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XIII Congresso Brasileiro de Mandioca 645

CITOGENTICA COMO FERRAMENTA PARA O MELHORAMENTO GENTICO VEGETAL:


ANLISE MITTICA E MEITICA EM ESPCIES DE Manihot



Reginaldo de CARVALHO
1
, Kaliny Veiga Pessoa da SILVA
2
, Ida Ferreira de OLIVEIRA
3
,
Alfredo Augusto Cunha ALVES
4


RESUMO: No presente trabalho, acessos de Manihot foram analisados quanto ao nmero, morfologia
e tamanho cromossmico, alm do nmero e da posio das constries secundrias,
comportamento meitico e localizao dos stios de DNAr 5S e 45S. Em todos os acessos
observados o nmero cromossmico foi semelhante, apresentando 2n=36 cromossomos de
metacntricos a submetacntricos. Dois pares de constries secundrias terminais foram
observados em cada um dos acessos, exceto na espcie M. leptophylla que apresentou dois pares de
constrio secundria proximais. A meiose mostrou-se regular nas espcies silvestres e bastante
irregular nos acessos de M. esculenta. A hibridizao in situ - FISH revelou seis stios de DNAr 45S e
apenas um par de cromossomos com stios de DNAr 5S. Esses dados sugerem uma grande
similaridade no complemento cromossmico entre as espcies de Manihot. Por outro lado, eles
revelam a importncia da anlise cromossmica e da meiose em acessos de bancos de germoplasma
como ferramenta nos programas de melhoramento de mandioca.
Palavras- chave: FISH, constries secundrias, cromossomos meiticos.

SUMMARY: CYTOGENETICS AS A TOOL FOR PLANT GENETIC BREEDING: ANALYSIS OF
MITOSIS AND MEIOSIS IN Manihot SPECIES. Accessions of Manihot species were analyzed in this
work for number, morphology and size of chromosomes. The number of secondary constrictions,
meiotic behavior and the location of 5S and 45S rDNA sites were also observed. All investigated
accessions showed a similar karyotype with 2n=36, small metacentric to submetacentric
chromosomes. Two pairs of terminal secondary constrictions were observed in each accession except
M. leptophylla, which presented two proximal secondary constrictions. The meiosis investigated was
regular in the wild species, displaying 18 bivalents, but with irregularity in the accessions of M.
esculenta. The analysis with fluorochromes frequently showed six 45S rDNA sites revealed by FISH
and only one chromosome pair presented a 5S rDNA site. These data suggest that all Manihot species
present a very similar chromosome complement. On the other hand, the results show us the
importance of the chromosome analysis and the investigation on the meiosis cycle in Manihot species
as a tool in cassava breeding programs.
Keywords: FISH, secondary constrictions, chromosomes meiotic.

Trabalho financiado pelo Generation Challenge Programme (GCP) e Embrapa


1
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Depto. de Biologia. Rua Dom Manuel de Medeiros s/n - Dois irmos - CEP:
52171-900 Recife- PE. Email: Reginaldo.ufrpe@gmail.com
2
Universidade Federal Rural de Pernambuco. Mestranda em Melhoramento Gentico de Plantas, Depto. de Biologia. Email:
kalinyveiga@hotmail.com
3
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Depto. de Biologia. Email: iedaferreira@yahoo.com.br
4
Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Caixa Postal 007, CEP: 44380-000, Cruz das Almas, BA. Email:
aalves@cnpmf.embrapa.br


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INTRODUO
A maior diversidade biolgica das espcies do gnero Manihot no Brasil ocorre na Regio Central,
nos Estados de Gois, Minas Gerais, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul. Muitas das espcies
tambm ocorrem na Regio Nordeste e na Regio Amaznica (Rogers e Appan, 1973; Nassar, 2000;
Allem, 2002). Nos ltimos anos, a destruio dos habitats naturais tem levado de forma alarmante a
perda da diversidade gentica da mandioca e das espcies aparentadas. Com isso, muitas espcies
de Manihot, encontram-se ameaadas de extino. Nassar (2006) relatou o desaparecimento de 40
populaes naturais de um total de 41 localizadas em diversas regies do Brasil entre os anos de
1977 e 2001, confirmando a grave situao em que se encontram as populaes nativas das
espcies de Manihot, sugerindo um esforo conjunto por parte dos grupos de pesquisas para o
desenvolvimento de programas de preservao in situ em bancos de germoplasmas das espcies
silvestres detentoras da ampla diversidade gentica e caractersticas agronmicas teis.
A caracterizao gentica de diferentes acessos de bancos de germoplasmas constitui-se em
importante fonte de dados para melhoristas e conservacionistas, uma vez que permite um melhor
gerenciamento do pool gnico, bem como uma seleo mais eficiente dos recursos genticos,
facilitando a deteco da variabilidade gentica para fins de melhoramento gentico ou com fins
biotecnolgicos (Benko-Iseppon, 2001). O estudo citogentico em espcies de importncia econmica
pode contribuir de forma significativa nas etapas que antecedem os cruzamentos de linhagens
parentais nos programas de melhoramento gentico. A anlise cariotpica em clulas meiticas ou
mitticas possibilita a identificao dos polimorfismos cromossmicos numricos ou estruturais entre
os caritipos e a descrio da homologia cariotpica em cultivares ou espcies fornecendo,
informaes relevantes como alteraes cromossmicas, taxa de fertilidade, problemas no
reconhecimento dos homlogos, no disjuno cromossmica nas anfases, gerando gametas
aneuplides, percentual dos genomas parentais nos hbridos, etc. Esses dados podem ser inclusos
nos esquemas de cruzamentos contribuindo na pr-seleo de linhagens progenitoras ou ainda,
determinando o percentual de genomas parentais nos indivduos hbridos. Desta forma, a indicao
de parentais favorveis a hibridaes pode ser auxiliada pelo do uso de parmetros citogenticos.
As espcies de Manihot so consideradas alotetraplides com 2n=36 e um nmero bsico x=9.
Contudo, acredita-se que essas espcies tenham sido diploidizadas ao longo do processo evolutivo
apresentando hoje, o comportamento tpico de um diplide. Alm disso, cruzamentos interespecficos
podem ocorrer freqentemente produzindo hbridos naturais e, que, nos casos de esterilidade, essa
caracterstica pode no ser facilmente detectada por anlise fenotpica comprometendo etapas
importantes no melhoramento gentico. Apresentamos aqui algumas caractersticas cariotpicas
observadas em cromossomos mitticos e meiticos de espcies de Manihot objetivando estabelecer
relaes entre dados citogenticos e sua utilizao em Programas de Melhoramento Gentico
(Carvalho e Guerra 2002; Nassar, 2000; Rogers e Appan, 1973).

MATERIAL E MTODOS
Foram analisadas as espcies Manihot esculenta (manipeba, aipim bravo e pornuna-
bebedouro), M. glaziovii, M. dichotoma e M. leptophylla.


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Pontas de razes foram pr-tratadas com 8-hidroxiquinolena na concentrao de 0,002M por 24
horas a ~10C. Em seguida as razes foram postas em soluo fixadora de etanol-cido actico (3:1,
v/v) por 24 h a temperatura ambiente e acondicionada em freezer a 20C. Os botes florais foram
colocados diretamente em soluo fixadora e estocados a 20C antes da preparao das lminas.
Para anlise citogentica convencional seguiu-se a metodologia de Guerra (1983). As razes foram
lavadas duas vezes em gua destilada, hidrolisadas em HCl 5N por 20 minutos e as lminas foram
coradas com Giemsa 2%. No caso dos botes florais, esses foram hidrolisados por apenas 5 minutos.
A hibridizao in situ fluorescente foi realizada de acordo com o protocolo de Morais et al. (2007).
As sondas de DNAr 45S foram marcadas com biotina e detectada com anticorpo anti-biotina
conjugado com TRITC. A sonda de DNAr 5S foi marcada com digoxigenina e detectada com anti-
digoxigenina conjugado com FITC. As lminas contendo as preparaes citolgicas foram lavadas em
fixador Carnoy e submetidas a uma srie alcolica. Em seguida foram desnaturadas a 75C em
soluo salina de 2xSSC por 7 min, a desnaturao da sonda ocorreu tambm a 75C durante 10
min. A soluo contendo a sonda foi adicionadas s lminas e essas, transferidas para uma cmara
mida a 37C por 16 horas. Aps os passos de hibrid izao, deteco e lavagens, as lminas foram
montadas com DAPI (2 g/mL) em meio de montagem apropriado para hibridizao in situ.
As imagens foram capturadas com cmera digital Cyber shot Sony 5.1 MP e transferidas para o
programa computacional Corel Draw V.12 para processamento.


RESULTADOS E DISCUSSO
O gnero Manihot parece apresentar uma forte homogeneidade entre suas espcies ao nvel
cariotpico, ao contrrio da ampla plasticidade botnica observada entre suas espcies. Todas as
espcies analisadas no presente trabalho apresentaram caritipos semelhantes com 2n=36,
morfologia cromossmica de meta a submetacntrica, tamanho mdio cromossmico de 1,75um e
nmero mximo de dois pares satelitados com constries secundrias (RON) subterminais (Figura
1). Os stios ribossmicos foram em nmero de seis para o DNAr 45S e dois para o DNAr 5S e
sempre na mesma posio (Figuras 3 e 4) no representando uma boa marca citogentica para
distino das espcies. Esses dados esto de acordo com dados previamente registrados na literatura
(Carvalho e Guerra, 2002; Nassar et al., 1995; Umanah e Hartmann, 1973). Apenas a espcie M.
leptophylla apresentou diferena em seu caritipo apresentando as constries secundrias prximas
ao centrmero e no subterminal como nas outras espcies, sempre sendo observado um nmero
mximo de quatro RONs (Figura 2). Este polimorfismo das RONs foi considerado como um marcador
espcie-especfico.
As espcies de Manihot so consideradas alotetraplides. Para explicar o sucesso que algumas
espcies consideradas poliplides possuem, tem se discutido a diploidizao do caritipo como
processo adaptativo ao longo do processo evolutivo (Singh, 1993). Esse mecanismo pode ter ocorrido
dentro do gnero Manihot levando a estabilidade cariotpica observada entre suas espcies. As
hibridaes interespecficas, com produo de hbridos frteis podem ocorrer, naturalmente ou
artificialmente, com quebra de barreiras de isolamento reprodutivo. Por outro lado, todas as espcies,
principalmente a mandioca apresentam a via assexuada (estacas ou manivas) como processo


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alternativo de reproduo, contornando possveis problemas meiticos pr ou ps-zigticos (Nassar,
2000; Carvalho e Guerra, 2002).
A meiose nas espcies silvestres foi normal observando-se 18 bivalentes na metfase I e uma
segregao regular dos cromossomos homlogos nas anfases I e II. No final da esporognese
formaram-se, em todas as espcies silvestres, quatro micrsporos, revelando uma meiose
completamente regular em termos de diviso celular. A variedade manipeba apresentou um
comportamento meitico muito irregular com a ocorrncia de univalentes, bivalentes e trivalentes
revelando comportamento tpico de um indivduo triplide. A segregao cromossmica no final da
meiose (anfase II) foi tambm irregular, resultando em 100% das ttrades ou polades anormais
apresentando um grande nmero de ncleos no seu interior (Figuras 5 e 6). Para este acesso, a
colorao carmim actico mostrou gros de plen de diversos tamanhos e sem contedo
citoplasmtico, sugerindo esterilidade total. No acesso pornuna-bebedouro foram observadas
polades com nmero inferior de microncleos e univalentes em relao a cultivar manipeba,
sugerindo um nvel mais atenuado ou parcial de irregularidade meitica parcial (Figuras 7 e 9).
Seguida a essa anlise, ser realizada uma quantificao dessas irregularidades e teste de viabilidade
dos esporos entre os materiais analisados. A ocorrncia de eventos de poliploidizao espontnea
parece no ser um evento freqente no gnero e a ocorrncia de irregularidades meiticas, embora
descritos por muitos autores em espcies de Manihot no tem sido tratados utilizando parmetros
estatsticos (De Carvalho et al. 1999; Hahn et al. 1990; Nassar et al. 1995).

CONCLUSO
Esses dados refletem claramente, a possibilidade de uso dos parmetros citogenticos e a
importncia de uma avaliao prvia dos cromossomos nos acessos includos nos esquemas de
cruzamentos em programas de melhoramento gentico. Na anlise dos cromossomos metafsicos
mitticos observou-se uma diferena marcante no nmero e posio das regies organizadoras dos
nuclolos (RONs) entre M. leptophylla e M. glaziovii sendo este considerado um bom marcador
espcie-especfico. Por outro lado, a anlise meitica se mostrou mais eficiente na identificao de
caractersticas que podem ser utilizadas de forma prtica e direta na seleo das linhagens parentais,
considerando as diversas irregularidades durante a diviso meitica e que poder influenciar na
obteno de hbridos com diversos nveis de fertilidade. possvel que o emprego de um maior
nmero de tcnicas de bandeamento utilizando DNA satlite, hibridizao com BACs ou mesmo da
hibridizao genmica in situ em cromossomos mitticos, possa ampliar o nvel de polimorfismo e
conseqentemente o nmero de marcadores espcie-especficos, complementando a anlise
meitica.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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relacionadas: Avanos e perspectivas. EMBRAPA Documentos 56: 327-332


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Figuras 1 a 9 - Clulas mitticas e meiticas de espcies de Manihot. 1) metfase mittica de M.
glaziovii (setas mostram um par de constries secundrias terminais -RONs); 2) metfase mittica
de M. leptophylla (setas apontam dois pares de RONs proximais). 3-4) metfases mitticas de M.
dichotoma e M. esculenta Aipim bravo revelando os stios de DNAr 45S (cores vermelho e rosa) e de
DNAr 5S (cor verde) setas pequenas. 5-6) metfase-anfase I e polade mostrando dois microncleos
em M. esculenta pornuna bebedouro. 7 e 9) metfase-anfase I e polade com cinco microncleos
no interior do meicito em M.esculenta manipeba (setas apontam para cromossomos univalentes). 8)
cariograma de quatro metfases mitticas de espcies de M. esculenta coradas convencionalmente
(barra corresponde a 20 m).