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A grande maioria dos testes imunolgicos

se baseia no princpio da Interao


Antgeno-Anticorpo

Reao de precipitao
Reao de aglutinao
ELISA
Radioimunoensaio (RIA)
Imunofluorescncia/Imunohistoqumica
Western Blotting
Citometria de Fluxo

Interao Ag-Ac (ligao no covalente)


Ligaes Eletrostticas (grupos inicos)

Pontes de Hidrognio (proximidade)

Foras de Van der Waal (fora fraca,


nuvem de eltrons)

Ligaes Hidrofbicas (molculas polares, H20)

OBS-Reaes Reversveis

Afinidade
Quanto maior a afinidade do anticorpo pelo antgeno,
mais estvel ser a interao.

Alta Afinidade

Baixa Afinidade

Ac

Ac

Ag

Ag

Afinidade = das foras de atrao e repulso

Especificidade
A capacidade de ligao da regio varivel de

um anticorpo a um nico determinante antignico


(ex: eptopos da molcula de LPS).

Teste de Aglutinao - Princpio


Agregao visvel de partculas
Eritrcitos
Bactrias
Fungos
ltex

Teste de Aglutinao - Princpio


Formao de agregados visveis como resultado da
interao de Ac especficos e partculas insolveis que
contenham determinantes antignicos na superfcie.
Comparadas precipitao, as tcnicas de aglutinao
so mais sensveis, necessitando de uma quantidade de
Ac 500 vezes menor, pois as partculas amplificam a
reao.

Aglutinao/Hemoaglutinao

Aplicaes:
-Tipagem sangunea (ABO), Coombs (Rh),
VDRL (sfilis), ASLO (anti-estreptolisina O),
Fator Reumatide , bHCG, Protena C Reativa.
-Deteco de aumento do ttulos de Ac (4x)
(infeces virais e bacterianas - soroconverso)

Aglutinao/Hemoaglutinao
Principio formao de imunocomplexos pela de equivalncia de Ag e Ac

Zona de maior
Aglutinao

Aglutinao/Hemoaglutinao
- Vantagens: Mtodo simples, de fcil execuo,
baixo custo, rpido;

- Desvantagens: sensibilidade e especificidade


relativamente baixas sendo que o mal
armazenamento de reagentes (ex: hemcias),
pode levar a resultados falso-negativos.

Aglutinao/ Sistema ABO

Aglutinao/ Sistema ABO


1) Amostra de sangue na placa teste:

3) Controle negativo:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

4) Mistura-se:

Aglutinao/ Sistema ABO

negativo

positivo

Imunoprecipitao
Anticorpo livre
Antgeno livre

+
-

=
=

Zona de
equivalncia

Zona de excesso
de antgeno

Percentual de
imunocomplexo
precipitado

Zona de excesso
de anticorpo

Quantidade de antgeno (solvel) adicionado

Imunoprecipitao
Os ensaios baseados no princpio da precipitao
possuem sensibilidade de deteco menor quando
comparados a outras tcnicas imunolgicas, j que h
necessidade de formao de grandes complexos Ag-Ac
para serem detectados.
Atualmente, sistemas automatizados que utilizam o
princpio da precipitao so utilizados:
Nefelometria

Turbidimetria

MTODOS
APLICAES

ELISA

- Pesquisa
- Diagnstico
- Soroepidemiologia

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

Ensaio Imunoadsorvente Ligado


Enzima ELISA
Mtodo quantitativo.
A reao Ag-Ac medida pela atividade enzimtica.
Teste de alta sensibilidade, comparvel ao RIA.
Vantagens do ELISA:
- utiliza reagentes estveis
- no trabalha com radioistopos
- pode ser adaptado automao
- No depende de formao de precipitado,
aglutinado, etc.
- RELATIVAMENTE BARATO

ELISA direto
COR
Substrato
(OPD)

COR

COR
Anticorpo
primrio

LAVA 3x

Diversos antgenos no poo ex: HBsAg

Aplicaes:
1)

Imunodiagnstico de doenas infecto-contagiosas onde a


Deteco de IgG, IgA ou IgE seja significativa (Chagas,
Leishmania, HIV- AIDS etc.)

2)

Deve ser analisada com cautela para deteco de IgM


devido reao cruzada com o Fator Reumatide
(geralmete uma IgM anti-IgG)

ELISA indireto
substrato

Anticorpo
secundrio

LAVA
LAVA3x
3x

cor
cor

Anticorpo
primrio

Diversos antgenos no poo amplificao

Radioimunoensaio (RIA) e
Ensaio Imunoradiomtrico (IRMA)
Mtodo quantitativo.
A reao Ag-Ac medida pela deteco de radioatividade.
Teste de alta sensibilidade, comparvel ao ELISA (pois utiliza
bascamente o mesmo princpio boa amplificao ).
Desvantagens:
- custo mais caro que o ELISA
- no utiliza reagentes estveis (radioistopos)
- decaimento do reagente (trtio H3 ou I125)
- eliminao de resduos da reao
total de radiao mdia anual de exposio = 0,012 mGy

Equipamentos RIA e IRMA


Molculas marcadas com istopo (H3, Cr 51, I 125 ,I 131 )

I125: emite raios gama - gamma counter

H3: raios beta

beta counter

RIA ACTH Hormnio adenocorticotrpico


LAVA 1x

I 125

RIA ACTH Hormnio adenocorticotrpico


GAMMA COUNTER

CPM (CONTAGEM POR MINUTO)


GRFICO SEMI LOG
1 Gy = 1 J/Kg = 100 rad = 1 Sivert

MTODOS
Imunofluorescncia
e
Imunohistoqumica

APLICAES
- Pesquisa
- Diagnstico
-Epidemiologia
-Marcadores tumorais

Imunofluorescncia (IFA)
Princpio da tcnica:
Anticorpos ou antgenos so conjugados a um fluorocromo,
que, quando excitado por radiaes luminosas em um
determinado comprimento de onda, emite luz no espectro
visvel.
A reao feita em lminas de microscopia e a observao
em um microscpio de fluorescncia
Principais fluorocromos: AMCA, GFP, FITC, Rodomina,
TRITC, Texas Red., DAPI, Iodeto de Propdeo.

Imunofluorescncia (IFA):
DIRETA (Ac diretamente conjugado ao fluorocomo):
Deteco direta de microrganismos em secrees, na urina, nas
fezes, em cortes de tecidos etc. Tambm utilizada na fenotipagem
de clulas tumorais, e doenas imunolgicas renais e de pele.

INDIRETA (Ac primrio + secundrio com fluorocromo):


pesquisa de antgenos ( plasmdio em hemcia) e de anticorpos
( sfilis, toxoplasmose, rubola, citomegalovrus, vrus herpes simples,
doena de chagas, malria, etc)

Imunofluorescncia (IFA):
IMUNOFLUORESCNCIA DIRETA

IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA

Imunofluorescncia (IFA)
lmpada de mercrio

Imunofluorescncia

Treponema pallidum

Pneumocystis carinii

Tripanosoma cruzi

Giardia lamblia

Imunofluorescncia de tecido
-Mtodo muito usado em pesquisa cientfica para deteco de citocinas e
quimiocinas. Possibilita viso da distribuio espacial de clulas produtoras.
-Pode ser feito em cortes de tecido congelado o fixado em formol e emblocado em
parafina

Microscopia Confocal (ferramenta)


Microscpio de fluorescncia a laser com iluminao

puntiforme
Microscpico faz a de varredura da amostra
Fatiamento ptico produz qualidade de imagem superior da

epifluorescncia (microscpico comum)


Resoluo no eixo Z

Z
Y

Microscopia Confocal (ferramenta)

Imunohistoqumica
-Mtodo muito usado em pesquisa cientfica, mesmo princpio da IFA porm
utiliza marcadores enzimticos (peroxidase, fosfatase alcalina).

-Pode ser feito em cortes de tecido congelado o fixado em formol e


emblocado em parafina
Oncoprotena c-erbB-2 em
carcinoma epidermide (peroxidase)

Deteco de p53 marcador tumoral


(fosfatase alcalina)

Western Blotting

Western Blotting
Associao de tcnica de Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

(SDS-PAGE) com tcnicas imunolgicas.


Permite a identificao do reconhecimento de antgenos com

peso molecular definido atravs do uso de padro de peso


molecular.
Identificao de anticorpos que reconhecem determinado

antgeno em soluo contendo diversos antgenos.


Permite a realizao de cintica de expresso de protenas

celulares.

Western Blotting
praticamente um ELISA em fase slida

Aplicaes :
HIV I e II/AIDS, Human T Lymphotropic Virus (HTLV I/ II) ,
Simian Immunodeficiency Virus (SIV) e Helicobacter
pylori.

Normalmente no utilizado como teste de triagem


(feito por ELISA) e sim confirmatrio devido ao alto
custo e protocolo extenso.

Western Blotting - mtodo

1) Protenas de um lisado de HIV-1 correm em um gel de SDS Poliacrilamida (SDS-PAGE).

Western Blotting - mtodo

2) As protenas so
transferidas para uma
membrana de
nitrocelulose

Western Blotting - mtodo

3) Aps a transferncia a mebrana cortada em tiras


4) E encubadas com o soro do paciente. A deteco feita com
anticorpos secundrios conjugados enzimas ou radioativos

Western Blotting - resultado


ENV

*
*

ENV

CAP

Western Blotting - resultado


Vantagens:

alta
sensibilidade
e
especificidade;
reconhecimento de antgenos individuais em um extrato;
realizao de perfil de reconhecimento de antgenos e
determinao de protenas imunodominantes;

Desvantagens: Custo mdio a alto; procedimento longo e


propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema
de revelao, pode-se ter problemas de segurana (sondas
radioativas).

Citometria de Fluxo

CITO

METRIA

Clula

Medida

FLUXO

Movimento

Citometria: Anlise quantitativa e qualitativa de parmetros celulares (clulas,


ncleos, cromossomas, mitocndrias, fungos, bactrias, etc)

Citometria de Fluxo
DEFINIO:
Tecnologia
que
mede
e
analisa
simultaneamente
caractersticas
fsicas
mltiplas em partculas (usualmente clulas) na
medida que fluem ordenadamente em frente a
um feixe de laser.

Citometria de Fluxo
Quais parmetros ?
Complexidade

Tamanho

Antgenos celulares

Metabolismo

Enzimas
DNA

Receptores

Citocinas

Citmetro - Princpio
Agulha de
injeo

Lquido de
envolvimento

Laser
Disperso laser

Ponto de Hidrofocagem

Citmetro Parmetros

Tamanho e
complexidade celular

Fluorescncia
(Ac monoclonais + fluorocromos)

Numero de eventos

FITC
FITC

FITC

FITC
FITC
FITC

FITC

FITC
FITC

FITC

Intensidade de Fluorescncia

SSC - complexidade

Citometria de Fluxo
FSC e SSC

FSC - tamanho

Citmetro Fluorocromos
Definio: molculas capazes de absorver luz em um
determinado l e emitir em outro l.
Fluorescena
(FITC)
l = 488 nm

O
H

l = 525 nm
CO2H

Luz Incidente
(AZUL) de
maior energia

Fluorocromo

Luz Fluorescente (VERDE)


(menor energia e maior
comprimento de onda)

Citometria de Fluxo -Fluorescncia


CD8 +
CD4 +
CD8+

CD8CD4-

CD4+

Citometria de Fluxo

Como tudo se encaixa?

Citometria de Fluxo - procedimento


1) Marcao com
Anticorpos (FL)

4) Anlise
de dados

2) Leitura no
citmetro

3) Processamento
de dados

15%

33%

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