apilaron y se envolvieron
con papel kraft y cinta adhesiva, luego se les
puso una cinta de autoclave en su exterior
para asegurarnos de que el procedimiento
fue exitoso al terminar la esterilizacin,de
misma manera se envolvieron cajas con
puntas para las pro-pipetas.
A los matraces que se utilizaron se les
prepararon tapones de gaza y algodn.
Se prepararon 2 medios de cultivo, TSA y
TSB. Para el TSA se pesaron 4 gr de
solucin y se diluyeron en 50 ml de agua
destilada. Para el medio TSB se extrajeron
33 ml del medio y se diluyeron en 50 ml de
agua destilada.
Todo lo anteriormente mencionado se rotul
y se meti en el autoclave, la cual contena
agua hasta cubrir la resistencia.
El autoclave se cerr haciendo coincidir las
flechas impresas en la tapa y la olla.
Se apretaron los tornillos haciendo un cierre
lateral simultneo y uniforme, se abri la
vlvula de seguridad colocndola en posicin
vertical. Se esper a que la aguja llegue a
121C y 15 libras de presin, y se dej en la
olla por 15 minutos.
Al finalizar el periodo de esterilizacin, se
apagel autoclave y se esper a que el
manmetro baje a cero, se levant la vlvula
para que escape el vapor restante y se
procedi a destapar la olla desenroscando
los tornillos de manera enfrentada

2) Sembrado y aislamiento de bacterias
Bajo la llama de un mechero de Bunsen se
realizaron los siguientes procedimientos:
Los medios de cultivo anteriormente
preparados se vaciaron en las placas Petri.
Una placa con medio PDA y otra con medio
TSA se expusieron al aire.
Un trozo de cascara de papa se sumergi en
medio de cultivo TSB, se agit
vigorosamente. Con un asa circular
anteriormente esterilizada al rojo se extrajo
una gota y se sembr la placa por
agotamiento.
Se pas una trula humedecida con suero
fisiolgico por las fosas nasales, luego se
agit en un medio de cultivo TSA. Con una
asa circular anteriormente esterilizada al rojo
se extrajo una gota y se sembr la placa por
agotamiento.
Las placas se llevaron a incubacin a 37C
las que contenan TSA y TSB, y a 25C los
de PDA durante 3 das.
3) Tincin Gram y observacin al
microscopio
Se tom una colonia proveniente de la
cascara de la papa con un asa circular
anteriormente esterilizada al rojo.
Esta colonia fue agregada en una gota de
agua destilada presente en el porta-objetos
del microscopio, se desliz en
aproximadamente 1 cm
3
de superficie y se
procedi a la tincin Gram, para ello se
siguieron los siguientes pasos:
- Se agreg al portaobjetos con mi
colonia disuelta cristal violeta por 2
minutos
- Se bot el exceso a pulso
- Se agregaron 3 gotas de lugol y se
mantuvo por 2 minutos
- Se bot el exceso a pulso y se lav
con un chorreo suave de agua
- La placa se lav con alcohol 2 veces.
- Se lav nuevamente con agua
- Se agreg safranina por 1 minuto
Finalmente la placa se llev a observacin
bajo microscopio

RESULTADOS

Los resultados obtenidos de la siembra y
aislamiento fueron:










De la tincin Gram de una colonia de
bacterias presente en la cascara de papa
podemos ver las siguientes imgenes bajo el
microscopio.




Figura 1: muestra ambiental en medio PDA
Figura 2: muestra ambiental en medio TSA
Figura 3: muestra de cascara de papa en
medio TSB.
Figura 4: muestra obtenida de la nariz en
medio TSA
Figura 5: fotografa al microscopio. Tincin
Gram de bacterias de cascara de papa
Figura 6: ampliacin de figura 5

DISCUSIN
En la figura 1 podemos observar las que la
forma de la colonia es del tipo filamentosa
con los bordes lobulados, y con una
elevacin elevada. La superficie presentada
por esta colonia es de tipo seca
En la figura 2 se aprecia en su mayora
colonias de color blanquecina de manera
irregular, los bordes en su mayora son
ondulados y algunos lobulados, la elevacin
que tienen estas colonias es plana con
superficie brillante. En medio de estas
colonias encontramos colonias pequeas de
color amarillo, las cuales son circulares, con
bordes enteros con una elevacin convexa y
de superficie brillante.
Las colonias de la cascara de papa (figura 3)
son irregulares con bordes ondulados. La
elevacin que se observa es convexa, y su
superficie es arrugada.
Las colonias de la nariz presentan una forma
irregular con bordes ondulados, la elevacin
convexa y con superficie arrugada
De la figura 5 se puede apreciar que la
tincin Gram fue exitosa ya que se pueden
apreciar bacterias de colores morados y rojo,
las cuales corresponden a bacterias Gram
positivas y negativas respectivamente. Esta
diferencia de tincin se debe a las diferencias
entre las paredes de peptidoglicanos que
poseen estas clulas procariontes.
Cuando agregamos el cristal violeta tanto
gran positivas como gran negativas captan
este reactivo, pero cuando agregamos yodo
se forma un complejo entre el cristal violeta
con el yodo, el cual queda atrapado dentro
de las Gram positiva por la deshidratacin y
la reduccin del tamao de poros resultante
del proceso de lavado con solvente.
En contraste, en las Gram negativas la fina
capa de peptidoglicanos no impide la
extraccin del complejo por el solvente, por lo
que estas clulas se decoloran y luego optan
el color de la safranina (roja).
En cuanto a morfologa se aprecia que las
bacterias Gram positivas tienen una forma de
cocobacilos, mientras que las gran negativas
presentan un forma bacilos, los cuales tienen
un mayor tamao.
Gracias al mtodo de tincin Gram las
bacterias adquieren color de acuerdo a su
naturaleza. Esto es de gran ayuda cuando
queremos determinar la morfologa de las
bacterias. Una forma de acercarnos ms a la
bacteria con la que estamos tratando sera
examinar las nutrientes especficos que
requiere para sobrevivir de manera ptima.

CONCLUSIN

En este experimento, se observ que luego
de sembrar las bacterias las bacterias se
distribuyen de manera uniforme por la
superficie de la placa.
De las muestras obtenidas se puede apreciar
que obtenemos colonias tanto de forma
filamentosa, irregular y circular, los bordes
que le presentan son curvos, lisos, ondulados
y lobulados con elevacin plana, convexa y
en forma de gota con superficies planas y
rugosas.
Especficamente en la muestra de papa
tenemos que macroscpicamente las
colonias son irregulares, con bordes
ondulados, elevacin convexa y su superficie
es arrugada. Al ver una colonia bajo
microscopio luego de realizar la tincin Gram
se aprecia que tenemos tanto bacterias
teidas de color violeta y de color rojo. Las
gran positivas resultaron ser cocobacilos,
mientras que las Gran negativo resultaron ser
bacilos. Resulta de gran ayuda la tincin
Gram, ya que nos facilita el reconocimiento
de las bacterias presente en nuestra
muestra. Al adquirir color podemos observar
su forma y determinar el tipo de bacteria con
la que estamos tratando de acuerdo a su
pared bacteriana.



Bibliografa:
(1) http://www.monografias.com/trabajos/bacterias/bacterias.shtml#ixzz3GMRbAYNE
(2) http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practicoIII.pdf
(3) http://microdonto.files.wordpress.com/2009/03/morfologia-de-las-colonias-bacterianas.pdf
(4) http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf
(5) http://biologiamedica.blogspot.com/2010/09/bacterias-gram-positivas-y-gram.html
(6) http://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-ii/pb-ii-2-fisicos.htm