INGENIERA BIOQUMICA

MATERIA:
Microbiologa

DOCENTE:
Ing. Cesar David Lara Coll

ALUMNO:
ngel de Jess Dzul Beh

NOMBRE DEL TRABAJO:
Investigacin:
Preservacin de los microorganismos

Oxkutzcab, Yucatn a jueves 23 de febrero de 2012






INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DEL
SUR DEL ESTADO DE YUCATN


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Mtodos de conservacin de los microorganismos
Los objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas
microbianas en los laboratorios de microbiologa son: que el cultivo a conservar
sea puro, evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de
conservacin (conservacin de sus caractersticas bioqumicas); que durante el
tiempo de conservacin sobrevivan al menos el 70-80% de las clulas, y por
ltimo, que estas clulas permanezcan genticamente estables. Los dos primeros
objetivos no son muy difciles de conseguir cuando se conoce bien la tcnica
microbiolgica, pero el tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por
el cual existen varios mtodos de conservacin para los microorganismos, y
ninguno de ellos es de utilizacin general. Vamos a resumir estos mtodos
agrupndolos en tres apartados, que son: Mtodos de eleccin o de conservacin
a largo plazo, mtodos alternativos y mtodos restringidos.

A.- Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo.
Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las clulas
microbianas, pero stas no han muerto. As se garantiza al mximo la estabilidad
gentica, por evitarse la aparicin de generaciones sucesivas. An as no se
puede descartar algn cambio originado por el mtodo preparatorio en si mismo.
Los mtodos de conservacin pertenecientes a este grupo son dos: Congelacin y
liofilizacin.
a) Conservacin por congelacin.
Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente crioprotector y
se guardan a temperaturas inferiores a cero grados centgrados, con lo que el
agua se congela. De esta forma, al no disponer las clulas de agua en forma
lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con las clulas as
conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor mtodo de
conservacin desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de
requerir aparatos especiales, y adems existe el peligro de que algn fallo del
sistema produzca una subida no deseada de la temperatura durante el
almacenamiento. Tambin resulta ser el mtodo ms molesto para realizar el
envo de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad
de las clulas conservadas por este mtodo son los siguientes: Edad de las
clulas, Velocidad en la congelacin y descongelacin, Temperatura de
almacenamiento y Empleo de agentes crioprotectores.

b) Conservacin por liofilizacin.
Tampoco se da crecimiento en las clulas conservadas por este mtodo, puesto
que se les ha quitado el agua mediante la liofilizacin, que es un proceso suave.


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Con ello la estabilidad gentica es alta, pero a veces no tanto como en la
congelacin, porque la liofilizacin se consigue por sublimacin del hielo de las
clulas. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el agua libre de las clulas y
despus eliminarla mediante el vaco, sin que haya necesidad de subir la
temperatura, lo que acabara afectando a la viabilidad del microorganismo. Para
este proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los que hay
muchos modelos en el mercado. Las clulas microbianas as conservadas se
someten a un tratamiento ms complejo que en el caso de la congelacin, pues la
liofilizacin se hace en dos etapas y se aade la sublimacin del agua a la
congelacin previa. Sin embargo, este es un mtodo muy recomendable por su
comodidad para el almacenamiento y para el envo de las cepas, pues una vez
conseguidos los lifilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18C-20C),
con lo cual su envo es muy cmodo.

2) Mtodos alternativos.
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de eleccin,
bien por carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no
resiste los tratamientos de la conservacin por estos mtodos. Conviene tener en
cuenta que nunca se debe usar un nico mtodo alternativo, sino que se
recomienda conservar el microorganismo empleando varios de estos mtodos.

a) Conservacin por transferencia peridica (Subcultivos).
La cepa microbiana se guarda en forma de cultivo activo en el medio de cultivo en
el que ha crecido. Sin embargo, estas clulas no pueden permanecer
indefinidamente en el mismo tubo, porque al seguir activas excretan productos
txicos del metabolismo que se acumulan, provocando el envejecimiento y muerte
celulares, por lo que es necesario transferirlas a otro tubo con medio de cultivo
fresco. Este es el peor mtodo para conseguir la estabilidad gentica, puesto que
al estar las clulas creciendo hay una alternancia de generaciones, y al cabo del
tiempo las clulas que se estn guardando sern descendientes lejanas de las
clulas iniciales y es posible que ya no conserven algunas de sus caractersticas.
Si se va a utilizar este mtodo es aconsejable retardar el envejecimiento y alargar
los periodos entre dos resiembras. Esto se puede conseguir de varias maneras
como por ejemplo: disminuyendo la cantidad de inculo; rebajando la proporcin
de algunos nutrientes en el medio de cultivo; inoculando en picadura los
microorganismos que son anaerobios facultativos, ya que el crecimiento en
presencia de oxgeno es ms rpido y origina productos generalmente txicos; y
almacenando los cultivos a 4C-8C. A veces tambin se suele recubrir el
crecimiento con una capa de aceite mineral estril. Con esto se consigue tambin
evitar en la medida de lo posible la desecacin del medio de cultivo, que podra
ser txico para las clulas al aumentar su concentracin.


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Hay que tener en cuenta que los microorganismos muy aerobios, como por
ejemplo los hongos filamentosos, no se pueden guardar en tubos completamente
cerrados. Por ltimo, otro inconveniente que tiene la transferencia peridica es que
la contaminacin de los cultivos resulta ms fcil al tener que manejar los tubos a
lo largo del tiempo y tambin por la posibilidad de entrada de caros en los
mismos.

b) Conservacin por suspensin en agua destilada o en agua de mar estril.
Es un mtodo alternativo muy utilizado y que da altos porcentajes de viabilidad en
diversos tipos de microorganismos, tanto hongos filamentosos como levaduras y
algunas bacterias. Consiste en suspender en agua estril unas cuantas clulas del
cultivo que se quiere conservar. Se pueden preparar en criotubos de los
anteriormente mencionados. En este caso la concentracin celular no debe ser
superior a 10
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-10
5
clulas/ml en el caso de bacterias y levaduras. Para los hongos
filamentosos que no esporulan, se pueden poner en suspensin trocitos de agar
con el crecimiento del hongo. En el caso de microorganismos marinos, la
suspensin se hace en agua de mar diluida.

e) Mantenimiento baja capa de aceite
Tcnica simple y efectiva para prolongar la conservacin de muchos organismos y
consiste en cubrir completamente el cultivo despus de su desarrollo en medio
slido, con una capa de aceite mineral o vaselina estril. Los cultivos en esta
forma se pueden conservar a temperatura ambiente o an mejoren refrigeracin
por perodos de varios aos (hasta los tres aos de mantenimiento).

3) Mtodos restringidos.
En este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente, pero a los que
es necesario recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy
determinados que no resisten bien la liofilizacin o la congelacin, como por
ejemplo los gneros bacterianos Spirillum, Rhodospirillum, etc. Los cuatro
mtodos que vamos a citar se basan en la paralizacin del crecimiento por
eliminacin del agua disponible para las clulas.
a) Desecacin en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann n 3) que se impregna con
una solucin muy densa de clulas y se deja secar al aire (en condiciones
estriles). Tambin es posible desecarlos por el procedimiento que se llama
desecacin lquida (L-Dry) porque se utiliza para ello el liofilizador, pero sin que
haya habido congelacin previa de las clulas.


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El vaco producido por el liofilizador deseca las clulas, pero hay que evitar que un
vaco excesivo provoque evaporacin brusca con ebullicin o que la temperatura
disminuya demasiado, ocasionando la congelacin incontrolada de las clulas.

b) Desecacin en suelo, arena, silicagel, etc.
Se aaden las clulas a estos sustratos que las protegern al desecar. Los
microorganismos productores de esporas se pueden conservar durante bastante
tiempo por este mtodo.

c) Desecacin en bolitas de alginato.
ste es un procedimiento bastante eficaz. Las clulas se encuentran en una matriz
de alginato y la eliminacin del agua se hace por tratamiento con soluciones
hipertnicas sucesivas y posterior desecacin al aire hasta que se pierde un 70%
de su contenido en agua. Estas bolitas de alginato se pueden conservar en tubos
cerrados hermticamente y a temperaturas de entre 4C y 18C, pudindose
guardar incluso a 80C debido al bajo contenido en agua de las clulas y la
proteccin que suministra el soporte de alginato. Este es un mtodo que se est
utilizando incluso para la conservacin de algas y clulas vegetales.

d) Desecacin en sal gorda para halobacterias.
Para su conservacin por este mtodo se mezclan las clulas con sal y se dejan
desecar espontneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecacin no
es total, pero las clulas dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua
disponible.
e) Preservacin en celulosa
Soporte de papel en condiciones de ausencia de agua es un procedimiento
adecuado y sencillo para conservar cepas. La tcnica consiste en embeber tiras
de papel filtro con una suspensin densa de organismos en suero, glutamato de
sodio u otro agente. Posteriormente se colocan en tubos para secarlas al vaco.
Ejemplos, cepas de Streptomyces y Salmonella conservadas por perodos de
hasta 2 aos a temperatura ambiente.
f) Cultivos en tierra
Tierra estril se inocula con un cultivo y se incubada varios das para inducir la
esporulacin de bacilos aerobios y anaerobios. Una vez que la misma se
manifiesta, la tierra es secada (desecador) y el cultivo mantenido de esta forma en
una atmsfera seca o en refrigerador. Otra forma, es agregar una suspensin de


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esporas. El mtodo es til para hongos y actinomicetos, que pueden mantenerse
por varios aos.

BIBLIOGRAFA SOBRE CONSERVACIN DE CEPAS MICROBIANAS
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