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SUMRIO

1. INTRODUO.............................................................................................................04
2. OBJETIVOS.................................................................................................................05
2.1 OBJETIVOS GERAIS................................................................................................05
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS.....................................................................................05
3. MATERIAIS E MTODOS...........................................................................................05
3.1 REAGENTES.............................................................................................................05
3.2 PROCEDIMENTOS...................................................................................................05
4. RESULTADOS E DISCUSSO...................................................................................07
4.1 CURVA DE ABSORO.......................................................................................... 07
4.2 DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS NA AMOSTRA
PROBLEMA.....................................................................................................................08
5.CONCLUSO...............................................................................................................10
6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS............................................................................11
7. APNDICE..................................................................................................................12






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1. INTRODUO

O termo medida fotomtrica foi definido originalmente como o ato de medir a
intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de
medida utilizada a espectrofotometria que se baseia na absoro da radiao nos
comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. O aparelho
espectrofotmetro faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo, e
mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo. Um prisma contido no
aparelho separa a luzem feixes com diferentes comprimentos de onda. Assim
possvel passar um feixe de luz monocromtica atravs da amostra. O equipamento
permite saber que quantidade de luz absorvida a cada comprimento de onda.
O conjunto das absorbncias aos vrios comprimentos de onda para um
composto chama-se espectro de absoro e varia de substncia para substncia.
Como diferentes substncias tm diferentes padres de absoro, a espectrofotometria
permite identificar e quantificar substncias com base no seu espectro. A quantificao
realizada com a relao entre quantidade de luz absorvida e concentrao da
substncia. A absoro da luz tanto maior quanto mais concentrada for a soluo por
ela atravessada e quanto maior for a distncia percorrida pelo feixe luminoso atravs da
amostra. Esses princpios formam a Lei de Lambert Beer
Para determinao da concentrao de um soluto em uma amostra por
espectrofotometria, temos a comparao da absorbncia da amostra com uma soluo
padro, na qual j conhecida a concentrao do soluto. Em geral, utilizada uma
soluo-padro com diferentes concentraes (padres de referncia), que tem sua
absorbncia determinada. Esses padres so preparados diluindo-se a soluo-padro
na proporo necessria para a obteno das concentraes desejadas.
Com os valores de absorbncia e de concentrao conhecidos, pode-se traar
um grfico cujo perfil conhecido como curva-padro ou curva analtica. Nesse
grfico, a reta indica a proporcionalidade entre o aumento da concentrao e da
absorbncia e a poro linear correspondente ao limite de sensibilidade do mtodo
espectrofotomtrico para o soluto em questo.




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2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Abordar a espectrofotometria como mtodo analtico para se determinar a
concentrao de solues.
Aprender a construir curvas de calibrao no programa Excel

, utilizando-se de
ferramentas para conferir a confiabilidade da curva

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Elaborar curva de calibrao de acordo com o mtodo espectrofotomtrico
Determinar diferentes concentraes de protenas em amostra problema.
Elaborar curva de calibrao para determinar a concentrao de protenas das
amostras problema da aula anterior
Relembrar clculos de concentraes
Resolver exerccios

3. MATERIAIS E MTODOS

3.1. REAGENTES

Foram utilizados como reagentes: soluo padro de protena (albumina
bovina) 5 mg/mL, amostra problema de concentrao desconhecida e reagente de
Biureto.

3.2. PROCEDIMENTOS

Foram utilizados seis tubos de ensaio que foram numerados de 1 a 6 para
realizar o experimento.
Cada tubo foi preparado da seguinte forma:



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1 Tubo: (branco) 1,0 ml de gua destilada e 5,0 ml de reagente de biureto;
2 Tubo: 0,2 ml de soluo padro de protena (5mg/mL), 0,8 ml de gua
destilada e 5,0 ml de reagente de biureto;
3 Tubo: 0,4 ml de soluo padro de protena (5mg/mL), 0,6 ml de gua
destilada e 5,0 ml de reagente de biureto;
4 Tubo: 0,6 ml de soluo padro de protena (5mg/mL), 0,4 ml de gua
destilada e 5,0 ml de reagente de biureto;
5 Tubo: 0,8 ml de soluo padro de protena (5mg/mL), 0,2 ml de gua
destilada e 5,0 ml de reagente de biureto,
6 Tubo: 1,0 ml de soluo padro de protena (5mg/mL) e 5,0 ml de reagente
de biureto.
Logo aps todos os tubos estarem prontos, foram agitados e deixados de
repouso por 10 minutos.
Depois de passado o tempo de repouso, calculou-se a concentrao final de
cada um e suas respectivas absorbncias. Os resultados foram anotados na tabela
abaixo:

TUBOS 1 2 3 4 5 6
CLCULO -
Cd2 =

.0,015
Cd3=

.0,069
Cd4=

.0,145

Cd5=

.0,162

Cd6=

.0,207
CONCENTRAO - 0,36mg/ml 1,67mg/ml 3,50mg/ml 3,9mg/ml 5mg/ml

Ento, dando continuidade ao experimento, utilizou-se o espectrofotmetro para
determinar a curva de absoro do Reagente de Biureto em presena da protena
albumina, utilizando os tubos 1 e 6 do experimento montado, para determinar:

a) Curva de absoro de protena com Reagente de Biureto;



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b) Curva de referncia para determinar a concentrao de uma amostra-
problema,
c) Concentrao de protenas na amostra-problema.

4. RESULTADOS E DISCUSSO

4.1. CURVA DE ABSORO

Para determinar a curva de absoro, foi ligado o espectrofotmetro e o tubo 1
(branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento no comprimento de onda () de
540nm.
As absorbncias das solues dos tubos 2 a 6 foram determinadas e anotadas
na tabela abaixo:

Tubos 1 2 3 4 5 6
Absorbncia 1 Branco 0,015 0,069 0,145 0,162 0,207

De acordo com os dados obtidos, foi montado um grafico correlacionando a
absorbancia com a concentrao das amostras.




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4.2. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS NA AMOSTRA
PROBLEMA

Foram separados dois tubos de ensaio e identificados como tubo A (amostra-
problema) e tubo B (amostra-problema diluda), e adicionaram-se os reagentes
conforme tabela abaixo:

Reagentes (ml)
Tubos
A B*
Amostra problema 1,0 0,5
gua destilada - 0,5
Reagente de Biureto 5,0 5,0

Depois de preparados, os tubos foram deixados em repouso por 10 minutos.
Utilizou-se o tubo 1 para calibrar o espectrofotmetro: 0 de absorbncia em 540nm.

Tubos A B*
Absorbncia 0,29 0,13

(*Fator de diluio da amostra = 2)

Resultado do volume total dividido pela amostra que foi colocada. Fator de
diluio quantas vezes a amostra cabe no volume total aps a diluio.

Conforme os valores obtidos na curva de calibrao, a concentrao de
protenas (mg/mL) presente nas amostras problema foi calculada da seguinte forma (foi
considerada a absorbncia do padro de concentrao igual a 3mg/ml):

Cda =

.Ad




9
Cda=

.0,29 Cdb=

.0,13
Cda= 6 Cdb=2,7
Utilizando o programa Excel, encontramos a equao da reta referente a
curva de calibrao conforme grfico abaixo:


Finalmente, para calcular a concentrao de protenas (mg/mL) presente
nas amostras problema utilizando a equao da reta obtida com a curva de calibrao,
obteve-se os seguintes resultados:

Y= a.x + b (exclumos b porque passa no 0)
y = absorbncia

Tubo A: 0,29 = 0,0413x Tubo B: 0,13 = 0,0413.x
xA= 7,02mg/mL xB = 3,15 mg/mL
concentrao original. amostra diluda.








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5. CONCLUSO

Com o experimento pode-se abordar a espectrofotometria para determinar as
concentraes de algumas amostras e a concentrao de protena na amostra
problema, foi possvel determinar a curva de absoro para o reagente de biureto em
presena da protena albumina. Tambm foram aplicados conhecimentos do programa
excel, elaborando a curva de calibrao para dosagem de protena e foi montada a
curva de referencia agregando novos conhecimentos ao experimento.


























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6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Espectrofotometria. Disponvel em: <
http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/espectrodeantipiril.html>. Acesso em 12 de Setembro
de 2014.

NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: Worth
Publishers, 2000.


























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7. APNDICE

1. Qual a finalidade e o fundamento da tcnica espectrofotomtrica?
A espectrofotometria o mtodo de anlises ptico mais usado nas
investigaes biolgicas e fisico-qumicas. O espectrofotmetro um instrumento que
permite comparar a radiao absorvida ou transmitida por uma soluo que contm
uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma
substncia.
Todas as substncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que
parece completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem
ao espectro visvel. A gua absorve fortemente na regio do infravermelho.
As absores das radiaes ultravioletas, visveis e infravermelhas dependem
das estruturas das molculas, e caracterstica para cada substncia qumica.
Quando a luz atravessa uma substncia, parte da energia absorvida
(absorbncia): a energia radiante no pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida.
A cor das substncias se deve a absoro (transmitncia) de certos
comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos
nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas no absorvidos.

2. O que significa faixa de sensibilidade do mtodo espectrofotomtrico
e como ela determinada?
A faixa de sensibilidade corresponde capacidade do mtodo de fornecer
resultados diretamente proporcionais concentrao da substncia em exame.

3. Que critrio deve ser usado para selecionar determinado
comprimento de onda para uma tcnica espectrofotomtrica?
Deve-se levar em conta a relao entre quantidade de luz absorvida e
concentrao da substncia. A absoro da luz tanto maior quanto mais concentrada
for a soluo por ela atravessada e quanto maior for a distncia percorrida pelo feixe
luminoso atravs da amostra.




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4. Qual o contedo e a finalidade do tubo branco?
O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento no comprimento
de onda de 540nm antes da leitura de absorbncia dos outros tubos. O tubo branco foi
preparado com 1,0 ml de gua destilada e 5,0 ml de reagente de biureto.

5. De acordo com as Leis de Lambert-Beer, se um determinado
composto apresenta um mximo de absoro em 545nm e para uma
concentrao de 3mg/mL foi obtida uma absorbncia de 0,22, calcule a
concentrao deste composto correspondente a uma absorbncia de 0,15,
sabendo-se que o limite de sensibilidade do mtodo utilizado de 0,5 a 5mg/mL.
Cd =

. Ad
Cd =

. 0,15
Cd = 2,045454545 > Cd = 2,05 mg/mL

6. Construa a curva padro para os seguintes dados experimentais:
Conc. (mg/ml) Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs 4 Abs 5 Abs Mdia
1 0,08 0,07 0,09 0,05 0,06 0,07
2 0,15 0,17 0,15 0,13 0,16 0,152
3 0,23 0,25 0,22 0,26 0,21 0,234
4 0,30 0,31 0,33 0,30 0,32 0,312
5 0,37 0,40 0,40 0,35 0,44 0,392





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Considere que as absorbncias, em triplicata, das amostras-problema
foram:
Amostra Abs 1 Abs 2 Abs 3 Abs Mdia
A 0,09 0,07 0,08 0,08
B 0,15 0,17 0,16 0,16
C 0,31 0,33 0,32 0,32






y = 0.0779x
R = 0.9992
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
0.45
0 1 2 3 4 5 6
a
b
s

m

d
i
a

(
n
m
)

[] mg/ml
exerccio 6



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Sendo a amostra A, a amostra C diluda (fator de diluio = 4), calcule as
concentraes das amostras A, B e C utilizando dois mtodos:
- da relao


- equao da reta obtida com a construo da curva-padro


CdA = 1,02 mg/mL CdB = 2,04 mg/mL CdC = 4,08 mg/mL



CONCENTRAES DAS AMOSTRAS A, B E C SEGUNDO A EQUAO DA RETA:
A) 0,08 = 0,0784 . xA B) 0,16 = 0,0784 . xB C) 0,32 = 0,0784 . xC
xA = 1,02 mg/mL xB = 2,04 mg/mL xC = 4,08 mg/mL





y = 0.0784x
R = 1
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0 1 2 3 4 5
a
b
s

m

d
i
a

[] mg/ml
amostra problema exercicio 6

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