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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

INSTITUTO DE CINCIAS BSICAS DA SADE
DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

Mdulo 3: Enzimas
Aula 1: Introduo s enzimas
As enzimas, importantes componentes do metabolismo de todos os seres vivos, tm a
capacidade de promover e acelerar reaes qumicas. Microrganismos ou substncias com
essa propriedade j eram usados por populaes humanas muito antigas para modificar
alimentos fermentar uvas e fabricar o vinho, ou alterar o leite e produzir queijo, por
exemplo. Depois que pesquisadores modernos compreenderam a ao das enzimas, estas
passaram a ser empregadas para as mais variadas finalidades. Hoje, essas protenas especiais
so teis inclusive na indstria, no apenas na rea de alimentos, mas em muitos outros
setores.
Essa maior compreenso possibilitou o emprego dessas protenas especiais em
processos industriais de diferentes reas: mdica, alimentcia, txtil e qumica, entre outras.
vantajoso usar enzimas na indstria, porque elas so naturais, no txicas e especficas
para determinadas aes. Alm disso, so capazes de alterar as caractersticas de variados
tipos de resduos, contribuindo para reduzir a poluio ambiental. O mercado brasileiro de
enzimas, embora pequeno diante do mundial, apresenta grande potencial, em funo da
enorme disponibilidade de resduos agroindustriais e do dinamismo dos setores industriais
citados acima.
Nas clulas, as enzimas esto envolvidas em todos os processos bioqumicos. Para
atuar corretamente, porm, precisam de condies especficas, pois so ativas apenas em
uma faixa estreita de acidez-alcalinidade (pH) e so sensveis a mudanas nesse fator e na
temperatura do meio. Os microrganismos so a principal fonte de enzimas de aplicao
industrial, mas diversas podem ser obtidas de animais (pancreatina, tripsina, quimotripsina,
pepsina, renina e outras) ou vegetais (papana, bromelina, ficina e outras). Hoje, porm,
como possvel modificar geneticamente os microrganismos para que forneam qualquer
enzima, a tendncia substituir as produzidas por vegetais e animais pelas de origem
microbiana.

O uso de enzimas em processos industriais de grande interesse, em especial devido
facilidade de obteno (por biotecnologia) e s vantagens em relao aos catalisadores
(aceleradores de reaes) qumicos, como maior especificidade, menor consumo energtico
e maior velocidade de reao. Alm disso, a catlise enzimtica tem outros benefcios, como
o aumento da qualidade dos produtos, em relao catlise qumica; a reduo dos custos de
laboratrio e de maquinrio, graas melhoria do processo; ou a fabricao controlada de
pequenas quantidades.
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Representao de William Beaumont.
Texto retirado do New York Times (por Abigail Zuger).
A descoberta das enzimas graas a um buraco em um estmago

Durante sua vida, o Dr. William Beaumont foi uma celebridade mdica de segunda linha. At hoje,
mais de 200 anos aps seu nascimento, seu nome esteve afundado na lama da histria mdica, sem sequer
uma doena ou sndrome homnima para mant-lo em evidncia (embora haja um sistema de sade em
Michigan batizado em homenagem a ele). A contribuio de Beaumont para a cincia mdica foi pequena,
mas nica e ainda mais notvel por conta das circunstncias em que se desenvolveu: em uma poca em que
o conhecimento cientfico considerado legtimo ainda chegava da Europa, ele trabalhou nas inspitas
regies do norte e do oeste americano.

Em 1822, Beaumont, aos 37 anos, trabalhava como cirurgio do exrcito na ilha de Mackinac, no
norte de Michigan, quando foi convocado com urgncia loja da Companhia Americana de Peles do local.
Um tiro acidental havia perfurado o abdome superior e o trax de um dos caadores da empresa.
Contrariando as expectativas, a vtima, um fracassado jovem franco-canadense chamado Alexis St. Martin,
no morreu. E apesar de Beaumont no ter qualquer tipo de educao formal como mdico _ como era
comum na poca, as suas credenciais para atuar como mdico vinham de um perodo como aprendiz,
seguido de servio militar _ a Guerra de 1812 o transformou em especialista no tratamento de feridas. Um
ano mais tarde, St. Martin estava fragilizado, mas mais ou menos bem, exceto por um detalhe: bem abaixo
de sua caixa torcica, esquerda, uma pequena abertura na pele levava diretamente a seu estmago.

Beaumont observou aquela fstula e vislumbrou sua prpria sorte. Ningum, quela altura, sabia
exatamente como o estmago digeria os alimentos: alguns argumentavam que era graas a contraes
musculares, outros que o alimento apodrecia, como aconteceria ao ar livre. Mas quando Beaumont amarrou
um barbante em torno de um pedao de carne, pendurou-a dentro do estmago de St. Martin e, mais tarde,
puxou os restos de volta, percebeu que substncias qumicas (que hoje chamamos de enzimas digestivas)
haviam dissolvido a comida. Ele colheu algumas amostras do fluido gstrico de St. Martin para mais
experimentos, planejando, em seguida, centenas de outros. O estmago seria o seu caminho para a glria
cientfica.

Mas o estmago tinha vontade prpria. St. Martin, inicialmente muito grato por Beaumont ter salvo
sua vida, foi se tornando, com o tempo, rude e desobediente, cansado da pesquisa do mdico. Ao longo das
dcadas seguintes, os dois oscilaram em uma demonstrao extraordinria de dependncia mtua,
hostilidade, lealdade, culpa, gratido e ganncia. Quem devia a quem - e quanto? Com quem ficava a
moralidade disso tudo? Com o mdico, que salvou a vida de St. Martin, o sustentou financeiramente por
anos e teve como objetivo beneficiar toda a humanidade com suas pesquisas? Ou com St. Martin,
alcolatra irremedivel, mas, ainda assim, um homem livre com direito de desistir, como tentou fazer
vrias vezes? Finalmente, no que talvez seja o nico documento desse tipo a estabelecer uma ligao entre
mdico e paciente antes dos formulrios de consentimento informado assinados pelos sujeitos de pesquisa
de hoje, foi elaborado um contrato legal entre eles. O paciente prometeu "servir, respeitar e continuar a
colaborar" com os experimentos, enquanto o mdico prometeu uma remunerao razovel. Funcionou, mas
por pouco tempo.
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Objetivo:
Identificar as propriedades gerais das enzimas em diferentes sistemas biolgicos e os
fatores que condicionam a atividade das enzimas.
Primeira parte da aula: Avaliar qualitativamente e discutir os fatores que afetam a
atividade da enzima catalase.
A catalase uma enzima presente em uma grande variedade de tipos celulares diferentes,
tais como bactrias, clulas vegetais e clulas animais. Esta enzima responsvel pela
degradao do perxido de hidrognio (gua oxigenada; H
2
O
2
) formado em diversos
processos metablicos normais ou processos patolgicos nas clulas. O perxido de
hidrognio um poderoso agente oxidante, que pode originar diversos tipos de radicais
livres que danificam protenas, lipdios e cidos nuclicos, ocasionando a inutilizao de
biomolculas e possvel mutao ou morte celular. A reao catalisada pela catalase a que
segue:

2 H
2
O
2
2 H
2
O + O
2


Na presente aula, utilizaremos amostras que consistem de homogenados de fgado,
um tecido que expressa quantidades significativas da enzima catalase.

Primeiro procedimento experimental:

a) Efeito do pH na atividade da catalase:
TUBO Amostra (mL) Tampo (mL) HCl 1M (mL) NaOH 1M
(mL)
Branco 0 2 - -
1 (pH 7.4) 0,5 1,5 - -
2 (pH cido) 0,5 1 0,5 -
3 (pH bsico) 0,5 1 - 0,5
-Incubar 5 minutos temperatura ambiente; em seguida, adicionar 0,5 mL de H
2
O
2
.
-Avaliar a formao de bolhas nos diferentes tubos.

b) Efeito da temperatura na atividade da catalase:

TUBO Amostra (mL) Tampo (mL)
4 (bancada; T=25 C) 0,5 1
5 (gelo; T = 0 C) 0,5 1
6 (banho-maria; T > 80
C)
0,5 1

-Incubar os tubos por 5 minutos; em seguida, adicionar 0,5 mL de H
2
O
2
.
-Avaliar a formao de bolhas nos diferentes tubos.
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Questes para o relatrio/portflio:
1) Explique por que possvel observar bolhas aps a adio de perxido de
hidrognio.
2) Por que a variao do pH e da temperatura nos tubos afeta a formao das bolhas
aps a adio do perxido?
3) O que seria necessrio para uma comparao quantitativa mais precisa da
atividade da catalase entre as diferentes condies testadas? Responda focando nos
princpios de quantificao j discutidos na disciplina.

Segunda parte da aula: avaliar a atividade da amilase salivar
A -amilase encontrada nos animais (sangue, saliva e suco pancretico), plantas,
fungos e bactrias. Esta enzima um endoamilase e hidrolisa as ligaes glicosdicas do
amido, glicognio, poli e oligossacardeos ao acaso. Como resultado da ao no ordenada
da amilase salivar, obtm-se rapidamente uma mistura complexa de produtos de hidrlise
que incluem: amido solvel, maltodextrinas, maltoses e eventualmente, glicose. Na cavidade
bucal, a amilase salivar tem participao na digesto de carboidratos.
O amido composto pela amilose (no-ramificada) e amilopectina (ramificada). A
amilose forma micelas hidratadas que adsorvem iodo, presente na soluo de lugol, em suas
espirais helicoidais, apresentando colorao azul-violeta.
Preparao das solues:
a) Preparao da soluo de saliva
- Um membro do grupo doa a sua saliva, coletando em um Becker;
- Diluir uma parte de saliva em mais nove partes de soluo salina (1:9), adicionando em
um tubo:
- 0,5 mL de saliva
- 4,5 mL de gua destilada
b) Preparao dos tubos para medir a atividade:
- Marcar 11 tubos, sendo um deles o branco (B) e numerar os restantes de 1 a 10.
- Adicionar a todos os 11 tubos:
- 2 mL de gua destilada
- 2 gotas de soluo lugol
c) Preparao da soluo de reao:
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- Misturar, em um Becker:
- 5 mL de soluo de amido 1%
- 2 mL de tampo fosfato (pH 6.8)
-2 mL de NaCl 0,9%.
Procedimento:
a) Retirar 2 gotas da soluo de reao e adicionar ao TUBO B (Branco)
b) Adicionar 0,5 mL de soluo de saliva soluo de reao no Beaker e
IMEDIATAMENTE:
* Retirar 2 gotas e adicionar ao TUBO 1
* Aps 1 minuto, retirar mais 2 gotas e adicionar ao TUBO 2
* Repetir sucessivamente, em intervalos de 1 minuto, a transferncia de 2
gotas para os tubos seguintes at o tubo que no se observe mais a colorao com o
iodo (ponto acromtico);
* Adicionar 5 mL de gua destilada a todos os tubos e agitar. Transferir 200
microlitros de cada amostra para respectivos poos em uma microplaca (96) e ler as
absorbncias no espectrofotmetro (620-660 nm), zerando o aparelho com o
contedo do TUBO B (Branco).
Questes para o relatrio/portflio:

1) O que faz o lugol? Por que ele utilizado nesta tcnica?
2) Qual a funo do tampo fosfato?
3) Explique as diferentes tonalidades de cores observadas aps a reao.
4) Traar duas curvas num mesmo grfico, colocando os tempos (minutos) na
abscissa e as absorbncias para os tubos contendo iodo na ordenada. Comparar a
curva de consumo de substrato (amido) entre os diferentes grupos.
5) Que fatores devem ser considerados para uma comparao efetiva da atividade de
uma enzima em diferentes condies?
6) Sugira um procedimento para comparar a atividade da amilase salivar entre dois
doadores diferentes doadores. Discuta quais condies necessrias e quais
procedimentos devem ser seguidos para uma comparao precisa.
7) Existe diferena entre atividade enzimtica e taxa de atividade enzimtica?
Discuta.
8) Existem enzimas que no sejam protenas?