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Antonio Luiz Gomes Jnior

Mtodos de investigao em genotoxicidade


em ensaios pr-clnicos de novos
fitomedicamentos
Genotoxicidade
Definio: o setor da gentica que estuda os
processos que alteram a base gentica da vida (DNA),
processo este classificado de mutagnese;
A genotoxicidade uma especialidade relativamente
recente, e se situa na interface entre toxicologia e
gentica, por isso denominada, frequentemente, de
gentica toxicolgica;
(DA SILVA; ERDTMANN; HENRIQUES, 2003)
FATORES ENDGENOS
Sexo
Idade
Constituio gentica
FATORES EXGENOS
Hbitos de consumo
Alimentao
Medicamentos
Fatores qumicos
Fatores fsicos
Fatores biolgicos
MUTAES
So alteraes irreversveis que podem ocorrer tanto ao nvel gnico
quanto cromossmico (Machado-Santelli, 2003)
CNCER
MUTAO
Alterao no DNA, o qual regula todos os fenmenos da
vida;
Espontnea X Induzida
Agentes: Sinttico X Natural
Finalidade: prejudicial ou benfica?
Efeitos: -variabilidade gentica
- disfuno/morte celular
- cncer
Teste Allium
cepa:
biomarcador de
toxicidade,
citotoxicidade e
mutagenicidade
TESTE Alliumcepa
Apesar de ser um ensaio
muito usado desde os
anos 30, somente em
1985 um protocolo foi
estabelecido (Fiskesjo,
1985).
Segundo este protocolo,
o teste de Allium pode
ser feito da forma
original ou da forma
modificada.
TESTE Alliumcepa VANTAGENS
-Sensvel;
- Alto percentual de clulas em diviso;
- Cromossomos uniformizados;
- Boas correlaes com outros sistemas e testes com
mamferos e humanos;
- Indicador de toxicidade;
- Investigaes para poluentes ambientais;
- Toxicidade de compostos qumicos;
- Avaliao de propriedades anticncer;
- Avaliao de extratos vegetais para toxicidade,
citotoxicidade e mutagenicidade;
(SETHet al., 2010)
Observao de clulas
Princpio do Teste de microncleo
em Allium cepa
Os microncleos so definidos como pequenas massas
esfricas, extranucleares, constitudas de cromatina no
incorporada ao ncleo principal da clula durante as
etapas finais da mitose (Fenech, 2000);
O princpio do teste de microncleo se baseia na
exposio de tipos celulares em diviso, como as
clulas radiculares de A. cepa, a um agente de
interesse, e a quantificao da freqncia de
microncleos aps exposio.
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Avaliao da Citotoxicidade
Avaliao da Mutagenicidade: MN
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Pontes Atrasos
Cromossomos
soltos
Fragmentos
Avaliao da Mutagenicidade: AC
ALTERAES
CROMOSSMICAS EM
Allium cepa
Figura: Razes de A. cepa crescidas em
amostras de gua do rio Parnaba do
ponto 2 (vero). (A) e (B) clulas com
microncleo; (C) clula com ponte e
fragmento na anfase; (D) e (E) clulas
com atraso na anfase; (F) clula com
fragmento em anfase (CRONEMBERG
et. al., 2008)
Ficha de avaliao do
Teste Allium cepa
Fases da Mitose Aberraes cromossmicas
Foto Intrfase Prfase Metfase Anfase Telfase
N de clulas
em diviso
Atrasos Pontes Fragmentos
Cromossomos
soltos MN
1 23 10 2 2 0 14 1 1 0 0 0
2 34 13 3 0 1 17 0 0 0 0 1
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Teste Cometa:
biomarcador de
genotocixidade
Princpio do Teste Cometa
O teste cometa um mtodo sensitivo para os estudos
de danos ao DNA em clulas individualizadas (SINGH et
al., 1988; SARAN et al., 2008).
As clulas so embebidas em agarose e colocadas em
lminas, onde so lisadas com detergentes e
submetidas eletroforese, onde possvel avaliar os
danos ao DNA pela sua migrao em forma de cauda,
que so observadas ao microscpico, indicando a
freqncia de quebras e danos de bases. (Dusinska e
Collins, 2008).
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Solues utilizadas no
Teste cometa
Agarose pr-corbetura (1,5%);
Agarose Low Mekting (LMP) (0,75%);
Soluo de Lise ~ estoque;
Tampo de eletroforese;
Tampo de neutralizao;
Soluo de fixao;
Solues de colorao com nitrato de prata;
Soluo de parada;
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Protocolo do Teste
Cometa
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Teste Cometa
ndice de dano:
o Tipo de dano x n de clulas com o dano
Ex.:
100 clulas avaliadas:
o Dano 0 = 20 0 x 20 = 0
o Dano 1 = 35 1 x 35 = 35
o Dano 2 = 15 2 x 15 = 30
o Dano 3 = 23 3 x 23 = 69
o Dano 4 = 7 4 x 7 = 28
26
+
162
Teste Cometa
Frequncia de danos:
o N de clulas com dano 0 100 (total de clulas avaliadas);
Ex.:
100 clulas avaliadas:
o Dano 0 = 20
o Dano 1 = 35
o Dano 2 = 15
o Dano 3 = 23
o Dano 4 = 7
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100 - 20 = 80
Tecidos que podem seu
usados pata o TC
Clulas do Sangue;
Clulas da Medula ssea;
Clulas da Mucosa Bucal;
Clulas do Fgado;
Clulas do Rim;
Clulas do Crebro;
Clulas do Pulmo;
Espermatozoides;
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Ex. Teste Cometa
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Teste de
Microncleo:
biomarcador de
mutagenicidade
Teste de Microncleo
Os microncleos so fragmentos de DNA que so
reportados como de alto risco para o aparecimento do
cncer, em resposta a agentes genotxicos e
carcingenos
O teste de microncleos um teste citogentico que
pode ser usado como biomarcador para avaliao de
efeitos aneugnicos e clastognicos e tem sido bastante
usado para avaliar danos citogenticos em vrias
populaes do mundo (PASTOR et al., 2003).
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Teste de Microncleo
Clulas do sangue perifrico;
Clulas da Mucosa Bucal;
Clulas da Medula ssea;
Clulas do Rim;
Clulas do Figado;
Avaliao de 2.000 clulas
Teste de MN com bloqueio da citocinese (CBMN);
o Apoptose;
o Pontes;
o Amplificao gnica;
Avaliao de 1.000 clulas
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Avaliao da citotoxicidade
MN em clulas da mucosa
bucal
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CBMN
35
CBMN
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Obrigado!!!
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