Abordagem genmica comparativa

Abordagem genmica comparativa

no estudo de genes do metabolismo
no estudo de genes do metabolismo
lipdico de oleaginosas
lipdico de oleaginosas
Prof. Dr. Rogrio Margis
Centro de Biotecnologia UFRGS
Laboratrio de Genomas e Po!la"#es de Plantas
Rogerio.margis$!frgs.br
Pelotas% &' de agosto de '(&(
genes mRNAs
ESTs
transcrio
protenas
enzimas
traduo
propriedades
sementes
teor lipdico
toxidez
frutificao
porte
outros
meloramento
gen!tico
caracteres lipdios
toxinas
metab"litos
glicdios
#enoma $en"tipo
marcadores
moleculares
NE%TR&S
N'&(NE%TR&
)&*+NANTES
,&)&*+NANTES
padro de expresso
polimorfismos
famlias g-nicas
produo de mutantes
seleo
seleo
)D!rrett et al.% Plant Journal, '((*+.
Palma% so,a% brassic-ceas )canola+ e girassol% resondem or cerca de *(. do total de
leo /egetal rod!0ido no m!ndo1
*2. do total de leos /egetais e3tra4do !tili0ado ara fins aliment4cios1
&2. emregado na ind5stria de l!brificantes% tintas% l-sticos% biodiesel e o!tros
s!brod!tos.
)D6er and M!llen% Plant Physiology % '((*+
*A*&NA .Ricinus communis)

7mortante fonte de leo ara !so ind!strial1

Prod!"8o de biocomb!st4/el1

9leo:

;lta reati/idade1

Conte5do ele/ado de !m 5nico -cido gra3o )&*:& <=+1

,AN&/A .Brassica napus /. var oleifera0

>erceira oleaginosa mais rod!0ida no m!ndo1

9leo:

?le/ado conte5do de gord!ras monoinsat!radas1

Menor teor de gord!ra sat!rada de todos os leos /egetais1

S&1A .Glycine max ./02 *err0

; so,a a leg!minosa mais imortante economicamente1

Seg!nda oleaginosa mais rod!0ida no m!ndo1

9leo:

Resons-/el or '( a '2. de todas as gord!ras e leos cons!midos no

m!ndo.
Presentes na forma de leos )triacilglicerois+
rincialmente em sementes% como forma de reser/a de energia ara o embri#es
< metabolismo de li4dios em lantas% en/ol/e no m4nimo &'( rea"#es e mais de @((
genes )Arabidopsis+
Presentes na forma de leos )triacilglicerois+%
< metabolismo de li4dios em lantas% en/ol/e no m4nimo &'( rea"#es e mais de @((
genes )Arabidopsis+
Acidos gra3os s8o comonentes f!ndamentais na membrana lasm-tica e de organelas
)Fosfoli4dios+
3cidos #raxos em 4lantas
3cidos #raxos em 4lantas
Presentes na forma de leos )triacilglicerois+
rincialmente em sementes% como forma de reser/a de energia ara o embri#es

Deendente de acilBCo;1

7ndeendente de acilBCo;1
Triacilglicerol. >rCs -cidos
gra3os esterificados em !ma
molc!la de glicerol.
Rotas para Sntese de TA#s
)D6er and M!llen% Plant Physiology % '((*+
)DaEorsFi and CaGoon% Curr Opin Plant Biol% '((H+.
4rincipais 5cidos graxos
encontrados nos "leos vegetais2
Acido ricinolico &*:& <=

;inda e3iste !m /a0io significati/o no I!e se refere J comreens8o dos

rocessos biolgicos en/ol/idos na e3ress8o de genes de s4ntese de
li4dios )D6er and M!llen% '((*+.

?sfor"os ara a transferCncia de genes codificantes de rote4nas

resons-/eis ela bioss4ntese de -cidos gra3os de interesse econKmico
tem% geralmente% aresentado s!cesso limitado )SGocFe6 et al.% '((@+.
&b6etivos

7dentificar e caracteri0ar os genes en/ol/idos na bioss4ntese de >;Gs nas

sementes de oleaginosas1

7dentificar e caracteri0ar genes codificantes de fatores de transcri"8o I!e

reg!lam a s4ntese de -cidos gra3os nas sementes de oleaginosas1

?st!dar a e3ress8o dos genes en/ol/idos na bioss4ntese de >;Gs e

codificantes de fatores de transcri"8o identificados1

7dentificar genes reg!lados or microRL;s

Comarar /ias de s4ntese e reg!la"8o b!scando formas de modificar o!

otimi0ar a rod!"8o de >;Gs e deri/ados
Metodologia

Material Vegetal

Mamona: sementes de cultivares do programa de

melhoramento gentico desenvolvido pela EMBRAPA
CPACT Pelotas RS;

Soja: sementes de cultivares de soja ornecidas pela

EMBRAPA Soja !ondrina PR;

Canola: sementes de cultivares de canola ornecidas

pela EMBRAPA"TR#$% Passo &undo RS;
Sntese de 3cidos #raxos
Sntese de 3cidos #raxos
Sntese de triacilglicerois ( TA#s
Sntese de triacilglicerois ( TA#s

BL;S> )Basic Local Alignment Search Tool+:

tBL;S>31

Mscas: Arabidopsis thaliana (Plant etabolic !et"or#$1

Castor Bean %enome &atabase )castorbean.'c(i.org+1

D!as rodadas de tBL;S>3:

A. thaliana N Castor Bean %enome &atabase)

Castor Bean %enome &atabase * Castor Bean %enome &atabase)

+dentificao de #enes do *etabolismo /ipdico
AN3/+SES in silico
Redund7ncia e relao dos
Redund7ncia e relao dos
genes da sntese de TA#
genes da sntese de TA#
presentes no
presentes no
genoma da mamona
genoma da mamona

'ois e(perimentos independentes para cada gene)

* Amostras +iol,gicas para cada est-gio de desenvolvimento

de semente;

Cada amostra +iol,gica) pool de ."* sementes;

/uadruplicatas e(perimentais;

Mtodo de an-lise 0
122CT
3!iva4 e Schmittgen5 066789
8uantificao da expresso g-nica por RT(94,R
8uantificao da expresso g-nica por RT(94,R
Expresso de genes da sntese de TA#
Expresso de genes da sntese de TA#
em cinco fases do amadurecimento da semente de mamona
em cinco fases do amadurecimento da semente de mamona
Genes Genes
n8o e3ressos n8o e3ressos
em sementes em sementes
Expresso de genes da sntese de TA#
Expresso de genes da sntese de TA#
em cinco fases do amadurecimento da semente de mamona
em cinco fases do amadurecimento da semente de mamona
#enes com diferentes perfis de expresso #enes com diferentes perfis de expresso
DGAT2 Vertebrate (8)
Xenopus tropicalis AWAT1
Homo sapiens MGAT3
AWAT Vertebrate (4)
MGAT Vertebrate (8)
DGAT2 Invertebrate (2)
DGAT2 Yeast (2)
DGAT2 Fungi (6)
Chlorella DGAT2B
Chlorella DGAT2A
DGAT2 Moss (2)
DGAT2 Monocotye!on (4)
DGAT2 Eudicots (14) DGAT2 Eudicots (14)
Arachis hypogaea solubleDGAT
Arabiopsis thaliana At!AT1
"uonymus alatus "aDAcT
A"AT# Vertebrate (8)
A"AT2 Vertebrate (6)
A"AT Invertebrate (2)
A$% &ungi Asco'ycete()asi!io'ycete(*)
A$% Yeast (2)
Alternaria brassicicola A#"
DGAT# Fungi Asco'ycetes (2)
DGAT# Vertebrate (+)
DGAT# Invertebrate (2)
Chlorella sp$ DGAT1
DGAT# Moss (2)
DGAT# Monocotye!ons (4)
DGAT1 Eudicots (16) DGAT1 Eudicots (16)
Arabiopsis thaliana W!D1
%etunia petals W!D
Acinetobacter AWAT&DGAT
766
766
766
.:
;;
766
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;<
;=
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::
.<
=<
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;;
766
:=
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..
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><
*6
.<
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;0
;:
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;;
<:
:*
>.
;:
99
;;
<<
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;>
766
:.
690
Rela:es $ilogen!ticas;
Rela:es $ilogen!ticas;
)#AT<
)#AT<
)#AT=
)#AT=
)#AT<
.> domnios0
)#AT=
.= domnios0
N
N
o o
)omnios
)omnios
Trans(membrana
Trans(membrana
At,
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QO *@ &(@ &2@ *P &QH
H(* *P
H(* '&* QO *@ &(@ &2@ *P P*
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/0a
H*P
*( QH QQ @* &'& Q@ &(' &HQ Q* &P @H O2
@@
OQ &(2
O&P *( QH QQ @2 &'O &(' &HQ *' &P @H O*
@@
2(
&(2 PP
H&P *( QH QQ @* &'O &(' &HQ *' &P @H O*
@H
2O &(2 PP
*( QH QQ @* &'O &(' &HQ *' &P @H O*
@H
2O PP P2 HQQ
*( QH QQ @* &'O &(' &HQ *' &P @H O*
@H
2O &&& HP@
H(* O'(
*( QH
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&(' &HQ *'
&P
@H O* @H 2O &(2 PP
&HQ @H &(2 H(* HO' QH QQ @* &'O &(' &HQ *' &P @H O*
@H
2O
&(2 PP
*(
H(* &OQ QH QQ @* &'O &(' &HQ *' &P @H O*
@H
2O
&(' PP
*(
D
G
A
T
1
D
G
A
T
2
&rganizao g-nica; exons e introns
&rganizao g-nica; exons e introns
)#AT<
)#AT<
x
x
)#AT=
)#AT=
DGAT2 Vertebrate (8)
Xenopus tropicalis AWAT1
Homo sapiens MGAT3
AWAT Vertebrate (4)
MGAT Vertebrate (8)
DGAT2 Invertebrate (2)
DGAT2 Yeast (2)
DGAT2 Fungi (6)
Chlorella DGAT2B
Chlorella DGAT2A
DGAT2 Moss (2)
DGAT2 Monocotye!on (4)
DGAT2 Eudicots (14) DGAT2 Eudicots (14)
Arachis hypogaea solubleDGAT
Arabiopsis thaliana At!AT1
"uonymus alatus "aDAcT
A"AT# Vertebrate (8)
A"AT2 Vertebrate (6)
A"AT Invertebrate (2)
A$% &ungi Asco'ycete()asi!io'ycete(*)
A$% Yeast (2)
Alternaria brassicicola A#"
DGAT# Fungi Asco'ycetes (2)
DGAT# Vertebrate (+)
DGAT# Invertebrate (2)
Chlorella sp$ DGAT1
DGAT# Moss (2)
DGAT# Monocotye!ons (4)
DGAT1 Eudicots (16) DGAT1 Eudicots (16)
Arabiopsis thaliana W!D1
%etunia petals W!D
Acinetobacter AWAT&DGAT
766
766
766
.:
;;
766
766
;<
;=
766
::
.<
=<
:6
;;
766
:=
766
;=
;>
=>
97
..
100
><
*6
.<
;;
;0
;:
;=
;;
<:
:*
>.
;:
99
;;
<<
766
;>
766
:.
690
Rela:es $ilogen!ticas;
Rela:es $ilogen!ticas;
)#AT<
)#AT<
)#AT=
)#AT=
Arabidopsis Seeds Expressing Ea)AcT Accumulate acTA#s2
+uonymus alatus - Ea)AcT

R-rios reg!ladoresBcGa/e% I!e controlam a mat!ra"8o da semente

foram identificados em Arabidopsis thaliana% incl!indo CB,s% ABSC-S-C
AC-& -!S+!S-T-.+/ );B7H+% e FUSC;H )FUSH+.

?3istem e/idCncias de I!e esses loci odem tambm estar

en/ol/idos com a reg!la"8o do metabolismo de -cidos gra3os.
)M! et al.% Plant Physiol, '((*+.
AT+?A)&RES TRANS,R+,+&NA+S

?m A. thaliana L?C& desemenGa ael cr4tico ara o desen/ol/imento normal

do embri8o )SEong et al.% Plant Cell '((H+1

; s!ere3ress8o ind!0ida de L?C& em A. thaliana le/o! J e3ress8o

a!mentada de genes de s4ntese de -cidos gra3os com conseI!ente ac5m!lo dos
mesmos1

; s!ere3ress8o de L?C& ati/o! ectoicamente os genes FUSH% ;B7H% e

TR7&% mas n8o L?C' )M! et al.% Plant Physiol, '((*+.
/E,<
/E,< ./eaf@ cot@ledon<0
/E,< ./eaf@ cot@ledon<0
? < m!tante L?;FU C<>UL?D<L& de Arabidopsis forma embri#es defecti/os intolerantes a desseca"8o.
? ?m A. thaliana L?C& desemenGa ael cr4tico ara o desen/ol/imento normal do embri8o )SEong et al.%
'((H+
? ; s!ere3ress8o constit!ti/a de L?C& detrimental or manter lantas em estado embrion-rio
ind!0indo embri#es em tecidos ad!ltos.
35S:LEC1
/E,< e outros fatores de transcrio
/E,< e outros fatores de transcrio
? L?C& e L?C&BL s8o Gomlogos a =;PH de S. cere(isae.
? =;PH em con,!nto com =;P' e =;P2 formam fatores de transcri"8o do tio CAAT binding
0actor )CBF+ o! LUBF factors.
? <s fatores CBF oss!em ati/idade de liga"8o ao DL; como Geterotr4meros.
? ?m S. cere(isae =;P2 forma !m d4mero com =;PH I!e s!bseI!entemente interage com
=;P'.
? ?m animais e le/ed!ras os genes s8o cia 5nica.
? ?m lantas a rede de intera"8o mais comle3a de/ido a grande di/ersifica"8o de
s!b!nidades.
? ?m Arabidopsis ,- foram identificados &( genes codificando a s!b!nidade =;P' )LFBU;+%
&H ara s!b!nidade =;PH )LFBUB% incl!indo L?C&+ e &H ara s!b!nidade =;P2 )LFBUC+.
? < genoma de 1icinus communis aresenta ' genes L?C&BliFe.
?
microRL;s )miRL;+

Molc!las de RL; fita simles1

Contm de &P a '2 n!cleot4deos1

Reg!ladores sBtranscricionais da e3ress8o gCnica.

mRNA clivagem Represso da traduo
Cell 223, p.4526478, 499:.
microRNAs como controladores da
microRNAs como controladores da
expresso g-nica
expresso g-nica
E
x
c
e
s
s
o

d
e

c
o
b
r
e
E
x
c
e
s
s
o

d
e

f
e
r
r
o
4
a
r
a
9
u
a
t
E
x
c
e
s
s
o

d
e

l
u
z
Sunkar et al., !!", #$e %lant &ell '() !*'-!"*.
mRNAs
super"xido
dismutases
miRNAs
)SR, A )rougt Sensitive Root ,ontrol .#EB(<0
)TR, A )rougt Tolerant Root ,ontrol .#EB(C0
)TRT A )rougt Tolerant Root Treated .#EB(=0
)SRT A )rougt Sensitive Root Treated .#EB(D0
RS/, A Rust Sensitive /eaf ,ontrol .#EB(E0
RS/+ A Rust Sensitive /eaf +noculated .#EB(F0
RR/, A Rust Resistent /eaf ,ontrol .#EB(G0
RR/+ A Rust Resistent /eaf +noculated .#EB(H0
Soybean Smal l - RN A Soybean Smal l - RN A
Lar ge- scal e Lar ge- scal e
sequ en ci n g sequ en ci n g
Abi ot i c an d Bi ot i c Abi ot i c an d Bi ot i c
Root , Leaf an d Seed Root , Leaf an d Seed
&P 'O nt
I dent i f i cat i on of mi RN A af t er smal l RN A sequenci ng I dent i f i cat i on of mi RN A af t er smal l RN A sequenci ng
Gma-mi R1507a and i t s 7 i so-mi RN As
EI
CI
Stem(loop structure
UCUCAUUCCAUACAUCGUCUGA
UCUCAUUCCAUACAUCGUCUGAC
UCUCAUUCCAUACAUCGUCUG
UCUCAUUCCAUACAUCGUCU
UCUCAUUCCAUACAUCGUC
UCAUUCCAUACAUCGUCUGA
gma(*+R<EJGa
isoform <
isoform =
CAUUCCAUACAUCGUCUGA
CAUUCCAUACAUCGUCUGACGA
isoform C
isoform D
isoform E
isoform F
isoform G
CI
EI
G - A - UUUUC U
GUUUG CAGA GGUGUAUGGAGUGAGAGA GGGAA AGGGUA CGAU \

CAAGC GUCU CUACAUACCUUACUCUCU CCCUU UCUCAU GCUG C
A G - C U---- U
Foram encontradas 20
potenciais RIPs 1 #com $I/s
An5lise de gene t"xicos R+4S em mamona
An5lise de gene t"xicos R+4S em mamona
S%K(4R&1ET& K+&TE,N&/L#+,& S%K(4R&1ET& K+&TE,N&/L#+,&
7nstit!i"#es: 7nstit!i"#es:
Financiamento: Financiamento:
4adro de expresso de R+4s em semente .SE0 e fola .$0
An5lise de genes t"xicos R+4S e Aglutininas
E9uipe
E9uipe
%$R#S %$R#S
$ranceli BulcesMi .)0 $ranceli BulcesMi .)0
/uis $elipe ?alter de &liveira .*0 /uis $elipe ?alter de &liveira .*0
#uilerme /oss .)0 #uilerme /oss .)0
/orra@ne #omes *olina .*0 /orra@ne #omes *olina .*0
*aurcio Almero .40 *aurcio Almero .40
Rogerio *argis .40 Rogerio *argis .40
Embrapa S&1A Embrapa S&1A
$rancismar ,orrea *arcelino .40 $rancismar ,orrea *arcelino .40
Alexandre Nepomuceno .40 Alexandre Nepomuceno .40
Ricardo Abdelnoor .40 Ricardo Abdelnoor .40
%nicamp %nicamp
*arcelo ,arazzolle .40 *arcelo ,arazzolle .40
S%K4R&1ET& K+&TE,N&/L#+,&
S%K4R&1ET& K+&TE,N&/L#+,&
4R&1ET& ESTR%T%RANTE )E
4R&1ET& ESTR%T%RANTE )E
A#R&ENER#+A )& RS
A#R&ENER#+A )& RS
Rogrio Margis )Coordenador+
Giancarlo PasI!ali )PesI!isador+
M-rcia MargisBPinGeiro )PesI!isadora+
;le3andro Cagliari )Mestrando+
G!ilGerme Loss )Mestrando+
MatGe!s ?tges )7.C.+
Rera L!cia BobroEsFi )PesI!isadora+
Beatri0 =.G.RocGa )PesI!isadora+
Clarissa de So!0a Borges )Mestranda+
Cristina C. C!cGiara )Mestranda+
Patr4cia D!sto )Mestranda+
Diego >ei3eira Sil/eira )7.C.+
;manda Moreira Loes )7.C.+
Leticia RicFes )7.C.+
Srgio Delmar dos ;n,os e Sil/a )PesI!isador+
D!liana Sil/a Lem#es% )Bolsista D>7+
Do8o G!ilGerme Casagrande Dr )Bolsista D>7+
La!ra Lemons Moreira% )7.C.+
RaI!el Bart0 Sneib )7.C.+