Biotecnologa Mdica Ingeniera Biotecnolgica

Ancco Mamani Midwar Universidad Catlica de Santa Mara

EVALUACION DE LA VIABILIDAD CELULAR: METODO DE EXCLUSION DEL AZUL DE TRYPAN
Midwar R. Ancco Mamani
Facultad de Ciencias Farmacuticas, Bioqumicas y Biotecnolgicas, Programa Profesional de Ingeniera
Biotecnolgica, Universidad Catlica de Santa Mara, Urb. San Jos s/n, Yanahuara, Arequipa, Per.
e-mail: midwar.ancco@hotmail.com
Resumen
En la prctica se utiliz azul de tripn que es un colorante azoico que se utiliza en tinciones
histolgicas para ensayos de viabilidad que permiten diferenciar clulas vivas de clulas
muertas. Las clulas vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a
que la membrana celular es selectiva respecto a qu compuestos pueden atravesarla. En las
clulas viables, con membrana intacta, no se incorpora el azul de tripano; por el contrario, s
atraviesa la membrana de las clulas muertas. Por lo tanto, las clulas muertas se muestran de
un distintivo color azul bajo el microscopio empleando una cmara de Neubauer para
contarlas. Debido a que las clulas vivas excluyen al colorante y no se tien.
Palabras clave: azul de tripan, viabilidad celular, membrana, cmara de Neubauer.
Abstract
In practice trypan blue azo dye which is used in histological staining for viability assays that
distinguish live cells from dead cells are used. Live cells or tissues with intact cell membranes
are not colored because the cell membrane is selective as to which compounds can penetrate.
Viable cells have an intact membrane, trypan blue is incorporated; on the contrary, does cross
the membrane of dead cells. Hence, dead cells are shown in a distinctive blue color under a
microscope using a Neubauer counting chamber. Since living cells exclude the dye and not
dyed.
Keywords: trypan blue, cell viability, membrane Neubauer chamber.














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INTRODUCCION

El azul trypan es un colorante azoico que se utiliza en tinciones histolgicas para ensayos
de viabilidad que permiten diferenciar clulas vivas de clulas muertas.



Las clulas vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se colorean debido a que la
membrana celular es selectiva respecto a qu compuestos pueden atravesarla.

En las clulas viables, con membrana intacta, no se incorpora el azul de tripano; por el
contrario, s atraviesa la membrana de las clulas muertas. Por lo tanto, las clulas
muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio (tpicamente,
empleando una cmara de Newbauer para contarlas).3 Debido a que las clulas vivas
excluyen al colorante y no se tien, este mtodo tambin se llama mtodo de tincin por
exclusin.

El azul de trypan se usa comnmente en microscopa (para el recuento de clulas) y en
ratones de laboratorio para la evaluacin de la viabilidad de tejidos. El mtodo no puede
distinguir entre clulas necrticas y clulas muertas por apoptosis.

1.1. Colorantes

Un colorante es un cuerpo coloreado que puede comunicar su color a otro cuerpo.
Segn su origen pueden ser:
Naturales
Sintticos o Artificiales
Segn sus propiedades qumicas:
cidos
Bsicos
Neutros
Indiferentes

1.2. Ventajas de colorantes

Facilita la identificacin de clulas, bacterias o en general de objetos
microscpicos.
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Los colorantes tien de forma parcial, total o gradual las diferentes estructuras
que integran los objetos y principalmente los productos que se desean observar.

1.3. Desventajas de colorantes

Despus de su empleo difcilmente se puede utilizar sobre las preparaciones
teidas otro colorante, en consecuencia, despus de emplear las tinciones se ha
modificado las propiedades fisicoqumicas del contenido de la preparacin ya que
el empleo de colorantes est basado en caractersticas fsicas y qumicas.

1.4. Tipos de coloraciones:

Directas: se producen por inmersin en el bao colorante.
Indirectas: en este tipo de coloracin, el colorante no puede actuar directamente,
el objeto que ha de colorearse debe ser tratado de antemano por otra sustancia
que lo prepare para admitir el colorante, esta se llama mordiente.




II. OBJETIVOS

Evaluar la viabilidad de una suspensin celular.
Determinar el nmero de clulas viables en una suspensin celular.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

- PBS
- Azul de Trypan (0.2%)
- Suspensin Celular
- Micropipetas 0 - 20l 200 - 100l
- Microscopio
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- Cmara de Newbauer (hemocitometro)

IV. PROCEDIMIENTO

1. Se centrifugo una alcuota de una suspensin celular de la cual se desea determinar
la viabilidad durante 2 minutos a 4000 rpm y luego se descarto el sobrenadante.
2. Se resuspendi el pellet en 1ml de PBS o medio de cultivo libre de suero.
3. Se mezclo 1 parte de la suspensin celular (diluida en PBS) con una parte del azul de
trypan (0.4%). Se incubo la mezcla por 3 minutos a temperatura ambiente.
4. Se aplico una gota de la mezcla clulas azul trypan en una cmara de Newbauer. Se
coloco el hemocitometro en la platina del microscopio y se enfoco las clulas con el
objetivo de 40x.
5. Se contaron las clulas viables (no teidas) y las clulas no viables (teidas).

V. RESULTADOS

1. Haga los clculos para determinar el nmero de clulas por ml

- Se contabilizaron 836560 cel/ml

2. Determinar el porcentaje de viabilidad celular

()




- Se obtuvo un 92.78% de clulas viables

VI. CUESTIONARIO
1. Cul es el fundamento del Mtodo de Exclusin del Azul de Trypan?
- El azul de trypan es un colorante utilizado para el recuento de clulas ntegras por
exclusin de dicho colorante.
Este mtodo est basado en que las clulas vivas (viables) no captan el azul de trypan
mientras que las clulas muertas (no viables) si lo hacen. Se cuentan como muertas
las clulas teidas de azul y como vivas las refringentes.
2. Por qu se debe evitar utilizar un medio de cultivo con suero, en la evaluacin de la
viabilidad celular por el mtodo de azul de trypan?
- Esto se debe a que el azul de trypan tiene alta afinidad por las protenas.


3. Cules serian las ventajas y desventajas del mtodo de exclusin del azul de trypan?
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- Ventajas
Permite obtener informacin del dao inducido a clulas aisladas.
No es necesario trabajar con clulas en proliferacin.
Fcil aplicacin (en cualquier tipo celular).
Puede aplicarse en estudios tanto in vitro con in vivo.
Alta sensibilidad (detecta muy bajos niveles de dao al ADN)
Se requieren bajas cantidades de clulas (<200000).
Relativamente poco tiempo para la obtencin de resultados.

- Desventajas
Despus de su empleo difcilmente se puede utilizar sobre las preparaciones
teidas otro colorante.
Despus de emplear las tinciones se ha modificado las propiedades fisicoqumicas
del contenido de la preparacin ya que el empleo de colorantes est basado en
caractersticas fsicas y qumicas.
4. Qu otros colorantes se puede usar en la determinacin de la viabilidad celular?
- Existen cinco mtodos principales para determinar la viabilidad celular. Tres se basan
en la exclusin de pigmentos por las clulas vivas y se pueden evaluar con el
microscopio ptico. Los pigmentos utilizados son el azul de trypan, la eosina y la
nigrosina (las clulas muertas aparecen teidas de azul, rojo o negro;
respectivamente). Los otros dos mtodos se basan en el acetato de fluorescena y el
naranja de acridina/bromuro de etidio y se valoran con un microscopio de
fluorescencia o por citofluorometria de flujo. Solo las clulas vivas hidrolizan el
acetato de fluorescena produciendo una fluorescencia verde. La acridina tie las
clulas vivas de verde mientras que el bromuro de etidio solo impregna las clulas
muertas que aparecen rojas a la fluorescencia.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

- http://www.ataonline.org.ar/stop/pdf/7c_fsimoniello.pdf
- http://www2.uah.es/tejedor_bio/bioquimica_ambiental/guion-citotoxicidad.pdf
- http://worldwidescience.org/topicpages/multi/ES/t/trypan+blue.html
- http://docencia.izt.uam.mx/sgpe/files/users/uami/lebo/6Cultivo-
celular_ColorantesFluorescentesEnsayos.pdf
- http://books.google.com.pe/books?id=p2BmCezyycsC&pg=PA32&lpg=PA32&dq=met
odo+de+exclusion+del+azul+de+tripan&source=bl&ots=QHXlfoekFC&sig=DS0xl_btL9
7HZ3MPUZSkL7GByJw&hl=es&sa=X&ei=-
o3GUZWYA4354AO2r4GgCA&ved=0CFQQ6AEwBQ#v=onepage&q=metodo%20de%2
0exclusion%20del%20azul%20de%20tripan&f=false
- http://www.slideshare.net/medicinac/tcnicas-de-tincin