Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39

Programa de Control de Calidad Instrumental

Especto!ot"metos # $otocolometos
%ua p&ctica 'e actuali(aci"n
Clau'io )u#mo*ic+
,
- .osana Ac+eme
2
- /an'a /esini
2
- )aniel 0a((iotta
,
,1 Licencia'o en Ciencias Bioqumicas1
21 Bioqumica1
Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana
2ncopoa'a al C+emical A3stact /e*ice1
C"'i4o 3i3lio4&!ico: ABCL)L1
2//5 0325-2956
2nto'ucci"n
El espectrofotmetro constituye una herramienta fundamental en
el laboratorio clnico. Ms del 90% de las determinaciones que se rea-
lizan en umica !lnica tienen como paso final la lectura de una ab-
sorbancia o una transmitancia. El correcto desempe"o de los espec-
trofotmetros es entonces determinante# en $ltima instancia# de la
calidad analtica de los resultados que emite el laboratorio %&-'(.
El ob)eti*o de esta +ua consiste en que el bioqumico cuente con
los materiales necesarios para la e*aluacin del funcionamiento del
espectrofotmetro# y de esta manera# pueda *erificar si los parme-
tros fotom,tricos se encuentran dentro de los ran+os de aceptabili-
dad establecidos de acuerdo a las normati*as internacionales.
-e debern lle*ar re+istros que certifiquen dichos controles.
.os estndares de calidad del instrumental debern cumplirse y
por el contrario si al+$n parmetro estu*iera fuera de ran+o# es
con*enien- te realizar la reparacin del instrumento a tra*,s de un
ser*icio t,cnico acreditado y lue+o *ol*er a *erificar el buen
funcionamiento.
Contol 'e la e7actitu' 'e la lon4itu' 'e on'a
5 8 A9:8 9A.A $8:8C8L8.;0E:.8/ 52 A<:8A5AL2=A)8.E/
/recuencia del control0 semestral
El control se podr realizar en espectrofotmetros con selector
continuo de lon+itudes de onda# no as en fotocolormetros de filtro
ni en autoanalizadotes# ya que en estos no se pueden realizar espec-
tros de barrido.
1efinicin0 2rado de concordancia entre la lon+itud de onda que
indica el seleccionador y la lon+itud de onda de referencia requeri-
da. -e e3presa en nm.
/undamento0 -e utiliza el m,todo del punto isosb,stico0 el ro)o
!on+o tiene la particularidad que los espectros de las formas cida y
bsica del colorante en i+ual concentracin presentan la misma ab-
sorbancia a una lon+itud de onda denominada 4punto isosb,stico5
530 )u#mo*ic+ C # col1
%67(. Esta lon+itud de onda es independiente de la
concentracin del colorante y de la temperatura de
traba)o por lo cual resulta un parmetro fi)o de refe-
rencia. -i el punto isosb,stico hallado e3perimental-
mente difiere del terico# indica que e3iste un corri-
miento en la lon+itud de onda %8(%9(.
9oce'imiento
El estudio consta de : pasos0
a( 6reparacin de las formas cida y alcalina del
colorante
b( ;ealizacin del espectro de barrido
c( 7nterpretacin de resultados0 +rfico del es-
pectro para hallar el 67
.eacti*os equei'os
-olucin de ;o)o !on+o &< m+=.
>!l ?#@ A
AaB> ?#@ A
a( 6reparacin de las formas cida C y alcalina D del
colorante.
Clicuotar con una misma pipeta @ m. de solucin
de ;o)o !on+o &< m+=. en dos tubos de ensayo rotu-
lados C y D.
-olucin C0 al tubo C a+re+arle ?0 u. de la
solucin de >!l ?#@ A
-olucin D0 al tubo D a+re+arle ?0 u. de la solucin
de AaB> ?#@ A
Esar una $nica micropipeta para dispensar los ?0 u..
.as soluciones C y D una *ez preparadas son esta-
bles & hora a temperatura ambiente.
b) Realizacin del barrido espectrofotomtrico de las solucio-
nes A y B entre 520 y 570 nm.
-e deber realizar el espectro de las soluciones C y
D contra a+ua destilada. -e puede traba)ar a tempera-
tura ambiente ya que el punto isosb,stico es indepen-
diente de la temperatura entre < y <@ F!.
b?( M,todo manual para espectrofotmetros con
cubetas de caras paralelas de & cm de espesor.
%M,todo que utiliza tres cubetas(
Ele+ir : cubetas i+uales# sin rayaduras y perfecta-
mente limpias. .lenar una con a+ua destilada y las
otras con las soluciones C y D respecti*amente. C)ustar
el cero de absorbancia a @?0 nm con la cubeta que tie-
ne el a+ua destilada. ;etirar dicha cubeta y medir la
absorbancia de la solucin C# y lue+o de la solucin D
re+istrando los *alores en la tabla directamente como
Cbs. netas. -eleccionar lue+o @?@ nm y repetir los pa-
sos anteriores# es decir# a)ustar primero el cero con
a+ua destilada y lue+o leer las soluciones C y D. ;epe-
tir estos pasos a cada una de las lon+itudes de onda in-
dicadas en la tabla ad)unta# lle*ando a cero con la cu-
beta de a+ua destilada en cada lon+itud de onda.
b:( M,todo para los espectrofotmetros con micro-
cubetas y bomba de succin.
Cspirar a+ua destilada y a)ustar a cero de absorban-
cia a @?0 nm. El re+ulador de absorbancias no se toca-
r ms en toda la e3periencia.
Mo*er el selector de lon+itudes de onda hacia los
@80 nm realizando el espectro del a+ua tal como se in-
dica en la tabla ad)unta# re+istrando todos los *alores
de absorbancia.
Gaciar la cubeta y aspirar la solucin C realizando el
mismo barrido.
Gaciar la cubeta# en)ua+ar pasando a+ua destilada y
aire y aspirar la solucin D realizando el mismo
barrido.
Aota0 para realizar el barrido del a+ua destilada en
los m,todos b& y b: se recomienda empezar lle*ando
a cero de absorbancia a @?0 nm con el fin de tener to-
das las absorbancias positi*as. -i el espectro del a+ua
da *alores ne+ati*os comenzar a otra lon+itud de onda
de manera tal de no tener *alores ne+ati*os de absor-
bancias ya que finalmente ser restado el espectro del
a+ua punto a punto del de las soluciones C y D.
Lon4itu' 'e A3so3ancias A3so3ancias
on'a (nm) a3solutas elati*as
A4ua /oluci"n /oluci"n A3s neta A3s neta
&ci'a (A) alcalina (3) 'e A 'e B
-e recomienda proceder de la si+uiente manera0
b&( M,todo manual para espectrofotmetros con
cubetas de caras paralelas de & cm de espesor.
%M,todo que utiliza una cubeta(
.lenar una cubeta con a+ua destilada y a)ustar el ce-
ro de absorbancia a @?0 nm. El re+ulador de absorban-
cias no se tocar ms durante toda la e3periencia.
.eer y re+istrar las absorbancias a las lon+itudes de
onda indicadas en la tabla pro*ista.
Gaciar y llenar la misma cubeta con la solucin C
re- pitiendo el mismo barrido.
Gaciar# en)ua+ar con a+ua destilada y llenar la
misma cubeta con la solucin D repitiendo el mismo
barrido.
520
525
530
535
53>
536
53?
539
540
54,
542
543
544
545
550
5>0
560
Espectrmetros y Fotocolormetros. Gua prctica de utilizacin 53,
8*elai' /ample /pecta
0-5
0-4
0-3
0-2
0-,
0
400 450 500 550
/ample@.esult :a3le
A 5ame A 5ame
>00 Ba*elen4t+ (nm)
, $oma alcalina 2 $oma &ci'a
%&!ico 'e 9unto 2sos3Cstico 'el .oDo Con4o1
.esulta'os
2raficar la absorbancia neta de las dos formas del
colorante en papel milimetrado en funcin de la lon-
+itud de onda y establecer la lon+itud de onda a la que
los dos espectros se cortan %punto isosb,stico(. El pun-
to isosb,stico terico en las condiciones de realizacin
de la e3periencia es @<& nm.
!alcular el corrimiento que presenta el instrumen-
consiste en la medicin de absorbancias de soluciones
certificadas y en la comparacin de los *alores halla-
dos con los de referencia. .as soluciones com$nmen-
te usadas como estndares de absorbancia son0 %9 -&:(0
H :<0 nm0 soluciones de dicromato de potasio en
>!lB< 0#00&A con absorbancia certificada
H <0@ nm0 soluciones de p-nitrofenol en AaB>
0#&A con absorbancia certificada o soluciones de
to como0
sales de Ai%>
?
B(
'
con absorbancia certificada.
I?
en
!orrimiento %nm( J p. isosb,stico hallado K
p. isosb,stico terico
El punto isosb,stico terico del ;o)o !on+o es @<& nm.
E)emplo0 -i el 67 hallado es de @:' nm el corrimien-
to ser0
H @0@ nm0 soluciones de sales de !o%>
?
B(
'
-B<>? 0#<8A con absorbancia certificada
H @<0 nm0 soluciones de cianmetahemo+lobina
con absorbancia certificada
@:' K @<& J K @ nm
.mites de aceptabilidad0
!orrimiento0 entre I=- : nm
7nter*alo ptimo0
!orrimiento0 entre I=-? nm
Contol 'e la E7actitu' $otomCtica
A9:8 9A.A E/9EC:.8$8:E0E:.8/-
$8:8C8L8.;0E:.8/ F A<:8A5AL2=A)8.E/
1efiniciones0 .a e3actitud fotom,trica es el +rado de
concordancia entre la absorbancia real y la absorban-
cia medida. El error cometido al leer una absorbancia
respecto de una de referencia se denomina entonces
4ine3actitud fotom,trica5.
/recuencia del control0 mensual
/undamento0 El estudio de la e3actitud fotom,trica
9oce'imiento
-e deber medir la absorbancia de las soluciones y
comparar dicho *alor con los que fi+uran en los certi-
ficados correspondientes.
-eleccionar la temperatura de traba)o.
-eleccionar la lon+itud de onda.
;ealizar un blanco con a+ua destilada. ;ealizar to-
das las medidas por duplicado.
Aota0 En el ane3o C fi+uran los diferentes procedi-
mientos para las lecturas de las absorbancias de acuer-
do al tipo de instrumento0 espectrofotmetro o fotoco-
lormetro manual# con bomba de aspiracin o equipos
automticos. Etilizar dicho ane3o como +ua para la
realizacin de las medidas.
.esulta'os
Estudio de e3actitud fotom,trica0
!alcular la ine3actitud fotom,trica como la diferen-
cia entre la absorbancia promedio hallada y el *alor de
Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39
A
3
s
o

3
a
n
c
i
a

(
A
<
)
I?
532 )u#mo*ic+ C # col1
referencia que se detalla en los certificados respecti-
*os.
% 7ne3actitud fotom,trica J
%Cbs. hallada K Cbs. referencia( 3 &00
Cbs. referencia
.mites de aceptabilidad0
E3actitud fotom,trica ptima0 error entre I=- ?%
E3actitud fotom,trica aceptable0 error entre I=-
:%
E)emplo0
K .on+itud de onda0 @0@ nm
K Lemperatura0 :0 F!
K Cbsorbancia contra a+ua destilada de ampolla
D?0
Medida &0 0#:&@ Medida ?0 0#:&:
K Cbsorbancia promedio hallada 0 0#:&<
K Cbsorbancia de referencia# :0 F!# @0@ nm %se-
+$n certificado(0 0#:?:
K 7ne3actitud fotom,trica J
%0#:&< K 0#:?:(
3 &00 J - ?#89%
0#:?:
6or lo tanto# la ine3actitud del instrumento a dicha
lon+itud de onda est dentro de los lmites aceptables.
Contol 'e la Lineali'a' $otomCtica
APTO PARA ESPECTROFOTMETROS
/undamento0 El estudio de la linealidad fotom,tri-
ca permite establecer el ran+o de absorbancias en el
que el instrumento tiene respuestas proporcionales a
los cambios de concentracin %&<-&'(.
9oce'imiento
-e debern medir las absorbancias de soluciones de
concentraciones crecientes y contrastar dichos *alores
con los de referencia que fi+uran en los certificados
correspondientes.
-eleccionar la temperatura de traba)o.
-eleccionar la lon+itud de onda0 se realiza a las mis-
mas lon+itudes de onda utilizadas para el control de
e3actitud fotom,trica.
;ealizar un blanco con a+ua destilada. ;ealizar to-
das las medidas por duplicado.
.esulta'os
2raficar las absorbancias promedio halladas %e)e y(
en funcin de las absorbancias de referencia %e)e 3(.
-e obtendr un +rfico del si+uiente tipo0
E)emplo0
.on+itud de onda0 :<0 nm
Lemperatura0 ?@ F!
FOTOCOLOR!METROS " A#TOA$ALI%A&ORES
/oluci"n A3s1 +alla'a A3s1 e!eencia
A4ua 0-000 0-000
1efiniciones0 !apacidad de respuesta lineal de un A 0-249 0-25,
espectrofotmetro a diferentes concentraciones de B 0-4?9 0-502
una sustancia que cumpla la ley de Deer. C 0-9?0 ,-004
/recuencia del control0 trimestral
) ,-42> ,-50>
A3s1 +alla'as *s e!eencia
,15
,
015
0
0 012 014 01> 01? , ,12 ,14 ,1>
A3s1 e!eencia
ecta i'eal ecta +alla'a
Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39
A
3
s
1

+
a
l
l
a
'
a
s
Espectrmetros y Fotocolormetros. Gua prctica de utilizacin 533
6ara el clculo de la .inealidad fotom,trica se de-
ber realizar un estudio de re+resin lineal de la recta
hallada0
M J a I b N
1onde b es la pendiente de la recta y a la ordenada
al ori+en. .a pendiente b representa la .inealidad fo-
tom,trica. .a recta ideal sera M J N por lo cual la pen-
diente ideal es &#00 que indica que el instrumento res-
ponde linealmente en el ran+o de absorbancias
estudiadas.
6or el m,todo de cuadrados mnimos se debern
calcular a y b.
>ay calculadoras cientficas o pro+ramas de com-
putacin %tipo E3cel( que permiten# incorporando los
< datos de absorbancias halladas y los < de absorban-
cias *erdaderas realizar una re+resin lineal y calcular
dichos *alores.
.mites de aceptabilidad0
6endiente ideal0 &#00
6endiente ptima0 entre 0#99 y &#0?
6endiente aceptable0 entre 0#98 y &#0:
En el e)emplo anterior# si se realiza el estudio de
cuadrados mnimos la ecuacin obtenida es0
M J 0#9@N I 0#009
6or lo tanto la pendiente de la recta es 0#9@ %error
K @%(# y no se encuentra dentro de los lmites acepta-
bles para el ran+o de absorbancias estudiadas %C&-
C<(.
En dicho caso se podra estudiar la .inealidad has-
ta el tercer punto# es decir considerando solo las absor-
bancias C# D y !. .a ecuacin obtenida es0
M J 0#98@ N I 0#00&
.a pendiente se encuentra dentro de los lmites
aceptables.
!onclusin0 El instrumento se comporta linealmente
hasta absorbancias apro3imadamente i+uales a &.000 EC
%!(. Este instrumento no debera usarse para leer ab-
sorbancias mayores a este *alor# ya que pierde sensibili-
dad de respuesta ante aumentos en la concentracin.
Contol 'e la pesencia 'e lu(
pa&sita
A9:8 9A.A E/9EC:.8$8:E0E:.8/-
$8:8C8L8.;0E:.8/ F A<:8A5AL2=A)8.E/
1efinicin0 -e denomina luz parsita a toda radia-
cin electroma+n,tica de lon+itud de onda distinta a
la seleccionada por el monocromador# que alcanza el
detector y por lo tanto queda re+istrada por el instru-
mento.
/undamento0 este control se basa en la medida del
porcenta)e de transmitancia de una solucin de nitri-
to de sodio @0 +=.. Esta sustancia tiene la propiedad
de que sus soluciones absorben toda la radiacin inci-
dente de lon+itudes de onda menores a los :90 nm#
por lo que se la denomina pticamente opaca a la luz.
6or lo tanto# la transmitancia a :<0 nm de esta solu-
cin debe ser i+ual a cero y toda transmitancia detec-
tada se corresponde con luz parsita %&8-?0(.
0ateiales necesaios
-olucin de AaAB
?
@0 +=.
9oce'imiento
K Lemperatura de traba)o0 .a transmitancia de la
solucin es independiente de la temperatura en-
tre &0 y <0 F!
K .on+itud de onda0 :<0 nm
;ealizar un blanco con a+ua destilada. ;ealizar las
medidas por duplicado.
-i el instrumento permite medir transmitancias# rea-
lizar directamente la medicin de la transmitancia de
la solucin calibrando el &00 % L con a+ua destilada.
.esulta'os
El *alor de transmitancia porcentual es definido co-
mo la luz parsita e3istente en la zona espectral.
.uz parsita J L;CA-M7LCA!7C % J &0
2 K absorbancia
(
E)emplo0
Cbsorbancia J ?.:00 EC corresponde una L % J 0#@%
.mites de aceptabilidad0
.uz parsita ptima0 L% menor del 0#@%.
%absorbancia mayor a ?.:00 EC(.
.uz parsita aceptable 0 menor del &%.
%absorbancia mayor a ?.000 EC(
Aota0 6uede suceder que la absorbancia leda supe-
re el *alor m3imo de re+istro del instrumento. 6or
e)emplo# hay muchos aparatos que no pueden leer ab-
sorbancias superiores a ?.000 EC y al superar este *a-
lor el instrumento no indica lecturas o indica error.
En estos casos sOlo podr calcular el%L reemplazando
en la frmula anterior la absorbancia por el *alor
m3imo que lee el instrumento0
Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39
534 )u#mo*ic+ C # col1
E)emplo0
Cbsorbancia leda a :<0 nm0 supera el lmite de
?.000 EC del espectrofotmetro. Esto si+nifica que la
absorbancia es mayor que ?.000 EC. En este caso0
%L J &0
%?-C(
J &0
%?-?(
J &0
0
J &#0%
6or lo tanto# el %L# o sea# la luz parsita presente es
menor al &#0% cuando la absorbancia es mayor que
?.000 EC.
Contol 'e la 9ecisi"n $otomCtica
A9:8 9A.A E/9EC:.8$8:E0E:.8/-
$8:8C8L8.;0E:.8/ F A<:8A5AL2=A)8.E/
1efinicin0 -e denomina precisin fotom,trica a
la medida de la dispersin de una serie de medicio-
nes de transmitancia o absorbancia alrededor de la
media y se e3presa como coeficiente de *ariacin
porcentual %?&(.
Materiales necesarios0 se puede utilizar cualquier
solucin# ya que no es necesario conocer el *alor de la
absorbancia. -lo se necesita que la absorbancia de la
solucin permanezca estable en el tiempo.
6or e)emplo0 se puede utilizar una solucin de sul-
fato c$prico en medio cido para '@0 nm.
9oce'imiento
K .on+itud de onda0 '@0 nm o la ms cercana %prefe-
rentemente superior( que el instrumento permita.
K Lemperatura de traba)o0 es preferible seleccio-
nar la temperatura a la que habitualmente traba-
)a a esta lon+itud de onda.
;ealizar un blanco con a+ua destilada y proceder a
medir &0 *eces la absorbancia de la solucin de la si-
+uiente manera0
&( Espectrofotmetros o fotocolormetros manua-
les0 car+ar una cubeta con la solucin y leer la
absorbancia. ;etirarla del portacubetas y *ol*er
a colocar la cubeta en la misma orientacin# re-
+istrando nue*amente el *alor de la absorban-
cia. ;epetir el procedimiento hasta obtener &0
medidas.
?( 7nstrumentos con bomba de aspiracin0 realizar
el blanco con a+ua. Cspirar la solucin y re+is-
trar la absorbancia. Cspirar nue*amente y *ol*er
a re+istrar. ;epetir hasta obtener &0 lecturas.
:( Cutoanalizadores0 car+ar una copa de reaccin
con a+ua y leer el blanco. ;etirar el a+ua y car-
+ar la solucin y leer la absorbancia. Gol*er a
leer la absorbancia de la solucin de la misma
copa de reaccin 9 *eces ms para completar &0
lecturas.
Aota0 el *alor absoluto de la absorbancia de esta so-
lucin no es importante ya que no es una solucin de
referencia para determinar e3actitud de la absorban-
cia# por lo que no se indica cul es la absorbancia de
referencia. -lo es importante el *alor del coeficiente
de *ariacin porcentual obtenido como ndice de la
imprecisin de las lecturas.
.esulta'os
-e tendrn &0 resultados de absorbancia.
!alcular la media aritm,tica N y la des*iacin estn-
dar 1E de dichas absorbancias.
/inalmente obtener el coeficiente de *ariacin por-
centual0
7mprecisin /otom,trica J !G% J
1E &00
N
.mites de aceptabilidad0 6recisin
ptima0 !G% menor de 0#@%
6recisin aceptable0 !G% menor de &%
E)emplo0 -e obtu*ieron las si+uientes lecturas del
sulfato c$prico a '@0nm0
0#??<# 0#??<# 0#??@# 0#??:# 0#??@# 0#??'# 0#??:# 0#??<#
0#??8# 0#???.
.a media de las &0 medidas es0 N J 0#??<
.a des*iacin estndar ser0 1E J 0#00&@
6or lo tanto# el !G% ser0
!G% J %0#00&@=0#??<( 3 &00 J 0#'8%# que supera el
lmite ptimo pero si+ue siendo aceptable.
Contol 'e la esta3ili'a' $otomCtica
A9:8 9A.A E/9EC:.8$8:E0E:.8/-
$8:8C8L8.;0E:.8/ F A<:8A5AL2=A)8.E/
1efinicin0 -e denomina estabilidad fotom,trica a
la capacidad del instrumento de mantener constante
la absorbancia en funcin del tiempo.
!uando se producen *ariaciones constantes y cont-
nuas hacia *alores superiores o inferiores de absorban-
cia se habla de deri*a fotom,trica y cuando se produ-
cen *ariaciones al azar se est en presencia de ruido
fotom,trico.
Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39
Espectrmetros y Fotocolormetros. Gua prctica de utilizacin 535
:iempo
:iempo
BaDo ui'o # 3aDa 'ei*a BaDa 'ei*a # alto ui'o
:iempo
:iempo
Alta 'ei*a # 3aDo ui'o Alta 'ei*a # alto ui'o
$i4ua - Esta3ili'a' 'e la lectua- 'ei*a # ui'o1
0ateiales necesaios
Cutoanalizadores0
!ar+ar una copa de reaccin con a+ua y leer el
blanco. ;etirar el a+ua y car+ar la solucin de dicro-
mato y leer la absorbancia. Gol*er a leer la absorbancia
de la solucin de la misma copa de reaccin cada :0
se+undos durante @ minutos. -e tendrn as && *alores.
Aota0 en equipos automticos se estudia la estabio-
lidad en un menor tiempo de acuerdo a sus caracters-
ticas de traba)o.
.esulta'os
-e +raficarn los ?& *alores de absorbancia en fun-
cin del tiempo determinando si e3iste deri*a o ruido
fotom,trico
!lculo de la deri*a0 este parmetro se define como
la pendiente de la cur*a de absorbancia !s tiempo y se
e3presa como porcenta)e del *alor inicial de absorban-
cia.
E)emplo0 -e obtu*ieron las si+uientes medidas0
0#<00# 0#<00# 0#<0&# 0#<0&# 0#<00# 0#<0&# 0#<0&# 0#<0?#
0#<0?# 0#<0?# 0#<0?# 0#<0:# 0#<0:# 0#<0? 0#<0:# 0#<0<#
0#<0<# 0#<0:# 0#<0<# 0#<0@# 0#<0@.
-i se supone un ruido despreciable# el *alor de la
deri*a ser0
%Cbs final - Cbs inicial(
-olucin de dicromato de potasio @0 +=. en medio
perclrico %0#00& A(
deri*a J
Cbs inicial
3 &00
9oce'imiento
K .on+itud de onda0 :<0 nm.
K Lemperatura de traba)o0 es preferible seleccio-
nar la temperatura a la que habitualmente se tra-
ba)a a esta lon+itud de onda.
Espectrofotmetros o fotocolormetros
;ealizar un blanco con a+ua destilada.
Medir la absorbancia de la solucin de dicromato.
En este momento poner en marcha un cronme-
tro y re+istrar la absorbancia cada :0 se+undos duran-
te &0 minutos sin *ariar nin+una condicin de la me-
dida. 6or lo tanto# al cabo de &0 minutos se tendrn
?& *alores.
deri*a J
%0#<0@ - 0#<00(
3 &00 J &#?@%
0#<00
!lculo del ruido0 este parmetro se calcula como
la dispersin de los *alores alrededor del *alor medio
de absorbancia multiplicando por &00 para e3presar
como porcenta)e. En el caso que la deri*a sea despre-
ciable se calcula como0
ruido J
des*iacin estnda r
3 &00 J
0#00&@@ 3 &0 0
J
0#:9%
Cbs media 0#<0?:
.mites de aceptabilidad0
Estabilidad ptima0 ruido I deri*a menor de 0#@%
6recisin aceptable0 ruido I deri*a menor de &%
Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39
A
3
s
o

3
a
n
c
i
a
A
3
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o

3
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s
o

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A
3
s
o

3
a
n
c
i
a
53> )u#mo*ic+ C # col1
A5EG8 A
0E)2C2E5 )E AB/8.BA5C2A/
Especto!ot"metos # !otocolometos
manuales
&. Encender el espectrofotmetro antes de realizar
la prueba teniendo en cuenta el tiempo de ter-
mostatizacin recomendado por el fabricante.
?. -eleccionar la lon+itud de onda de traba)o. -i
tiene un fotocolormetro seleccione el filtro ms
pr3imo a la lon+itud de onda indicada.
:. -eleccionar la temperatura de traba)o.
<. Ele+ir una cubeta en buen estado %sin deforma-
ciones ni suciedad(
@. .le*ar a cero de absorbancia con a+ua destilada.
'. Gaciar la cubeta y en)ua+arla con una peque"a
porcin de la solucin a medir para e*itar arras-
tre.
8. !ar+ar la cubeta con la solucin y leer la absor-
bancia por duplicado informando la absorban-
cia promedio.
9. -i se debe medir ms de una solucin# en)ua+ar
la cubeta con una porcin de la solucin antes
de medir y leer como en el paso 8. Lener la pre-
caucin de empezar siempre por la solucin
ms diluida.
Especto!ot"metos # !otocolometos
con 3om3a 'e aspiaci"n
&. Encender el espectrofotmetro antes de realizar
la prueba teniendo en cuenta el tiempo de ter-
mostatizacin recomendado por el fabricante.
?. -eleccionar la lon+itud de onda de traba)o. -i se
tiene un fotocolormetro seleccionar el filtro
ms pr3imo a la lon+itud de onda indicada
:. -eleccionar la temperatura de traba)o.
<. .le*ar a cero de absorbancia con a+ua destilada.
Cspirar aire.
@. Cspirar la solucin a medir y re+istrar el *alor.
Cspirar aire y repetir la operacin con la misma
solucin. !alcular la absorbancia promedio.
'. -i se debe medir ms de una solucin aspirar ai-
re entre muestra y muestra. ;epetir el paso @.
Autoanali(a'oes # equipos autom&ticos
&. !onsultar el manual del fabricante para selec-
cionar la funcin o test que le permita medir ab-
sorbancias absolutas.
?. -eleccionar el filtro de lon+itud de onda ms
cercano a la lon+itud de onda de traba)o
:. -eleccionar la temperatura de traba)o.
<. ;ealizar un blanco con a+ua destilada y proce-
der a la medicin de la absorbancia de la=s so-
lucin=es por duplicado.
En caso que el camino ptico de la celda de medi-
cin no sea de & cm realizar la correccin que corres-
ponda para normalizar la absorbancia a & cm de paso
de luz. El factor a utilizar en dichos casos ser0
Cbs. normalizada J Cbs. leda 3
& cm
!amino ptico de la celda %en cm(
$ecuencia ecomen'a'a paa las 'istintas
popie'a'es !otomCticas
El crono+rama recomendado para el control de las
distintas propiedades fotom,tricas es el si+uiente0
0ensual :imestal /emestal
9ecisi"n G
Lineali'a' G
E7actitu' G
Lon4itu' 'e on'a G
Lu( pa&sita G
Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39
Espectrmetros y Fotocolormetros. Gua prctica de utilizacin 536
A5EG8 B
9.E9A.AC2E5 )E /8L<C285E/
)E .E$E.E5C2A 9A.A C85:.8L
E/9EC:.8$8:80H:.2C8
9epaaci"n 'e soluciones 'e 'icomato 'e potasio
en &ci'o pecl"ico 0-00,5 paa el contol 'e
lineali'a' !otomCtica en el <I
a( Materiales necesarios
H 1icromato de potasio calidad espectrofoto-
m,trica
H Pcido perclrico concentrado %'9 - 8?%(
H C+ua bidestilada
b( -ecado del dicromato de potasio
!olocar en estufa a &0@ F! durante ? h. !olocar en
desecador hasta que alcance la temperatura ambiente
y pesar. Gol*er a &0@ F! durante & hora ms y repetir
la pesada. !ontinuar hasta lo+rar peso constante.
1e)ar en desecador hasta el momento de ser usado.
c( 6reparacin de solucin de cido perclrico & A
.lenar hasta apro3imadamente la mitad un matraz
de &00 m. con a+ua bidestilada. C+re+ar 9#< m. de
cido perclrico concentrado %80%(. !ompletar hasta
el enrase con a+ua bidestilada.
d( 6reparacin de las soluciones de dicromato
de potasio en cido perclrico 0#00& A
-e debern preparar @ soluciones de las si+uientes
concentraciones0 ?@# @0# &00# &@0 y ?00 m+=..
K 6reparacin de solucin de ?@ m+=.0
H 6esar en balanza analtica con precisin de
0#& m+# ?@#0 m+ de dicromato de potasio pre-
*iamente secado.
H .lenar un matraz de & litro con a+ua bidesti-
lada apro3imadamente hasta la mitad.
H Lras*asar cuantitati*amente el dicromato de
potasio pesado a dicho matraz# arrastrando
cualquier resto con a+ua bidestilada.
H C+re+ar & m. de solucin de cido perclri-
co & A %preparada en D(.
H !ompletar hasta el enrase con a+ua bidestila-
da.
H C+itar por in*ersin hasta disolucin total.
H Clmacenar en frascos de *idrio color carame-
lo y en la oscuridad. Estable por lo menos '
meses.
K 6reparacin de las soluciones @0# &00# &@0 y ?00
m+=.0
6roceder de la misma manera que en el caso ante-
rior# pesando cada *ez la cantidad que corresponda a
cada solucin con precisin de 0#& m+.
9epaaci"n 'e soluci"n 'e nitito 'e so'io 50 4@L
paa contol 'e pesencia 'e lu( pa&sita
a( Materiales necesarios
H Aitrito de sodio calidad analtica
H C+ua bidestilada
b( -ecado del nitrito de sodio
!olocar en estufa a &0@ F! durante ? h. !olocar en
desecador hasta que alcance la temperatura ambiente
y pesar. Gol*er a &0@ F! durante & hora ms y repetir
la pesada. !ontinuar hasta lo+rar peso constante.
1e)ar en desecador hasta el momento de ser usado.
c( 6reparacin de la solucin de @0 +=.
H 6esar en balanza analtica con precisin de
0#& m+# @0 + de nitrito de sodio pre*iamente
secado.
H .lenar un matraz de & litro con a+ua bidesti-
lada apro3imadamente hasta la mitad.
H Lras*asar cuantitati*amente el nitrito de so-
dio pesado a dicho matraz# arrastrando cual-
quier resto con a+ua bidestilada.
H !ompletar hasta el enrase con a+ua bidestila-
da.
H C+itar por in*ersin hasta disolucin total.
0H:8)8 )EL 9<5:8 2/8/BH/:2C8
9A.A EL C85:.8L )E LA EGAC:2:<)
)E LA L85%2:<) )E 85)A
9epaaci"n 'e la soluci"n 'e .oDo Con4o
a( Materiales necesarios
H ;o)o !on+o calidad analtica
H C+ua bidestilada
b( -ecado del ;o)o !on+o
!olocar el colorante en estufa a 80 F! la noche an-
terior a la preparacin de la solucin. ;etirar de la es-
tufa y colocar en desecador hasta que alcance la tem-
peratura ambiente antes de pesar.
c( 6reparacin de la solucin de ;o)o !on+o &< m+=.0
H 6esar en balanza analtica con precisin de
0#& m+# &<#0 m+ de ;o)o !on+o pre*iamente
secado.
H .lenar un matraz de & litro con a+ua bidesti-
lada apro3imadamente hasta la mitad.
H Lras*asar cuantitati*amente el ;o)o !on+o
pesado a dicho matraz# arrastrando cualquier
resto con a+ua bidestilada.
H !ompletar hasta el enrase con a+ua bidestila-
da.
H C+itar por in*ersin hasta disolucin total.
Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39
53? )u#mo*ic+ C # col1
H Clmacenar en frascos de *idrio color carame-
lo y en la oscuridad.
9oce'imiento
a( Materiales necesarios
H -olucin de ;o)o !on+o &< m+=.
H AaB> @ A
H >!l @ A
b( 6reparacin de las soluciones cida y bsica del
colorante
H !olocar en sendos tubos de ensayo &0 m. de
la solucin de ;o)o !on+o con una pipeta de
doble aforo.
H C+re+ar a uno de los tubos ?0 u. de AaB> @
A %solucin bsica(. Mezclar por in*ersin.
H C+re+ar al otro tubo ?0 u. de >!l @ A %solu-
cin cida(. Mezclar por in*ersin.
H 1e)ar ambas soluciones en reposo &0 minu-
tos.
H ;ealizar el barrido espectral antes de las ? h.
c( ;ealizacin del barrido espectral de las solucio-
nes cida y bsica
H Etilizar a+ua destilada como blanco# lle*an-
do a cero de absorbancia a @:0 nm.
H .eer las absorbancias del blanco entre @:0 y
@@0 nm.
H -in modificar el cero# realizar el mismo barri-
do con las soluciones cida y bsica.
H ;estar a cada absorbancia en cada lon+itud
de onda# la lectura correspondiente al blanco
de a+ua destilada.
H 2raficar absorbancia en funcin de la lon+i-
tud de onda para ambos espectros.
H 1eterminar la lon+itud de onda correspon-
diente al punto de corte de ambos espectros
%punto isosb,stico(
9epaaci"n 'e soluciones 'e co3alto paa el contol
'e lineali'a' !otomCtica en el *isi3le
El color de las soluciones de cobalto es debido al
ion !o%>
?
B(
'
I?
# cuyo m3imo de absorcin se en-
cuentra en @&? nm. .as soluciones se preparan por di-
solucin de la cantidad necesaria de una sal de cobal-
to %77(# %nitrato# sulfato( que conten+a entre : y &? +
de !o
I?
.
1isol*er la cantidad de sal pesada en apro3imada-
mente @00 m. de a+ua destilada. C+re+ar &? m. de
cido sulf$rico y lle*ar a & litro con a+ua destilada.
.as absorbancias a las lon+itudes de onda a contro-
lar se deben asi+nar contra soluciones de referencia
con *alores de absorbancia certificados %A7-L -;M
9:&( en un espectrofotmetro de referencia. 6ara esto
se establecer un protocolo para la asi+nacin de *alo-
res de absorbancia en funcin de la temperatura de
me- dicin# ya que el coeficiente de e3tincin del ion
!o%77( es dependiente de la temperatura entre ?0 y :8
F!.
Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39
Espectrmetros y Fotocolormetros. Gua prctica de utilizacin 539
.e!eencias 3i3lio4&!icas
,1 0uali )+aan1 Contol 'e cali'a' 'e instumentos #
equipamientos 'e la3oatoio1 En: 0uali )+aan1
Contol 'e Cali'a' en las La3oatoios Clnicos1
0a'i': E'1 .e*etC /1A; ,9?01 p1 ,45->21
21 .an' .51 9actical spectop+otometic stan'a's1
Clin C+em ,9>9; ,5 (9): ?39->31
31 $in4s C/- Boussa' LA1 Cali3ation an' monitoin4 o!
spectometes an' spectop+otometes Clin C+em
,969; 25 (>): ,0,3-61
41 Ellis J- 0oison K1 /ome souces o! eos an' ati-
!acts in spectop+otometic measuements1 Clin C+em
,96>; 2,(>): 66>-61
51 $ancini C- Catto((o %1 La spetto!otometa in
Bioc+imica Clinica: Iei!ica 'elle caatteistic+e 'i te
spetto!otometi 'oppo a44io: espeien(a patica1
Bioc+imica Clinica ,9??; ,2: 420-2>1
>1 Ameican /ociet# !o :estin4 an' 0ateials1 /tan'a'
9actice !o )esci3in4 an' 0easuin4 9e!omance o! <l-
ta*iolet- Iisi3le- an' 5ea-2n!ae' /pectop+otometes1
A/:0 )esi4nation: E 265-93; ,9931
61 Alman )- Billme#e $1 A e*ieL o! La*elen4+t
cali3a- tion met+o's !o *isi3le- an4e p+otoelectic
spectop- +otometes1 K C+em E'uc ,965; 52 (5):
5,0-51
?1 Mo7te %1 /u44este' 2sos3estic La*elen4t+ cali3ation
in clinical anal#ses1 Clin C+em ,969; 25 (,)- ,43->1
91 Ameican /ociet# !o :estin4 an' 0ateials1
/tan'a' 9actice !o t+e 9eio'ic Cali3ation o!
5aoL Ban'- 9ass /pectop+otometes1 A/:0
)esi4nation: E 925-
?3; ,9941
,01 5ational Bueau o! /tan'a's1 /tan'a' .e!eence
0ateial 935 a: C#stalline 9otassium )ic+omate !o
<se as an <lta*iolet A3so3ance /tan'a'1 20001
,,1 5ational 2nstitute o! /tan'a's N :ec+nolo4#1 /tan-
'a' .e!eence 0ateial 93,!: Liqui' A3so3ance
/tan'a' !o <lta*iolet an' Iisi3le /pectop+oto-
met#1 ,9991
,21 5ational Bueau o! /tan'a's1 5B/ /pecial
9u3lication 2>0-541 /tan'a' .e!eence 0ateials:
Ceti!ication an' use o! Aci'ic 9otassium
)ic+omate /olutions as an <lta*iolet A3so3ance
/tan'a' - /.0
9351 5at1 Bu1 /tan'1 (<1/1)1 /pec 9u3l 2>0-541
,9661
,31 =iDlsta BC1 /tan'ai(ation o! +emo4lo3inomet#1
:+e e7tinction coe!!icient o! +emi4lo3inc#ani'e1
Clin C+em Acta ,9>0; 5: 6,9-2>1
,41 Ian'elin'e .- .ic+a's A- JoLalsOi 91 Lineait# an'
accuac# o! ulta*iolet an' *isi3le La*elen4t+ p+oto-
metes: an intela3oato# su*e#1 Clin C+im Acta
,965; >,: 39-4>1
,51 $in4s C- 0uscat I- Bal'op 51 Con*enient met+o'
!o c+ecOin4 'etecto esponse o! spectop+otometes
at t+ee La*elen4t+s1 Clin C+em ,96>; 22 (,): ,0,-
21
,>1 BoLes %- 0c Com3 .- C+istensen .- /c+a!!e .1
Mi4+ puit# 4-nitop+enol: pui!ication- c+aactei(a-
tion an' speci!ications !o use as a
spectop+otometic e!eence mateial1 Clin C+em
,9?0; 2> (>): 624-91
,61 Ja#e B1 /ta# li4t+ atio measuements1 Anal C+em
,9?,; 53 (,4): 220,->1
,?1 Beele 0- Lancaste .1 CA9 /u*e# to asses t+e e7tent
o! sta# li4t+ po3lems in pecision
spectop+otomet#1 Am K Clin 9at+ol ,965; >3: 953-
691
,91 /+ape 01 /ta# li4+t in <I-I2/ spectop+otometes1
Anal C+em ,9?4; 5> (2): 339-5>1
201 5ational Bueau o! /tan'a's1 /tan'a' .e!eence
0ateial 2032: C#stalline1 9otassium 2o'i'e1 Mete-
oc+omatic /ta# .a'iant Ene4# /tan'a' !o <lta-
*iolet A3soption /pectop+otomet#1 ,9691
2,1 Jo(um B- 0ille B1 0onitoin4 t+e sta3ilit# o!
La*e- len4t+ cali3ation o! spectop+otometes1 Clin
C+em
,9?>; 32 (,): ,>2-51
Acta Bioqum Cln Latinoam 2005; 39 (4): 529-39