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Universidad Rafael Landvar

Microbiologa y Parasitologa
Lab Seccin 01
Licda. Xiomara de Barreda
Anlisis de Mtodos de Tincin Ziehl Neelsen y Wirtz Conkiln utilizando
E.Coli y B.Cereus

INTRODUCCIN
La tcnica de tincin Ziehl Neelsen, es utilizada para identificar a las bacterias del
gnero Mycobacterium; las cuales tienen forma de bacilos con abundantes lpidos
en su pared celular que se tien con dificultad. Lo que hace de gran relevancia a
estas bacterias, es su poder patgeno tanto para el hombre como para los
animales. Otra de las caractersticas fundamentales de este tipo de bacterias es
su poder cido-alcohol resistente, ya que no se decoloran con ste. En este
mtodo de tincin se utilizan dos colorantes; el primero es el carbolfuscina, que al
ser calentado junto con la muestra, penetra en las clulas bacterianas alcohol-
cido resistentes; el segundo colorante a utilizar es el azul de metileno, que tie
todas aqueas clulas que no posean
abundantes lpidos en su pared celular. Con
esta coloracin, las bacterias del gnero
Mycobacterium se tien de rojo, mientras que
otros grmenes y clulas toman tonos de azul
al ser observados por el microscopio. La
metodologa para este tipo de tincin es la
siguiente. (BritaniaLab, 2014)
(Scilogs,2013)
Utilizando el mtodo de extensin, en un porta objetos seco y limpio, se
coloca una gota de suspensin de la bacteria a analizar y se coloca una
gota de solucin salina. (BritaniaLab, 2014)
Se mezcla la suspensin de bacteria con la solucin salina y se deja secar
al aire. (BritaniaLab, 2014)
Se fija la muestra pasando cuidadosamente el portaobjetos de 2 a 3 veces
por encima del mechero y se deja enfriar. (BritaniaLab, 2014)
Se realiza la primera coloracin con carbolfuscina y se hace una torunda de
algodn empapada en alcohol. Se toma la torunda con una pinza, se
enciende y se pasa por debajo del portaobjetos para que ste se caliente
hasta que empiece a emitir vapores blancos. Se debe vigilar que el
Jhoseline Martnez 1255413
Mercedes Villatoro 1167413
Ma. Jos Gonzlez 1003813
colorante no hierva ni se evapore, sino agregar poco a poco ms colorante.
Realizar este procedimiento durante 15 minutos. (BritaniaLab, 2014)
Se deja enfriar la lmina y se lava con agua y se sacude. (BritaniaLab,
2014)
Se agrega el alcohol-cido, en cantidad suficiente para cubrir la muestra.
Se deja actuar por 2 minutos y se enjuaga; en caso que no se haya
decolorado por completo, se agrega otra gota de alcohol-cido y se deja
actuar por un minuto ms y se lava nuevamente. (BritaniaLab, 2014)
Se cubre la preparacin con azul de metileno y se deja actuar por un
minuto.
Se lava el portaobjetos con agua y se deja secar. Posteriormente se
observan los resultados por el microscopio. (BritaniaLab, 2014)
Escherichia coli es una proteobacteria de clase gammaproteobacteria, pertenece a
la familia de la enterobacteriaceae. (Ann, 2012)

El mtodo de tincin Wirtz-Conklin, es un mtodo de tincin diferencial utilizado
para identificar bacterias esporoformadoras; en donde las estructuras celulares se
diferencian en funcin de los diferentes colorantes que se fijan de acuerdo con su
constitucin qumica. Las esporas son estructuras que se producen cuando las
condiciones ambientales son desfavorables. Entre los gneros esporoformadores
destacan Clostridium y Bacillus, los cuales son patgenos. Este mtodo tambin
es til para distinguir las morfologas y disposiciones que adoptan las endosporas,
ya que stas pueden localizarse ya sea en
localizacin terminal; elipsoidal, que es en el
centro y que provoca un abombamiento
caracterstico; y por ltimo en forma de espora
cilndrica subterminal la cual es no deformante.
En ste mtodo se utilizan dos colorantes; el
verde malaquita que tie las esporas en
presencia de calor; y la safranina que tie las
clulas vegetativas. (Julianes, 2013)
(Scilogs,2013)
La metodologa para teir este tipo de bacterias es la siguiente:
Se prepara el frote bacteriano, se seca y se fija al calor. Se deja enfriar.
Se cubre el frote con Verde Malaquita y se calienta utilizando una torunda
de algodn empapada en alcohol, y se deja humear por 5 minutos evitando
la ebullicin y evaporacin del colorante agregando cada vez que sea
necesario. (Julianes, 2013)
Al enfriarse la muestra, se lava con abundante agua. (Julianes, 2013)
Se tie durante 1 minuto la muestra con Safranina. Se lava y se seca la
preparacin. (Julianes, 2013)
Se observan los resultados con el objetivo de inmersin. (Julianes, 2013)
Bacillus cereus es un microorganismo gram positivo, con forma de bastn
alargado, es aerobio facultativo, formador de esporas, y una bacteria mvil por la
presencia de flagelos pertricos. (Ann, 2012)
MATERIALES Y MTODOS
RESULTADOS
La muestra de E. coli al observarlo en el lente me inmersin denoto poseer un
fondo transparente y en este se vean pequeos puntos de color azul.
En la muestra de B. cereus los bacilos se observaban algunos en cadena y otros
en racimos, estos eran de color rosado y las esporas tenan un color verde pero
era muy plido, por lo que se deduce que en alguna parte del procedimiento de
tincin que no se realiz correctamente hizo que no se fijara bien el color.
DISCUSIN
La razn por la cual la muestra de E.Coli se observ toda de coloracin azul, fue
porque esta bacteria es perteneciente al gnero enterobacteriaceae y no al
gnero Mycobacterium, por lo que no posee una abundante pared lipdica a la cual
pueda adherirse el colorante de carbolfuscina.
Debido a que la bacteria B.Cereus pertenece al gnero Bacillus, el cual es
esporoformador; se pudieron observar las esporas de color verde, ya que el
colorante Verde Malaquita penetr dentro de las clulas vegetativas y ti las
esporas por la presencia del calor al colocar la muestra por encima de la torunda
de algodn en llamas. El color rosa observado alrededor de las esporas eran las
clulas vegetativas que se tieron solamente del colorante Safranina, debido a
que la muestra se encontraba a temperatura ambiente y la safranina ya no penetro
en las esporas.
CONCLUSIONES
La coloracin de Ziehl Neelsen, es uno de los mejores mtodos para identificar
microorganismos patgenos, adems de ser rpido y econmico. Y la tincin de
Wirtz Conklin nos ayuda a teir las esporas que puedan formar los gneros
esporoformadores, adems de observar la formologa y clasificacin de las
bacterias. A pesar de ser mtodos fciles y rpidos se debe tener precisin y
exactitud tanto en el tiempo y uso de colorantes, ya que se puede dar algn fallo.
Como se dio en el caso de la tincin de B. cereus el cual hubo un mal manejo y
conteo del tiempo y fijacin a lo largo del procedimiento por lo que el color de las
esporas no se fij correctamente. A pesar de que las bacterias no aparecen muy
diferentes del medio que las rodea, difieren mucho qumicamente esta diferencia
qumica es lo que permite distinguir las bacterias por tincin, pues generalmente,
el colorante reacciona con la clula bacteriana, pero no reacciona con su medio
exterior.

REFERENCIAS BIBLIGRFICAS
BritaniaLab.Tincin Ziehl Neelsen. [en lnea]. Publicado en el 2014. [ref. 25 de
septiembre del 2014]. Disponible en Web:
http://britanialab.com.ar/esp/productos/b14/neelsen.htm
Scilogs. Tuberculosis Mycobacterium. [en lnea]. [ref. 25 de septiembre del 2014].
Disponible en Web: http://www.scilogs.com/in_scientio_veritas/tb-rational-vaccine-
design/
Julianes, P. Mtodos de Tincin. [en lnea]. Publicado en el 2013. [ref. 26 sep.
14]. Disponible en Web:
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
Ann, A. et, al. Bad bug handbook. [En lnea]. 2012. Fecha de consulta: 22 de
agosto del 2014. Disponible en web:
[http://www.fda.gov/downloads/Food/FoodSafety/FoodborneIllness/FoodborneIllne
ssFoodbornePathogensNaturalToxins/BadBugBook/UCM297627.pdf]