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se baseia no princípio da Interação Antígeno-Anticorpo
se baseia no princípio da Interação
Antígeno-Anticorpo

A grande maioria dos testes imunológicos

Reação de precipitação

Reação de aglutinação

ELISA

Radioimunoensaio (RIA)

Imunofluorescência/Imunohistoquímica

Western Blotting

Citometria de Fluxo

Interação Ag-Ac (ligação não covalente)
Interação Ag-Ac (ligação não covalente)
Interação Ag-Ac (ligação não covalente) – Ligações Eletrostáticas (grupos iônicos) – Pontes de Hidrogênio

Ligações Eletrostáticas (grupos iônicos)

Pontes de Hidrogênio (proximidade)

Forças de Van der Waal (força fraca,

nuvem de elétrons)

Ligações Hidrofóbicas (moléculas polares, H20)

OBS-Reações Reversíveis

Afinidade
Afinidade

Quanto maior a afinidade do anticorpo pelo antígeno,

mais estável será a interação.

Alta Afinidade Ac Ag
Alta Afinidade
Ac
Ag
Baixa Afinidade Ac Ag
Baixa Afinidade
Ac
Ag

Afinidade = das forças de atração e repulsão

Especificidade
Especificidade
Especificidade  A capacidade de ligação da região variável de um anticorpo a um único determinante

A capacidade de ligação da região variável de um anticorpo a um único determinante antigênico (ex: epítopos da molécula de LPS).

ligação da região variável de um anticorpo a um único determinante antigênico (ex: epítopos da molécula
Teste de Aglutinação - Princípio
Teste de Aglutinação - Princípio

Agregação visível de partículas

Eritrócitos Bactérias

Fungos

látex

- Princípio  Agregação visível de partículas  Eritrócitos  Bactérias  Fungos  látex
Teste de Aglutinação - Princípio
Teste de Aglutinação - Princípio

Formação

de

agregados

visíveis

como

resultado

da

interação de Ac específicos e partículas insolúveis que

contenham determinantes antigênicos na superfície.

Comparadas à precipitação, as técnicas de aglutinação são mais sensíveis, necessitando de uma quantidade de

Ac 500 vezes menor, pois as partículas amplificam a reação.

Aglutinação/Hemoaglutinação
Aglutinação/Hemoaglutinação

Aplicações:

-Tipagem sanguínea (ABO), Coombs (Rh), VDRL (sífilis), ASLO (anti-estreptolisina O),

Fator Reumatóide , bHCG, Proteína C Reativa.

-Detecção de aumento do títulos de Ac (4x)

(infecções virais e bacterianas - soroconversão)

Aglutinação/Hemoaglutinação

Aglutinação/Hemoaglutinação Principio – formação de imunocomplexos pela de equivalência de Ag e Ac Zona de

Principio formação de imunocomplexos pela de equivalência de Ag e Ac

Zona de maior Aglutinação
Zona de maior
Aglutinação
Aglutinação/Hemoaglutinação
Aglutinação/Hemoaglutinação

- Vantagens: Método simples, de fácil execução,

baixo custo, rápido;

- Desvantagens: sensibilidade e especificidade relativamente baixas sendo que o mal

armazenamento de reagentes (ex: hemácias),

pode levar a resultados falso-negativos.

Aglutinação/ Sistema ABO

Aglutinação/ Sistema ABO
Aglutinação/ Sistema ABO
Aglutinação/ Sistema ABO

1) Amostra de sangue na placa teste:

Sistema ABO 1) Amostra de sangue na placa teste: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 3)

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

Sistema ABO 1) Amostra de sangue na placa teste: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 3)

3) Controle negativo:

Sistema ABO 1) Amostra de sangue na placa teste: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 3)

4) Mistura-se:

Sistema ABO 1) Amostra de sangue na placa teste: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 3)
Aglutinação/ Sistema ABO
Aglutinação/ Sistema ABO
negativo
negativo
positivo
positivo
Aglutinação/ Sistema ABO negativo positivo
Imunoprecipitação
Imunoprecipitação
Imunoprecipitação = - Anticorpo livre + - Antígeno livre = + Percentual de imunocomplexo precipitado Zona
= - Anticorpo livre + - Antígeno livre = + Percentual de imunocomplexo precipitado Zona
=
-
Anticorpo livre
+
-
Antígeno livre
=
+
Percentual de
imunocomplexo
precipitado
Zona de excesso
Zona de excesso
de antígeno
de anticorpo
Zona de
equivalência
Quantidade de antígeno (solúvel) adicionado
Imunoprecipitação
Imunoprecipitação

Os ensaios baseados no princípio da precipitação possuem sensibilidade de detecção menor quando

comparados a outras técnicas imunológicas, já que há

necessidade de formação de grandes complexos Ag-Ac

para serem detectados.

Atualmente, sistemas automatizados que utilizam o

princípio da precipitação são utilizados:

• Nefelometria
• Nefelometria
• Turbidimetria
• Turbidimetria

MÉTODOS

MÉTODOS ELISA APLICAÇÕES - Pesquisa - Diagnóstico - Soroepidemiologia Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
ELISA
ELISA
APLICAÇÕES
APLICAÇÕES
-
-

Pesquisa

- Diagnóstico

- Soroepidemiologia

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima – ELISA
Ensaio Imunoadsorvente Ligado à
Enzima – ELISA

Método quantitativo.

A reação Ag-Ac é medida pela atividade enzimática.

Teste de alta sensibilidade, comparável ao RIA.

Vantagens do ELISA:

- utiliza reagentes estáveis

- não trabalha com radioisótopos

- pode ser adaptado à automação

- Não depende de formação de precipitado,

aglutinado, etc.

- RELATIVAMENTE BARATO

ELISA direto
ELISA direto
ELISA direto COR COR C O R Anticorpo Substrato primário (OPD) LAVA 3x Diversos antígenos no
COR
COR
COR
COR
ELISA direto COR COR C O R Anticorpo Substrato primário (OPD) LAVA 3x Diversos antígenos no

COR

Anticorpo Substrato primário (OPD)
Anticorpo
Substrato
primário
(OPD)

LAVA 3x

ELISA direto COR COR C O R Anticorpo Substrato primário (OPD) LAVA 3x Diversos antígenos no
ELISA direto COR COR C O R Anticorpo Substrato primário (OPD) LAVA 3x Diversos antígenos no
Aplicações:
Aplicações:
Aplicações: 1) Imunodiagnóstico de doenças infecto-contagiosas onde a Detecção de IgG, IgA ou IgE seja significativa

1) Imunodiagnóstico de doenças infecto-contagiosas onde a

Detecção de IgG, IgA ou IgE seja significativa (Chagas,

Leishmania, HIV- AIDS etc.)

2)

Deve ser analisada com cautela para detecção de IgM devido á reação cruzada com o Fator Reumatóide

(geralmete é uma IgM anti-IgG)

com cautela para detecção de IgM devido á reação cruzada com o Fator Reumatóide (geralmete é
ELISA indireto
ELISA indireto
ELISA indireto Anticorpo secundário substrato cor LAVA LAVA 3x 3x cor Anticorpo primário Diversos antígenos no
ELISA indireto Anticorpo secundário substrato cor LAVA LAVA 3x 3x cor Anticorpo primário Diversos antígenos no

Anticorpo

secundário substrato cor
secundário
substrato
cor
ELISA indireto Anticorpo secundário substrato cor LAVA LAVA 3x 3x cor Anticorpo primário Diversos antígenos no
ELISA indireto Anticorpo secundário substrato cor LAVA LAVA 3x 3x cor Anticorpo primário Diversos antígenos no
ELISA indireto Anticorpo secundário substrato cor LAVA LAVA 3x 3x cor Anticorpo primário Diversos antígenos no
ELISA indireto Anticorpo secundário substrato cor LAVA LAVA 3x 3x cor Anticorpo primário Diversos antígenos no
ELISA indireto Anticorpo secundário substrato cor LAVA LAVA 3x 3x cor Anticorpo primário Diversos antígenos no

LAVA LAVA 3x 3x

Anticorpo secundário substrato cor LAVA LAVA 3x 3x cor Anticorpo primário Diversos antígenos no poço –
cor
cor

Anticorpo

primário

secundário substrato cor LAVA LAVA 3x 3x cor Anticorpo primário Diversos antígenos no poço – amplificação

Radioimunoensaio (RIA) e Ensaio Imunoradiométrico (IRMA)

Radioimunoensaio (RIA) e Ensaio Imunoradiométrico (IRMA) • Método quantitativo. • A reação Ag-Ac é medida pela

Método quantitativo.

A reação Ag-Ac é medida pela detecção de radioatividade.

Teste de alta sensibilidade, comparável ao ELISA (pois utiliza

bascamente o mesmo princípio boa amplificação ).

Desvantagens:

- custo mais caro que o ELISA

- não utiliza reagentes estáveis (radioisótopos) - decaimento do reagente (trítio H 3 ou I 125 ) - eliminação de resíduos da reação

total de radiação média anual de exposição = 0,012 mGy

Equipamentos – RIA e IRMA
Equipamentos – RIA e IRMA

Moléculas marcadas com isótopo (H 3 , Cr 51 , I 125 ,I 131 )

I 125 : emite raios gama - gamma counter

1 , I 1 2 5 ,I 1 3 1 ) I 1 2 5 :

H 3 : raios beta

-

beta counter

1 , I 1 2 5 ,I 1 3 1 ) I 1 2 5 :
RIA – ACTH – Hormônio adenocorticotrópico

RIA ACTH Hormônio adenocorticotrópico

LAVA 1x

RIA – ACTH – Hormônio adenocorticotrópico LAVA 1x I 125

I 125

RIA – ACTH – Hormônio adenocorticotrópico LAVA 1x I 125
RIA – ACTH – Hormônio adenocorticotrópico GAMMA COUNTER CPM (CONTAGEM POR MINUTO) GRÁFICO SEMI LOG
RIA – ACTH – Hormônio adenocorticotrópico GAMMA COUNTER CPM (CONTAGEM POR MINUTO) GRÁFICO SEMI LOG

RIA ACTH Hormônio adenocorticotrópico

RIA – ACTH – Hormônio adenocorticotrópico GAMMA COUNTER CPM (CONTAGEM POR MINUTO) GRÁFICO SEMI LOG 1
RIA – ACTH – Hormônio adenocorticotrópico GAMMA COUNTER CPM (CONTAGEM POR MINUTO) GRÁFICO SEMI LOG 1
RIA – ACTH – Hormônio adenocorticotrópico GAMMA COUNTER CPM (CONTAGEM POR MINUTO) GRÁFICO SEMI LOG 1
GAMMA COUNTER
GAMMA COUNTER
– ACTH – Hormônio adenocorticotrópico GAMMA COUNTER CPM (CONTAGEM POR MINUTO) GRÁFICO SEMI LOG 1 Gy
CPM (CONTAGEM POR MINUTO) GRÁFICO SEMI LOG 1 Gy = 1 J/Kg = 100 rad
CPM (CONTAGEM POR MINUTO)
GRÁFICO SEMI LOG
1 Gy = 1 J/Kg = 100 rad = 1 Sivert

MÉTODOS

MÉTODOS Imunofluorescência e Imunohistoquímica APLICAÇÕES - Pesquisa - Diagnóstico - Epidemiologia - Marcadores

Imunofluorescência

e
e

Imunohistoquímica

APLICAÇÕES
APLICAÇÕES
Imunofluorescência e Imunohistoquímica APLICAÇÕES - Pesquisa - Diagnóstico - Epidemiologia - Marcadores
Imunofluorescência e Imunohistoquímica APLICAÇÕES - Pesquisa - Diagnóstico - Epidemiologia - Marcadores

- Pesquisa

- Diagnóstico

-Epidemiologia

-Marcadores tumorais

Imunofluorescência (IFA)
Imunofluorescência (IFA)

Princípio da técnica:

Anticorpos ou antígenos são conjugados a um fluorocromo, que, quando excitado por radiações luminosas em um

determinado comprimento de onda, emite luz no espectro

visível.

A reação

é

feita

em

lâminas de microscopia

e a

observação

em um microscópio de fluorescência

 

Principais

fluorocromos:

AMCA,

GFP,

FITC,

Rodomina,

TRITC, Texas Red., DAPI, Iodeto de Propídeo.

Imunofluorescência (IFA):
Imunofluorescência (IFA):

DIRETA (Ac diretamente conjugado ao fluorocomo):

Detecção direta de microrganismos

em

secreções,

na

urina,

nas

fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem

de células tumorais, e doenças imunológicas renais e de pele.

INDIRETA (Ac primário + secundário com fluorocromo):

pesquisa de antígenos ( plasmódio em hemácia) e de anticorpos

( sífilis, toxoplasmose, rubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples,

doença de chagas, malária, etc)

Imunofluorescência (IFA):
Imunofluorescência (IFA):

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

Imunofluorescência (IFA): IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Imunofluorescência (IFA): IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

Imunofluorescência (IFA) lâmpada de mercúrio

Imunofluorescência (IFA) lâmpada de mercúrio
Imunofluorescência (IFA) lâmpada de mercúrio

Imunofluorescência

Imunofluorescência Treponema pallidum Pneumocystis carinii Tripanosoma cruzi Giardia lamblia

Treponema pallidum

Pneumocystis carinii

Tripanosoma cruzi
Tripanosoma cruzi

Giardia lamblia

Imunofluorescência de tecido

-Método muito usado em pesquisa científica para detecção de citocinas e

quimiocinas. Possibilita visão da distribuição espacial de células produtoras.

visão da distribuição espacial de células produtoras. -Pode ser feito em cortes de tecido congelado o

-Pode ser feito em cortes de tecido congelado o fixado em formol e emblocado em

parafina

espacial de células produtoras. -Pode ser feito em cortes de tecido congelado o fixado em formol
Microscopia Confocal (ferramenta)
Microscopia Confocal (ferramenta)

Microscópio

puntiforme

de

fluorescência

a

laser

com

iluminação

Microscópico faz a de varredura da amostra

Fatiamento óptico produz qualidade de imagem superior à da

epifluorescência (microscópico comum)

Resolução no eixo Z

Y
Y

X

Z

Microscopia Confocal (ferramenta)

Microscopia Confocal (ferramenta)
Microscopia Confocal (ferramenta)

Imunohistoquímica

-Método muito usado em pesquisa científica, mesmo princípio da IFA porém utiliza marcadores enzimáticos (peroxidase,
-Método muito usado em pesquisa científica, mesmo princípio da IFA porém
utiliza marcadores enzimáticos (peroxidase, fosfatase alcalina).
-Pode ser feito em cortes de tecido congelado o fixado em formol e emblocado em
-Pode ser feito em cortes de tecido congelado o fixado em formol e
emblocado em parafina

Oncoproteína c-erbB-2 em

carcinoma epidermóide (peroxidase)

Oncoproteína c- erbB-2 em carcinoma epidermóide (peroxidase) Detecção de p53 marcador tumoral (fosfatase alcalina)

Detecção de p53 marcador tumoral

(fosfatase alcalina)

Oncoproteína c- erbB-2 em carcinoma epidermóide (peroxidase) Detecção de p53 marcador tumoral (fosfatase alcalina)
Western Blotting
Western Blotting
Western Blotting
Western Blotting
Western Blotting
Western Blotting

Western Blotting

Associação de técnica de Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

(SDS-PAGE) com técnicas imunológicas.

Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido através do uso de padrão de peso

molecular.

Identificação

de

anticorpos

que

reconhecem

determinado

antígeno em solução contendo diversos antígenos.

Permite a realização de cinética de expressão de proteínas celulares.

Western Blotting

É praticamente um ELISA em fase sólida

Aplicações :

HIV I e II/AIDS, Human T Lymphotropic Virus (HTLV I/ II) ,

Simian

Immunodeficiency

Virus

(SIV)

e

Helicobacter

pylori.

Normalmente não é

como teste de triagem

(feito por ELISA) e sim confirmatório devido ao alto

custo e protocolo extenso.

utilizado

Western Blotting - método

Western Blotting - método 1) Proteínas de um lisado de HIV-1 correm em um gel de
Western Blotting - método 1) Proteínas de um lisado de HIV-1 correm em um gel de

1) Proteínas de um lisado de HIV-1 correm em um gel de SDS -

Poliacrilamida (SDS-PAGE).

Western Blotting - método

2) As proteínas são

transferidas para uma

membrana de nitrocelulose

Western Blotting - método 3) Após a transferência a mebrana é cortada em tiras …

Western Blotting - método

Western Blotting - método 3) Após a transferência a mebrana é cortada em tiras … 4)
Western Blotting - método 3) Após a transferência a mebrana é cortada em tiras … 4)

3) Após a transferência a mebrana é cortada em tiras

4) E encubadas com o soro do paciente. A detecção é feita com

anticorpos secundários conjugados à enzimas ou radioativos

Western Blotting - resultado ENV ENV CAP * * * *

Western Blotting - resultado

ENV

ENV

CAP

* * * *
*
*
*
*
Western Blotting - resultado  Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos

Western Blotting - resultado

Western Blotting - resultado  Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos

Vantagens: alta sensibilidade e especificidade;

 Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato;

reconhecimento de antígenos individuais em um extrato;

realização de perfil de reconhecimento de antígenos e

determinação de proteínas imunodominantes;

antígenos e determinação de proteínas imunodominantes;  Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo

Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e

Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do

propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema

de revelação, pode-se ter problemas de segurança (sondas

radioativas).

Citometria de Fluxo
Citometria de Fluxo
CITO METRIA FLUXO
CITO
METRIA
FLUXO

Célula

Medida

Movimento

Citometria: Análise quantitativa e qualitativa de parâmetros celulares (células,

núcleos, cromossomas, mitocôndrias, fungos, bactérias, etc)

Citometria de Fluxo
Citometria de Fluxo

DEFINIÇÃO:

Tecnologia que

simultaneamente características físicas

múltiplas em partículas (usualmente células) na

medida que fluem ordenadamente em frente a

um feixe de laser.

mede

e analisa

Citometria de Fluxo

Quais parâmetros ?

Complexidade

Tamanho

Enzimas DNA
Enzimas
DNA

Antígenos celulares

Metabolismo

Receptores

Citocinas

Agulha de injeção Citômetro - Princípio Líquido de envolvimento Laser Dispersão laser Ponto de Hidrofocagem

Agulha de

injeção

Citômetro - Princípio

Líquido de envolvimento

Laser
Laser
Dispersão laser
Dispersão laser
Ponto de Hidrofocagem
Ponto de Hidrofocagem
Citômetro – Parâmetros
Citômetro – Parâmetros
Tamanho e
Tamanho e

omplexidade celular

Citômetro – Parâmetros Tamanho e omplexidade celular Fluorescência (Ac monoclonais + fluorocromos) Numero de eventos
Citômetro – Parâmetros Tamanho e omplexidade celular Fluorescência (Ac monoclonais + fluorocromos) Numero de eventos
Fluorescência (Ac monoclonais + fluorocromos)
Fluorescência
(Ac monoclonais + fluorocromos)

Numero de eventos

FITC

FITC
FITC
FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC

FITC

Numero de eventos FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Intensidade de Fluorescência

Intensidade de Fluorescência

Citometria de Fluxo FSC e SSC

Citometria de Fluxo FSC e SSC FSC - tamanho
FSC - tamanho
FSC - tamanho

Citômetro Fluorocromos

Definição: moléculas capazes de absorver luz em um determinado l e emitir em outro l.

l = 488 nm

luz em um determinado l e emitir em outro l. l = 488 nm Luz Incidente

Luz Incidente

(AZUL) de

maior energia

Fluoresceína

(FITC)

O CO 2 H
O
CO 2 H
O H
O
H
(AZUL) de maior energia Fluoresceína (FITC) O CO 2 H O H Fluorocromo l = 525
(AZUL) de maior energia Fluoresceína (FITC) O CO 2 H O H Fluorocromo l = 525

Fluorocromo

l = 525 nm

Fluoresceína (FITC) O CO 2 H O H Fluorocromo l = 525 nm Luz Fluorescente (VERDE)

Luz Fluorescente (VERDE)

(menor energia e maior

comprimento de onda)

Citometria de Fluxo -Fluorescência

CD8 +

CD4 +

Citometria de Fluxo -Fluorescência CD8 + CD4 + CD8+ CD4+ CD8- CD4-
Citometria de Fluxo -Fluorescência CD8 + CD4 + CD8+ CD4+ CD8- CD4-
CD8+
CD8+
Citometria de Fluxo -Fluorescência CD8 + CD4 + CD8+ CD4+ CD8- CD4-
CD4+
CD4+
CD8- CD4-
CD8-
CD4-
Citometria de Fluxo Como tudo se encaixa?
Citometria de Fluxo Como tudo se encaixa?
Citometria de Fluxo
Citometria de Fluxo
Como tudo se encaixa?
Como tudo se encaixa?
Citometria de Fluxo - procedimento
Citometria de Fluxo - procedimento
1) Marcação com Anticorpos (FL)
1)
Marcação com
Anticorpos (FL)
de Fluxo - procedimento 1) Marcação com Anticorpos (FL) 4) Análise de dados 2) Leitura no
4) Análise de dados
4) Análise
de dados
2) Leitura no citômetro
2) Leitura no
citômetro
1) Marcação com Anticorpos (FL) 4) Análise de dados 2) Leitura no citômetro 3) Processamento de
1) Marcação com Anticorpos (FL) 4) Análise de dados 2) Leitura no citômetro 3) Processamento de
3) Processamento de dados
3) Processamento
de dados
1) Marcação com Anticorpos (FL) 4) Análise de dados 2) Leitura no citômetro 3) Processamento de
15%
15%
33%
33%