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El laboratorio de microbiologa

Los laboratorios son edificados especialmente diseados, para la


realizacin de experimentos, investigaciones cientficas o el anlisis de
diferentes muestras, as como, para la produccin de medicamentos,
reactivos o la obtencin de productos biolgicos.

Normas generales de uso del laboratorio


Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas
normas elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad:
1. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente el guin para
adquirir una idea clara de su objetivo, fundamento y tcnica. (Los
resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente apenas se
conozcan).
2. Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y
quemaduras, deben comunicarse inmediatamente al Instructor.
3. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de
laboratorio. En consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a
limpiar cuidadosamente el material que se ha utilizado. Cada grupo de
prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material.
4. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse
alejados de las llamas de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas se
debe tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.
5. Cuando no se utilizan los mecheros, stos deben guardarse y se debe
estar seguro que se les ha apagado al final de cada laboratorio.
6. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para
asegurarse de que es el que se necesita y de los posibles riesgos de su
manipulacin.

7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y


microscopios, deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar
sus mecanismos.
8. Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con
microorganismos (como pipetas usadas, placas petri o tubos), deben
colocarse en bolsas de autoclave preparadas para tal efecto y proceder
posteriormente a su esterilizacin. Las pipetas Pasteur de cristal y los cubres
y portas usados se colocarn en un recipiente especial para vidrio.
9. Usar siempre bata en el laboratorio.
10. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
11. Lavarse las manos con jabn o con un desinfectante si es necesario,
antes de dejar el laboratorio.

Trabajo En Condiciones Estriles Y Manipulacin De Microorganismos

El trabajo con microorganismos no se realiza con clulas aisladas,


sino con poblaciones extensas y homogneas del microorganismo a estudiar,
por lo que el microbilogo utiliza tcnicas que permiten obtener un cultivo
puro, y luego cultivar a gran escala dicho microorganismo. Importancia de:
- La esterilizacin del material de trabajo (asas de siembra, medios de
cultivo, frascos de toma de muestras, etc.)
- El mantenimiento de un ambiente estril (mechero bunsen,
campanas de flujo laminar) para la manipulacin de microorganismos.

Fig. 1 ESTERILIZACIN DE ASAS DE SIEMBRA

Aspectos bsicos para toma de muestras e inoculacin o siembra de


microorganismos
Fig. 2 Siembra por extensin

Medios de cultivo
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables
para el crecimiento de los microorganismos.
Composicin de un medio de cultivo:
- componentes indispensables: agua, nutrientes orgnicos (hidratos de
carbono, aminocidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgnicos ( P, e, N, Mg,
S, etc.)
- componentes alternativos: isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agaragar), tampones, indicadores de pH, etc.
Tipos de medios de cultivo:
En funcin de su consistencia:
- medios lquidos
- medios slidos (en tubo, en placa)
- medios semislidos

En funcin de su composicin:
- medios complejos (caldo ordinario, extracto de levadura)
- medios sintticos

Existen medios de cultivo cuya composicin permite el crecimiento de


una gran diversidad de microorganismos (agar nutritivo, caldo ordinario).
Otros en cambio, se utilizan para la seleccin de determinados grupos de
organismos, o se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas
fisiolgicas o test bioqumicos.
- medios selectivos
- enriquecimientos
- medios para test bioqumicos (utilizacin de citratos, acidificacin a partir de
azcares, etc.).

Fig. 3 Medios selectivos

Preparacin y esterilizacin de medios de cultivo

Preparacin de un medio de cultivo:


- Pesar y disolver los componentes en el medio en el volumen indicado de
agua destilada

- Ajustar el pH del medio, si procede


- Para la preparacin de medios slidos se adiciona agar-agar como agente
solidificante. Para asegurar la completa disolucin del agar, el medio se
calienta hasta ebullicin al mismo tiempo que se somete a agitacin
previamente a su esterilizacin en el autoclave.

Esterilizacin de medios de cultivo:


Una vez preparado el medio, ste se debe esterilizar lo antes posible para
evitar el crecimiento de microorganismos:
- Medios slidos en placa - tapar el matraz con tapn de algodn graso y
cubrir con papel de aluminio para llevar a esterilizar en el autoclave (121 C,
15-20 min). Una vez estril repartir el medio en placas de Petri estriles y
dejar en reposo para su solidificacin.

Fig. 4 Tcnica de Esterilizacin

Medios slidos en tubo (agar inclinado)


- tras la ebullicin del medio con agar, ste se reparte en los tubos de cristal,
de forma que queden llenos hasta aproximadamente la mitad. Los tubos se
cubren con tapn (de aluminio), etc.). Para llevar a autoclavar. Una vez
esterilizado, los tubos se disponen en posicin inclinada para su
solidificacin.

- Medios lquidos una vez disueltos los componentes del medio en el


matraz, repartir en su caso en tubos a razn de 2-4 ml por tubo, cubrir con
tapn y llevar a esterilizar en el autoclave.
Alternativamente,

se

puede

esterilizar

el

medio

en

el

matraz,

posteriormente repartirlo con la ayuda de pipetas estriles en tubos de


plstico estriles.
- Medios semislidos se preparan con concentraciones inferiores de agente
solidificante (agaragar). El medio se reparte en tubos. En caso de desear
proporcionar condiciones anaerbicas, existen diversas metodologas para
ello. Los medios semislidos se utilizan para el crecimiento bacteriano a lo
largo del tubo. Los niveles de difusin de oxgeno en las distintas capas
condicionar el crecimiento de distintos tipos de microorganismos (aerobios,
anaerobios).

Mtodos de esterilizacin:
- Agentes fsicos
a) Calor
- Calor seco: flameado, aire caliente (horno Pasteur)
- Calor hmedo: vapor saturado (AUTOCLAVE). En el autoclave la
esterilizacin se produce mediante vapor de agua a presin. En el autoclave
se alcanza una temperatura de 121 C a una presin de 1 atmsfera sobre la
presin ambiental.
Fig. 5 curva de esterilizacin

b) Filtracin: permite la eliminacin de los microorganismos de un medio


lquido, sin la destruccin de estos. Para ello se hace pasar la muestra
lquida a travs de un filtro de membrana con tamao de poro inferior al
tamao de los microorganismos (0,2-0,45 micras). Los microorganismos
quedarn retenidos en el filtro y el fluido obtenido tras la filtracin estar
estril.
c) Radiaciones:
- Rayos gamma -. Radiaciones ionizantes
- Rayos Ultravioleta de escasa penetracin y de utilidad para eliminacin
de microorganismos de superficies.
d) Agentes qumicos: para esterilizar material (generalmente algunos tipos de
plstico) que son termolbiles. Como el xido de etileno y glutaldehdo.
e) Otros mtodos de eliminacin, si bien parcial, de microorganismos:
- calor: ebullicin, pasteurizacin, tindalizacin
- agentes qumicos: desinfectantes, antispticos

Aislamiento y Recuento de Bacterias

Tcnicas de aislamiento para la obtencin de cultivos puros:

A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de


bacterias, a travs de la obtencin de colonias aisladas. Cada colonia
representa una poblacin de microorganismos procedentes de una sola
clula, a partir de la cual se posee la seguridad de obtener dicho cultivo puro
de un solo tipo de microorganismo. Para ello se utilizan diferentes tcnicas
de aislamiento, basadas en diluir la muestra inicial para obtener colonias
aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener
haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las
clulas en glicerol (10-30%) a -70 C, en Nitrgeno lquido a -173 C, o
mediante liofilizacin.

- Agotamiento. Para obtener colonias aisladas por la tcnica del agotamiento


la muestra se extiende sobre la superficie segn se indica en la figura, de
forma que al final de dicha siembra por agotamiento, la cantidad de inculo
se espera sea lo suficientemente bajo como para que se depositen clulas
aisladas y distanciadas en la superficie del agar a partir de las cuales surjan,
tras incubar, colonias aisladas.
- Estras escocesas. Se procede de forma similar al caso anterior, en lo que
se respecta al mtodo general para la siembra en placa y permite tambin
obtener colonias aisladas.

Fig. 6 MANIPULACIN DE MICROORGANISMOS. Aislamiento en estra

2
3

ESTRAS POR AGOTAMIENTO

ESTRAS ESCOCESAS

Tcnica se aislamiento y recuento. Banco de diluciones.

Tcnica que consiste en obtener una suspensin de la mezcla de


microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa
Petri hasta conseguir colonias aisladas. Se debe trabajar, como siempre, en
condiciones estriles, flameando la boca de los tubos antes y despus de
introducir la pipeta, en las proximidades del mechero. Tras incubar se podrn
obtener colonias aisladas. El recuento de estas colonias permitir conocer el
nmero de clulas existentes en el cultivo original.

Fig. 7 DILUCIONES SERIADAS

Ci = N x D x 10
Ci = Concentracin inicial (unidades: nmero de clulas / ml)
N = n de colonias
D = dilucin

Mtodos de Recuento y Medida del Crecimiento Bacteriano

Contaje directo en cmara de recuentos


Se basa en el recuento directo del nmero de clulas en un volumen
determinado, prefijado en la cmara de recuento, mediante su observacin al
microscopio. El mtodo no permite distinguir entre clulas viables y no
viables.
Fig. 7 CMARA DE RECUENTOS

Medicin de la densidad ptica en el espectrofotmetro


Se trata del mtodo ms habitual para el seguimiento del crecimiento
de un cultivo bacteriano. La medicin de alcuotas o muestras del cultivo a lo
largo del tiempo, permite desarrollar curvas de crecimiento de la poblacin
bacteriana. Ello permitir, a su vez, la comparacin de tasas de crecimiento
en diferentes condiciones, el establecimiento de las condiciones ptimas, etc.

Recuento de viables
Se determina el nmero de clulas capaces de generar colonias sobre
la superficie de un medio slido. En la prctica habitual se considera que el
nmero de colonias en una placa debe oscilar entre 30 y 3000, con objeto de
que la muestra sea estadsticamente representativa, y evitando que aparezca
crecimiento confluente.

Mediante la realizacin de diluciones, en caso de muestras


concentradas.

Mediante tcnicas de filtracin, de volmenes determinados, y


posterior incubacin del filtro en que han quedado retenidos los
microorganismos sobre la superficie de medios slidos. Ello permite el
uso de medios selectivos para el aislamiento y cuantificacin de
determinados grupos de microorganismos.

Fig. 8 RECUENTO DE VIABLES

Efecto de Factores Ambientales Sobre el Crecimiento. Tcnicas De


Incubacin

Los distintos factores ambientales (temperatura, pH, oxgeno, concentracin


de solutos u osmolaridad, etc.) afectan al crecimiento microbiano. Se debe,
por tanto, tener en cuenta las condiciones en que se debe cultivar un
determinado tipo de microorganismos.

TEMPERATURA: En funcin de su espectro de crecimiento respecto a la


temperatura, distintos tipos de microorganismos crecern con distintas tasas
de crecimiento a una determinada temperatura. Ello puede ser utilizado como
base para el aislamiento de organismos psicrfilos, mesfilos o termfilos. Se
incubarn muestras de diversos orgenes (suelo, agua, alimentos y cultivos
mixtos y puros) a distintas temperaturas en medio slido (agar nutritivo,
medios selectivos) y se comparar el crecimiento y tipos de microorganismos
obtenidos tras su incubacin.

OXGENO: Existen mtodos para proporcionar una mayor o menor


oxigenacin en funcin del tipo de microorganismos que se desee cultivar.
Los medios lquidos permiten una mayor difusin del oxgeno hacia las capas
inferiores que los medios slidos. Se utilizan medios semislidos para el
crecimiento bacteriano a lo largo del tubo. Los niveles de difusin de oxgeno
en las distintas capas condicionar el crecimiento de distintos tipos de
microorganismos (aerobios, anaerobios estribitos, anaerobios facultativos,
microaerfilos).

Incubacin de bacterias aerobias


- Medio lquido:

Tubo - horizontal o inclinado con agitacin

Matraz con poca cantidad de medio, con agitacin o burbujeo

- Medio slido

Placa en superficie

Tubo agar inclinado (crecimiento en superficie)

Incubacin de bacterias anaerobias


- Medio lquido

Tubo vertical con agente reductor (tioglicolato sdico)

- Medio slido

Placa en el interior de jarra de anaerobios o en estufa de anaerobios

- Medio semislido

Tubo en tubo vertical. El medio se somete a ebullicin, con objeto de


eliminar el oxgeno, previamente a la inoculacin de la muestra. Se
puede adicionar entonces un agente reductor. Tras haber sembrado la
muestra por picadura, se sella la parte superior del medio (con
glicerina estril).

Anlisis Microbiolgicos - Anlisis De Agua

En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los


cuales afectan en mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus
caractersticas organolpticas. Adems de la flora normal (Bacillus,
Pseudomonas,

etc.),

en

el

agua

pueden

existir

microorganismos

contaminantes. Una de las fuentes principales de contaminacin son las


aguas residuales que contienen heces que pueden ser vehculo de
transmisin de patgenos. La presencia de indicadores de contaminacin
fecal (Escherichia coli, Enterococcus faecalis) revela la existencia de
contaminacin fecal, y por tanto la posibilidad de que se encuentren
presentes patgenos de transmisin oral-fecal.

El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos estn


dentro de los lmites establecidos por la ley.
Las normas legales vigentes exigen:
Aerobios totales: No existe lmite legal pero los valores mximos
recomendados son:
Aerobios a 37 C: 10 /ml. Aerobios a 22 C: 100 por ml.
Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml.
Estreptococos fecales: < 1 / 100ml.
Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml.

Fig. 9 ANLISIS DE AGUAS - SISTEMA DE FILTRACIN

Fig. 9 ANLISIS DE AGUAS - SISTEMA DE FILTRACIN

Introducir filtro de 0,45mm en sistema de filtracin (con pinzas metlicas


previamente flameadas)
- Filtrar 50-100ml de la muestra
- Depositar filtro (con pinzas metlicas previamente flameadas) en placa de:

Agar nutritivo marcar- incubar a 37 C

MacConkey marcar incubar a 37 C

MF-C marcar incubar a 44,5 C

Microbiologa Mtodos Rpidos

Las distintas tcnicas fueron evolucionando a medida que las exigencias de


calidad de los entes controladores y los consumidores fueron aumentando.
Cada una de estas tcnicas surgi de la necesidad de anlisis cada vez ms
precisos y confiables, pero tambin de procesos ms simples. Es as como
las tcnicas de presencia/ausencia o de nmero ms probable ha sido
reemplazada por mtodos ms rpidos y precisos en la mayora de los
laboratorios.

Las distintas empresas que participan en el mercado ofreciendo los insumos


para estos anlisis han aportado nuevos desarrollos tecnolgicos basados en
las experiencias de sus clientes. La tcnica de filtracin por membranas es
uno de esos desarrollos que han aportado mayor precisin en los resultados
de los anlisis ya que, no slo nos permite identificar microorganismos
presentes en una muestra determinada sino tambin, cuantificarlos. El
desarrollo de los monitores microbiolgicos ha sido una de las mejoras
sustanciales de la tcnica de filtracin por membranas dado que permite
llevar a cabo un anlisis tan preciso, como lo es esta tcnica, reduciendo al
mnimo los pasos necesarios del proceso con el consecuente aumento de
confiabilidad de los resultados obtenidos. Repasando el proceso tradicional
de filtracin por membranas podemos identificar un conjunto de elementos
necesarios para llevar a cabo el anlisis.

Este conjunto consiste en un embudo sin costura que se fija a un receptculo


provisto de una placa porosa, que soporta el filtro de membrana. Ambas
partes deben ser de un diseo y construccin tal que se pueda fijar el
embudo al receptculo por medio de un cierre adecuado y que permita que la
membrana se apoye con firmeza en la placa porosa, obligando a que todo el
lquido a filtrar pase a travs de la membrana durante la filtracin de la

muestra. Obviamente ser necesaria una membrana de filtracin pero


tambin un disco de algn material absorbente, libre de agentes que inhiban
el desarrollo de microorganismos y con un espesor que permita absorber
hasta 3 ml del medio de cultivo, pinzas sin estras con puntas redondeadas y
una placa de Petri de por lo menos 50 mm de dimetro para colocar el disco
absorbente embebido en el medio de cultivo adecuado y la membrana una
vez filtrada la muestra. Como toda tcnica de microbiologa, la de filtracin
por membrana requiere trabajar en condiciones de asepsia. Cabina de flujo
laminar, o entre dos mecheros encendidos y todos los elementos
mencionados deben estar estriles para cada anlisis.

Con excepcin de las membranas, los discos absorbentes y las placas de


55mm, que las distintas empresas proveedoras ya los ofrecen estriles, los
dems elementos deben ser esterilizados en el laboratorio, con la
consecuente inversin de tiempo que esto requiere. Por otro lado, si bien el
proceso de esterilizacin por autoclave estndar (15 minutos a 121C,
1.1Kg/cm2 o 15psi) es un mtodo vlido, los elementos pueden
contaminarse en su traslado desde el autoclave hasta el puesto de trabajo.

Terminado el proceso de limpieza y esterilizacin los elementos deben ser


trasladados desde la estufa de esterilizacin o autoclave hasta la campana
de flujo laminar donde ser realizado el anlisis. Dentro del flujo laminar, el
analista debe colocar la base del embudo de filtracin en el kitasato, tomar
un sobre de membrana estril, abrirlo, tomar con la pinza la membrana,
retirarla del sobre y colocarla sobre la placa porosa. Luego colocar el
embudo sobre la base y asegurarlo. Recin despus de haber realizado
todos estos pasos, el analista est en condiciones de agregar la muestra en
el embudo para ser filtrada. Cumplido este proceso, el analista debe retirar la
membrana del embudo y colocarla dentro de la placa de Petri sobre el disco
absorbente, el cual ya debe estar embebido del medio de cultivo a utilizar. Si

el analista fuera a realizar tres anlisis en lnea, utilizando un manifold por


ejemplo, el proceso se vuelve an ms prolongado dado que debera triplicar
la preparacin de los elementos necesarios para el proceso.

En todo procedimiento de control de calidad, a mayor cantidad de etapas,


mayor la probabilidad de errores con la consecuente posibilidad de
contaminaciones cruzadas y falsos positivos o falsos negativos. Si bien este
es un proceso cuasi rutinario para el analista de laboratorio, sigue siendo un
punto crtico en cuanto a la confiabilidad de los resultados del anlisis. El
desarrollo de los monitores microbiolgicos permiti que el proceso de
preparacin de los elementos a utilizar en el anlisis microbiolgico por
tcnica de filtracin por membranas ya no tenga que ser una tarea a llevar a
cabo por el analista.

Pasos para la Tcnica de filtracin por membrana (MF)

1. Recoger la muestra y realizar las diluciones necesarias. Seleccionar


los medios adecuados, verter el caldo en una placa Petri estril
empapando de manera uniforme la almohadilla absorbente. Flamear
las pinzas y retirar la membrana del envase estril. Colocar el filtro de
membrana en la base del embudo.
2. Flamear el extremo de vaciado del contenedor de la muestra y verter
la muestra en el embudo. Abrir el vaco y dejar que pase toda la
muestra a travs del filtro. Aclarar el embudo con agua tamponada
estril. Abrir el vaco y dejar que pase todo el lquido a travs del filtro.
3. Colocar el filtro de membrana en la placa Petri preparada. Incubar a la
temperatura apropiada y durante el tiempo adecuado.
4. Contar las colonias con una lupa de 10 - 15x.

Ventajas

Permite la concentracin de grandes volmenes de muestra.

Reduce el tiempo de preparacin en comparacin con muchos otros


mtodos tradicionales.

Permite el aislamiento y el recuento de colonias.

Proporciona informacin sobre presencia o ausencia en 24 horas.

Permite la eliminacin de inhibidores o biocidas que no se eliminaran


con las tcnicas Pour Plate, Spread Plate o NPM.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Affif F,. (2011), CATLAB, Portar de laboratorios analticos. Direccin:


http://www.catlab.com.ar/notas.php?idm=1101&accion1=notas&PHPSESSID
=72c3cd8cfdeb82c42a9b3cedc6d1ca77
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+34

937

859

342.

http://www.telstar-

lifesciences.com/es/tecnologias/bombas+de+laboratorio/bombas+de+vacio+p
ara+laboratorio.htm#. Bombas de vaco para laboratorio

manual para anlisis bsicos de calidad del agua de bebida.


http://www.bvsde.paho.org/bvsacg/fulltext/manual.pdf