El Centro de Genomas Compartiendo Informacin - N18

BIOLOGA MOLECULAR
Como garantizar la calidad en los resultados - Parte 1
El desarrollo de la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR) como un
componente bsico del laboratorio de
biologa molecular ocurri demasiado
rpido, desde su invencin en 1985.
Desde entonces, ms de 15.500
artculos fueron publicados donde esta
tcnica fue usada. Mientras la tcnica
de PCR se torn cada vez ms
utilizada, los cientficos aprendieron
rpidamente ms sobre ella y por
consiguiente, aprendieron que la PCR
tiene sus puntos fuertes y sus
deficiencias. La PCR demostr su
poder de amplificar cantidades muy
pequeas (por ejemplo, una nica
copia) de cidos nucleicos y de
amplificar
los
cidos
nucleicos
diferentes (por ejemplo, ADN y ARN).
Al mismo tiempo, el equipo del
laboratorio aprendi que esta reaccin
bioqumica tena una deficiencia
especfica: una fuerte susceptibilidad a
la contaminacin con su propio
producto. Las experiencias iniciales
con la PCR luego mostraron que
precauciones
adicionales
eran
necesarias (Lo et al. 1988; Kwok y
Higuchi 1989). Este artigo es dedicado
a explicar como establecer un
laboratorio de PCR cuyas operaciones
den resultados de confianza, ausentes
de contaminacin.
CONTAMINACIN
La contaminacin de la PCR
permanece un problema para los
laboratorios
que
ejecutan
procedimientos
forenses
y
procedimientos de deteccin de
agentes infecciosos (Pellett et al.
1999; Scherczinger et al. 1999). Hace
una serie de tratados sobre el control
de la contaminacin de PCR, y el
grado de exigencia que es requerido
en un laboratorio es determinado
frecuentemente por el tipo de
procedimientos y exmenes que estn
siendo ejecutados.
- Aerosol de amplicn
La fuente ms importante y crucial de
la contaminacin del producto de PCR
es la generacin de los aerosoles de
amplicones de PCR, que es asociada
con el anlisis de post PCR . Mtodos
para eliminar este aerosol van desde
un proyecto fsico que separe los
laboratorios al uso de pipetas y puntas
especficas
que
eviten
la
contaminacin.

La
eleccin
del
mtodo
frecuentemente dependiente de
frecuencia de amplificacin de
determinado amplicn y de
cantidades y concentraciones de
amplicones creados por la PCR.

es
la
un
las
los

- Contaminacin por muestras

primarias
Adems de la contaminacin de post
PCR , el propio blanco (ADN o ARN a
ser analizado en la muestra) puede
ser una fuente de contaminacin. Por
ejemplo, las molculas de ADN son
tpicamente ms incmodas como
contaminadoras porque son ms
estables que las molculas de ARN.
La deteccin de agentes infecciosos
exige
tpicamente
los
mayores
esfuerzos para evitar contaminacin,
ya que la deteccin errnea de una
molcula de ARN/ADN viral causada
por contaminacin es definitivamente
problemtica.
- Sistemas de PCR en Tiempo Real
Los sistemas de PCR en Tiempo Real
suministran la medida directa de la
acumulacin del amplicn durante la
reaccin. Estos sistemas ofrecen una
aproximacin
alternativa
a
los
mtodos tradicionales del anlisis de
post PCR . De una perspectiva de
control
de
contaminacin,
la
adquisicin de datos durante la
reaccin de amplificacin (y no
despus) elimina la necesidad de
manipular la muestra. De esta
manera, cuando estos PCR son
terminados, la deteccin y el anlisis
estn completos, los tubos de la
reaccin permanecen sellados y no
existe ningn escape de amplicn.
An as, la manipulacin de las
mquinas de Real Time es una fuente
potencial
de
contaminacin
en
guantes y mandiles.
COMO PREVENIR LA
CONTAMINACIN EN UN
LABORATORIO DE PCR
El laboratorio de PCR est involucrado
tpicamente con actividades que
incluyen: preparacin de la muestra,
preparacin de la reaccin de PCR,
ejecucin de la PCR y el anlisis de
post PCR. Estas actividades estn
resumidas en la Figura 1.

Cuando son distribuidas en esta forma

lineal, estas actividades pueden ser
agrupadas en dos grupos principales:
las
actividades
de
pre
PCR
(preparacin de la muestra y
preparacin de la PCR) y las
actividades de post PCR (ejecucin y
anlisis de PCR). El uso de la PCR
para finalidades de diagnstico
requiere que algunas limitaciones
adicionales sean observadas para que
la reaccin tenga resultados vlidos.
Cuando la susceptibilidad de la PCR a
la contaminacin se torn conocida,
Kwok e Higuchi (1989) presentaron
algunas recomendaciones adicionales
para laboratorios que usan la PCR.
Observar estas recomendaciones es
esencial para que un laboratorio de
PCR sea operado con xito a largo
plazo. Ellas forman parte de una serie
de protocolos focalizados en mantener
un laboratorio de PCR en una
condicin libre de contaminacin.

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Para la contaminacin por amplicones de PCR, el programa de control de la contaminacin es basado en la retirada de los
amplicones. Cuando la PCR es usada en laboratorios de diagnstico, donde una gran variedad de microorganismos estn
siendo amplificados y manipulados, el control de contaminacin debe ser bastante exigente. De hecho, en el laboratorio de
diagnstico existen ms oportunidades para la contaminacin de PCR debido al anlisis extremamente repetido de
determinados microorganismos y de hecho que las reacciones de PCR pueden estar extremamente prximas del lmite de
deteccin de los exmenes. Este hecho exige cuidado especial y requiere un tratado mucho ms riguroso para controlar la
contaminacin. Las partes esenciales de este programa de control de contaminacin incluyen la separacin espacial de las
actividades pre y post PCR uso de equipos de proteccin individual especficos para cada rea (mandiles, guantes, tocas,
protector de pies etc.), uso de la luz (UV) ultravioleta, uso de reactivos alicuotados, uso de controles positivos y negativos
adems del uso de uno o ms mtodos de control de contaminacin que utilizan reactivos qumicos (hipoclorito, perxido de
hidrgeno, alcohol). El problema mayor de la contaminacin por amplicones es que ella no puede ser vista, sentida, o
detectada a simple vista, antes que ella ocurra. El uso de las protecciones mencionadas arriba, la concientizacin del equipo
del laboratorio y la limpieza constante de las reas de trabajo aseguran un tratado vigilante y proactiva con relacin a la
contaminacin de PCR.
Separacin Fsica
Como ilustrado en la Figura 1, la fuente principal de
contaminacin en el rea pre PCR son los amplicones
generados en el rea post PCR . Separando la fuente de los
amplicones (el rea post PCR ) de las actividades de pre
PCR, el potencial para la contaminacin es significativamente
reducido. Esta separacin es ilustrada mejor en la Figura 2.
Los procesos de extraccin de muestras y preparacin de
reactivos tambin deben ser realizados separadamente,
alejados del rea post PCR . La preparacin de reactivos
debe ocurrir dentro de una campana o flujo laminar, equipada
de preferencia con una luz UV. Las paredes de la campana
deben ser limpiadas con una solucin de hipoclorito al 1%
antes de la preparacin de los reactivos. Los materiales que
contiene amplicones de PCR no pueden de ninguna manera
ser acumulados en reas que sean frecuentadas por personal
involucrado en la extraccin de muestras. Y lo ms
importante, la persona que manipula los amplicones nunca
deben regresar al rea de extraccin de muestras.

Figura 1: Esquema de procesamiento de muestras y

anpalisis de un laboratorio

Como arreglar el espacio en el laboratorio

Como mencionamos anteriormente, la disposicin ideal del laboratorio de PCR debe tener las reas pre y post PCR situadas
en reas fsicamente separadas (vea la Fig. 2), cada una con recursos dedicados. Ambas reas deben poseer fuentes de agua
destilada separadas, as como centrfugas, congeladores, refrigeradores exclusivos, adems de separar tambin el
almacenamiento de los materiales descartables para uso. Incluso los telfonos, computadoras y otras comunicaciones
electrnicas tambin deben ser dedicadas.
En el laboratorio de diagnstico, el men de actividades es
focalizado en la extraccin y en el procesamiento de la
muestra. Existe una demanda muy grande para detectar y
cuantificar cantidades extremamente bajas de ADN/ARN en
muestras biolgicas y eso exige una necesidad mucho mayor
de impedir la contaminacin del amplicn. En estos casos las
reas separadas ofrecen los mejores resultados contra
contaminacin. Las reacciones en Tiempo Real son ms
seguras, ya que no hay necesidad de abrir los recipientes de
PCR y el material es eliminado sellado. Mientras tanto, puede
haber situaciones donde las placas individuales necesitan ser
analizadas independientemente de la reaccin en Tiempo
Real, haciendo con que estos recipientes sean abiertos. Esto
propicia la contaminacin por amplicones y siempre debe
ocurrir en el rea post PCR .
Figura. 2: Organizacin de un laboratorio de PCR en
reas pre y post
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