UNIVERSIDAD TECNOLGICA DE PANAM

FACULTAD DE INGENIERA CIVIL

LICENCIATURA EN INGENIERA AMBIENTAL

TRABAJOP DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL
MICROBIOLOGA DE LA LECHE

PROFESOR CENOBIO CRDENAS

PRESENTADO POR:
Luis Batista 4-733-2426
Gabriela Velarde PE-12-357
Jenny Barra 8-787-845
Licenny Lpez 9-718-2013
Lucas Garrido PE-11-12

Grupo 1IB131

10 de mayo de 2006
MICROBIOLOGA DE LA LECHE
Contenido
Introduccin
Microbiologa de la leche cruda
1. Contaminacin de la leche
1.1. Fuentes de contaminacin de la leche cruda
1.1.1. El animal
1.1.2. Aire
1.1.3 Agua
1.1.4 Suelo
1.1.5 El ordeador
1.1.6 Estircol
1.1.7. Utensilios y transporte
2. Control de la contaminacin
3. Factores que afectan el crecimiento de microorganismos
3.1. Factores intrnsicos
3.1.1 ph
3.1.2. Actividad del agua (aw)
3.1.3. Potencial de xido-reduccin (redox, eh)
A. Aerobios estrictos
B. Anaerobios facultativos
C. Anaerobios estrictos
D. Microaerfilos
3.1.4. Contenido de nutrientes
3.1.5. Componentes y sistemas antimicrobianos de la leche
A. Lactoferrina
B. Inmunoglobulinas
C. Sistema lactoperoxidasa tiocianato - perxido de
hidrgeno (lp)
D. Aglutininas
E. Fagocitosis
F. Otros sistemas antimicrobianos
3.2. Factores extrnsecos
3.2.1. Temperatura
3.2.2. Humedad relativa
3.2.3. Gases atmosfricos
3.3. Factores implcitos
4. Microorganismos de importancia en leche cruda
4.1. Bacterias
4.1.1. Bacterias gram positivas:
4.1.1.1. Bacterias lcticas
4.1.1.2. Micrococcos
4.1.1.3. Estafilococos
4.1.1.4. Bacterias esporuladas
4.1.1.5. Otras bacterias gram +
4.1.2. Bacterias gram negativas
4.1.2.1. Enterobacterias
4.1.2.2. Pseudomonas
4.1.2.3. Acromobacteriaceae
4.1.2.4. Bacterias gran negativas diversas
4.2. Mohos y levaduras
4.3. Virus
5. Determinacin de la calidad microbiolgica en la leche cruda
6. Determinacin de bacterias coliformes en la leche y sus productos
6.1. Pruebas presuntivas
6.1.1. Prueba presuntiva en medio liquido. Determinacin del
"nmero mas probable" de coliformes.
6.1.2. Prueba presuntiva en medio slido
6.2. Pruebas confirmativas
6.2.1. Prueba confirmativa en medio slido (a partir de medio
liquido)
6.2.2. Prueba confirmativa en medio liquido (a partir de medio
slido)
6.3. Pruebas completas
6.3.1. Prueba completa (a partir de medio slido)
7. Pruebas de diferenciacin de bacterias coliformes
7.1. Pruebas bioqumicas imvic
7.1.1. Prueba del indol:
7.1.2. Prueba del rojo de metilo y voges-proskauer
7.1.3. Prueba de asimilacin del citrato
8. Eficiencia de la pasteurizacin. Prueba de la fosfatasa alcalina
8.1. Mtodo de scharer para fosfatasa (covenin 363)
Conclusiones
Bibliografa
Anexos




Introduccin

Las caractersticas nutricionales que hacen de la leche un alimento completo
para la dieta de los seres humanos, tambin la hacen un medio de cultivo ideal para el
crecimiento de una gran variedad de microorganismos.

Ya en la antigedad se aprovechaba la actividad de las bacterias para la
elaboracin de productos lcteos y para la conservacin de la leche, fue as como se
inicio la elaboracin del yogurt y otras bebidas lcteas fermentadas, donde, como
resultado del metabolismo fermentativo de la lactosa y la consecuente produccin de
cido lctico, se consegua la variacin de las caractersticas fsico-qumicas de la
leche y se prolongaba su vida til.

Una de las ramas de la industria lctea que depende en gran manera de la
actividad de los microorganismos, es la industria de los quesos. Una gran variedad de
ellos han sido elaborados bajo la actividad enzimtica de diversas especies bacterianas
y fngicas. En la elaboracin de mantequillas tambin se utilizan cultivos bacterianos
seleccionados por su habilidad de producir cido y sabor.

Otros microorganismos deben ser estudiados no por su utilidad, si no por la
capacidad de alterar la composicin y caractersticas organolpticas de la leche y
derivados lcteos o por ser agentes causales de enfermedad en los consumidores.

En general se puede resumir la importancia del estudio microbiolgico de la
leche basado en esos tres aspectos:
Los microorganismos producen cambios deseables en las caractersticas fsico
qumicas de la leche durante la elaboracin de diversos productos lcteos.
Los productos lcteos y la leche pueden contaminarse con microorganismos
patgenos o sus toxinas y provocar enfermedad en el consumidor.
Los microorganismos pueden causar alteraciones de la leche y productos
lcteos hacindolos inadecuados para el consumo.



En la leche cruda pueden encontrarse microorganismos de los diferentes grupos:
bacterias, hongos (mohos y levaduras) y virus, los cuales sern descritos brevemente a
continuacin, de acuerdo a su importancia en la industria lctea.

Dentro del llamado "grupo coliforme" se incluyen todos los bacilos Gram
negativo, aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, capaces de fermentar la
lactosa con produccin de gas y cido en 48 horas, en medios de cultivo slidos o
lquidos. Los gneros que integran este grupo son el Escherichia, Enterobacter,
Citrobacter y Klebsiella (Flia. Enterobacteriaceae). Siendo las especies ms
importantes la Escherichia coli y el Enterobacter aerogenes El primero en particular es
husped normal del trato intestinal del hombre y los animales de sangre caliente, por lo
cual se encuentra en grandes cantidades en las heces y el estircol. El segundo (E.
aerogenes) tambin se presenta en las heces, pero mas frecuentemente se origina del
suelo y materia vegetal en descomposicin. La presencia en el agua de estos
microorganismos se considera inaceptable, asocindose con contaminacin fecal y por
ende con la posible presencia de otros microorganismos patgenos de origen intestinal,
como por ejemplo las especies del gnero Salmonella productoras de la fiebre tifoidea
y disenteras bacilares.

La leche cruda se contamina corrientemente con bacterias coliformes, derivadas
directa o indirectamente del tracto intestinal de las vacas, animales que
afortunadamente no sufren las infecciones entricas propias del hombre. Esta
contaminacin puede provenir del estircol, polvo, suelo, alimentos del ganado, agua,
insectos (especialmente moscas) o del contacto con residuos lcteos que quedan en
los utensilios de ordeo y tanques de transporte o almacenamiento, mal lavados y
saneados; donde esas bacterias suelen desarrollarse con gran facilidad. Por estas
razones, es sumamente difcil producir leche cruda libre de coliformes, dndole a su
presencia una significacin diferente que en el agua, y aunque es indeseable, se tolera.
No obstante, altas cuentas bacterianas de coliformes son indicativas de condiciones
insanas de produccin, transporte o almacenamiento y producen defectos en la leche
(sabores desagradables), razones suficientes para evitar su desarrollo, mediante
buenas prcticas de produccin.

En la leche pasteurizada, a diferencia de la leche cruda, la presencia de
bacterias coliformes es inaceptable ya que a las temperaturas de pasteurizacin se
destruyen. Por lo tanto, una prueba de coliformes positiva en productos lcteos
pasteurizados denota mala pasteurizacin y aunque este hecho generalmente se
descubre por la prueba de fosfatasa, la colimetria a veces resulta ms sensible.
Adems, un resultado coliforme positivo puede indicar recontaminacin post-
pasteurizacin, bien sea por los equipos sucios o defectuosos (escapes de leche cruda,
escapes de vapor condensado, etc.) por los trabajadores (manos, ropa, etc.) o por
envases mal desinfectados. Ahora bien, como no hay forma de establecer si los
coliformes se originaron en la vaca o de un ser humano, cuyas heces si pueden ser
portadoras de otros microorganismos patgenos, la leche pasteurizada coliforme
positiva debe rechazarse.

De la anterior discusin se deduce, que la determinacin de bacterias coliformes
en la leche y otros productos lcteos pasteurizados, es sumamente importante tanto en
los laboratorios de control de calidad de las industrias del ramo como la de las agencias
gubernamentales de sanidad. Ello puede efectuarse por diferentes mtodos, siendo los
ms comunes las llamadas pruebas de fermentacin, las cuales han sido clasificadas
en presuntivas, confirmativas y completas. Estas determinaciones pueden continuarse
con pruebas de diferenciacin de especies de coliformes, siendo muy recomendables
las pruebas bioqumicas del IMViC y McKeenzie.





MICROBILOGA DE LA LECHE CRUDA
1. CONTAMINACIN DE LA LECHE

Los diferentes microorganismos alcanzan la leche por dos vas principales: la va
mamaria y el medio externo.
1. Mamaria: los microorganismos que pueden alcanzar la ubre, igualmente pueden
llegar a contaminar la leche antes o despus del ordeo. Estos microorganismos
pueden alcanzar la leche por va mamaria ascendente o mamaria descendente. Por va
ascendente lo hacen bacterias que se adhieren a la piel de la ubre y posterior al ordeo
entran a travs del esfnter del pezn (Staphilococcus aureus, Streptococcus,
Coliformes). La va descendente o hematgena la utilizan los microorganismos que
pueden causar enfermedad sistmica o tienen la propiedad de movilizarse por la
sangre y a travs de los capilares mamarios llegar a infectar la ubre (Salmonellas,
Brucellas, Mycobacterium tuberculosos).
2. Medio externo: la contaminacin de la leche puede ocurrir una vez que esta ha
sido extrada de la glndula mamaria. Los utensilios, tanques de almacenamientos,
transportes e incluso el personal que manipula la leche, son fuentes de contaminacin
de microorganismos que utilizan esta va, que en algunos casos son las ms
abundantes, causantes de grandes prdidas en la calidad del producto.

1.1. Fuentes de Contaminacin de la Leche Cruda

Las principales fuentes de contaminacin de la leche cruda son:

1.1.1. El animal:
Tericamente la leche al salir del pezn debera ser estril, pero siempre
contiene de 100 a 10.000 bacterias/mL, una baja carga microbiana que puede no llegar
a multiplicarse si la leche es manipulada adecuadamente. Los microorganismos
pueden entrar por va mamaria ascendente a travs del esfnter del pezn, es por ello
que cualquier lesin que afecte la integridad del mismo, facilitara un aumento en la
contaminacin. L leche puede tambin contaminarse al salir por medio de pelos o sucio
que se desprenden de los animales. La ubre est en contacto con el suelo, heno, y
cualquier superficie donde las vacas se echen, de all que los pezones sean
considerados como una fuente importante de esporas bacterianas. En animales
enfermos, (vacas con mastitis) aumenta el nmero de microorganismos en leche.

Origen de los Microorganismos de la Leche
Origen Numero de bacterias/mL
Salida del pezn 500-1000
Equipo de ordeo 1000-10000
Tanque de refrigeracin 5000-20000
Fuente: Amiot, J. 1991.

Una vaca padeciendo de mastitis clnica puede producir una leche con 107
bacterias/mL y si es subclnica de 105 a 106 bacterias/mL. Str. agalactiae, Str.
dysgalactiae y Str. uberis son bacterias comnmente asociadas a cuadros de mastitis.
Igualmente, aunque poco frecuente, pueden causar mastitis Escherichia coli,
Pseudomona aeruginosa, Clostridium, Bacillus, Pasteurella, Proteus, Serratia. Uno de
los microorganismos ms frecuentemente causante de mastitis es el Staphylococcus
aureus, el cual adems es resistente al tratamiento antibitico comn y es capaz de
producir una enterotoxina, que por su termo-resistencia no es destruida en la
pasteurizacin, pudiendo llegar a causar enfermedad en el consumidor.


Cantidad De Flora En Leche Recin Ordeada
Contaminacin de la leche
Frecuencia
(%)
<100 41
100-1.000 35
1.000-10.000 23
>10.000 1
Fuente: Amiot, J. 1991
1.1.2. Aire:
El aire representa uno de los medios ms hostiles para la supervivencia de los
microorganismos debido a la constante exposicin al oxigeno, cambios de temperatura
y humedad relativa, radiacin solar, etc. Es por ello que solo aquellos microorganismos
resistentes podrn ser capaces de permanecer en el aire y llegar a contaminar los
alimentos. Los microorganismos Gram negativos mueren rpidamente mientras que los
Gram positivos y aquellos esporulados pueden persistir por largo tiempo. En el aire se
pueden encontrar Micrococcus, Streptomyces y esporas de mohos como Penicillium y
Aspergillus. Las levaduras raramente se encuentran en suspensiones areas.

1.1.3. Agua:
El agua utilizada para la limpieza de los equipos y utensilios de ordeo, la
higiene del animal y del personal, debe ser lo ms limpia posible. El agua puede ser
una fuente importante de microorganismos psicrffilos (Pseudomonas) y por
contaminacin de esta, de bacterias coliformes.

1.1.4. Suelo:
El suelo es la principal fuente de microorganismos termodricos y termfilos. La
leche nunca entra en contacto con el suelo pero si los animales, utensilios y personal,
de manera que es a travs de ellos que los microorganismos telricos (Clostridium)
pueden alcanzar a contaminar la leche.

1.1.5. El ordeador:
El ordeador puede llegar a jugar un papel importante en la contaminacin de la
leche, sobre todo cuando el ordeo es manual. En nuestro medio es frecuente observar
como el personal encargado del ordeo no se lava las manos y peor an se las
humedece en la misma leche para lograr lubricacin que facilite el ordeo. Se ha
sealado al ordeador como responsable de la contaminacin de la leche con
microorganismos patgenos (S. Aureus, Leptospiras, E. coli, M. tubercolosis,
Streptococcus, etc.). Las heridas infectadas en manos y brazos pueden ser fuentes de
algunos de estos microorganismos.

1.1.6. Estircol:
El estircol es la fuente principal de microorganismos coliformes. Estos pueden
alcanzar la leche a travs del animal o del ordeador as como tambin por medio de
los utensilios mal higienizados.

1.1.7. Utensilios y Transporte:
El contacto de la leche con el material de ordeo y su permanencia en los
tanques y transporte puede multiplicar por un factor de 2 a 50 la flora microbiana
presente. De all que la higiene adecuada de estos, por medio de agentes
desinfectantes, afecta significativamente la calidad sanitaria de la leche. La flora
microbiana proveniente de esta fuente puede ser diversa, pero la ms frecuente es
flora termorresistente, razn ms que suficiente para exigir al mximo la higiene.

2. CONTROL DE LA CONTAMINACIN
El empleo de sistemas de ordeo mecnico ayuda reducir la contaminacin a
partir del animal, ordeadores, aire y suelo. De manera que la contaminacin en este
caso estar mayormente en los tanques de almacenamiento y en el sistema de ordeo
en si mismo.
A travs de campaas de educacin se puede reducir la contaminacin por parte
del personal, as como una supervisin cercana para evitar que personas enfermas
participen en la labor diaria de ordeo.
Deben ejecutarse programas sanitarios preventivos sobre el rebao, con lo cual
no solo se logra una producto de buena calidad si no que tambin se incrementa la
productividad. Adems debe evitarse ordear animales enfermos o bajo tratamiento
medicinal.
En fin, tomando en cuenta las principales fuentes de contaminacin, pueden
tomarse diversas medidas encaminadas a evitar el contacto de estas con la leche y
mejorar su calidad sanitaria final.

3. FACTORES QUE AFECTAN EL CRECIMIENTO DE
MICROORGANISMOS
Una vez que los microorganismos han alcanzado la leche comienza un periodo
de adaptacin de estos al medio circundante, la duracin de este periodo as como la
capacidad para multiplicarse esta condicionada al efecto de varios factores intrnsecos,
extrnsecos e implcitos, los cuales sern discutidos brevemente en los apartes
siguientes.

3.1. Factores Intrnsicos:
Los factores intrnsecos son aquellos que tienen que ver con el alimento en si, su
composicin y caractersticas. Dentro de este grupo esta el pH, actividad de agua,
potencial de oxido reduccin, cantidad de nutrientes y sistemas antimicrobianos.
3.1.1. pH:
La gran mayora de bacterias y hongos crecen a pH cercano a la neutralidad. El
pH de la leche normal se encuentra entre 6.5 a 6.7, ligeramente cido, esto favorece el
crecimiento de una flora microbiana diversa. Sin embargo son las bacterias y de ellas el
grupo de las cido lcticas las que se ven favorecidas para crecer el la leche a pH
normal.
Rangos de pH para el Crecimiento de los
Microorganismos
Grupo Rango Optimo
Bacterias 4,5 - 9 6,5 - 7,5
Levaduras 2 11 4 6
Mohos 2 - 9 -

3.1.2. Actividad del agua (a
w
):
Como actividad de agua se conoce la cantidad de agua libre disponible para el
crecimiento microbiano y para los procesos qumicos y enzimticos. En los alimentos
no toda el agua se encuentra en estado libre, una parte se puede encontrar ligada a las
protenas o formando parte de otros compuestos. El 87,5 % de la leche esta constituido
por agua, una parte esta ligada a las casenas y una mayor se encuentra en estado
libre. La actividad de a
w
de la leche esta estimada en 0,99, la del agua pura es 1,00.
Los microorganismos as como todos los seres vivos necesitan presencia de agua para
la mayora de los procesos metablicos. Sin embargo debido a la excesiva humedad de
la leche algunos mohos y levaduras se les dificulta la multiplicacin de all que sean
considerados de mayor importancia en productos lcteos deshidratados que en leche
fluida.
Actividad de agua (a
W
) a la cual crecen algunos
microorganismos
GRUPOS a
W

Bacterias G 0,97
Bacterias G + 0,90
Levaduras 0,88
Hongos filamentosos 0,80
Bacterias halfilas 0,75
Hongos xerfilos 0,61

3.1.3. Potencial de xido-Reduccin (Redox, Eh):
El potencial redox de los alimentos esta determinado por la presencia de
elementos reductores (que ganan oxigeno o pierden electrones) y oxidante (que
pierden oxigeno o ganan electrones). El Eh puede tener valores positivos, cuando la
sustancia o el alimento se comporta como oxidante o negativos cuando se comporta
como reductor. El oxigeno disuelto en la leche contribuye a que la misma posea un Eh
de +250 a +350 mV (milivoltios). Los microorganismos al multiplicarse, debido a su
metabolismo liberan electrones y consumen oxigeno, lo cual hace que el Eh disminuya.
En medios no bufferados una pequea parte de microorganismos (10
5
/g) pueden
causar cambios en el potencial, en cambio en alimentos bien amortiguados una
poblacin mayor (10
8
/g ) apenas modificar el Eh.
Segn las necesidades de oxigeno los microorganismos se clasifican en:
a. Aerobios Estrictos: los que necesitan oxigeno para desarrollarse, no
se multiplican en ambientes anaerbicos. Ejemplos: Pseudomonas,
Micrococcus, Bacillus, mohos.
b. Anaerobios Facultativos: Son microorganismos que pueden crecer en
presencia o ausencia de oxigeno. Ejemplo: Enterobacterias,
Staphilococcus.
c. Anaerobios Estrictos: microorganismos que solo crecen en ausencia
de oxigeno. Ejemplos: Clostridium, Propionibacterium
d. Microaerofilos: aquellos que para crecer necesitan solo una pequea
fraccin de oxigeno en la atmsfera. Ejemplos: Lactobacillus,
Streptococcus, Pediococcus

Por lo general en ciertos alimentos el desarrollo inicial de los microorganismos
es aerbico y posteriormente al reducirse el Eh comienza el desarrollo de los
anaerbicos. En la leche las bacterias cido lcticas se consiguen en abundancia y por
ser varias de ellas anaerobias facultativas, pueden desarrollarse en ambos ambientes.

3.1.4. Contenido de Nutrientes:
En la leche se encuentran gran variedad de vitaminas, adems por poseer
azucares fcilmente fermentables, citratos, grasas y protenas aportan un medio
enriquecido para el crecimiento de microorganismo. Sin embargo es vlido notar que se
encuentran pocos aminocidos libres y pptidos de bajo peso molecular, de all que las
bacterias que no posean la capacidad de sintetizar enzimas proteolticas se vern en
mayor dificultad para crecer. Pero en la leche se dan diversa asociaciones de
microorganismos que mediante relaciones simbiticas logran desarrollarse en el medio.
Algunas de estas asociaciones se aprovechan para la elaboracin de productos
lcteos, como ejemplo se puede citar el yogurt, donde se da una simbiosis entre el
Streptococcus y el Lactobacillus.

3.1.5. Componentes y Sistemas Antimicrobianos de la Leche:
En la leche se encuentran diversos sistemas antimicrobianos que pueden
proteger a la glndula contra infecciones y a la leche de la contaminacin.
Desgraciadamente la proteccin es limitada y de poca duracin posterior al ordeo.
Entre estos sistemas tenemos:
a. Lactoferrina: es una glicoprotena que tiene la propiedad de unirse al
hierro, similar a la transferrina de la sangre. Se encuentra en altas
concentraciones en la leche de los animales que no se ordean y en la de
aquellos afectados por mastitis. Inhibe la multiplicacin de las bacterias al
privarlas del hierro y puede proteger a la ubre seca de la infeccin por
Escherichia col. Se ha demostrado que altas concentraciones de citrato y
bajas de bicarbonato reducen su capacidad de unin con el hierro,
disminuyendo por lo tanto su accin inhibitoria. La concentracin de
lactoferrina esta correlacionada positivamente con el nmero de PMN, ya
que sta es derivada de estas clulas durante la inflamacin de la ubre.
Adems la accin de la lactoferrina es acelerada por la presencia de
lisozima, derivada tambin de los PMN. En leche de bfala se han
encontrado concentraciones de 0,320 mg/mL, mayores a la reportadas en
leche de vaca (0,200 mg/mL). Actualmente se estudian derivados de
lactoferrina bovina (apo-lactoferrina, holo-lactoferrina, lactoferrina B) con
el fin de utilizarlas como biopreservadores en alimentos.
b. Inmunoglobulinas: en la leche se pueden encontrar anticuerpos que
llegan desde el torrente sanguneo (Ig G) o bien sintetizados en la
glndula mamaria (Ig A), cuya funcin es proteger al recin nacido por
transferencia pasiva (inmunizacin pasiva). Pero tambin actan a nivel
local para evitar o reducir la severidad de las mastitis, causada por
grmenes susceptibles al sistema complemento-anticuerpo que opera en
la glndula. Adems pueden neutralizar toxinas o actuar como opsoninas
para facilitar la fagocitosis por parte de los polimorfonucleares.
c. Sistema Lactoperoxidasa Tiocianato - Perxido de hidrgeno
(LP): la lactoperoxidasa es un enzima que se sintetiza en la ubre y est
presente en altas concentraciones en la leche de vaca. Puede llegar a
representar el 1% de las protenas totales de esta. El tiocianato se
encuentra en diferentes concentraciones dependiendo principalmente de
la alimentacin del animal; se ha reportado valores de 5,9 a 8,94 mg/L en
leche cruda de bfala y de 1,2 a 14,5 mg/L en leche de vaca. El perxido
de hidrgeno, procede de los microorganismos que producen esta
sustancia, (ejemplo los estreptococos) y de los PMN. El sistema LP,
destruye los microorganismos por oxidacin de sus sistemas enzimticos,
actuando como sustrato el peroxido de hidrgeno y como cofactor el
tiocianato. Este sistema antimicrobiano solo inhibe temporalmente ciertas
bacterias (estreptococos del grupo B y N), aunque tiene poder bactericida
sobre otras. Bacterias catalasa positiva, Gram negativos como
Pseudomonas, Coliformes, Salmonella y Shigella, son inhibidas por el
sistema. La letalidad depende del pH, temperatura, tiempo de incubacin
y densidad celular. La activacin del sistema LP puede incrementar la
vida til de la leche por inhibicin microbiana, mejorar la calidad
microbiolgica de la leche al ofrecer un efecto bacteriosttico sobre la
flora lctea y un efecto bactericida sobre coliformes.
d. Aglutininas: son anticuerpos capaces de aglutinar las bacterias
sensibles de una manera especfica, formando masas agrupadas que son
arrastradas a la superficie por los glbulos grasos o se depositan en el
fondo en la leche desnatada. El resultado es una verdadera inhibicin por
separacin fsica. Son activas sobre un gran nmero de estreptococos
lcticos y lactobacilos. Tambin actan sobre enterobacterias. Son ms
abundantes en el calostro. Se destruyen fcilmente con el calentamiento
sobre los 60 C.
e. Fagocitosis: el principal mecanismo de defensa de la ubre lo
constituyen los fagocitos polimorfonucleares (PMN). Una ubre sana puede
excretar de 100.000 a 500.000 clulas por mL, de las cuales el 10% son
PMN. En una ubre enferma, el nmero de clulas puede llegar a
10.000.000 por mL, siendo el 90 % PMN. La fagocitosis y la destruccin
de bacterias por los PMN es menos eficiente en la leche que en la sangre,
debido principalmente a que los mismos ingieren grandes cantidades de
grasa y casena, razn por la cual la ubre puede llegar a ser fcilmente
infectada, an con un pequeo nmero de patgenos.
f. Otros sistemas antimicrobianos descritos en la leche pero que aun
no se conoce su modo de accin o bien son de menor importancia son la
Vitamina B
12,
cierto factor descritos en vacas cercanas al secado. La
lisozima enzima que se encuentra en mayor abundancia en la leche de
madres humanas se encuentra en cantidades trazas en la leche de vaca y
tiene la propiedad de producir la lsis de las bacterias.

3.2. Factores Extrnsecos:
Los factores extrnsecos son los que tienen que ver con el ambiente donde se
almacenan los alimentos. Entre ellos estn la temperatura, la humedad relativa y los
gases atmosfricos.
3.2.1. Temperatura:
No todos los microorganismos crecen a la misma temperatura. Segn la
temperatura ptima de crecimiento se pueden distinguir tres grupos: los mesfilos, los
psicrfilos y los termfilos. Al grupo de las bacterias Mesfilas pertenece la mayora de
la flora que se encuentra con mayor frecuencia en la leche, principalmente las bacterias
lcticas. Bacterias Psicrfilas son las que crecen a temperaturas de refrigeracin. Son
bacterias psicrofilas los miembros del genero Pseudomonas, Flavobacterium,
Acinetobacter, Alcaligenes, Bacillus. Bacterias Termfilas son aquellas que crecen bien
a temperaturas entre 45 a 55 C, en este grupo estn el Lactobacillus bulgaricos, L.
fermenti, L. Lactis, L. helveticus, L. acidophilus, Strepctococcus termophilus. Otro grupo
que merece ser descrito lo constituyen las Bacterias Termoduricas que son bacterias
en su mayora mesfilas que resisten temperaturas de pasteurizacin; algunas de ellas
son termfilas. Se encuentran en este grupo los Micrococcus, Microbacterium, Esporas
de Bacillus y Clostridium.
Los microorganismos psicrotrofos y los termotrofos, son microorganismos
mesfilos pero que igualmente pueden crecer a temperaturas bajas o altas,
respectivamente (vase el Cuadro anterior)
La temperatura a la cual se encuentra la leche despus del ordeo favorece la
rpida multiplicacin microbiana. La mayor proporcin de la flora bacteriana presente,
son microorganismos mesfilos, es por ello que la inmediata refrigeracin a
temperaturas de 4 a 5 C se hace fundamental para asegurar la calidad de la leche.
Pero su almacenamiento no debe ser prolongado (mximo 24 horas) ya que entonces
se favorecera el aumento en nmero de la flora psicrotrofa. Cuando la leche no vaya a
ser procesada el mismo da de recepcin debe ser sometida a un proceso de
termizacin.


Rangos de Temperatura (C) para el Crecimiento de los
Microorganismos
GRUPOS MIN OPTIMA MAX
Termfilos 40-45 55-75 60-90
Termotrofos 15-20 30-40 45-50
Mesfilos 5-15 30-40 40-47
Psicrfilos -5 - +5 12-15 15-20
Psicrotrofos -5 - +5 25-30 30-35

Microorganismos Psicrfilos y Termodricos de la Leche
Cruda
Gneros Termodricos Generos Psicrotrofos
Microbacterium
Micrococcus
Esporos de Bacillus
Esporos de Clostridium
Alcaligenes
Pseudomonas
Acinetobacter
Flavobacterium
Aerobacter
Alcaligenes
Bacillus
Arthrobacter
Fuente: Robinson, R. K. 1987


3.2.2. Humedad relativa:
La humedad de la atmsfera influye en la humedad de las capas superficiales de
los alimentos en almacenamiento. En leche fluida no juega un papel importante,
contrario al que puede jugar en quesos en almacenamiento o en cavas de maduracin.

3.2.3. Gases Atmosfricos:
Al igual que la humedad relativa, los gases atmosfricos no influyen
marcadamente en la calidad microbiolgica de la leche cruda, salvo que la misma sea
sometida a procesos de agitacin fuerte donde el oxigeno del aire pueda ser
incorporado al alimento y favorecer el crecimiento microbiano aerbico. Este factor
debe ser considerado en el almacenamiento de ciertos derivados lcteos los cuales
pueden verse alterados por una alta presin de oxigeno en la atmsfera (leche en
polvo, leche evaporada, quesos, etc).

3.3. Factores Implcitos
Dentro de los factores implcitos se describen los relacionados directamente con
las especies microbianas, su metabolismo y las relaciones que establecen. No todas
las bacterias tienen la capacidad de crecer en la leche, an cuando encuentren
condiciones optimas. Esto es debido al estado como se encuentran los diferentes
componentes. Por ejemplo, no todas las especies tienen la capacidad de metabolizar la
lactosa, si no que necesitan que esta este hidrolizada para as poder utilizar la glucosa
o galactosa. De manera que aquellas que estn capacitadas para producir las enzimas
necesarias se vern ms favorecidas en crecer. As mismo pasa con las protenas,
muchos microorganismos no tienen poder proteoltico, por lo que dependen de otros
que metabolicen las protenas y as poder utilizar los aminocidos libres. De esa
manera en la leche y productos lcteos se pueden observar varios ejemplos de
relaciones simbiticas, siendo la ms destacada la que se da entre el Strectococcus
thermophilus y el Lactobacilus bulgaricus, durante la elaboracin del yogurt. En estos el
primero se favorece de la capacidad proteoltica del segundo, a la vez que este
incrementa su desarrollo a medida que el estreptococo produce cido formico y baja el
pH de la leche.

4. MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA EN LECHE CRUDA
A continuacin se presenta una breve descripcin de los principales
microorganismos que pueden encontrarse en leche cruda.

4.1. Bacterias
Dada las caractersticas de la leche cruda, los microorganismos predominantes y
que se ven favorecidos para su crecimiento son las bacterias. En la leche se pueden
encontrar diverso gneros y especies bacterianas. Aquellas de mayor importancia en la
industria lctea son las llamadas bacterias lcticas y las bacterias coliformes.
4.1.1. Bacterias Gram positivas:
4.1.1.1. Bacterias lcticas
Son un grupo de bacterias de diferentes gneros, ampliamente distribuidas en la
naturaleza. Se encuentran en el suelo y en cualquier lugar donde existan altas
concentraciones de carbohidratos, protenas desdobladas, vitaminas y poco oxigeno.
Son Gram positivas y su forma puede ser bacilar, cocoide u ovoide. Algunas tienen
forma bifida (Bifidobacterium). Soportan pH 4 en leche. Son anaerbicas facultativas,
mesfilas y termfilas y de crecimiento exigente. Pueden ser homofermentativas (ms
del 90% de su metabolismo resulta en cido lctico) o heterofermentativas (producen
adems del cido lctico, otros cidos y gases). Los principales gneros de bacterias
cido lcticas son: Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus,
Lactobacillus, Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus, Aerococcus,
Tetragonococcus, Alloiococcus y Bifidobacterium.
Su estudio en el mbito tecnolgico es importante por lo siguiente:
Son formadoras de textura y ayudan al establecimiento de las condiciones para la
elaboracin de ciertos productos lcteos. Por efecto de la acidez producida por la
fermentacin de la lactosa, la leche puede llegar a coagular gracias a la coalescencia
de las casenas al alcanzarse el pH iso-elctrico, lo cual es deseable en la elaboracin
de yogurt y quesos. En la elaboracin de crema y mantequilla una ligera acidificacin
permite acelerar el proceso y aumentar el rendimiento. Algunas especies producen
polisacridos (gomas, mucina), que aumentan la viscosidad de la leche cambiando su
textura (S. termophilus, Lb. bulgacricus, Lc. cremoris).
Aportan sabor y aroma, ya que como parte de su metabolismo fermentativo se da la
produccin de acetaldehdo, diacetilo, acetoina, acetona, lactonas, cidos voltiles,
alcohol y gas. El diacetilo es el principal responsable del aroma de la mantequilla. La
acetoina lo es en el yogurt, mientras que el cido lctico aporta sabor a diversos
productos fermentados. Adems la produccin de enzimas que intervienen en el
afinado de los quesos por degradacin de las protenas y las grasas afectan
notablemente las caractersticas organolpticas de los mismos.
Ejercen efecto biopreservador manifestado en la prolongacin de la vida til de los
productos elaborados con sus cultivos. Este efecto se lleva a cabo por varios
mecanismos: a) ciertas especies producen bacteriocinas (Lactococcus lactis subsp.
lactis, Enterococcus) las cuales son protenas que se comportan como antibiticos y
que inhiben el crecimiento de bacterias relacionadas con estas; b) con la produccin de
cido y descenso del pH se logra la inhibicin de otras especies bacterianas y la
conservacin de los alimentos; c) el efecto biopreservador tambin se cumple gracias a
la competencia por nutrientes que se da entre las diversas especies bacterianas.
Aportan beneficios para la salud de los consumidores, el cual se ha descrito como
efecto probitico. Este puede manifestarse de manera especfica en la prevencin y
reduccin de los sntomas en los cuadros diarreicos. Adems se le han atribuido a las
BAL, efecto preventivo de tumores, anticolesterolmico y modulador del sistema
inmunolgico.

4.1.1.2. Micrococcos
Dbilmente fermentadores, forman parte de la flora inocua que contamina la
leche cruda. Tienen poca actividad enzimtica, por lo tanto son de muy poca
importancia como agentes de adulteracin en la leche. Sin embargo por ser la flora
ms abundante en leche cruda y tener cierta capacidad proteoltica pueden llegar a ser
causante de alteraciones en leches pasteurizadas mal almacenadas.

4.1.1.3. Estafilococos:
Son anaerobios facultativos, fuertemente fermentadores. Son de gran
importancia desde el punto de vista sanitario. Causan mastitis y pueden provocar
enfermedades o intoxicaciones en los humanos. Staphilococus aureus produce una
exotoxina que causa fuertes trastornos intestinales en los humanos, la cual es
termorresistente, por lo cual no es destruida con la pasteurizacin. El Staphilococcus
epidermidis se ve implicado en algunos casos de mastitis, por lo cual puede llegar a
contaminar la leche.

4.1.1.4. Bacterias Esporuladas
Los Bacillus son bacterias aerbicas con actividad enzimtica variada producen
acidificacin, coagulacin y proteolisis. Los Clostridium son anaerobios estrictos,
producen gas. Algunos producen toxinas patgenas (Clostridium botulinum). Ambos
gneros son de poca importancia en leche cruda, su crecimiento es inhibido por las
bacterias lcticas. Cobran importancia en productos lcteos como en leches
pasteurizadas, quesos fundidos, leches concentradas, quesos de pasta cocida.
Resisten la pasteurizacin por su capacidad de producir esporas, las cuales solo se
destruyen a temperaturas por encima de 100 C.

4.1.1.5. Otras Bacterias Gram +
Que pueden encontrarse en la leche son Corynebacterium, bacterias
propionicas, Brevibacterium estos ltimos se encuentran en las cortezas de algunos
quesos madurados almacenados en condiciones hmedas.

4.1.2. Bacterias Gram negativas
4.1.2.1. Enterobacterias
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son huspedes normales del
intestino de los mamferos, por lo tanto su presencia en el agua y la leche se relaciona
con contaminacin de origen fecal. Las enterobacterias son menos abundantes en la
leche que otras bacterias gran negativas, sin embargo, tienen una gran importancia
desde dos puntos de vista, higinico: ya que varias de estas especies tienen poder
patgeno, de las cuales la ms temible es la Salmonella y otras que pueden provocar
trastornos gastrointestinales (Yersinia, E. Coli, Shigella); y tecnolgico: ya que son
bacterias heterofermentativas, grandes productoras de gas (carbnico e hidrogeno)
adems producen sustancias viscosas y de sabor desagradable, todo lo cual conduce a
la alteracin de la leche o subproductos. De las enterobacterias las ms comunes
encontradas en los productos lcteos son las del grupo Coliformes (Escherichia,
Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter). La determinacin de su presencia indica calidad
higinica de la leche cruda y pasteurizada.
Enterobacterias ms comunes de la leche cruda: Escherichia coli, Enterobacter
aergenes, Klebsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia. Los ltimos
dos gneros se consiguen poco frecuentes, son microorganismos inocuos pero por su
poder proteo ltico pueden provocar alteraciones en la leche.

4.1.2.2. Pseudomonas
Ms del 50% de la flora Gram negativa de la leche cruda esta representada por
este gnero. Juegan un papel importante en la conservacin de productos lcteos, ya
que adems de ser psicrfilas, varias especies tienen un gran poder proteoltico y
lipoltico. Adems se ha descrito que algunas de estas enzimas resisten temperaturas
por encima de los 80 C, por lo cual pueden causar alteraciones an en productos
elaborados con leches pasteurizadas,

4.1.2.3. Acromobacteriaceae
Este grupo de bacterias no fermentan la lactosa, no son proteolticas ni
patgenas, pero representan las bacterias psicrfilas que crecen en las leches
conservadas a baja temperaturas, algunas pueden producir sustancias viscosas y
pigmentos. Se han descritos los gneros Flavobacterium, Alcaligenes y Achromobacter.

4.1.2.4. Bacterias Gran Negativas Diversas
Las Brucellas son bacterias patgenas para los animales y para el hombre,
aunque poco frecuente, pueden llegar a causar cuadros de mastitis. Se destruyen con
la pasteurizacin.

4.2. Mohos y Levaduras
No tienen importancia en leche fluida, si no ms bien en los productos. Algunas
especies son utilizadas como cultivos lcteos para el afinado de los quesos madurados
como el Penicillium candidum y Penicillium camemmberti en los quesos de corteza
blanca como el Camembert y el Penicillium roqueforti en los quesos de pasta azul
(Roquefort).
Las levaduras al igual que los mohos son de poca importancia en la leche liquida
y son fcilmente destruidos a temperaturas de pasteurizacin. En la leche se
encuentran la especies Cndida cremoris, Sacharomices lactis, Sacharomices kefir.
Torula kefir se encuentra en los granos de kefir utilizados para producir esta bebida
lctea, caracterizada por su sabor cido-alcohlico, producto de la fermentacin de la
lactosa por estas especies.

4.3. Virus
La leche se puede contaminar con los virus causantes de la Fiebre Aftosa,
Estomatitis Vesicular. Los ms importantes para la industria lctea son los
Bacteriofagos virus que infectan a las bacterias produciendo su muerte, por lo cual
pueden afectar la produccin de derivados lcteos causando lisis de los cultivos
aadidos para la produccin de sabor y aroma.

5. DETERMINACIN DE LA CALIDAD MICROBIOLGICA EN LA
LECHE CRUDA
El laboratorio de control de calidad de la industria lctea debe estar capacitado
para determinar la calidad microbiolgica de las diferentes materias primas as como de
los productos terminados. En el anlisis de la leche cruda existen diferentes mtodos
que permiten medir de manera indirecta o directa su calidad sanitaria.
Las pruebas indirectas se fundamentan en la modificacin de algunas
propiedades por parte de los microorganismos. Dentro de este grupo estn la
determinacin del sedimento (lactofiltracin), temperatura, pH, acidez titulable,
lactofermentacin y las pruebas de reduccin de colorantes (azul de metileno,
resazurina)
1. Sedimento: el sedimento obtenido por el mtodo de lactofiltracin mide la
calidad sanitaria. La presencia de abundante partculas de sucio y su tipo
(heces, insectos, tierra, restos de alimentos), puede indicar el cuidado que se
ha tenido durante el ordeo y almacenamiento de la leche cruda.
2. Temperatura: la determinacin de la temperatura en la recepcin muestra
el cuidado que se haya podido tener durante el trasporte y almacenamiento
de la leche. Sin embargo una leche que se encuentre e temperatura ptima
de refrigeracin (4-5 C) no confirma que sea de buena calidad, ya que es
posible que durante las fases que estn desde el sitio de produccin hasta la
industria la misma haya sufrido fluctuaciones de temperaturas que hayan
permitido la multiplicacin microbiana.
3. Lactofermentacin: esta prueba permite observar las caractersticas del
coagulo obtenido de la fermentacin de una muestra de leche incubada a
temperatura ambiente (35-37 C) por 24 horas. Segn las caractersticas
observadas se puede presumir acerca del tipo de bacterias predominantes,
ya que un coagulo homogneo sin o con pequeas burbujas de gas, indicara
predominio de bacterias lcticas homofermentativas, por el contrario un
coagulo grumoso con abundante gas puede indicar la presencia de bacterias
coliformes.
4. Acidez Titulable y pH: ya se ha estudiado estas dos propiedades de la
leche en el tema de fsico qumico. Esta claro que la fermentacin microbiana
modifica estos valores, aumentando la acidez y reduciendo el pH. Sin
embargo hay que tener en cuenta que ciertos microorganismos proteolticos
pueden causar la coagulacin dulce de la leche, es decir, sin acidez o con
alcalinizacin de la leche.
5. Reduccin de Colorantes: estas pruebas se fundamentan en como por el
metabolismo microbiano hace variar el potencial de xido reduccin de la
leche. Para ello se utilizan como indicador el azul de metileno y la resazurina,
los cuales van variando su coloracin a medida que se van reduciendo.

Los mtodos directos se fundamentan en determinar la presencia y/o el nmero
de microorganismo en los alimentos. En el anlisis de la leche cruda se emplean los
siguientes:
1. Recuento Microscpico Directo: el recuento microscpico directo es una
tcnica que tiene poco uso en el anlisis de la leche cruda. En el se analiza
un frotis de una muestra diluida la cual se colorea con un colorante especial
(Newman Lambert), y se hace recuento de las celulas bacterianas
observadas en varios campos. El promedio del conteo se multiplica con el
factor del microscopio (valor relacionado al rea del frotis, el dimetro del
objetivo y la dilucin de la muestra) para obtener el nmero de bacterias por
mililitro de muestra. Se debe tener en cuenta que el conteo intervienen las
clulas vivas y las muertas.
2. Recuento Estndar en Placa (REP): tambin conocido como recuento de
aerobios mesfilos, es el anlisis directo mayormente empleado para
determinar la calidad microbiolgica de la leche y otros alimentos. El mtodo
consiste en hacer diluciones de la muestra y sembrar en placas de petri con
agar estndar; luego de 24 a 48 horas de incubacin a 37 2se cuentan las
colonias observadas las cuales permiten obtener el nmero de unidades
formadoras de colonias por mililitro o gramo de muestra (ufc/mL o ufc/g). Los
resultados obtenidos siempre son inferiores a los reportados con el recuento
directo, ya que aqu solo intervienen microorganismos vivos capaces de
formar colonias, adems una colonia puede estar originada por uno o ms de
una unidad formadora de colonias.
3. Recuento de Bacterias Termodricas, Termfilas, Psicrfilas: cuando
se desea determinar los tipos microbianos presentes en la leche se utilizan
anlisis especficos. Usando el mtodo del REP pero variando la temperatura
de incubacin se pueden seleccionar los diferentes grupos de bacterias
segn su temperatura optima de crecimiento.
4. Coliformes Totales, Coliformes Fecales, Nmero ms Probable (NMP):
en los apartes anteriores ya se discuti la importancia del estudio de las
bacterias del grupo coliforme. Su determinacin puede hacerse en placas con
agar rojo bilis cristal violeta (coliformes totales) o en tubos con caldo verde
brillante (NMP), donde adems se puede observar la acumulacin de gas.
5. Pruebas Especficas (Determinacin de Salmonelas, Staphylococcus):
ciertas especies bacterianas tienen especial inters en alimentos,
especialmente por su poder patgeno. En leche en polvo se exige la
determinacin de Salmoneras y en productos lcteos es conveniente hacer
determinaciones de estafilococos especficamente Staphylococcus aureus.

Adems de los anlisis mencionados anteriormente existen otros especiales que
se relacionan con la calidad sanitaria. As tenemos la determinacin de mastitis y la
medicin de la eficiencia de la pasteurizacin.
1. Mastitis y Antibiticos: la determinacin de mastitis a y travs de la leche
pueden indicar la calidad microbiologa, ya que una leche masttica por lo
general es abundante en bacterias, especialmente del tipo del agente etiolgico
causante de la enfermedad. As mismo la determinacin de antibiticos, aunque
no necesariamente puede deberse a causas de infecciones a nivel mamario,
sugiere el descuido en la segregacin de los animales para el ordeo, ya que la
leche de animales enfermos no deben ser dirigida a la produccin de alimentos.
2. Eficiencia de la Pasteurizacin: los mtodos que evalan la eficiencia de la
pasteurizacin, evalan indirectamente la calidad sanitaria, ya que, una leche
mal pasteurizada por no haber alcanzado la temperatura mnima requerida,
tendr el riesgo de microorganismos patgenos que pudiesen afectar al
consumidor. Dentro de estas se cuneta la Tcnica de Sharer, basada en la
actividad de la enzima fosfatasa alcalina.
6. DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES EN LA LECHE Y
SUS PRODUCTOS
6.1. Pruebas Presuntivas
Las pruebas de fermentacin presuntivas, para establecer la presencia de
coliformes en la leche y derivados, pueden efectuarse siguiendo dos procedimientos:
a. Utilizando un medio liquido selectivo en tubos de fermentacin (tipo
Durham) como el caldo lactosado-bilis-verde brillante (CLBVB) o el caldo
lactosado-peptona-recinoleato-formato. Estos medios se recomiendan
cuando se desea analizar volmenes relativamente grandes de leche (5 a
100 mL). En el CLBVB, el colorante (verde brillante) y la bilis actan como
inhibidores del crecimiento de las bacteria Gram positivas, pero permiten el
desarrollo de las Gram negativas; la lactosa sirve como sustrato a las
bacterias coliformes que la fermentan en 48 horas a 32 o 35C, formando
cido y gas el cual es recolectado en los tubos de fermentacin, demostrando
el crecimiento de las bacterias coliformes. Cuando se emplean 5 tubos del
medio liquido para cada una de 3 diluciones diferentes de leche (10, 1 y 0,1
mL) es posible obtener valiosa informacin, que con la ayuda de tablas
especiales permite hacer un calculo aproximado del numero de bacterias
posiblemente presentes en la muestra, resultado que se expresa en trminos
del "Nmero Mas Probable" de coliformes por unidad de volumen (Ej.:
NMP/100 mL). En forma similar puede emplearse el caldo lactosado peptona-
ricinoleato-formato, en el cual el ricinoleato sdico acta como inhibidor de
las bacterias Gram positivas, pero no de las Gram negativas, en tal forma
que los coliformes crecen formando gas a partir de la lactosa, reaccin que
es acelerada por el formato de sodio.
b. Utilizando un medio selectivo slido en placas como el agar-lactosa-
desoxicolato-formiato o agar bilis-rojo neutro-cristal violeta. Los medios
slidos se emplean generalmente para el control sanitario de leches
pasteurizadas, con el objeto de establecer si cumplen las normas sanitarias
(mximo conteo de bacterias/mL). Tienen la ventaja de que permiten obtener
resultados cuantitativos en una sola placa. Sin embargo, no se emplean
cuando se necesita utilizar volmenes grandes de muestra. Los coliformes
crecen fcilmente en el agar lactosa-desoxicolato-formiato, ayudados por la
presencia de lactosa que fermentan produciendo cido que hace cambiar el
pH y virar el indicador (rojo neutro) de amarillo a rojo; el desoxicolato inhibe el
crecimiento de los grmenes Gram positivos. El periodo de incubacin de las
placas con este medio, no deber ser mayor a las 24 horaspreferiblemente 20
horas, ya que otros microorganismos pueden crecer ocasionando confusin.
Por ello solo se cuentan aquellas colonias rojas de dimetro mayor a los 0,5
mm, rodeadas de un alo de desoxicolato de sodio precipitado. Adems las
placas se deben preparar con una capa fina superficial de medio,
superpuesta, para obtener las colonias de coliformes ligeramente por debajo
de la superficie y evitar sean confundidas con colonias superficiales. De
manera similar se usa el agar bilis-rojo neutro-cristal violeta, donde la bilis y
el colorante inhiben el desarrollo de los microorganismos Gram positivos,
mientras que el rojo neutro acta como indicador. Las bacterias coliformes
crecen en este medio en 24 horas, formando colonias de color rojo prpura
(por debajo de la capa superpuesta) de 1-2 mm de dimetro, rodeadas de
una zona rojiza de bilis precipitada.

6.1.1. Prueba Presuntiva en Medio Lquido. Determinacin del
"Nmero mas probable" de Coniformes.
Materiales, Equipos y Medios de Cultivo:
Tubos de fermentacin de Durhan con 10 mL de CLBVB (simple) o 20 mL
de CLBVB (doble); Pipetas estriles de 10 mL (o de 11 marcadas a 10 y 11
mL); Pipetas estriles de 1,1 mL; Blanco de dilucin 99 mL; Estufa de
incubacin; Equipo individual.
Caldo lactosado - bilis - verde brillante 2 %.


Simple
( 10 mL/tubo)
Doble
(20 mL/ tubo)
Peptona 10 g 15 g
Lactosa 10 g 15 g
Bilis de buey desecada 20 g 30 g
( o bilis de buey fresca ) (200 g) (300 g)
Verde brillante 0,1 % 13,3 mL 20mL
Agua destilada c.s.p. 1 L 1 L
pH 7,2 0,1


Muestras:
Leche cruda y Leche recin pasteurizada
Procedimiento:
1. Siembra en tubos de fermentacin empleando cualquiera de los dos
medios lquidos indicados, proceder de la siguiente manera:
a. Con pipetas estriles, inocular 3 tubos conteniendo 20 mL de caldo doble
estril, con 10 mL de la muestra asignada homognea.
b. Con pipeta estril de 1,1 mL, inocular 3 tubos conteniendo 10 mL de caldo
simple, con porciones de 1 mL de la muestra homognea.
Simultneamente, inocular otros 3 tubos de caldo simple (10 mL) con
porciones de 0,1 mL de la muestra.
c. Si se requiere hacer mejores diluciones, preparar una 1:100 transfiriendo
1 mL de la muestra a un blanco de dilucin e inoculando porciones de 1 y
0,1 mL en dos series de 3 tubos de caldo simple, con lo cual se obtienen
diluciones de 1:100 y 1:1000.
d. Incubar los tubos, debidamente rotulados, colocados en una gradilla
identificada con el nmero del equipo, en la incubadora a 32 o 35C, por
48 horas.
e. Pasado el tiempo de incubacin, observar las tres series de 3 tubos, para
establecer la formacin de gas, lo cual se interpreta como desarrollo
positivo de coliformes (presuntivo).

2. Calculo del Nmero Ms Probable (NMP) de coliformes:
a. Determinar el nmero de tubos positivos (con gas) de cada serie de 3
tubos. Registrar los resultados en la forma que se ejemplariza a
continuacin: suponiendo que en los tubos de 10 mL de muestra
resultaron 3 de 3 positivos, en los de 1 mL: 1 de 3 y en los 0,1 mL: 0 de 3:

10 mL 1 Ml 0,1 mL
3/3 1/3 0/3

b. Con ayuda de la tabla para coliformes se establece el NMP de coliformes
por 100 mL.
c. De la misma forma debe procederse cuando se trabaja con series de 5
tubos, pero utilizando en ese caso las tablas especificas para esa
situacin.
d. Utilizar los tubos de fermentacin positivos para la prueba en medio
slido.

Observaciones: El mtodo anterior se aplica en forma similar al agua y derivados
lcteos, hacindose las diluciones necesarias. En general, cada producto lcteo se
trata en forma igual a la sealada para el recuento estndar en placas y luego se
procede como en la leche.

6.1.2. Prueba presuntiva en medio slido
Materiales y Equipos:
Pipetas estriles de 1,1 mL; Placas de Petri estriles; Blancos de dilucin
99 mL; Estufa de incubacin; Equipo individual.
Agar bilis-rojo neutro-cristal violeta.
Muestras:
Las mismas empleadas en la parte anterior.
Procedimiento:
1. Con pipeta de 1,1 mL, transferir porciones de 1 y 0,1 mL de la muestra
homognea a placas de Petri estriles, debidamente rotuladas (diluciones 1 y
10
-1
).
2. Cuando se requieren mayores diluciones (10
-2
, 10
-3
) preparar una dilucin
1:100 (10
-2
) transfiriendo 1 mL de la muestra a un blanco de dilucin (99 mL).
Mezclar bien y sembrar volmenes de 1 y 0,1 mL en placas rotuladas. En
general el procedimiento es similar al del recuento estndar en placa.
3. Verter 10-12 mL del medio slido fundido (45

1C) y mezclar.
4. Despus que el medio se haya solidificado, agregar a cada placa un
pequeo volumen adicional (3-4 mL) del medio fundido para obtener una fina
capa superpuesta.
5. Incubar las placas a 32 o 35 C por 18 - 24 horas.
6. Terminado el periodo de incubacin, contar las colonias rojas tpicas que
presenten un dimetro de 0,5 mm o mayor; multiplicar el recuento por la
dilucin correspondiente y expresar el resultado en trminos de "ufc de
coliformes por 100 mL".
7. Utilizar las placas con colonias tpicas rojas para la prueba confirmativa en
medio lquido.

6.2. Pruebas Confirmativas
Cuando se requiere confirmar la evidencia obtenida en una prueba presuntiva
sobre la posible presencia de bacterias coliformes, se acostumbra continuar el anlisis
con una prueba confirmativa. Esta puede efectuarse por dos procedimientos:
a. Utilizando un medio selectivo slido para repicar o "transplantar" los
microorganismo (presuntamente coliformes) cuando la prueba presuntiva
previa se ha hecho en medio liquido. Con tal fin se utiliza comnmente el
Agar de Levine, en el cual las bacterias coliformes se confirman por las
caractersticas de sus colonias. En este medio, las colonias de Escherichia
coli se presentan planas o ligeramente cncavas, de color oscuro con el
centro negro, brillo metlico verdoso (a la luz refleja) con tendencias a unirse
y con un tamao de 2 - 3 mm. En cambio, las colonias de Enterobacter
aerogenes se observan mas levantadas, marcadamente convexas, de color
menos oscuro que la especie anterior, con el centro marrn, sin el brillo
metlico que caracteriza a las de Escherichia, y con un tamao mayor,
generalmente de 4 - 6 mm. El medio en si es de color prpura. Para este fin
tambin puede emplearse el agar Endo. Ambos medios se incuban a 32 o 35
C por 18 - 24 horas, seleccionndose las colonias tpicas para la prueba
completa, cuando esta se requiere.
b. Empleando un medio selectivo liquido para repicar los microorganismos
cultivados en la prueba presuntiva precedente en medio slido. Con este fin
se emplean comnmente el mismo caldo lactosado-bilis-verde brillante al 2%
(CLBVB). El desarrollo de gas en este medio, confirma la presencia de
coliformes, si ocurre en 48 horas a 32 o 35 C.

6.2.1. Prueba Confirmativa en Medio Slido (a partir de medio
liquido)
Materiales, Equipos y Medios de Cultivos:
Placas preparadas con agar Levine esterilizado; Estufa de incubacin;
Equipo individual
Agar de Levine ( agar - eosina - azul de metileno ):
Muestras:
Tubos de fermentacin positivos (con gas) obtenidos en la prueba
presuntiva de coliformes.
Procedimiento:
1. Sobre placas estriles con agar de Levine, sembrar por estra lquido de
tubos de fermentacin positivos obtenidos en la prueba presuntiva.
2. Incubar a 32 o 35C durante 18 - 24 horas.
3. Observar las colonias tpicas.
4. Utilizar las placas que presentan colonias tpicas para la prueba completa.

6.2.2. Prueba Confirmativa en Medio Lquido (a partir de medio
slido)
Materiales, Equipos y Medios de Cultivo:
Tubos de fermentacin de Durham con CLBVB simple estril; Equipo
individual.
Muestras:
Placas de medio slido con colonias tpicas, obtenidas en la prueba
presuntiva en medio slido.
Procedimiento:
1. Seleccionar varias colonias tpicas de la placa de medio slido. Si el medio
empleado fue agar lactosado-rojo neutro-cristal violeta, escoger colonias
tpicas que se hayan desarrollado por debajo de la superficie, de color rojo
intenso.
2. Con la aguja de Kolle estril, transferir material de las colonias
seleccionadas a tubos de fermentacin con CLBVB.
3. Incubar a 32 o 35C por 48 horas. Si al cabo de ese periodo ningn tubo
presenta gas, la prueba confirmativa puede considerarse negativa. Si por el
contrario hay formacin de gas, la prueba se toma como positiva.
4. Emplear los tubos positivos para la prueba completa.

6.3. Pruebas Completas
Cuando se quiere comprobar definitivamente la presencia de los coliformes
confirmados mediante las pruebas anteriores, el anlisis puede continuarse con las
llamadas pruebas completas. Estas prueban son necesarias cuando an existe cierta
duda sobre la identidad de las colonias aisladas, especialmente en placas con
profusin de colonias; o cuando adems de lactosa, existe en el cultivo otra sustancia
que pudiera fermentar, como ocurre cuando se siembra helados en tubos de caldo
lactosado. Los procedimientos que se emplean pueden ser dos:
a. Si la prueba confirmativa se ha logrado en medio slido y en este ultimo se
han aislado bien colonias tpicas de coliformes, esto es, colonias planas o
cncavas, rodeadas de un rea con brillo metlico, se seleccionan y se
repican en tubos de fermentacin con caldo lactosado (CLBVB) que se
incuban a 32 o 35C durante 48 horas y en tubos de agar nutritivo inclinado
que se incuban a 32 o 35C durante 24 horas. La prueba completa se
considera positiva si se observa formacin de gas en los tubos de
fermentacin y si al microscopio del frotis de ambos cultivos, demuestra el
desarrollo de bacteria en forma de bastoncitos, Gram negativas, no
esporuladas.
b. Si la prueba confirmativa previa se ha hecho repicando de medio slido a
liquido y se ha obtenido formacin de gas (generalmente en 18-24 horas) la
prueba completa se obtiene "repicando" de nuevo en medio slido (agar
Levine) que se incuba a 32 o 35C por 18-24 horas. Seguidamente se hacen
"repiques" de colonias tpicas seleccionadas como se ha indicado en (a), es
decir, haciendo cultivos sucesivos en tubos de fermentacin con caldo
lactosado, en tubos de agar nutritivo inclinado y examen microscpico de los
cultivos teidos al Gram.

6.3.1. Prueba Completa (a partir de medio slido )
Materiales, Equipos y Medios de Cultivos:
Tubos de fermentacin de Durhan con CLBVB (simple) estriles; Tubos de
agar nutritivo inclinado estriles; Estufa de incubacin; Equipo individual.
Muestras:
Placas de medio slido con colonias tpicas, obtenidas en la prueba
confirmativa.
Procedimiento:
1. Seleccionar colonias tpicas de coliformes de las placas de medio slido
obtenidas en las pruebas confirmativas y repicar (a partir de cada placa) en
un tubo de fermentacin con CLBVB y otro con agar nutritivo inclinado.
2. Incubar el primer tubo (CLBVB) a 35C por 48 horas y el segundo (agar
nutritivo inclinado) a la misma temperatura, por 24 horas.
3. Al observar indicios de crecimiento bacteriano hacer frotis, colorear con
Gram y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
4. Interpretar las observaciones, as como todos los resultados obtenidos a
travs de las diferentes pruebas de fermentacin.

6.3.2. Prueba Completa (a partir de medio liquido)
Materiales, Equipos y Medios de Cultivo:
Tubos de fermentacin tipo Durham con CLBVB (simple) estriles; Tubo de
agar inclinado esterilizado; Placas de Petri preparadas con agar Levine;
Estufa de incubacin; Equipo individual.
Muestras:
Tubos de fermentacin con CLBVB positivos, obtenidos en la prueba
confirmativa en medio liquido (con gas).
Procedimiento:
1. A partir de tubos de fermentacin positivos, sembrar placas preparadas
con agar Levine. Hacer las siembras por estra, con capa superpuesta.
Encubar a 35C por 18-24 horas.
2. En caso de obtener colonias tpicas de coliformes, repetir la prueba
completa a partir de medio slido. Interpretar todos los resultados obtenidos
en las diferentes pruebas de fermentacin

7. PRUEBAS DE DIFERENCIACIN DE BACTERIAS COLIFORMES

Una vez confirmada la presencia de bacterias coliformes, mediante pruebas de
fermentacin presuntivas, confirmativas y completas, utilizando medios selectivos
lquidos y slidos; y aisladas las bacterias en cultivos puros, el anlisis puede
continuarse con pruebas de diferenciacin, para establecer la identidad de la especie
bacteriana. Entre esas pruebas, son recomendables las del IMViC y de McKenzie, cuyo
estudio constituye el objetivo principal de esta prctica. Debe recordarse adems que la
identificacin de las especies de Coliformes puede tambin efectuarse por las
caractersticas de desarrollo en medios selectivos ya sea en placas o en tubos de
cultivo, siendo los ms comunes los medios de Levine, Endo, McConkey (en placas) y
el medio de Costa y Vernin (en tubos). En este trabajo nos avocaremos exclusivamente
a las pruebas bioqumicas del IMViC.

7.1. Pruebas Bioqumicas IMViC
Las principales especies y variedades de bacterias coliformes pueden
diferenciarse mediante cuatro pruebas bioqumicas comnmente agrupadas bajo la
denominacin de IMViC, las cuales son: Indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer y
asimilacin del citrato. La tabla I, presenta los resultados que dan las especies ms
importantes de bacterias coliformes cuando se someten a estas pruebas, cuyos
fundamentos especficos se explican a continuacin.



7.1.1. Prueba del Indol:
Esta prueba, ideada por Kovacs, consiste en sembrar el organismo que se
estudia en caldo triptona e incubar a 35C por 24 horas. En este medio ciertos
microorganismos forman Indol por descomposicin del aminocido triptofano (indol-
alanina) presente en la triptona. Despus del periodo de incubacin, la presencia del
Indol se reconoce con el reactivo de Kovacs, integrado por p-dimetil-amino-
benzaldehido, alcohol amlico y HCl concentrado, con el cual forma un estrato
superficial de color rojo en el tubo de reaccin. La cepa ms comn de Escherichia coli
(variedad I) da esta reaccin positiva, mientras que la cepa ms comn de
Enterobacter aerogenes (variedad I) la da negativa.

7.1.2. Prueba del Rojo de Metilo y Voges-Proskauer
Estas pruebas pueden desarrollarse simultneamente utilizando el medio M.R.-
V.P. (caldo glucosado-sal-peptona) en el cual se siembra el organismo en estudio y se
incuba a 35C. Despus de un periodo de incubacin de 24 -48 horas, parte del medio
se utiliza para la reaccin de Voges-Proskauer, que consiste en establecer la formacin
de acetil-metil-carbinol o acetona, producida por ciertos microorganismos a partir de la
glucosa, con el reactivo de Barrit, constituido por alfa-naftol y KOH. Escherichia coli da
esta reaccin negativa, mientras que el Enterobacter aerogenes la da positiva.
El resto del medio M.R.-V.P. no utilizado en la reaccin anterior, se continua
incubando hasta completar 5 das (a 35C) para ser luego sometido a la prueba del rojo
de metilo, la cual consiste en la adicin de gotas del indicador para observar la reaccin
del medio. Escherichia coli fermenta la glucosa produciendo una cantidad de cido tal
que, lleva el pH del medio por debajo del punto de viraje del indicador (amarillo a rojo,
pH 5,1); por consiguiente, cuando el microorganismo en estudio corresponde a esta
especie, el medio toma un color rojo. Por el contrario, el Enterobacter aerogenes,
aunque tambin fermenta la glucosa con formacin de cido, solo baja el pH hasta un
valor de aproximadamente 6,0 en 5 das, todava por encima de la zona de viraje del
indicador y por ello al adicionarlo al cultivo de este microorganismo, se obtiene un color
amarillo que se interpreta como una reaccin negativa, un color intermedio entre el rojo
y el amarillo se debe interpretar como dudoso e indicativo de purificacin incompleta
del cultivo.

7.1.3. Prueba de Asimilacin del citrato
Esta prueba se efecta sembrando en agar-citrato de Simmons a 35C por 48
horas. En medio contiene sales minerales y citrato de sodio como nica fuente de
carbono y azul de bronotimol como indicador. Por su mismo funcionamiento, este
medio debe sembrarse con una cantidad mnima, nunca con pipeta, para evitar la
introduccin de material nutritivo en la transferencia, que afectara los resultados por
incorporacin de otras fuentes de carbono. Escherichia coli no crece en este medio,
mientras que el Enterobacter aerogenes por tener la capacidad de utilizar el citrato de
sodio como fuente de carbono, se desarrolla, produciendo carbonato que alcaniliza el
medio, hacindolo virar del color verde al azul. Este viraje se interpreta como una
reaccin positiva, lo mismo que la presencia de crecimiento microbiano.

Tabla I. Diferenciacin de coliformes por el IMVIC
Microorganismo INDOL Rojo de Metilo Voges-Proskauer
Citrato
Escherichia coli
Variedad I + + - -
Variedad II - + - -
Enterobacter aerogenes
Variedad I - - +
+
Variedad II +/- - +
+


Materiales, Equipos, Medios de Cultivos y Reactivos:
Tubos bacteriolgicos estriles conteniendo los siguientes medios: Caldo
triptona (I); RM-VP (M-P) y Agar citrato de Simmons (c)
Estufa de incubacin (35
-
+
0,1C)
Reactivos de Kovacs (INDOL); Reactivo de Barrit (Voges-Proskauer);
Solucin indicadora de rojo de metilo.
Caldo Triptona en tubos (10 mL c/u); Medio R.M.-V.P. en tubos (10 mL c/u);
Agar citrato de Simmons en tubos (10 mL c/u)

Muestras:
Tubos con crecimiento positivo en CLBVB o agar nutritivo inclinado,
obtenido en la prueba de fermentacin completa
Placas de medios de cultivo selectivo slidos con cultivos puros, aislados
anteriormente.

Procedimientos:
1. Prueba del Indol
a. Inocular tubos estriles, conteniendo caldo-triptona, con el cultivo
puro aislado en los medios selectivos, e incubar a 35C por 24 horas.
b. Cumplido el tiempo de incubacin, adicionar 0,2-0,3 mL (2 a 3
gotas) de reactivo de Kovacs y agitar. Dejar en reposo por 10 minutos,
observar e interpretar los resultados.

2. Prueba de Voges-Proskauer:
a. Inocular tubos estriles, conteniendo medio R.M-V.P con el cultivo
puro e inocular a 35C.
b. Despus de 48 horas de incubacin, transferir aspticamente 1 mL
del cultivo a otro tubo y adicionar 0,6 mL o de la solucin A ( Alfa-
naftol) ms 0,2 mL de la solucin B (KOH) que integran el reactivo de
Barrit.
c. Dejar en reposo por no ms de 2-4 horas, observar e interpretar los
resultados.

3. Prueba del Rojo de Metilo
a. Incubar el tubo con medio R.M-V.P. inoculado en la prueba anterior
(Voges-Proskauer) y mantenerlo a 35C hasta completar 5 das.
b. A 5 mL de cultivo, adicionar 5 gotas de la solucin indicadora de rojo
de metilo.
c. Observar e interpretar los resultados.
d. Las pruebas 2 y 3 pueden tambin efectuarse separadamente con
diferentes tubos.

4. Prueba de Asimilacin del Citrato.
a. Incubar tubos estriles de agar citrato de Simmons con el cultivo
puro. Esta siembra debe hacerse haciendo un trazo con la aguja de
Kolle poco cargada, evitando transferir medio de cultivo.
b. Incubar a 35C durante 72-96 horas y luego observar si ha habido
desarrollo del cultivo o cambio del color verde al azul. Interpretar los
resultados obtenidos.

8. EFICIENCIA DE LA PASTEURIZACIN. PRUEBA DE LA
FOSFATASA ALCALINA
En la leche cruda se ha demostrado la presencia de tres tipos diferentes de
fosfatasas (monoestearasas, diestearasas y pirofosfatasas), entre ellas una -
monoestearasa cida y una alcalina, en la determinacin de la actividad de esta ltima
se basa la prueba de eficiencia de la pasteurizacin.
La fosfatasa alcalina se encuentra en la leche asociada al material fosfolipdico
presente el la pseudo membrana de los glbulos grasos, tiene un pH optimo de
actividad de 9,75; se destruye progresivamente por el ca1or y a una temperatura de
62,8C por 30 minutos su destruccin es total, resultando este temperatura ligeramente
superior a la requerida para inactivar a cualquiera de los microorganismos patgenos
presentes en la leche, entre ellos Mycobacterium tuberculosis y la Coxiella burneti, por
lo tanto, una leche bien pasteurizada no debe presentar una reaccin positiva a la
prueba de fosfatasa.
La determinacin de la actividad del enzima se basa en su capacidad de
hidrolizar los esteres fenil-fosfricos que se adicionan como sustrato a la muestra,
liberando fenol, el cual puede ser detectado con reactivos especiales como la
dicloro-quinona-clorimida (CQC), con la cual forma un complejo de indofenol azul,
siendo esta coloracin la clave para evidenciar la actividad enzimtica.
La valoracin cuantitativa de la cantidad de fenol liberada, la cual depende de la
concentracin de fosfatasa en leche, se puede hacer por comparacin visual o
fotoelctrica con el color obtenido en testigos de fenol de concentraciones conocidas
tratados en idnticas condiciones. La presencia de incluso un 0,1% de la fosfatasa
originalmente en la leche cruda puede ser detectada, resultando las prueba positiva.
Las pruebas de fosfatasa fundamentadas en este principio deben realizarse bajo
condiciones estrictamente controladas para evitar errores en los resultados, estas
condiciones incluyen la toma de una muestra representativa del producto a ser
analizado, nunca menor de 10 mL y su adecuada conservacin hasta el momento del
anlisis, mediante refrigeracin (sin llegar a la congelacin) o utilizando un preservativo
como el cloroformo al 1-3%. Es esencial realizar la prueba en una atmsfera libre de
sustancias fenlicas, las cuales interfieren con la determinacin, como se deduce al
observar las reacciones qumicas involucradas, para lograr esto es muy importante
utilizar material de vidrio escrupulosamente limpio y libre de residuos de detergentes
que pueden contener fenol, emplear reactivos qumicamente puros y en general bajo
condiciones que garanticen la ausencia de contaminacin con sustancias fenlicas.
Es importante destacar que algunas que muestras recin pasteurizadas dan
negativa a la prueba de fosfatasa, pueden dar una reaccin positiva al cabo de un
cierto tiempo. Este fenmeno se ha observado especialmente cuando la pasteurizacin
se ha leche a temperaturas ultraelevadas, en leches muy ricas en materia grasa,
cuando no se refrigeran adecuadamente o de manera continua. El fenmeno se
atribuyo inicialmente a la produccin de enzimas por parte de los microorganismos,
pero posteriormente se observ incluso en leches estriles. Por ello se ha llegado a
concluir que se trata de una reactivacin de la fosfatasa de la leche, lo cual no
significaba una mala pasteurizacin. Ente esto se ha ideado un procedimiento para
diferenciar la fosfatasa reactivada de aquella que resulta de una mala pasteurizacin
(fosfatasa residual), la cual se basa en la propiedad de la primera de aumentar su
actividad aproximadamente diez veces, cuando se almacena en presencia de cloruro
de magnesio (MgC1
2
) a una concentracin de 1,5%; cosa que no ocurre con la
fosfatasa residual.
8.1. Mtodo de Scharer para Fosfatasa (COVENIN 363)
El sustrato empleado para realizar esta prueba es el fnil-fosfato-disdico en
solucin amortiguada de carbonato-bicarbonato sdicos a pH 9,6, que se incuba
durante 15 minutos a 40C. El reactivo de coloracin es el 2,6 dicloro-quinona-
cloroimida, preparado en metanol o etanol absoluto. La reaccin se cataliza utilizando
sulfato de cobre (CuSO
4
), y el indofenol azul formado se extrae con alcohol n-butlico
neutralizado.
El extracto indofenlico se compara con soluciones patrones, de
concentraciones de fenol conocidas y que son tratadas en idnticas condiciones a la
lo que equivale a 1 unidad Sharer (US).
La norma COVENIN 198-94, establece para leche pasteurizad un mximo de 1
mayor puede significar que la muestra no ha sido
bien pasteurizada o contaminada con leche cruda, o que la fosfatasa ha sufrido una
reactivacin.
Este mtodo puede aplicarse a otros productos lcteos, que en caso de ser
slidos, deben primero ser llevados a estado lquido y neutralizar su acidez hasta pH
6,6 con carbonato de sodio (Na
2
C0
3
) o solucin amortiguadora (buffer). Sin embargo,
en algunos casos pueden presentarse algunas interferencias por la presencia de
ingredientes que contienen sustancias fenlicas, como la vainillina y otros compuestos
sintticos (en helados, leches saborizadas, etc.); razn por lo cual se requieren de
controles adecuados.