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Mestrado Integrado em Cincias Farmacuticas

2. Ano / 1. Semestre
2014/2015

Introduo anlise quantitativa por


Espectrofotometria do UV-visvel:

*
*

Lei de Beer
Curvas de Calibrao

*
2

*
* A absoro de radiao ultravioleta (UV) ou luz visvel
(VIS) por compostos orgnicos ocorre atravs da
excitao de um eletro de uma orbital molecular
ligante ou no-ligante para uma orbital molecular
antiligante.

requer uma energia de excitao substancial,


comparvel com a fora de uma ligao qumica.

* Todos os compostos orgnicos absorvem a luz UV


*

mas poucos espectrmetros comerciais podem


efetivamente varrer os comprimentos de onda onde as
ligaes C-H, C-C e C=C (no conjugadas) absorvem,
devido interferncia da forte absoro UV pelas
molculas O2 e CO2 da atmosfera.

*
* As

transies eletrnicas teis na espectroscopia


de UV envolve a absoro de radiao entre
comprimentos de onda de 200 e 400 nanmetros
(nm) ou 200-40010-9 metros.
* Na espectroscopia visvel a radiao utilizada
est entre 400 e 800 nm.

* Em

ambos os casos , um eletro de uma orbital


ligante ou de uma orbital n no-ligantes excitado
para uma orbital * antiligante.

* Consideram-se

as transies -* e n-*, de
compostos orgnicos conjugados, pois so as
transies eletrnicas com maior probabilidade de
ocorrer na regio de 200-800 nm .
4

Os compostos conjugados podem


ter um ou mais pares de ligaes
duplas alternados ou ento uma
ligao dupla conjugada com um
par de eletres no ligantes num
heterotomo, tal como oxignio,
azoto ou halognio.

*
Espectrometria - conjunto de recursos que nos permite identificar a
estrutura das partculas que constituem as substncias.

* Os equipamentos funcionam a partir de feixes de onda eletromagntica


incidentes sobre uma amostra do composto que absorve energia em
determinados comprimentos de onda.

* Os

valores da energia e dos comprimentos de onda absorvidos so


detetados no aparelho e transformados num grfico, no computador.

* A partir da anlise desse grfico possvel determinar


*
*
*
*
*

estrutura de molculas
os tipos de elementos presentes num composto
a quantidade de cada um deles
a posio tridimensional de cada tomo
e muito mais
5

*
Espetros UV e visvel - grficos de absorvncia (A) em funo do comprimento de onda, em
nanmetros.

A absorvncia est relacionada com a concentrao atravs da lei de Lambert-Berr:

onde
I0 intensidade da luz incidente
I intensidade da luz transmitida
coeficiente de extino molar em M-1cm-1
l comprimento da clula em centmetros
c concentrao da amostra em mol/L (M)

Muito importante a
proporcionalidade entre
a
absoro
e
a
concentrao linear
ao longo de uma ampla
gama de concentraes,
o
que
torna
a
espectroscopia UV/Vis
ideal
para
a
determinao
da
concentrao de um
determinado composto.
Os valores de , o
coeficiente de extino
molar, podem variar de
10 a mais do que 105.
Assim,
alguns
cromforos, os grupos
funcionais
orgnicos
que absorvem radiao
UV ou luz visvel,
podem absorver mais
eficientemente do que
outros, com fatores de
104 ou superiores.

*
Lei de Planck - relao
entre a variao de
energia
(E)
e
a
frequncia da radiao
absorvida
onde

A variao da energia inversamente proporcional ao


comprimento de onda da luz absorvida
quanto menor for a diferena maior o comprimento
de onda da luz
As variaes de energia (E) correspondem s transies
eletrnicas que ocorrem quando a radiao UV absorvida
so muito maiores para as transies -* do que paras
as transies n-*
As transies -* ocorrem em comprimentos de onda mais
baixos do que as transies n-*.

h constante de Planck (6,62610-34


J.s)
frequncia
c velocidade da luz (299 792
458 m/s)
comprimento de onda
7

*
* Transio eletrnica ocorre muito mais rapidamente do

que o tempo necessrio para que uma molcula para


vibrar ou rodar .

A excitao eletrnica ocorre a partir de uma gama de


nveis de energia vibracional e rotacional .

* Quando

a radiao UV interage com uma vasta


populao de molculas, que tm uma variedade de
estados de vibrao e rotao, absorvida numa vasta
gama de comprimentos de onda.

Em geral, a radiao de UV e visvel absorvida em


bandas de absoro em vez de valores de comprimentos
de onda discretos. As bandas de absoro, muitas vezes
tm uma largura de 10 nm ou mais.

O comprimento de onda de uma banda de absoro de


radiao UV dado por max, o comprimento de onda de
absoro mxima .
8

*
Espetro UV de 4-metil-3-penten-2ona em etanol

* A transio -* no mximo 236 nm


tem um coeficiente de extino
molar de 12.800

* A transio n-*no mximo 311 nm


tem uma um coeficiente de
extino molar valor de apenas 59

*
*A

intensidade das transies -*


virtualmente sempre maior do que a
intensidade de transies n-*.

* As

absorvncias n-* so muito mais


fracas, devido orientao espacial
desfavorvel das orbitais contendo
eletres no ligantes em relao
rbitais,
* no permite uma sobreposio
substancial entre uma orbital noligantes e a orbital .
Na mecnica quntica, as transies -*
so "permitidas" e as transies n-* so
proibidas ".
10

11

*
* O etileno tem 2 orbitais
* 1,3-butadieno tem 4 orbitais
* 2 orbitais ligantes
* 2 orbitais * antiligantes

*A

variao de energia entre a energia mais


elevada da orbital do 1,3-butadieno e a energia
mais baixo da orbital * muito menor do que a
diferena correspondente para os orbitais de
etileno.

* A diferena de

energia produz um deslocamento


max de 171 nm, para o etileno, para 217 nm,
para o butadieno.
12

O diagrama de orbital molecular


mostra porque os compostos
orgnicos conjugados absorvem a
radiao UV com comprimentos
de onda maiores do que os
compostos no conjugados.

*
* Quando

uma molcula contm um


anel de benzeno, com um total de 6
orbitais e *, pode ocorrer um
determinado nmero de transies
eletrnicas envolvendo mudanas de
energia semelhantes.
Figura 24.2 mostra a
complexidade do espectro
de UV de tolueno (C6H5CH3)
na regio de 240-265 nm.
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Figura 24.3 mostra o espectro visvel da clorofila a, que tem dois


picos principais de absoro, uma na regio de 430 nm (violeta) e
o outro em torno de 660 nm (vermelho); os valores exatos de max
dependem do solvente em que a clorofila dissolvida.

Existe uma relao complementar entre a cor de um composto


e a cor (ou comprimentos de onda) da luz que absorve.
As ondas de luz verde que no so absorvidas de forma eficaz pela
clorofila so refletidas de volta para os nossos olhos.

Os compostos que absorvem a


luz visvel so corados

* Os

compostos orgnicos com


oito ou mais ligaes duplas
conjugadas absorver na regio
do visvel (400-800 nm).

* Um

exemplo a clorofila, o
principal fotorecetor presente
na maioria das plantas verdes.

14

*
A roda das cores e a cor de compostos
* Por exemplo, -caroteno, o composto
que d cor s cenouras, tem uma
absoro intensa na poro azul
esverdeado do espectro visvel.

* Atravs

da roda de cores possvel


prever
que
-caroteno
reflete
(transmisso) a cor do lado oposto da
roda, isto , vermelho-laranja.

15

*
Principais classes de espetrofotmetros UV / VIS:

*
*

dispersivos
de dodos

* A fonte de luz em ambos os espectrmetros dispersivos e


de dodos,

lmpada de descarga de deutrio (D2), utilizado para a


regio do espectro entre 190-350 nm

lmpada de filamento de tungstnio-halognio, usado


para a regio do espectro entre 330-800 nm

Na lmpada de deutrio, uma descarga eltrica passa


atravs de D2, que est sob presso, o gs excitado e
emitida radiao UV contnua .

Espectrofotmetros UV / VIS esto equipados com lmpadas


de deutrio e tungstnio, que podem ser ambas ligadas ou
no
16

*
* Modelos de instrumentais para espectrmetros UV
dispersivos

* espelhos, fendas e detetores


*

mono feixe ou duplo feixe duplo

* A luz passa atravs de um monocromador, que

separa a luz em estreitas faixas de frequncias.


* Num espectrmetro duplo feixe, depois de passar
atravs do monocromador, a radiao dividida
em dois feixes e , em seguida, dirigida para os
espelhos atravs de clulas da amostra e de
referncia .

* Os dois feixes so recombinados no final do

percurso tico.
* Instrumentos de duplo feixe pode compensar as
flutuaes na sada radiante da fonte de luz.
* Funcionam bem para a gravao contnua de
espectros.
17

*
* Detetores para espectrmetros dispersivos UV / VIS:
*

fotoclulas

fotomultiplicadores

Aphotocell o tipo mais simples de detetor, tem uma


superfcie de metal que sensvel luz , e quando a
radiao atinge, os eletres so ejetados e pode ser
convertido num sinal .
Spectronic 20 um instrumento de feixe nico com uma
lmpada de tungstnio e um detetor de fotoclula.
Quando a radiao atinge uma superfcie de metal
fotoreativo num tubo fotomultiplicador, os eletres so
ejetados e direcionados para os eltrodos de carga
positiva, designados por dnodos, que provocam a emisso
de mais de eletres. Este processo em cascata pode ser
repetido vrias vezes, e pode levar a um grande aumento
na sensibilidade, at 109 eletres por fotes de radiao
que atingir o detetor.
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As concentraes das amostras


obtidas a partir de medies
de UV em espectrmetros
dispersivos so muitas vezes
mais precisa quando so
obtidos no comprimento de
onda
do
mximo
de
absorvncia.
A variao de absorvncia
relativamente concentrao
maior no max.

*
Espectrmetros de dodos:

*
*
*
*
*
*
*

no usam monocromador para o varrimento da


radiao antes de passar atravs da clula de amostra.
toda a luz que passa atravs da amostra
instrumentos de feixe nico,
usam uma rede de difrao para dispersar os
diferentes comprimentos de onda de luz aps a
passagem de luz atravs da amostra.
todos os comprimentos de onda so detetados
simultaneamente num agrupamento linear de dodos
fotoreativos.
um potencial eltrico em cada um dos elementos de
dodo pode ser convertido num sinal digital.
Normalmente, um detetor de dodos, tem 1000-2000
elementos, e cada elemento abrange uma regio
pequena do comprimento de onda do espectro de
UV/VIS.

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*
Espectroscopia UV / VIS
* concentraes de 10- 4-10- 5 M com boa preciso.
* Erros relativos so ~ 1-3%

com precaues, que pode ser reduzido a poucos dcimos de um por cento. para obter

Para obter resultados quantitativos precisos:


* vital ter cuidado na preparao da amostra
* As amostras devem ser precisamente pesados em balana analtica e as medies de volume em
bales volumtricos.
* As diluies so feitas atravs da remoo de alquotas com pipetas volumtricas e diluindo em
bales volumtricos separados.
Depois de preparar a soluo da amostra:
* Consultar os procedimentos operacionais especficos para o espectrmetro UV/VIS
* traar um espectro completo, a fim de determinar os comprimentos de onda de mxima de absoro

20

*
*

importante preparar um conjunto de padres de


calibrao para garantir que as concentraes dos
compostos esto de acordo com a lei de LambertBeer.

* As

calibraes deve ser realizadas sob condies em


que a medida de absorvncia inferior a 1,0 e,
definitivamente, no maior do que A=2.0

A absortividade molar () Deve ser determinada


experimentalmente usando um determinado solvente.

A melhor preciso obtida com solues diludas,


com concentraes inferiores a 0,01 M.

21

*
*

Calibrao o conjunto de operaes que estabelece, sob condies


especificadas, a relao entre os valores indicados por um
instrumento de medio ou sistemas de medio ou valores
representados por uma medida materializada ou material de
referncia, e os valores correspondentes das grandezas estabelecidas
por padres.

Para muitos tipos de anlises qumicas, a resposta para o procedimento


analtico deve ser avaliado para quantidades conhecidas de constituintes
(designados padres), de forma que a resposta para uma quantidade
desconhecida possa ser interpretada.
* 1. Curva de calibrao externa ou curva analtica
* 2. Curva de adio de padro
* 3. Padro interno
22

*
Mtodo do padro externo
* Quando se usam mtodos instrumentais,
necessrio calibrar, frequentemente, os
instrumentos usando uma srie de amostras
(padres), cada uma numa concentrao
diferente e conhecida do analito - CURVA
DE CALIBRAO EXTERNA

* Procedimentos
de calibrao:

estatsticos aplicados curva

a) Verificar se o grfico linear ou no


b) Encontrar a melhor reta (ou melhor curva)
que passa pelos pontos.

23

Quanto mais prximo de 1, maior


a probabilidade de que exista uma
relao linear entre as variveis x e
y.
Valores de R2 que tendem a zero
indicam que x e y no esto
linearmente correlacionados

Mtodo da adio de padro adies de quantidades conhecidas do


analito na amostra (spiking)
* Elimina ou minimiza interferncias
introduzidas
pela
matriz
de
amostras complexas
* A matriz permanece quase
inalterada aps cada adio, a nica
diferena concentrao do
analito.
24

25

*
Mtodo do padro interno

* Adio

de quantidade conhecida de
elemento de referncia nos padres e
na amostra

* Correo

das
variaes no sinal
analtico devido a mudanas nas
condies de anlise.

26

27

*
* Os

solventes utilizados na
preparao de solues a serem
analisadas devem ser de grau
espectral

* Pequenas

quantidades
de
impurezas orgnicas que tm
elevadas absortividades molares
podem
interferir
com
os
resultados
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*
Solventes polares

* Estabilizam

orbitais * antiligantes mais do que as


orbitais de estados fundamentais

*
*

A variao de energia das transies - * reduzida


max passa para um comprimento de onda maior

* Promovem

um efeito oposto nas transies n- *


devido s pontes de hidrognio

*
*
*

Os nveis de energia dos eletres n so mais


estabilizados por pontes de hidrognio do que os das
orbitais *
A diferena entre o n e * torna-se maior
max ocorre num comprimento de onda mais baixo,
devido s pontes de hidrognio .

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Efeito do solvente nas mudanas de


max para as transies * e n-

*
Comprimentos de
solventes padro UV

onda

de

abaixo
destes
comprimentos de onda a
absoro
do
solvente
interfere com as medies.

Por exemplo, ciclo-hexano


pode ser usado como um
solvente de 400 nm at 210
nm,
enquanto
que
o
diclorometano no til
abaixo 235 nm.

30

*
Clulas para a regio UV

vidro de quartzo ou slica fundida e so de 1,0 cm2

transparente acima de 200 nm e requerem cerca de 3 ml de


soluo

*
*
*
*
*

Clulas limpas so cruciais. Antes de utilizar clulas com as


amostras , eles devem ser enxaguados vrias vezes com solvente e
verificados para a absoro . Impresses digitais ou gorduras nas
superfcies de clulas transparentes devem ser evitadas.
Clulas UV nunca deve ser secas num forno , pois podem deformar
com o calor.
no se deve utilizar solues de bases fortes , uma vez que estes
podem danificar as clulas.
Aps o espectro foi obtido , clulas de quartzo devem ser
removidas e lavadas imediatamente repetidas vezes
Aps a lavagem , as clulas devem ser colocadas de cabea para
baixo para secar sobre um pano limpo ou tecido
31

*
Clulas para a regio visvel
* Clulas acrlicas descartveis
* Abaixo de 300 nm estas clulas
descartveis absorvem e deixam de ser
uteis.

Se o espectrofotmetro for de feixe duplo


* as clulas de referncia e de amostra
devem ser um par correspondente, o
que permite a eliminao de qualquer
pequena absoro por parte do
solvente e da clula, de modo a que
no interfiram com as medies
espectrais.
32

*
Principais fontes de erros que surgem na preparao da amostra e no uso incorreto do espectrmetro de UV/VIS

Clulas sujas
* clulas com vestgios de substncias que absorvem radiao ultravioleta nas superfcies (ex.: gorduras e impresses
digitais)

Solventes impuros
* solventes que no so de qualidade espectral ou se vidraria volumtrica encontra-se sujo sero obtidos espectros de m
qualidade

Lei de Lambert-Beer com fraca linearidade


* A no-linearidade ser provavelmente causado pelo uso de uma concentrao acima de 0,01 M
* A relao entre a absorvncia e a concentrao pode tornar-se no linear se a absorvncia medida demasiado elevada,
superior a A= 1,0-2,0.

Absortividade molar no coincidente com o valor publicado


* O valor exato para a absortividade molar pode depender de um nmero de fatores ambientais, incluindo o solvente
utilizado, a temperatura, e outras substncias que podem tambm estar presentes na soluo da amostra.

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Fluorescncia e Fosforescncia moleculares

Muitos sistemas qumicos podem ser excitados pela radiao eletromagntica


e reemitir ao mesmo ou a outro comprimento de onda.
Estes sistemas denominam-se:

Fluorescentes
LUMINESCENTES
Fosforescentes

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Os processos de fluorescncia e fosforescncia so produzidos de maneira


diferente:
A emisso por fluorescncia cessa quando se d a interrupo da radiao
incidente.
A emisso por fosforescncia ainda se mantm, durante um curto intervalo de
tempo, depois da radiao incidente ter sido interrompida.
A radiao emitida pode situar-se na zona do visvel, ultravioleta ou noutras
gamas mais energticas do espectro eletromagntico.
Quanto maior a absoro por parte de uma molcula, maior a
intensidade da fluorescncia
A anlise fluorimtrica extremamente sensvel e usada bastante pelos
Bioqumicos, Qumicos Clnicos e Qumicos Analticos
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37

Estados excitados de singlete e triplete

38

O que acontece energia absorvida?

S0-estado fundamental
eletrnico
S1-Estado excitado de
singleto de mais baixa
energia
T1-Estado excitado de
tripleto de mais baixa
energia
A -absoro
F -Fluorescncia
P -Fosforescncia
IC - Converso interna
ISC - Converso
intersistemas
R - Relaxao vibracional

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Fluorescncia: emisso de um foto causada pela transio entre estados


com o mesmo nmero quntico de spin: S1 S0
Fosforescncia: emisso de um foto causada pela transio entre estados
com diferente nmero quntico de spin: T1 S0
Converso interna: Transio entre estados com o mesmo nmero quntico
de spin, acompanhada de libertao de calor.
Converso intersistemas: Transio entre estados com diferente nmero
quntico de spin, acompanhada de libertao de calor.
A absoro ocorre tipicamente em 10-15 s, enquanto a relaxao vibracional
acontece na escala de tempo entre 10-11 e 10-10 s.
A converso interna entre estados eletrnicos diferentes tambm muito
vida para a fluorescncia encontramrpida (10-12 s), ao passo que os tempos de
41
-10
-5
se tipicamente entre 10 e 10 s.

A estrutura qumica e a fluorescncia


Em princpio qualquer molcula que absorva no ultravioleta pode fluorescer
Exemplos:
Compostos aromticos e heterocclicos
Compostos com ligaes duplas conjugadas

Grupos Inibidores da fluorescncia:

Grupos que aumentam a fluorescncia:


-OH

-NO2

-NH2

-COOH

-OCH3

-CH2COOH
-Br
-I
42

Intervalo entre o mximo da primeira banda de absoro e o mximo de


43
fluorescncia - desvio de Stokes.

44

Determinaes Quantitativas
A intensidade da fluorescncia proporcional intensidade da fonte
Para concentraes baixas de analito (ordem de grandeza dos ppb):
a intensidade de Luminescncia (fluorescncia, fosforescncia) torna-se
diretamente proporcional concentrao do analito
I = k P0 c
I - intensidade de luminescncia
P0 - potncia da radiao incidente
c - Concentrao do analito
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46

*
* Calcule

o nmero de onda de um feixe de radiao


infravermelha de comprimento de onda de 5,00 m.
2000 cm-1

* Calcule

a energia em joules de um fotes da radiao


descrita na alnea anterior.
E= 3,98x10-20 J

*
*Uma

soluo 7,25x10-5 mol.L-1 de permanganato de


potssio apresenta uma transmitncia de 44,1% quando
medida em uma clula de 2,10 cm no comprimento de
onda de 525 nm.
Calcule:
(a) a absorvncia dessa soluo
(b) a absortividade molar do KMnO4